PL229194B1

PL229194B1 - Neoglycoconjugate of Escherichia coli R1 LOS and Clostridium difficile toxoid oligo sugar and its application in bacterial vaccines

Info

Publication number: PL229194B1
Application number: PL415211A
Authority: PL
Inventors: Ewelina Bobko; Czesław ŁUGOWSKI; Czesław Ługowski; Wojciech Jachymek
Original assignee: Wroclawskie Centrum Badan Eit Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2015-12-09
Publication date: 2018-06-29
Also published as: PL415211A1

Abstract

Neoglikokoniugat będący przedmiotem zgłoszenia stanowi połączenie oligosacharydu zwitterjonowego Escherichia coli R1 LOS z rekombinowanym C-końcowym fragmentem toksyny B Clostridium difficile. Immunogena kompozycja zawierająca neoglikokoniugat przeznaczona jest do stosowania jako szczepionka w prewencji i leczeniu infekcji wywołanych przez bakterie Gram ujemne - Enterobacterioceae jak Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli a także przez Bordetella pertussis czy Clostridium difficile bądź jako element diagnostyczny do wykrywania zakażeń wywołanych przez rzeczone bakterie. Zgłoszenie obejmuje również kompozycję farmaceutyczną, szczepionkę zawierającą tę kompozycję, przeciwciało generowane oraz zestaw diagnostyczny.The reported neoglycoconjugate is a combination of Escherichia coli R1 LOS zwitterionic oligosaccharide with a recombinant C-terminal fragment of Clostridium difficile toxin B. The immunogena composition containing neoglycoconjugate is intended for use as a vaccine in the prevention and treatment of infections caused by Gram negative bacteria - Enterobacterioceae, such as Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, and also by Bordetella pertussis or Clostridium difficile, or as a diagnostic element to detect infections caused by said bacteria. The application also covers a pharmaceutical composition, a vaccine containing the composition, a generated antibody, and a diagnostic kit.

Description

Wynalazek dotyczy nowego glikokoniugatu składającego się z oligocukru rdzenia Escherichia coli R1 LOS i toksoidu Clostridium difficile. immunogennej kompozycji farmaceutycznej i szczepionki zawierającej nowy glikokoniugat oraz jego zastosowania w zapobieganiu i leczeniu zakażeń wywołanych przez szczepy bakterii Gram ujemnych i Gram dodatnich.The invention relates to a novel glycoconjugate consisting of the Escherichia coli R1 LOS core oligosaccharide and the Clostridium difficile toxoid. an immunogenic pharmaceutical composition and a vaccine containing the novel glycoconjugate, and its use in the prevention and treatment of infections caused by strains of gram negative and gram positive bacteria.

Szczepionki antybakteryjne stanowią skuteczny sposób przeciwdziałania wielu chorobom wywoływanym przez wielolekooporne szczepy bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, wobec których zawodzą terapie antybiotykowe. Immunoprofilaktyka jest obiecującym sposobem na zmniejszenie a nawet eliminację liczby zachorowań i powikłań wywołanych zakażeniami bakteryjnymi.Antibacterial vaccines are an effective way to counter many diseases caused by multi-drug-resistant strains of Gram-negative and Gram-positive bacteria for which antibiotic therapies have failed. Immunoprophylaxis is a promising way to reduce or even eliminate the incidence and complications caused by bacterial infections.

Dokument EP0941738 ujawnia zastosowanie jako antygenu koniugatu białka nośnikowego z konserwatywnym regionem LOS Neisseria meningitidis. Neisseria gonorrhoeae. H. influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Chlamydia, Proteus mirabilis, P.aeruginosa, Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Klebsiella spp. oraz V cholerae. Regionem tym jest fragment LOS o strukturze GlcNAc-Hep2-PEtn-Kdo2-Lipid A, obejmujący wewnętrzny region oligocukrów rdzeni lipooligosacharydów wymienionych bakterii. Uzyskane w wyniku immunizacji takim koniugatem surowice wykazywały krzyżową reaktywność z LOS N. meningitidis, H. influenzae, N. gonorrhoeae i H. pylori oraz aktywność bakteriobójczą w testach in vitro z użyciem kilku szczepów N. meningitidis.EP0941738 discloses the use of a carrier protein conjugate with a conserved LOS region of Neisseria meningitidis as an antigen. Neisseria gonorrhoeae. H. influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Chlamydia, Proteus mirabilis, P.aeruginosa, Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Klebsiella spp. And V cholerae. This region is a LOS fragment with the structure GlcNAc-Hep2-PEtn-Kdo2-Lipid A, including the inner oligosaccharide region of the lipooligosaccharide cores of the mentioned bacteria. Serum obtained by immunization with such a conjugate showed cross-reactivity with LOS N. meningitidis, H. influenzae, N. gonorrhoeae and H. pylori and bactericidal activity in in vitro tests with several strains of N. meningitidis.

Z publikacji WO2014195881 znany jest glikokoniugat zawierający oligocukier lub fragment oligocukru LOS Bordetella pertussis (OS) i toksynę krztuśca (PT) połączone ze sobą wiązaniem kowalencyjnym mające zastosowania do wytworzenia przeciwkrztuścowej szczepionki zawierającej immunogenne składniki Bordetella pertussis w formie w pełni zinaktywowanej.WO2014195881 discloses a glycoconjugate containing an oligosaccharide or a LOS fragment of Bordetella pertussis (OS) and a pertussis toxin (PT) linked together by a covalent bond for the preparation of an anti-pertussis vaccine containing the immunogenic components of Bordetella pertussis in a fully inactivated form.

Zgłoszenie WO2014195880 ujawnia wyizolowany antygen będący immunogenną formą wspólnego enetrobakteryjnego antygenu Gram-ujemnych bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. tj. ECA połączonego z lipopolisacharydem (ECALPS), mający zastosowanie w profilaktyce i leczeniu chorób wywołanych przez bakterie Gram-ujemne, zwłaszcza z rodziny Enterobacteriaceae, uwzględniających w szczególności zakażenie szpitalne i wstrząs septyczny oraz zakażenia jelitowe. Ujawniony antygen określa struktura [podjednostka ECA]n-oligocukier rdzenia - lipid A, gdzie powtarzająca się biologiczna podjednostka ECA stanowi: [ >3)-a-D-Fuc4NAc-(1 >4)-p-D-ManNAcA-(1 >4)-a-D-GlcNAc-(1 >]-. a n > 1, i gdzie oligocukier rdzenia i lipid A pochodzą z LPS lub LOS szczepów bakterii Gram-ujemnych. a lipid A jest detoksyfikowany.The application WO2014195880 discloses an isolated antigen which is an immunogenic form of the common enetrobacterial antigen of Gram-negative bacteria of the Enterobacteriaceae family. ie ECA combined with lipopolysaccharide (ECALPS), applicable in the prophylaxis and treatment of diseases caused by Gram-negative bacteria, especially from the Enterobacteriaceae family, including in particular nosocomial infection and septic shock and intestinal infections. The disclosed antigen is defined by the structure [ECA subunit] core n-oligosaccharide - lipid A, where the repeating biological ECA subunit is: [> 3) -aD-Fuc4NAc- (1> 4) -pD-ManNAcA- (1> 4) -aD -GlcNAc- (1>] -. An> 1, and where the core oligosaccharide and lipid A are derived from the LPS or LOS of Gram-negative bacterial strains and the lipid A is detoxified.

Pomimo znanych ze stanu techniki rozwiązań nadal istnieje potrzeba dostarczenia immunogennej kompozycji, która będzie miała zastosowanie jako skuteczna hybrydowa szczepionka indukująca szerokie spektrum ochrony przeciwbakteryjnej zarówno wobec Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych szczepów.Despite the prior art solutions, there is still a need to provide an immunogenic composition that will be used as an effective hybrid vaccine inducing a broad spectrum of antibacterial protection against both gram-positive and gram-negative strains.

