RU2818894C1 - C-polysaccharide-free capsular polysaccharides of streptococcus pneumoniae with a 2,5-anhydromanose residue at the reducing end - Google Patents
C-polysaccharide-free capsular polysaccharides of streptococcus pneumoniae with a 2,5-anhydromanose residue at the reducing end Download PDFInfo
- Publication number
- RU2818894C1 RU2818894C1 RU2023123917A RU2023123917A RU2818894C1 RU 2818894 C1 RU2818894 C1 RU 2818894C1 RU 2023123917 A RU2023123917 A RU 2023123917A RU 2023123917 A RU2023123917 A RU 2023123917A RU 2818894 C1 RU2818894 C1 RU 2818894C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pneumoniae
- cps
- kps
- polysaccharide
- residue
- Prior art date
Links
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 70
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 58
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 57
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 title abstract description 29
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 title abstract description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 claims abstract description 15
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 claims description 30
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 21
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 20
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 20
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 16
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 16
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 13
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 13
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 claims description 12
- LKAPTZKZHMOIRE-KVTDHHQDSA-N (2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolane-2-carbaldehyde Chemical group OC[C@H]1O[C@H](C=O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKAPTZKZHMOIRE-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 11
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 11
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M potassium hydroxide Substances [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 7
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- -1 tetanus toxoid Proteins 0.000 claims description 6
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 5
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 5
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 claims description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 4
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 claims description 4
- 108010031071 cholera toxoid Proteins 0.000 claims description 2
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 17
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 28
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 27
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 26
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- FOCGWLUKTRKABV-XBXARRHUSA-N 1-[2-oxo-2-[4-[(e)-3-phenylprop-2-enyl]piperazin-1-yl]ethyl]pyrrolidin-2-one Chemical compound C1CN(C\C=C\C=2C=CC=CC=2)CCN1C(=O)CN1CCCC1=O FOCGWLUKTRKABV-XBXARRHUSA-N 0.000 description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 16
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 14
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 11
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 11
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- MNLRQHMNZILYPY-MKFCKLDKSA-N N-acetyl-D-muramic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1NC(C)=O MNLRQHMNZILYPY-MKFCKLDKSA-N 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 5
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 4
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N glucosamine group Chemical group OC1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 4
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- LKAPTZKZHMOIRE-UHFFFAOYSA-N chitose Natural products OCC1OC(C=O)C(O)C1O LKAPTZKZHMOIRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 238000011197 physicochemical method Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 3
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 3
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical group N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002358 autolytic effect Effects 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical group C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229940031960 pneumococcal polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229960001973 pneumococcal vaccines Drugs 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- YGOAYNVRTAEAAI-GKZUZGRISA-N (2R)-2-[(3R,4R,5S,6R)-2-acetyl-3-amino-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxypropanoic acid Chemical compound C(C)(=O)C1(O)[C@H](N)[C@@H](O[C@@H](C(=O)O)C)[C@H](O)[C@H](O1)CO YGOAYNVRTAEAAI-GKZUZGRISA-N 0.000 description 1
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 1
- IMGXDCAOBSTOQJ-CFTXMQDWSA-N (3R,4R,5R,6R)-3-amino-6-(hydroxymethyl)oxane-2,4,5-triol (2R,3R,4R,5R)-2-amino-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound O=C[C@H](N)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO.N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O IMGXDCAOBSTOQJ-CFTXMQDWSA-N 0.000 description 1
- IMGXDCAOBSTOQJ-DOACPYJISA-N (3R,4R,5S,6R)-3-amino-6-(hydroxymethyl)oxane-2,4,5-triol (2R,3R,4S,5R)-2-amino-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound O=C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O IMGXDCAOBSTOQJ-DOACPYJISA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N Glc-NH2 Natural products O=CC(N)C(O)C(O)C(O)CO FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- AEFLONBTGZFSGQ-VKHMYHEASA-N L-isoglutamine Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AEFLONBTGZFSGQ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical group C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 108030005277 Peptidoglycan-N-acetylglucosamine deacetylases Proteins 0.000 description 1
- 208000035109 Pneumococcal Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 101000980463 Treponema pallidum (strain Nichols) Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical class [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQMLFJWIKARBFW-BKKMTDGVSA-N evomonoside Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C[C@@H](CC[C@H]2[C@]3(CC[C@@H]([C@@]3(C)CC[C@H]32)C=2COC(=O)C=2)O)[C@]3(C)CC1 WQMLFJWIKARBFW-BKKMTDGVSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical group CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZADHKSJXSZBQFB-HHHXNRCGSA-N lipid fragment Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCC[C@@H](C)CCCCCCCC(C)C ZADHKSJXSZBQFB-HHHXNRCGSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 101150035723 pgdA gene Proteins 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 125000002525 phosphocholine group Chemical group OP(=O)(OCC[N+](C)(C)C)O* 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical group 0.000 description 1
- 229940033515 pneumovax 23 Drugs 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000011118 potassium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 239000011251 protective drug Substances 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000008684 selective degradation Effects 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техникиField of technology
Изобретение относится к медицине, а именно к новым соединениям, представляющим собой модифицированные капсульные полисахариды S. pneumoniae, перспективным для получения вакцинных препаратов для профилактики пневмококковой инфекции.The invention relates to medicine, namely to new compounds, which are modified capsular polysaccharides of S. pneumoniae , promising for the production of vaccine preparations for the prevention of pneumococcal infection.