W związku z tym istnieje potrzeba identyfikacji i wytworzenia nowych antygenów, wspólnych dla większej grupy gatunków Gram-ujemnych i Gram-dodatnich bakterii, w szczególności gatunków wywołujących zakażenia szpitalne oraz infekcje, takie jak te wywoływane przez Bordetella pertussis, Klebsiella pneumoniae. Escherichia coli, Shigella spp. oraz Clostridium difficile.Accordingly, there is a need to identify and produce new antigens common to a larger group of Gram-negative and Gram-positive bacterial species, in particular species causing nosocomial infections and infections such as those caused by Bordetella pertussis, Klebsiella pneumoniae. Escherichia coli, Shigella spp. And Clostridium difficile.

Nieoczekiwanie problem ten rozwiązuje niniejszy wynalazek.Surprisingly, this problem is solved by the present invention.

Przedmiotem wynalazku jest neoglikokoniugat składający się z białkowego nośnika zawierającego fragment C-końcowy toksyny B Clostridium difficile zawierający 517 aa od reszty 1850-2366. oraz z co najmniej jednego oligocukru rdzenia Escherichia coli R1 LOS.The present invention relates to a neoglycoconjugate consisting of a carrier protein containing the C-terminal fragment of Clostridium difficile toxin B containing 517 aa from residue 1850-2366. and from at least one Escherichia coli R1 LOS core oligosaccharide.

Korzystnie. oligocukier rdzenia Escherichia coli R1 LOS posiada wolną grupę aminową (a-GlcN) oraz wolną grupę karboksylową (a-Kdo).Favorable. the core oligosaccharide of Escherichia coli R1 LOS has a free amino group (a-GlcN) and a free carboxyl group (a-Kdo).

Korzystnie. oligocukier Escherichia coli R1 LOS posiada strukturę o wzorze 1.Favorable. Escherichia coli R1 LOS oligosaccharide has the structure of formula 1.

Korzystnie, białkowy nośnik posiada sekwencję aminokwasową SEKW NR ID 1.Preferably, the protein carrier has the amino acid sequence of SEQ ID NO. 1.

Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej zawierającej powyżej zdefiniowany neoglikokoniugat oraz farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą i/lub adiuwant.The invention also relates to a pharmaceutical composition containing the above-defined neoglycoconjugate and a pharmaceutically acceptable excipient and / or an adjuvant.

Innym przedmiotem wynalazku jest szczepionka zawierająca kompozycję farmaceutyczną obejmującą wyżej cytowany neoglikokoniugat oraz dopuszczalną farmaceutycznie substancję pomocniczą i adiuwant.Another object of the invention is a vaccine comprising a pharmaceutical composition comprising the above-cited neoglycoconjugate, and a pharmaceutically acceptable excipient and an adjuvant.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca cytowany powyżej neoglikokoniugat oraz farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą i/lub adiuwant do leczenia, zapobiegania i diagnozowania zakażeń wywołanych przez bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie.The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the above-cited neoglycoconjugate and a pharmaceutically acceptable excipient and / or adjuvant for the treatment, prevention and diagnosis of infections caused by Gram-negative and Gram-positive bacteria.

PL229 194B1PL229 194B1

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca cytowany powyżej neoglikokoniugat oraz farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą i/lub adiuwant do leczenia, zapobiegania i diagnozowania zakażeń wywołanych przez bakterie Bordetella pertussis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Shigella spp., Clostridium difficile.The invention also relates to a pharmaceutical composition containing the above-cited neoglycoconjugate and a pharmaceutically acceptable excipient and / or adjuvant for the treatment, prevention and diagnosis of infections caused by Bordetella pertussis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Shigella spp., Clostridium difficile.

Innym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało generowane przez powyższą kompozycję.Another object of the invention is an antibody generated by the above composition.

Innym przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny do wykrywania zakażeń Bordetella pertussis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Shigella spp., Clostridium difficile zawierający powyżej cytowane przeciwciało.Another object of the invention is a diagnostic kit for the detection of Bordetella pertussis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Shigella spp., Clostridium difficile infections containing the above-cited antibody.

Wynalazek dotyczy neoglikokoniugatu oligocukru i toksoidu Clostridium difficile. Neoglikokoniugat według rozwiązania stanowi połączenie oligosacharydu Escherichia coli R1 LOS z rekombinowanym C-końcowym fragmentem toksyny B Clostridium difficile. Oligocukierten stanowi konserwatywną strukturę głównego czynnika wirulencji bakterii Gram-ujemnych, natomiast toksyna B jest egzotoksyną bakterii Gram-dodatniej wywołującej częste zakażenia szpitalne.The invention relates to a neoglycoconjugate of a Clostridium difficile oligosaccharide and a toxoid. The neoglycoconjugate of an embodiment is a combination of an Escherichia coli R1 LOS oligosaccharide with a recombinant C-terminal fragment of Clostridium difficile toxin B. Oligosquierten is a conserved structure of the main virulence factor of Gram-negative bacteria, while toxin B is an exotoxin of Gram-positive bacteria causing frequent hospital infections.

Oligocukier wyizolowano z Escherichia coli mającej lipopolisacharyd pozbawiony antygenu O - LPS typu szorstkiego (LPS typu R, lipooligosacharyd, LOS). Oligocukierten otrzymano w wyniku łagodnej hydrolizy kwaśnej LOS Escherichia coli R1. Następnie z uzyskanej heterogennej mieszaniny wyizolowano oligocukier rdzenia wykazujący cechy zwitterjonu poprzez obecność wolnej grupy aminowej (α-GlcN) oraz grupy karboksylowej (α-Kdo). Zastosowanie oczyszczonej frakcji oligocukrów w postaci „zwitterjonów” zwiększa odpowiedź immunologiczną na dany antygen. Uzyskane fragmenty oczyszczano i skoniugowano z nośnikiem białkowym -toksoidem Clostridium difficile.Oligosaccharide was isolated from Escherichia coli having a lipopolysaccharide lacking the O-rough type LPS antigen (R-type LPS, lipooligosaccharide, LOS). Oligosuccinate was obtained by mild acid hydrolysis of Escherichia coli R1 LOS. Then, the core oligosaccharide showing zwitterion features was isolated from the obtained heterogeneous mixture through the presence of a free amino group (α-GlcN) and a carboxyl group (α-Kdo). The use of a purified fraction of oligosaccharides in the form of zwitterions increases the immune response to a given antigen. The obtained fragments were purified and conjugated to the protein carrier Clostridium difficile toxoid.

Oligosacharyd Escherichia coli R1 LOS (dekasacharyd rdzenia Escherichia coli PCM 1985) będący konserwatywnym fragmentem głównego antygenu powierzchniowego, ma strukturę wspólną dla wielu pokrewnych szczepów bakterii Gram-ujemnych i w formie immunogennej zapewnia szeroką ochronę przeciwbakteryjną. Według stanu techniki nie są znane właściwości immunogenne tej cząsteczki, opublikowano jedynie dane dotyczące koniugatów oligocukrowych zawierających głównie struktury pozbawione podstawienia GIcN. Strukturę oligosacharydu rdzenia Escherichia coli R1ZW (ZWT) odpowiadającą masie 1865,6 Da przedstawia WZÓR 1. Litery odpowiadają monosacharydom na widmie NMR.The Escherichia coli R1 LOS oligosaccharide (Escherichia coli PCM core decasaccharide 1985), which is a conserved fragment of the main surface antigen, has a structure common to many related strains of Gram-negative bacteria and provides broad antibacterial protection in an immunogenic form. According to the prior art, the immunogenic properties of this molecule are not known, only data have been published on oligosugar conjugates containing mainly structures lacking a GlcN substitution. The structure of Escherichia coli R1ZW core oligosaccharide (ZWT) corresponding to a mass of 1865.6 Da is shown in FORMULA 1. The letters correspond to the monosaccharides in the NMR spectrum.