Уровень техникиState of the art
Одним из главных возбудителей инфекционных вспышек пневмонии, менингита и безочаговой бактериемии является грамположительный микроорганизм Streptococcus pneumoniae, для которого характерна высокая контагиозность, бессимптомное носительство, причем нескольких серотипов одновременно. В 2016 году из 336 млн. зарегистрированных в мире случаев респираторных заболеваний нижних дыхательных путей 197 млн. пришлось на S. pneumonia (1,2 млн. летальных исходов). В наибольшей степени подвержены этому заболеванию дети до 5 лет и представители возрастной когорты 70+ [1]. Ежегодно в Российской Федерации регистрируется 500000 эпизодов заболевания пневмонией, и у 76% взрослых и 90% детей до 5 лет возбудителем инфекции является S. pneumoniae. При этом смертность от пневмонии в 2013 году составила 26,7 случаев на 100000 человек (51,7% всех летальных исходов от респираторных заболеваний) [2]. Наиболее эффективным средством противодействия распространению S. pneumoniae является вакцинопрофилактика, так как многие циркулирующие и вновь появляющиеся штаммы обладают устойчивостью к антибиотикам. One of the main causative agents of infectious outbreaks of pneumonia, meningitis and nonfocal bacteremia is the gram-positive microorganism Streptococcus pneumoniae , which is characterized by high contagiousness, asymptomatic carriage, and several serotypes at the same time. In 2016, of the 336 million registered cases of lower respiratory tract respiratory diseases worldwide, 197 million were due to S. pneumonia (1.2 million deaths). Children under 5 years of age and representatives of the 70+ age cohort are most susceptible to this disease [1] . Every year in the Russian Federation, 500,000 episodes of pneumonia are recorded, and in 76% of adults and 90% of children under 5 years of age, the causative agent of the infection is S. pneumoniae . At the same time, mortality from pneumonia in 2013 was 26.7 cases per 100,000 people (51.7% of all deaths from respiratory diseases) [2]. The most effective means of preventing the spread of S. pneumoniae is vaccination, since many circulating and newly emerging strains are resistant to antibiotics .
Современный этап разработки вакцин против S. pneumoniae характеризуется признанием того, что в качестве непременных компонентов протективного препарата должны выступать уникальные по химической структуре капсульные полисахариды (КПС) S. pneumoniae. The current stage of development of vaccines against S. pneumoniae is characterized by the recognition that capsular polysaccharides (CPS) of S. pneumoniae, unique in their chemical structure, should act as essential components of a protective drug.