O .oO. O

ChOH B \ChOH B \

WZÓR 1MODEL 1

PL 229 194 B1PL 229 194 B1

Nośnikiem białkowym jest chimera białkowa fragmentu C-końcowego toksyny B Clostridium difficile (TBd, 517 aa, reszty 1850-2366 TcdB) oraz białka SUMO (98 aa) otrzymany w wyniku rekombinacji w heterologicznym systemie bakteryjnym Escherichia coli.The carrier protein is the protein chimera of the C-terminal fragment of toxin B of Clostridium difficile (TBd, 517 aa, residues 1850-2366 TcdB) and the SUMO proteins (98 aa) obtained by recombination in an Escherichia coli heterologous bacterial system.

Oligosacharyd skoniugowany z wymienionym wyżej nośnikiem białkowym uzyskuje nowe właściwości antygenowe. W modelu zwierzęcym w wyniku szczepienia takim antygenem generowane są przeciwciała reagujące z toksyną Clostridium difficile oraz z szerokim spektrum LPS i LOS Gram-ujemnych potencjalnie patogennych bakterii. Unikatową właściwością tak wygenerowanej szczepionki jest indukcja przeciwciał rozpoznających struktury powierzchniowe Bordetella pertussis (część końcową cząsteczki endotoksyny) oraz Klebsiella pneumoniae (struktury wielocukrowych epitopów) przy zachowaniu jednocześnie oczekiwanej aktywności generowania przeciwciał rozpoznających toksynę Clostridium difficile, i struktury endotoksyn Escherichia coli oraz Shigella spp.The oligosaccharide conjugated to the above-mentioned protein carrier obtains new antigenic properties. In an animal model, vaccination with such an antigen generates antibodies that react with Clostridium difficile toxin and with a broad spectrum of Gram-negative LPS and LOS potentially pathogenic bacteria. The unique property of the vaccine generated in this way is the induction of antibodies recognizing the surface structures of Bordetella pertussis (the end part of the endotoxin molecule) and Klebsiella pneumoniae (multi-sugar epitope structures) while maintaining the expected activity of generating antibodies recognizing the Clostridium difficile toxin, and the structure of Escherichia sppi and Shigella sppi endotoxins.

Obserwowane reakcje dotyczą części rdzeniowej w przypadku Bordetella pertussis oraz szczepów Escherichia coli, których LPS zawierają rdzeń typu R1. W przypadku Klebsiella pneumoniae obserwuje się reakcje w regionie rdzeniowym jak i w części polisacharydowej LPS.The observed reactions concern the core part in the case of Bordetella pertussis and strains of Escherichia coli, the LPS of which contain an R1 core. In the case of Klebsiella pneumoniae, reactions are observed in the core region as well as in the polysaccharide part of the LPS.

Neoglikokoniugat według wynalazku powoduje generację przeciwciał rozpoznających struktury antygenów o strukturach innych niż te użyte w neoglikokoniugacie. Może mieć to związek ze specyficznym rozkładem ładunków w nowosyntetyzowanym koniugacie i kontekście użytego fragmentu białkowego.The neoglycoconjugate of the invention results in the generation of antibodies recognizing the structures of antigens with structures different from those used in the neoglycoconjugate. This may be related to the specific charge distribution in the newly synthesized conjugate and the context of the protein fragment used.

Indukowane neoglikokoniugatem przeciwciała wykazują właściwości bakteriobójcze wobec bakterii Escherichia coli (Escherichia coli PGM 1985), Bordetella pertussis (Bordetella pertussis 186), Klebsiella pneumoniae O5 w testach płytkowych. Neoglikokoniugat według wynalazku pozwala na dostarczenie hybrydowej szczepionki indukującej szerokie spektrum ochrony przeciwbakteryjnej. Szczepionka ta może zapewnić skuteczną ochronę przed infekcją wywołaną przez bakterie Gram-dodatnie i Gramujemne.The neoglycoconjugate-induced antibodies show bactericidal properties against Escherichia coli (Escherichia coli PGM 1985), Bordetella pertussis (Bordetella pertussis 186), Klebsiella pneumoniae O5 in plate tests. The neoglycoconjugate according to the invention makes it possible to provide a hybrid vaccine that induces a broad spectrum of antibacterial protection. This vaccine can provide effective protection against infection by Gram-positive and Gram-negative bacteria.

Fig. 1 Przesunięcia chemiczne 1H.13C NMR oligocukru zwitterjonowego R1ZW (ZWT).Fig. 1 Chemical shifts of 1H.13C NMR of the zwitterionic oligosaccharide R1ZW (ZWT).

Fig. 2 Sekwencja białka nośnikowego Clostridium difficile (SEKW NR ID 2).Fig. 2 Sequence of the Clostridium difficile carrier protein (SEQ ID NO 2).

Fig. 3 Sekwencja rekombinowanego nośnika białkowego TBd (SEKW NR ID 1).Fig. 3 Sequence of the recombinant TBd protein carrier (SEQ ID No. 1).

Sekwencja białkowa zawiera 616 aa. Reszta N jest 1850 aminokwasem w sekwencji TcdB. Masa monoizotopowa rekombinantu wynosi 70748,44 Da. (peptyd SUMO 11261.68 Da).The protein sequence is 616 aa. Residue N is 1850 amino acid in the TcdB sequence. The monoisotope mass of the recombinant is 70 748.44 Da. (SUMO 11261.68 Da peptide).

Fig. 4 Profil elucji supernatantu po wirowaniu zawiesiny komórek E. coli, w których ekspresjonowano TBd. Eluent monitorowano przy 280 nm.Fig. 4 Supernatant elution profile after centrifugation of a suspension of E. coli cells expressing TBd. The eluent was monitored at 280 nm.

Fig. 5 Profil elucji frakcji II na kolumnie HitrapQ. Połączone frakcje zaznaczono. Eluent monitorowano przy 280 nm.Fig. 5 Elution profile of fraction II on the HitrapQ column. The combined fractions are marked. The eluent was monitored at 280 nm.

Fig. 6 Profil elucji utlenionego oligosacharydu rdzenia Escherichia coli ZWT. Frakcje oligosacharydu użyte do koniugacji zaznaczono. Eluent monitorowano z pomocą refraktometru przepływowego (Shodex).Fig. 6 Elution profile of oxidized Escherichia coli ZWT core oligosaccharide. The oligosaccharide fractions used for conjugation are indicated. The eluent was monitored with a flow refractometer (Shodex).

Fig. 7 Rozdział w żelu poliakryloamidowym i immunobloting LPS z surowicą skierowaną przeciwko koniugatowi R1ZW-TBd.Fig. 7 Separation in polyacrylamide gel and immunoblotting of LPS with serum directed against the R1ZW-TBd conjugate.

Fig. 8 Rozdział w żelu poliakryloamidowym i immunobloting LPS z surowicą skierowaną przeciwko koniugatowi R1 ZW-TTd .Fig. 8 Separation in polyacrylamide gel and immunoblotting of LPS with serum directed against the R1 ZW-TTd conjugate.

Fig. 9 Immunobloting (test dot blot) reakcja aktywnej toksyny B Clostridium difficile (TCdB) oraz toksoidu TBd (EcdB) z surowicą skierowaną przeciwko koniugatowi R1ZW-TBd. TCdB x1: 70 ng, x2: 140 ng, x3: 210 ng; TBd (EcdB) x1: 100 ng, x2 200 ng, x3: 300 ng. Rozcieńczenie surowicy 1:50.Fig. 9 Immunobloting (dot blot assay) reaction of active Clostridium difficile toxin B (TCdB) and TBd toxoid (EcdB) with serum directed against the R1ZW-TBd conjugate. TCdB x1: 70ng, x2: 140ng, x3: 210ng; TBd (EcdB) x1: 100 ng, x2 200 ng, x3: 300 ng. Serum dilution 1:50.