Капсульные полисахариды бактерий (КПС), образуя плотную оболочку вокруг клетки, играют, главным образом, защитную роль во взаимодействии микроорганизма с окружающей средой, в частности, с организмом хозяина. В случае S. pneumoniae, КПС не только формируют защитную капсулу вокруг бактериальной клетки, но и являются основным фактором вирулентности, определяют серологическую специфичность каждого из более чем 100 известных к настоящему времени серотипов S. pneumonia и при введении в макроорганизм индуцируют образование протективных антител. Циркуляция в человеческой популяции значительного числа серотипов S. pneumonia заставляет при разработке вакцины не только анализировать и учитывать вклад каждого серотипа в эпидемиологическую ситуацию в географическом регионе в данное время, но принимать во внимание динамику изменений этой ситуации, связанную с проведением массовой вакцинопрофилактики. При этом часто наблюдается заметное снижение в циркулирующей популяции S. pneumonia штаммов, КПС которых, выделяемые из надклеточной жидкости после культивирования и лизиса бактериальных клеток (далее обозначаемые как п-КПС, т.е. природные КПС, выделяемые для получения вакцин), входят в состав применяемых вакцин, при одновременном повышении вклада в эпидемиологическую ситуацию штаммов S. pneumonia не «вакцинных» серотипов. Отмечается также появление новых серотипов, связанное с генетически обусловленной постполимеризационной модификацией полисахаридной цепи КПС (О-ацетилирование, гликозилирование), что помогает пневмококку избегать воздействия защитных механизмов организма хозяина. Таким образом, чем большее число п-КПС эпидемически важных (для данной территории в данное время) серотипов входит в вакцинную композицию, тем эффективнее ее протективное действие. В настоящее время широко используется вакцина PNEUMOVAX 23 (Merck Sharp & Dohme, США), в состав которой входит 23 КПС, выделенных из эпидемически важных для США серотипов S. pneumoniae (эффективность от 56 до 81%). Bacterial capsular polysaccharides (CPS), forming a dense shell around the cell, play a mainly protective role in the interaction of the microorganism with the environment, in particular with the host organism. In the case of S. pneumoniae, CPS not only form a protective capsule around the bacterial cell, but are also the main virulence factor, determine the serological specificity of each of the more than 100 currently known serotypes of S. pneumonia and, when introduced into the macroorganism, induce the formation of protective antibodies . The circulation of a significant number of S. pneumonia serotypes in the human population forces, when developing a vaccine, not only to analyze and take into account the contribution of each serotype to the epidemiological situation in the geographic region at a given time, but to take into account the dynamics of changes in this situation associated with mass vaccine prevention. In this case, a noticeable decrease in the circulating population of S. pneumonia strains is often observed, the CPS of which, isolated from the supracellular fluid after cultivation and lysis of bacterial cells (hereinafter referred to as p-CPS, i.e. natural CPS isolated for the production of vaccines), are included in the composition of the vaccines used, while simultaneously increasing the contribution to the epidemiological situation of S. pneumonia strains of non-vaccine serotypes. The emergence of new serotypes is also noted , associated with a genetically determined post-polymerization modification of the polysaccharide chain of the CPS (O-acetylation, glycosylation), which helps the pneumococcus to avoid the effects of the host’s defense mechanisms. Thus, the greater the number of p-KPS serotypes of epidemic importance (for a given territory at a given time) is included in the vaccine composition, the more effective its protective effect. Currently, the vaccine PNEUMOVAX 23 (Merck Sharp & Dohme, USA), which includes 23 CPS isolated from epidemically important S. pneumoniae serotypes for the USA, is widely used (efficacy from 56 to 81%).
Чрезвычайно высокомолекулярные КПС всех серотипов S. pneumonia (от 500-900 до 1000 кДа) построены из различающихся по структуре повторяющихся олигосахаридных звеньев, в состав которых входит от 2 до 7 моносахаридных остатков, а также не углеводные фрагменты - О-ацетильные и фосфатные группы, остатки глицерина и пировиноградной кислоты. Моносахарид, расположенный на восстанавливающем конце этого биополимера, присоединен гликозидной связью непосредственно к пептидогликану (ПГ) клеточной стенки [3], в то время как в большинстве изученных грамположительных микроорганизмов связь между полисахаридной цепью и ПГ осуществляется через фосфодиэфирный остаток.Extremely high-molecular CPS of all S. pneumonia serotypes (from 500-900 to 1000 kDa) are built from repeating oligosaccharide units that differ in structure, which include from 2 to 7 monosaccharide residues, as well as non-carbohydrate fragments - O-acetyl and phosphate groups, residues of glycerol and pyruvic acid. The monosaccharide located at the reducing end of this biopolymer is attached by a glycosidic bond directly to the peptidoglycan (PG) of the cell wall [3], while in most studied gram-positive microorganisms the connection between the polysaccharide chain and PG is through a phosphodiester residue.