P r z y k ł a d 1P r z k ł a d 1

Izolacja rdzenia Escherichia coli R1Isolation of the Escherichia coli R1 core

Szczep Escherichia coli R1 uzyskano z Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów. Źródłem struktury jest szczep Escherichia coli PCM 1985. Hodowle bakteryjne prowadzono na płytkach agarowych w 37°C przez noc, następnie zawieszano w sterylnym PBS. Przygotowanym inokulum zaszczepiano 9 l podłoża LB lub podłoża mineralnego Davis'a wzbogaconego w glukozę, hydrolizat kazeiny i wyciąg drożdżowy. Hodowlę prowadzono przez 18 godzin w fermentorze Bioflo 415 (Eppendorf) w 37°C z napowietrzaniem. Po hodowli bakterie zabijano 0,5% fenolem i wirowano na wirówce przepływowej Cepa. Otrzymaną masę bakteryjną zawieszano w 300 ml wody (miliQ 18 MQ/cm) i liofilizowano.The Escherichia coli R1 strain was obtained from the Polish Collection of Microorganisms. The source of the structure is Escherichia coli PCM 1985. Bacterial cultures were grown on agar plates at 37 ° C overnight, then resuspended in sterile PBS. The prepared inoculum was inoculated with 9 L of LB medium or Davis mineral medium enriched with glucose, casein hydrolyzate and yeast extract. The cultivation was carried out for 18 hours in a Bioflo 415 fermenter (Eppendorf) at 37 ° C with aeration. After cultivation, the bacteria were killed with 0.5% phenol and centrifuged in a Cepa flow-through centrifuge. The obtained bacterial mass was suspended in 300 ml of water (milliQ 18 MQ / cm) and freeze-dried.

Ekstrakcja LOSLOS extraction

LOS ekstrahowano z masy bakteryjnej metodą wodno-fenolową opisaną przez Westphala (1). Masę bakteryjną zawieszano w wodzie (25 ml wody miliQ na 2 g suchej masy), dodawano równą objętość fenolu i po ogrzewaniu do 65°C ekstrahowano przez 15 min. intensywnie mieszając. MieszaninęLOS was extracted from the bacterial mass by the water-phenolic method described by Westphal (1). The bacterial pulp was suspended in water (25 ml of milliQ water per 2 g of dry matter), an equal volume of phenol was added and after heating to 65 ° C it was extracted for 15 min. stirring intensively. The mixture

PL229 194B1 po ochłodzeniu do 4-5°C wirowano 3000 rpm przez 30 min. Zebrano fazę wodną, a do pozostałości dodano wody miliQ w ilości odpowiadającej zebranej objętości i powtórzono cykl ekstrakcji. Fazy wodne połączono i dializowano w wodzie przez 72 godziny, a następnie liofilizowano. Ostatnim etapem oczyszczania LOS było trzykrotne ultrawirowanie przy 100000xg przez 6 godzin (2). Zlifilizowany LOS po dializie zawieszono w wodzie miliO za pomocą sondy ultradźwiękowej i ultrawirowano. Osad po ultrawirowaniu (zawierający LOS) zawieszono w wodzie (miliO) i wirowano jeszcze dwa razy. Po ostatnim cyklu ultrawirowania LOS zawieszono w wodzie i liofilizowano.PL229 194B1 after cooling to 4-5 ° C was centrifuged at 3000 rpm for 30 min. The aqueous phase was collected, a quantity of milliQ water was added to the residue corresponding to the collected volume, and the extraction cycle was repeated. The aqueous phases were combined and dialyzed in water for 72 hours and then lyophilized. The last step in LOS purification was three ultracentrifugation at 100,000 xg for 6 hours (2). The dialysed LOS was suspended in milliO water using an ultrasonic probe and ultracentrifuged. The ultracentrifugation pellet (containing LOS) was suspended in water (milliO) and centrifuged two more times. After the last cycle of ultracentrifugation, LOS was suspended in water and lyophilized.

Otrzymanie i oczyszczanie oligosacharydu ZWTPreparation and purification of ZWT oligosaccharide

Oczyszczony LOS hydrolizowano w 1,5% kwasie octowym (40 ml 1,5% kwasu na 200 mg LOS) w temperaturze 100°C przez 0,5 do 1 godziny i wirowano 18000xg przez 20 minut w celu oddzielenia rozpuszczalnych oligosacharydów od osadu lipidu A. Oligosacharyd zwitterjonowy R1 ZW (ZWT) izolowano za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią masową, korzystając z kolumny ZIC-HILIC (Merck-Milipore, SeOuant 5um 200A, 150x21,2 ΗΧ4310044) i spektrometru masowego ze źródłem jonowym typu ESI i pułapką jonową jako analizatorem jonów. Rozdziały chromatograficzne prowadzono w gradiencie acetonitrylu i 0,1% roztworu kwasu mrówkowego w wodzie (62%-40% acetonitrylu 30 min). Frakcje rdzeniowe o charakterze zwiterjonowym (oznaczone jako ZWT) z kolejnych rozdziałów łączono i liofilizowano. Osobno łączono frakcje ZWT monofosforylowane (obserwowane jony w widmie 931,8 i 922,8), a osobno pozostałe frakcje ZWT- pozostałe jony wyszczególnione w Tabeli nr 1. Strukturę zliofilizowanych oligosacharydów potwierdzano za pomocą spektroskopii NMR.Purified LOS was hydrolyzed in 1.5% acetic acid (40 ml 1.5% acid per 200 mg LOS) at 100 ° C for 0.5 to 1 hour and centrifuged at 18,000 x g for 20 minutes to separate the soluble oligosaccharides from the lipid A pellet The R1 ZW zwitterion oligosaccharide (ZWT) was isolated by mass-coupled liquid chromatography using a ZIC-HILIC column (Merck-Millipore, SeOuant 5um 200A, 150x21.2 ΗΧ4310044) and a mass spectrometer with an ESI ion source and ion trap as ion analyzer. Chromatographic separations were performed in a gradient of acetonitrile and 0.1% formic acid in water (62% -40% acetonitrile 30 min). The spiterionic core fractions (marked as ZWT) from the following sections were combined and lyophilized. The monophosphorylated ZWT fractions (observed ions in the spectrum 931.8 and 922.8) were combined separately, and the remaining ZWT fractions - other ions listed in Table No. 1. The structure of the lyophilized oligosaccharides was confirmed by NMR spectroscopy.

Tabela 1Table 1

ZWT [M] ZWT [M] Obliczona masa monoizotopowa Calculated mass monoisotope Obserwowany jon (m/z) na widmie ESI QTrap Observed ion (m / z) on the ESI QTrap spectrum Interpretacja jonu Ion interpretation Kdo+3Hep+5Hex+HexN+P Kdo + 3Hep + 5Hex + HexN + P 1988,57 1988.57 993,2 993.2 [M-2H+PEtNJ²'[M-2H + PEtNJ ² ' Kdo+3Hep+5Hex+HexN+P Kdo + 3Hep + 5Hex + HexN + P 1970,56 1970.56 984,2 984.2 [M-2H+PEtN-H_z0]²'[M-2H + PEtN-H _z 0] ² ' Kdo+3Hep+5Hex+HexN+2P Kdo + 3Hep + 5Hex + HexN + 2P 1945,52 1945.52 971,8 971.8 [M2H]²'[M2H] ² ' Kdo+3Hep+5Hex+HexN+2P Kdo + 3Hep + 5Hex + HexN + 2P 1927,5 1927.5 962,8 962.8 [Μ-2Η-Η₂Ο]*[Μ-2Η-Η ₂ Ο] * Kdo+3Hep+5Hex+HexN+R Kdo + 3Hep + 5Hex + HexN + R 1865,56 1865.56 931,8 931.8 [M-2H]²'[M-2H] ² ' Kdo+3Hep+5Hex+HexN+P Kdo + 3Hep + 5Hex + HexN + P 1847,56 1847.56 922,8 922.8 [M 2H-H₂O]² [M 2H-H ₂ O] ²

Ekspresja C-końcowego fragmentu toksyny B z Clostridium difficile w Escherichia coli (EcdB).Expression of the C-terminal fragment of toxin B from Clostridium difficile in Escherichia coli (EcdB).

Do ekspresji w systemie bakteryjnym wybrano fragment C-końca białka TcdB zawierający 517 aminokwasów. Do sekwencji dodano serynę jako pierwszy aminokwas, obecność tej reszty na N-końcu rekombinowanego białka ułatwia hydrolizę białka SUMO za pomocą proteazy SUMO. Zoptymalizowano skład nukleotydowy wybranej sekwencji, tak aby zawartość poszczególnych nukleotydów odpowiadała wymaganiom Escherichia coli.The 517 amino acid C-terminal fragment of the TcdB protein was selected for expression in a bacterial system. Serine was added as the first amino acid to the sequence, the presence of this residue at the N-terminus of the recombinant protein facilitates the hydrolysis of the SUMO protein by the SUMO protease. The nucleotide composition of the selected sequence was optimized so that the content of individual nucleotides meets the requirements of Escherichia coli.

Zawiesinę chemikompetentnych komórek Escherichia coli BL21 rozmrożono na lodzie i dodano 10 ng plazmidu ChampionTM pET SUMO z wklonowanym fragmentem receptorowym toksyny B z Clostridium difficile. Postępowano zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu Champion pET SUMO (Protein Expression System, lnvitrogen by life technologies). Inkubowano na lodzie przez 30 minut a następnie przez 30 sekund inkubowano w 42°C i dodano 250 ml SOC ogrzanego do temperatury pokojowej i inkubowano w 37°C z wytrząsaniem przez 1 h 200 rpm/min. Otrzymaną zawiesiną bakteryjną zaszczepiono 50 ml płynnego podłoża LB zawierającego kanamycynę (Gibco by life technologies) w stężeniu 50 pg/ml i inkubowano przez noc w 37°C z wytrząsaniem. Otrzymanym inokulum zaszczepiono 1,5 I płynnego LB zawierającego kanamycynę 50 pg/ml, hodowlę prowadzono w 37°C z wytrząsaniem. W momencie gdy gęstość optyczna hodowli osiągnęła wartość OD=0,6 dodano IPTG (Roth) do stężenia 1 mM/ml. Ekspresję prowadzono przez 5 godzin w 37°C z wytrząsaniem. Otrzymaną masę bakteryjną zebrano przez wirowanie 5000xg przez 10 minut i zamrożono w - 20°C. Masę bakteryjną po rozmrożeniu zawieszono w 20 ml buforu 10 mMTris/HCI 50 mMCaCb pH=8 (bufor A), i sonikowano naThe suspension of chemically competent Escherichia coli BL21 cells was thawed on ice and 10 ng of ChampionTM pET SUMO plasmid with the clostridium difficile toxin B receptor fragment cloned was added. The instructions for the Champion pET SUMO kit (Protein Expression System, Invitrogen by life technologies) were followed. Incubated on ice for 30 minutes followed by 30 seconds incubation at 42 ° C and 250 ml of SOC warmed to room temperature was added and incubated at 37 ° C with shaking for 1 h 200 rpm / min. The obtained bacterial suspension was inoculated with 50 ml of liquid LB medium containing kanamycin (Gibco by life technologies) at a concentration of 50 pg / ml and incubated overnight at 37 ° C with shaking. The obtained inoculum was inoculated with 1.5 L of liquid LB containing kanamycin 50 µg / ml, the culture was carried out at 37 ° C with shaking. When the optical density of the culture reached the OD = 0.6, IPTG (Roth) was added to a concentration of 1 mM / ml. Expression was carried out for 5 hours at 37 ° C with shaking. The resulting bacterial mass was collected by centrifugation 5000xg for 10 minutes and frozen at -20 ° C. The thawed bacterial stock was suspended in 20 ml of 10 mMTris / HCl 50 mMCaCb pH = 8 buffer (buffer A), and sonicated on

PL 229 194 B1 lodzie 3 lub 4 razy po 1 min, w celu dezintegracji ściany i błony komórkowej bakterii, obserwując zgęstnienie zawiesiny w momencie uwolnienia zawartości komórki. Zawiesinę wirowano dwukrotnie 18000xg 20 min. Rekombinowane białko oczyszczono z supernatantu za pomocą chromatografii jonowymiennej na złożu DEAE Sephadex A-25, w buforze A w gradiencie 0-0,5M NaCI (1M NaCI 10m MTris/HCI 50 mMCaCl2 pH=8 - bufor B). Obecność białka w eluencie monitorowano obserwując absorbancję przy długości fali 260 i 280 nm. Obecność toksoidu TBd monitorowano w teście dot-blot za pomocą przeciwciała anty TcdB (antibodies-online GmbH).Using ice 3 or 4 times for 1 min, in order to disintegrate the bacterial cell wall and membrane, observing the thickening of the suspension as the cell contents were released. The suspension was centrifuged twice at 18,000 xg 20 min. The recombinant protein was purified from the supernatant by DEAE Sephadex A-25 ion exchange chromatography in buffer A with a gradient of 0-0.5M NaCl (1M NaCl 10m MTris / HCl 50mMCaCl2 pH = 8 - buffer B). The presence of protein in the eluent was monitored by observing the absorbance at 260 and 280 nm. The presence of TBd toxoid was monitored in a dot-blot assay with an anti-TcdB antibody (antibodies-online GmbH).

Frakcje zawierające toksoid połączono, następnie zagęszczono na filtrach Amicon 30 kDa, wymieniając bufor na bufor A. Otrzymany roztwór toksoidu oczyszczano na kolumnie HiTrap Q w buforze A i gradiencie 0-0,5M NaCl. Obecność białka w eluencie monitorowano obserwując absorbancję przy długości fali 260 i 280 nm. Obecność toksoidu monitorowano w teście dot-blot za pomocą przeciwciała anty-TcdB. Oczyszczony toksoid przechowywano w -20°C w 50% roztworze glicerolu.Toxoid containing fractions were pooled, then concentrated on 30 kDa Amicon filters, exchanging buffer with buffer A. The resulting toxoid solution was purified on a HiTrap Q column in buffer A with a 0-0.5M NaCl gradient. The presence of protein in the eluent was monitored by observing the absorbance at 260 and 280 nm. The presence of the toxoid was monitored in a dot-blot assay with an anti-TcdB antibody. The purified toxoid was stored at -20 ° C in a 50% glycerol solution.

Przygotowanie koniugatów oligosacharydów rdzeniowych z toksoidem toksyny B z Clostridium difficile.Preparation of core oligosaccharide conjugates with toxin B toxoid from Clostridium difficile.