ПГ, в свою очередь, представляет собой прочную замкнутую пространственно «сшитую» структуру в виде так называемого «муреинового мешка», которая обеспечивает механическую и биологическую сохранность внутренних органелл бактериальной клетки. В основе ПГ лежит полисахарид, построенный из дисахаридных повторяющихся звеньев, включающих остаток N-ацетил-D-глюкозамина и N-ацетил-D-мурамовой кислоты (N-ацетил-D-глюкозамина, к которому простой эфирной связью присоединен остаток молочной кислоты). Дисахаридные звенья соединены β-1,4-гликозидными связями, а поперечные связи («сшивки») между полисахаридными цепями осуществляются за счет пептидных мостиков, образующихся между карбоксильными группами остатков N-ацетил-D-мурамовой кислоты соседних полисахаридных цепей. В случае S. pneumonia в состав мостика входят остатки L- и D-аланина, L-изоглутамина и L-лизина. На внешней поверхности «муреинового мешка» расположена липид-содержащая наружная мембрана, в которую «заякорены» соматические антигены белковой и полисахаридной природы, имеющие терминальный, обычно липидный, гидрофобный фрагмент («якорь»). PG, in turn, is a strong closed spatially “cross-linked” structure in the form of a so-called “murein sac”, which ensures the mechanical and biological safety of the internal organelles of the bacterial cell. PG is based on a polysaccharide, built from disaccharide repeating units, including an N-acetyl-D-glucosamine residue and N-acetyl-D-muramic acid (N-acetyl-D-glucosamine, to which a lactic acid residue is attached by an ether bond). Disaccharide units are connected by β-1,4-glycosidic bonds, and cross-links (“crosslinks”) between polysaccharide chains are carried out due to peptide bridges formed between the carboxyl groups of N-acetyl-D-muramic acid residues of neighboring polysaccharide chains. In the case of S. pneumonia , the bridge contains residues of L- and D-alanine, L-isoglutamine and L-lysine. On the outer surface of the “murein sac” there is a lipid-containing outer membrane into which somatic antigens of protein and polysaccharide nature are “anchored”, having a terminal, usually lipid, hydrophobic fragment (“anchor”).
Наряду с КПС, который присоединяется к ПГ в положение 6 остатков N-ацетил-D-глюкозамина [4], на внешней поверхности бактерий S. pneumonia локализованы другие полимерные молекулы полисахаридной природы, являющиеся одинаковыми (т.е. общими) для S. pneumonia всех серотипов - общие полисахаридные антигены пневмококков (ОПАП). Часть этих биополимеров, имея от 2 до 8 повторяющихся олигосахаридных звеньев и липидный фрагментна восстанавливающем конце, «заякорена» во внешнюю липид-содержащую мембрану бактериальной клетки (F-антиген), тогда как другая часть ОПАП восстанавливающим концом присоединяется ковалентной связью к ПГ клеточной стенки (С-полисахарид, С-ПС) [5]. Строение полисахаридной области обоих антигенов идентично, различен лишь способ их локализации на внешней поверхности бактериальной клетки.Along with KPS, which attaches to PG at position 6 of N-acetyl-D-glucosamine residues [4], on the outer surface of bacteriaS. pneumoniaother polymer molecules of a polysaccharide nature are localized, which are the same (i.e. common) forS. pneumoniaall serotypes - common polysaccharide antigens of pneumococci (CPAP). Some of these biopolymers, having from 2 to 8 repeating oligosaccharide units and a lipid fragment at the reducing end, are “anchored” in the outer lipid-containing membrane of the bacterial cell (F-antigen), while the other part of the OPAP with the reducing end is attached by a covalent bond to the PG of the cell wall ( S-polysaccharide, S-PS) [5]. The structure of the polysaccharide region of both antigens is identical, only the method of their localization on the outer surface of the bacterial cell is different.
При получении вакцин против S. pneumonia п-КПС обычно выделяют из надклеточной жидкости после культивирования S. pneumonia и удаления клеточной массы центрифугированием. Надклеточную жидкость концентрируют, и низкомолекулярный водорастворимый F-антиген, который наряду с п-КПС содержится в надклеточной жидкости, отделяют физико-химическими методами, а С-ПС при этом теоретически должен оставаться связанным с ПГ клеточной стенки и отделяться при очистке п-КПС от ПГ. Однако при использовании различных методов очистки практически все препараты п-КПС, использующиеся для приготовления вакцин, включая конъюгированные, содержат заметное количество F-антигена и/или С-ПС. Эти полисахаридные молекулы обладают высокой иммуногенностью, однако образующиеся против них антитела не обладают защитным действием против S. pneumonia (Nielsen, Sorensen, & Henrichsen, 1993). Поэтому очистка п-КПС от указанных выше примесей остается важной проблемой, которая до настоящего времени не находила решения. Молекулярная масса п-КПС на порядки выше, чем молекулярная масса ОПАП, однако применение традиционных методов разделения полимерных молекул (различные виды гель-хроматографии, ультрафильтрация с предварительной обработкой ультразвуком, использование детергентов) для удаления примеси ОПАП не приводит к успеху. Количество примесного ОПАП в п-КПС вакцинного качества составляет от 5-7 до 15-18%, и это необходимо учитывать при производстве вакцин против S. pneumoniae, так как доза вакцинного п-КПС в препарате должна быть стандартной вне зависимости от содержания примеси ОПАП. Это существенно усложняет производство вакцин, в связи, с чем разработка методов выделения и очистки п-КПС S. pneumonia от F-антигена является важной задачей не только при создании полисахаридных, но и конъюгированных вакцинных препаратов на их основе. Недавно проведенные исследования показали, что очистка п-КПС от примеси ОПАП возможна с использованием реакции дезаминирования [6], в которую вовлекаются только соединения со свободной аминогруппой [7]. Мишень дезаминирования - остаток 4-амино-2,4,6-тридезоксигалактозы, который входит в состав ОПАП и, как показано авторами исследования, разрушается в результате действия азотистой кислоты (NaNO2 + CH3COOH), что приводит к деполимеризации ОПАП. Низкомолекулярные продукты деградации легко удаляются с помощью ультрафильтрации, и полученные таким способом КПС по данным спектров ЯМР, не претерпевая структурных изменений, освобождаются от примеси ОПАП.When preparing vaccines against S. pneumonia, p-KPS is usually isolated from the supercellular fluid after culturing S. pneumonia and removing the cell mass by centrifugation. The supracellular fluid is concentrated, and the low molecular weight water-soluble F-antigen, which, along with p-CPS, is contained in the supercellular fluid, is separated by physicochemical methods, while S-PS should theoretically remain associated with the PG of the cell wall and be separated when purifying p-CPS from PG. However, when using various purification methods, almost all preparations of p-CPS used for the preparation of vaccines, including conjugate vaccines, contain a noticeable amount of F-antigen and/or C-PS. These polysaccharide molecules are highly immunogenic, but antibodies generated against them are not protective against S. pneumonia (Nielsen, Sorensen, & Henrichsen, 1993). Therefore, purification of p-CPS from the above impurities remains an important problem, which has not yet been solved. The molecular weight of p-CPS is orders of magnitude higher than the molecular weight of OPAP, but the use of traditional methods for separating polymer molecules (various types of gel chromatography, ultrafiltration with pre-treatment with ultrasound, the use of detergents) to remove OPAP impurities does not lead to success. The amount of impurity OPAP in vaccine-quality p-CPS ranges from 5-7 to 15-18%, and this must be taken into account when producing vaccines against S. pneumoniae , since the dose of vaccine p-CPS in the preparation should be standard, regardless of the content of the impurity OPAP . This significantly complicates the production of vaccines, and therefore the development of methods for isolating and purifying S. pneumonia p-CPS from the F-antigen is an important task not only in the creation of polysaccharides, but also conjugate vaccine preparations based on them. Recent studies have shown that purification of p-CPS from OPAP impurities is possible using a deamination reaction [6], which involves only compounds with a free amino group [7]. The target of deamination is the 4-amino-2,4,6-trideoxygalactose residue, which is part of OPAP and, as shown by the authors of the study, is destroyed by the action of nitrous acid (NaNO 2 + CH 3 COOH), which leads to depolymerization of OPAP. Low-molecular-weight degradation products are easily removed using ultrafiltration, and the CPS obtained in this way, according to NMR spectra, are freed from OPAP impurities without undergoing structural changes.