Koniugat R1ZW-TBd przygotowano wykorzystując reakcję reduktywnej aminacji, 4,2 mg oczyszczonego R1ZW (ZWT) rozpuszczono w 0,1M octanie sodu pH=5,5 w stężeniu 10 mg/ml i utleniano w ciemności w 10 mM nadjodanie sodu przez 1 h (3), w takich warunkach utlenieniu do aldehydów ulegają wicynalne grupy hydroksylowe na heptozach i Kdo. Następnie oligosacharyd oczyszczano za pomocą chromatografii SEC w wodzie na kolumnie ze złożem G3000 PW. Eluent monitorowano za pomocą refraktometru przepływowego, a otrzymane frakcje analizowano za pomocą spektrometrii mas na obecność oligosacharydów. Frakcje oligosacharydowe połączono i zliofilizowano. Otrzymano 3,5 mg utlenionego oligosacharydu. Utleniony oligosacharyd R1ZW (3.5 mg) następnie rozpuszczono w 260 pl roztworu białka TBd, (1,5 mg) w 0.2 M buforze boranowym (pH=9.0), inkubowano przez 1 h w 37°C, dodano 40 pl 1M roztworu cyjanoborowodorku sodu (odczynnik ALD, Sterogene, USA) oraz kroplę chloroformu. Reakcję prowadzono w temperaturze 37°C przez 12 dni, bez mieszania. W 5 i 10 dniu reakcji dodano kolejne porcje 22 pl ALD. Po zakończeniu reakcji mieszaninę oczyszczono przy użyciu SECHPLC na kolumnie G3000 SW (2.5 x 30 cm) (Tosoh Bioscience, Japonia) zrównoważonej buforem PBS. Wielkość nastrzyku wynosiła 1 ml, prędkość przepływu 6 ml/min., a objętość zbieranych frakcji wynosiła 3 ml. Frakcje koniugatu monitorowano immunochemicznie pod względem reakcji ze specyficznymi przeciwciałami anty-R1ZW i anty-CdTB i tym samym na obecność antygenu białkowego toksyny B C. difficile cukrowego ZWR1 za pomocą testu dot-blot. Na dwie membrany nitrocelulozowe naniesiono 3x 0,7 pl roztworu z każdej analizowanej frakcji. Membrany blokowano w 0,2% roztworze kazeiny w TBS, następnie w celu wykrycia antygenu cukrowego, jedną membranę inkubowano z surowicą króliczą, otrzymaną w wyniku immunizacji koniugatem oligosacharydu rdzenia E. coli R1 z toksoidem tężcowym OSR1TTd, w rozcieńczeniu 1:150. Surowicę rozcieńczano 0,2% roztworem kazeiny w TBS. Jako drugorzędowego przeciwciała użyto koziego anty króliczego IgG skoniugowanego z fosfatazą alkaliczną w rozcieńczeniu 1:500. Drugą membranę inkubowano z mysim przeciwciałem poliklonalnym przeciwko toksynie B z C. difficile, roztwór o stężeniu 1 mg/ml rozcieńczono 1:500 0,2% roztworem kazeiny w TBS. Jako drugorzędowego przeciwciała użyto koziego anty mysiego IgG skoniugowanego z fosfatazą alkaliczną w rozcieńczeniu 1:500. Jako substratów używano roztworów BCIP/NBT. Zebraną frakcję zawierającą glikokoniugat zagęszczono na koncentratorach Vivaspin 30 kDa (Millipore) do stężenia mg/ml w oparciu o pomiar zawartości białka (spektrofotometryczny, przy dł. fali 280 nm). Do konserwacji roztworu koniugatu użyto roztworu mertiolatu o końcowym stężeniu 0.02%. Roztwór koniugatu jest przechowywany w lodówce w 4°C.The R1ZW-TBd conjugate was prepared using a reductive amination reaction, 4.2 mg of purified R1ZW (ZWT) was dissolved in 0.1M sodium acetate pH = 5.5 at a concentration of 10 mg / ml and oxidized in the dark in 10 mM sodium periodate for 1 h ( 3), under such conditions, the vicinal hydroxyl groups on heptoses and Kdo are oxidized to aldehydes. The oligosaccharide was then purified by SEC in water chromatography on a G3000 PW bed column. The eluent was monitored with a flow refractometer and the obtained fractions analyzed by mass spectrometry for the presence of oligosaccharides. The oligosaccharide fractions were pooled and lyophilized. 3.5 mg of oxidized oligosaccharide was obtained. Oxidized oligosaccharide R1ZW (3.5 mg) was then dissolved in 260 µl of TBd protein solution (1.5 mg) in 0.2 M borate buffer (pH = 9.0), incubated for 1 h at 37 ° C, 40 µl of 1M sodium cyanoborohydride solution (reagent ALD, Sterogene, USA) and a drop of chloroform. The reaction was carried out at 37 ° C for 12 days without stirring. On days 5 and 10 of the reaction additional 22 µl ALD were added. After completion of the reaction, the mixture was purified by SECHPLC on a G3000 SW column (2.5 x 30 cm) (Tosoh Bioscience, Japan) equilibrated in PBS buffer. The injection size was 1 ml, the flow rate was 6 ml / min and the volume of the collected fractions was 3 ml. Conjugate fractions were immunochemically monitored for reaction with specific anti-R1ZW and anti-CdTB antibodies and hence for the presence of the C. difficile sugar ZWR1 toxin B protein antigen by means of a dot-blot assay. 3x 0.7 µl of the solution from each analyzed fraction was applied to two nitrocellulose membranes. Membranes were blocked in 0.2% casein solution in TBS, then, for the detection of the sugar antigen, one membrane was incubated with rabbit serum obtained by immunization with the E. coli R1 core oligosaccharide conjugate with OSR1TTd tetanus toxoid at a dilution of 1: 150. Serum was diluted with 0.2% casein in TBS. A goat anti-rabbit IgG conjugated to alkaline phosphatase at a dilution of 1: 500 was used as the secondary antibody. The second membrane was incubated with mouse C. difficile toxin B polyclonal antibody, the 1 mg / ml solution was diluted 1: 500 with 0.2% casein solution in TBS. A 1: 500 dilution of goat anti-mouse IgG conjugated to alkaline phosphatase was used as the secondary antibody. BCIP / NBT solutions were used as substrates. The collected fraction containing the glycoconjugate was concentrated on 30 kDa Vivaspin concentrators (Millipore) to a concentration of mg / ml based on the measurement of protein content (spectrophotometric, at 280 nm). A mthiolate solution with a final concentration of 0.02% was used to preserve the conjugate solution. The conjugate solution is stored in a refrigerator at 4 ° C.

Immunizacja zwierząt i preparacja surowic odpornościowychAnimal immunization and preparation of immune sera

3-miesięczne samice królików rasy baran francuski szczepiono podskórnie w okolice karku, 5-6 punktów podania. Cykl szczepień obejmował trójkrotną immunizację w odstępach 3 tygodni. Przed rozpoczęciem cyklu szczepień pobierano surowicę kontrolną. 14 dni po ostatniej immunizacji króliki poddawano procedurze całkowitego skrwawiania. Krew zbierano do probówek o obj. 10 ml (probówki PMMA z granulatem i akceleratorem koagulacji, FL Medical, Włochy) i pozostawiano (bez mieszania/wytrząsania) do wykrzepienia przez noc, w temperaturze 20°C. Po wykrzepieniu krwi, surowice oddzielano od skrzepu poprzez wirowanie (1500 x g, 15 min. 4°C, Beckman J-2MC, rotor JS-7.5). Otrzymane surowice inkubowano bez mieszania przez 30 min. w temperaturze 56°C w celu inaktywacji białek układu dopełniacza. Surowice porcjowano i przechowywano w temperaturze - 20°C.3-month-old female French ram rabbits were vaccinated subcutaneously at the nape of the neck at 5-6 points of administration. The vaccination course included triple immunizations at 3-week intervals. A control serum was collected prior to the start of the vaccination cycle. 14 days after the last immunization, the rabbits were subjected to the total bleeding procedure. The blood was collected in test tubes with a volume of 10 ml (PMMA tubes with granules and coagulation accelerator, FL Medical, Italy) and allowed (without stirring / shaking) to clot overnight at 20 ° C. After blood clotting, sera were separated from the clot by centrifugation (1500 x g, 15 min. 4 ° C, Beckman J-2MC, JS-7.5 rotor). The obtained sera were incubated without agitation for 30 min. at 56 ° C to inactivate proteins of the complement system. Sera were aliquoted and stored at -20 ° C.

PL 229 194 B1PL 229 194 B1

Przygotowanie formulacji szczepionkiPreparation of a vaccine formulation

Bezpośrednio przed immunizacją królików sporządzano szczepionkę, która zawierała dla: R1ZW-dTT:Immediately prior to immunization, rabbits were prepared a vaccine containing for: R1ZW-dTT:

• 40 pg of the antygenu, (glikokoniugatu) (objętość zależna od stężenia antygenu), • 80 pl of the MPLA adiuwant (1 mg/ml in skwalen/lecytyna/Tween-80/PBS • PBS, pH=7,3 do objętości 320 pL dla : R1ZW-RdTCdB:• 40 pg of the antigen, (glycoconjugate) (volume dependent on antigen concentration), • 80 pl of the MPLA adjuvant (1 mg / ml in squalene / lecithin / Tween-80 / PBS • PBS, pH = 7.3 to volume 320 pL for: R1ZW-RdTCdB:

• 60 pg antygenu, (glikokoniugatu) (objętość zależna od stężenia antygenu), • 80 pl adiuwantu MPLA (1 mg/ml in squalen/1 ecitine/Tween-80/PBS • PBS, pH=7,3 do objętości 320 pL.• 60 µg of antigen, (glycoconjugate) (volume dependent on antigen concentration), • 80 µl of MPLA adjuvant (1 mg / ml in squalen / 1 ecitine / Tween-80 / PBS • PBS, pH = 7.3 to a volume of 320 µL.

Mieszaninę, bezpośrednio przed immunizacją, homogenizowano ultradźwiękami na lodzie (5-krotnie po 5 sek., 10 sek. przerwy między etapami sonikacji moc: 70 Weff) stosując sondę ultradźwiękową (homogenizator ultradźwiękowy Sonoplus, Bandelin, Niemcy).The mixture, immediately before immunization, was ultrasonically homogenized on ice (5 times 5 sec., 10 sec. Pause between sonication steps, power: 70 Weff) using an ultrasonic probe (Sonoplus ultrasonic homogenizer, Bandelin, Germany).

Przygotowanie adiuwantu - monofosforylowanei pochodnej lipidu A Hafnia alvei (MPLA)Adjuvant preparation - monophosphorylated and lipid A derivative Hafnia alvei (MPLA)

Adiuwant MPLA otrzymano z lipidu A H. alvei PCM 1200. W celu otrzymania MPLA, lipid A (200 mg) zawieszono w 20 ml 0,1 M HCl, a następnie przeprowadzono reakcję hydrolizy w 100°C przez 15 min. Po reakcji mieszaninę zliofilizowano. Formulację adiuwantu otrzymano wg metody Baldridge i Crane (Methods, 1999, 19:103-7). Przygotowano 12% roztwór lecytyny w skwalenie oraz 0,5% roztwór detergentu Tween 80 w buforze PBS. 10 mg MPLA zawieszano w 1 ml 12% mieszaniny skwalenu w lecytynie w 65°C na łaźni ultradźwiękowej Bandelin RK10H przez 2 godziny - do rozpuszczenia próbki, a następnie 0,5 ml otrzymanej zawiesiny zmieszano z 4,5 ml 0,5% roztworu detergentu Tween 80 w PBS. Otrzymaną mieszaninę sonikowano sondą ultradźwiękową, chłodząc mieszaninę na lodzie. Tak przygotowaną formulację adiuwantu zawierającą 1 mg/ml MPLA stosowano do przygotowania szczepionek.MPLA adjuvant was obtained from lipid A H. alvei PCM 1200. To obtain MPLA, lipid A (200 mg) was suspended in 20 ml 0.1 M HCl, followed by a hydrolysis reaction at 100 ° C for 15 min. After the reaction, the mixture was freeze-dried. The adjuvant formulation was obtained according to the method of Baldridge and Crane (Methods, 1999, 19: 103-7). A 12% solution of lecithin in squalene and a 0.5% solution of Tween 80 detergent in PBS buffer were prepared. 10 mg of MPLA was suspended in 1 ml of a 12% mixture of squalene in lecithin at 65 ° C in an ultrasonic bath Bandelin RK10H for 2 hours - until the sample was dissolved, then 0.5 ml of the obtained suspension was mixed with 4.5 ml of a 0.5% detergent solution Tween 80 in PBS. The resulting mixture was sonicated with an ultrasonic probe while cooling the mixture on ice. The thus prepared adjuvant formulation containing 1 mg / ml MPLA was used for the preparation of vaccines.

P r z y k ł a d 2P r z k ł a d 2

Surowicę skierowaną przeciwko koniugatowi R1ZW-TBd (Cd) (Fig. 7) przebadano z 32 lipopolisacharydami: Escherichia coli R1, R2, R3, R4, K-12, Shigella flexneri 3A, Shigella sonnei fazy II, Salmonella Ra, S. sonnei fazy I, Escherichia coli O6, O18, O39, O10, O100, O111, O86, Klebsiella pneumoniae O1, O2a, O3, O4, O5, Plesiomonas shigelloides O17, O51, Proteus penneri 12, Proteus vulgaris 9/57, Proteus mirabilis O28, Citrobacter O16, Hafnia alvei 1209, H. alvei 1190, Salmonella enterica, Shigella flexneri VI, Bordetella pertussis 186. Immunobloting poprzedzono rozdziałam elektroforetycznym z żelu poliakryloamidowym, w warunkach denaturujących.Serum against R1ZW-TBd conjugate (Cd) (Fig. 7) was tested with 32 lipopolysaccharides: Escherichia coli R1, R2, R3, R4, K-12, Shigella flexneri 3A, Shigella sonnei phase II, Salmonella Ra, S. sonnei phase I, Escherichia coli O6, O18, O39, O10, O100, O111, O86, Klebsiella pneumoniae O1, O2a, O3, O4, O5, Plesiomonas shigelloides O17, O51, Proteus penneri 12, Proteus vulgaris 9/57, Proteus mirabilis O28, Citrobacter O16, Hafnia alvei 1209, H. alvei 1190, Salmonella enterica, Shigella flexneri VI, Bordetella pertussis 186. Immunobloting was preceded by electrophoretic separation with polyacrylamide gel under denaturing conditions.

Dla surowicy anty-R1ZW-TBd (Cd) obserwowano silne reakcje krzyżowe dla szybko wędrujących frakcji rdzeniowych dla LPS Escherichia coli R1, S. sonnei fazy II i I, Escherichia coli O6, O18, O39, Bordetella, pertussis 186 oraz dla LPS Klebsiella pneumoniae O5 dla wolno wędrujących frakcji łańcuchów O-swoistych. Surowica słabiej reagowała z LPS Klebsiella pneumoniae O1, O2a, O23, O4, P. shigelloides 017, 051, P. mirabilis O28, Citrobacter O16, H. alvei 1209, 1190, S. flexneri VI. Wyniki zebrano w Tabeli 2.For anti-R1ZW-TBd (Cd) serum, strong cross-reactions were observed for fast-migrating core fractions for LPS Escherichia coli R1, S. sonnei phase II and I, Escherichia coli O6, O18, O39, Bordetella, pertussis 186 and for LPS Klebsiella pneumoniae O5 for the slowly moving fraction of O-specific chains. The serum reacted less well with LPS Klebsiella pneumoniae O1, O2a, O23, O4, P. shigelloides 017, 051, P. mirabilis O28, Citrobacter O16, H. alvei 1209, 1190, S. flexneri VI. The results are summarized in Table 2.

PL229 194B1PL229 194B1

Tabela 2. Tabela reaktywności surowicy R1ZW-TBd (Cd), anty-R1ZW-TTd i anty-R1-TTd z LPSTable 2. Table of R1ZW-TBd (Cd), anti-R1ZW-TTd and anti-R1-TTd serum reactivity with LPS

Bakterie Bacteria Reaktywność surowicy RlZW-TBd RlZW-TBd serum reactivity Reaktywność surowicy RlZW-TTd RlZW-TTd serum reactivity Reaktywność surowicy Rl-TTd Serum reactivity Rl-TTd E.coli R1 E. coli R1 ₊₊₊₊₊₊ -F++ -F ++ -++ - ++ E.C0//R2 E.C0 // R2 + + E.coli R3 E. coli R3 +++ +++ E.coli R4 E. coli R4 E.coli K-12 E.coli K-12 S. flexneri 3a S. flexneri 3a + + S. sonnei fazy II S. sonnei phase II +++ +++ -++ - ++ +++ +++ Salmonella Ra Salmonella Ra S. sonnei fazy 1 S. sonnei phase 1 +++ +++ ) ) E.coli 06 E. coli 06 ++ ++ + + E.coli 018 E. coli 018 +++ +++ +++ +++ -I-++ -I - ++ E.coli 039 E. coli 039 +++ +++ -++ - ++ +++ +++ E.coli 010 E. coli 010 E.coli 0100 E.coli 0100 E.coli 0111 E.coli 0111 + + E.coli 086 E. coli 086 K. pneuminlae Ol K. pneuminlae Ol + + K. pneuminiae 02a K. pneuminiae 02a + + K. pneuminiae 03 K. pneuminiae 03 + + 1' (silna reakcja w antygenie 0) 1 ' (strong reaction to antigen 0) K. pneuminiae 04 K. pneuminiae 04 + + K. pneuminiae 05 K. pneuminiae 05 +++ +++ P. shigeiioides 017 P. shigeiioides 017 + + P. shigeiioides 051 P. shigeiioides 051 + + p. penneri 12 p. penneri 12 P. vulgaris 9/57 P. vulgaris 9/57 P. mirabiiis 028 P. mirabiiis 028 + + Citrobacter 016 Citrobacter 016 ++ ++ H. alvei 1209 H. alvei 1209 + + H. alvei 1190 H. alvei 1190 ++ ++ Salmonella enterica Salmonella enterica + + S. ftexneri VI S. ftexneri VI + + + + ++ ++ 8, pertussis 186 8, pertussis 186 +++ +++

Na uwagę zasługuje brak reakcji surowic anty-R1-TTd i anty-R1ZW-TTd z lipopolisacharydem Bordetella pertussis 186 (Fig. 8) podczas gdy surowica indukowana koniugatem R1ZW-TBd reagowała silnie z lipopolisacharydem Bordetella pertussis 186. Wszystkie surowice anty R1ZW-TBd reagowały z toksyną B Clostridium difficile.Noteworthy is the lack of reaction of anti-R1-TTd and anti-R1ZW-TTd sera with Bordetella pertussis 186 lipopolysaccharide (Fig. 8), while the serum induced with R1ZW-TBd conjugate reacted strongly with Bordetella pertussis 186 lipopolysaccharide. All anti R1ZW-TBd sera reacted strongly. with Clostridium difficile toxin B.

Bakteriobójcze działanie surowicy anty-R1ZW-TBd sprawdzono dla następujących bakterii: Klebsiella pneumoniae 05, Escherichia coli 018, Escherichia coli 039, Escherichia coli R1 oraz Bordetella pertussis 186 (Tabela 3). Dla wszystkich surowic badano rozcieńczenia dla 1:2 do 1:2048 z wyjątkiem Bordetella pertussis - testy do rozcieńczenia surowicy 1:400. Wszystkie testy przeprowadzono dwukrotnie, dane liczbowe: średnia liczba kolonii na płytkach.The bactericidal activity of anti-R1ZW-TBd serum was verified for the following bacteria: Klebsiella pneumoniae 05, Escherichia coli 018, Escherichia coli 039, Escherichia coli R1 and Bordetella pertussis 186 (Table 3). For all sera, dilutions from 1: 2 to 1: 2048 were tested with the exception of Bordetella pertussis - tests to dilute the serum 1: 400. All tests were run in duplicate, figures: mean number of colonies on the plates.

Surowica anty-R1ZW-TBd wykazała właściwości bakteriobójcze wobec bakterii Klebsiella pneumoniae 05 przy rozcieńczeniu 1:8.The anti-R1ZW-TBd serum showed bactericidal properties against Klebsiella pneumoniae 05 at a dilution of 1: 8.

W przypadku bakterii Escherichia coli R1 surowica anty-R1ZW-TBd wykazała właściwości bakteriobójcze do rozcieńczenia 1:2048.In the case of Escherichia coli R1 bacteria, the anti-R1ZW-TBd serum showed bactericidal properties up to a dilution of 1: 2048.

PL229 194B1PL229 194B1

Tabela 3Table 3

Bakteria Bacteria K- K- K+ K + Miano bakteriobójczości Bactericidal titer E. coli Rl* E. coli R1 * 90.5 90.5 24 24 1:2048, w tym stężeniu zabitych 52 % bakterii 1: 2048, at this concentration of 52% of bacteria killed E. coli 039 E. coli 039 133 133 0,5 0.5 W przypadku bakterii E. coli 039 nie obserwowano wzrostu bakterii nawet w przypadku próby kontrolnej (same bakterie z komplementem) - bakteriobójcze działanie komplementu. In the case of E. coli 039 bacteria, no bacterial growth was observed even in the control sample (only bacteria with the compliment) - the bactericidal effect of the compliment. E. coli 018 E. coli 018 156 156 77,5 77.5 Do rozcieńczenia surowicy 1:2 w przypadku E. coli 018 nie obserwowano właściwości bakteriobójczych surowicy anty-RlZW-RdTCdB No bactericidal properties of anti-RlV-RdTCdB serum were observed for E. coli 018 dilution of serum 1: 2 K. pneumoniae 05 K. pneumoniae 05 96.5 96.5 83,5 83.5 1:8, w tym stężeniu zabitych 51% bakterii 1: 8, at this concentration 51% of bacteria killed B. pertussis B. pertussis 1904 1904 964 964 1:200, w tym stężeniu zabitych 58% bakterii 1: 200, at this concentration 58% of bacteria killed

K+ - kontrola: surowica królika nieimmunizowanego z komplementem, średnia liczba kolonii na płytkachK + - control: serum from unimmunized rabbit with complement, mean number of colonies on the plates

K- - surowica królika nieimmunizowanego bez komplementu * - test wykonany z użyciem płodowego komplementu cielęcego (źródło Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, Katedra Immunologii Weterynaryjnej (prof. Tadeusz Stefaniak). Ze względu na ograniczoną ilość otrzymanego płodowego komplementu cielęcego wykonano testy bakteriobójczości wyłącznie na bakteriach Escherichia coli R1.K- - unimmunized rabbit serum without compliment * - test performed with the use of fetal calf complement (source: Wrocław University of Environmental and Life Sciences, Department of Veterinary Immunology (Prof. Tadeusz Stefaniak) Due to the limited amount of fetal calf complement obtained, bactericidal tests were performed only on Escherichia bacteria coli R1.

Claims

1. A neoglycoconjugate consisting of a carrier protein containing the C-terminal fragment of Clostriudium difficile toxin B containing 517 aa from residue 1850-2366, and at least one Escherichia coli R1 LOS core oligosaccharide.

2. The neoglycoconjugate according to claim 1 The process of claim 1, wherein the oligosaccharide has a free amino group (α-GlcN) and a free carboxyl group (α-Kdo).

3. The neoglycoconjugate according to claim 1, The method of claim 1, wherein the Escherichia coli R1 LOS oligosaccharide has the structure of formula 1.

4. The neoglycoconjugate of claim 1, The method of claim 1, wherein the protein carrier has the amino acid sequence of SEQ ID NO. 1.

5. A pharmaceutical composition comprising a neoglycoconjugate as defined in claim 1, 1-4 and a pharmaceutically acceptable carrier and / or adjuvant.

6. A vaccine containing a pharmaceutical composition as defined in claim 1 5.

7. A pharmaceutical composition as defined in claim 1 5 for the treatment, prevention and diagnosis of infections caused by gram-negative and gram-positive bacteria.

8. The pharmaceutical composition for use according to claim 1 The method of claim 7, wherein the bacteria are Bordetella pertussis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Shigella spp., Clostridium difficile.

9. An antibody generated by a composition as defined in claim 1; 5.

10. A diagnostic kit for the detection of infections caused by Bordetella pertussis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Shigella spp., Clostridium difficile comprising an antibody according to claim 1. 9.