Было установлено, что КПС как грамотрицательных, так и грамположительных микроорганизмов, являясь факторами вирулентности, представляют собой тимус-независимые антигены, которые, при использовании в качестве вакцинных препаратов, индуцируют выработку в основном довольно быстро исчезающих IgM антител, но не способны переключить гуморальный иммунный ответ на выработку долго живущих высоко специфичных антител класса G. Обычно не обнаруживаются при этом и В-клетки памяти. Кроме того, вакцины, содержащие только полисахаридные антигены, не эффективны при проведении профилактики у детей младшего возраста и пожилых людей. В последние годы разработаны конъюгированные полисахарид-белковые вакцины, лишенные этих недостатков. Присоединение к полисахариду белкового носителя (обычно анатоксина) с помощью ковалентной связи придает конъюгату тимус-зависимость и обеспечивает, таким образом, способность активировать иммунную память. В настоящее время для применения в клинической практике разрешены 7-, 10- и 13-валентная конъюгированные вакцины против S. pneumoniae, клинические испытания проходит 20-валентная вакцина [3].It was found that CPS of both gram-negative and gram-positive microorganisms, being virulence factors, are thymus-independent antigens, which, when used as vaccine preparations, induce the production of IgM antibodies that disappear rather quickly, but are not able to switch the humoral immune response to the production of long-living, highly specific antibodies of class G. Memory B cells are usually not detected in this case. In addition, vaccines containing only polysaccharide antigens are not effective for prevention in young children and the elderly. In recent years, conjugated polysaccharide-protein vaccines have been developed that do not have these disadvantages. Attachment of a protein carrier (usually toxoid) to the polysaccharide via a covalent bond imparts thymus dependence to the conjugate and thus provides the ability to activate immune memory. Currently, 7-, 10-, and 13-valent conjugate vaccines against S. pneumoniae are approved for use in clinical practice, and a 20-valent vaccine is undergoing clinical trials [3].
Однако этот подход, несмотря на ряд несомненных достоинств, не лишен некоторых существенных недостатков. Так, в силу невысокой иммуногенности конъюгированных полисахарид-белковых вакцин обычно необходимо присутствие в вакцине адъювантов, чаще всего производных гидроокиси алюминия, которые, по данным последних исследований, обладают рядом нежелательных характеристик.However, this approach, despite a number of undoubted advantages, is not without some significant drawbacks. Thus, due to the low immunogenicity of conjugated polysaccharide-protein vaccines, it is usually necessary to contain adjuvants in the vaccine, most often aluminum hydroxide derivatives, which, according to recent studies, have a number of undesirable characteristics.
Высокое содержание в конъюгате белкового компонента (более 50%) приводит к индуцированию мощного экранирующего антибелкового гуморального иммунного ответа. В случае вакцин против S. pneumoniae при проведении конъюгации очень высокомолекулярного КПС (молекулярная масса до 1000 кДа) с различными белковыми матрицами обычно используются методы «рандомного» образования мостиковых связей между полимерными макромолекулами, что приводит к появлению новых структурных эпитопов в полисахаридной (и белковой) части конъюгата и, как следствие, к индукции антител, не характерных для иммунного ответа на нативный КПС. The high content of the protein component in the conjugate (more than 50%) leads to the induction of a powerful screening anti-protein humoral immune response. In the case of vaccines against S. pneumoniae, when carrying out the conjugation of very high molecular weight CPS (molecular weight up to 1000 kDa) with various protein matrices, methods of “random” formation of bridging bonds between polymer macromolecules are usually used, which leads to the appearance of new structural epitopes in the polysaccharide (and protein) part of the conjugate and, as a consequence, to the induction of antibodies that are not characteristic of the immune response to native CPS.
Конъюгат, в состав которого входит КПС с высокой молекулярной массой и большое количество белка разной степени гидрофобности, зачастую склонен к частичной потере растворимости. В этой связи в случае некоторых КПС приходится понижать его молекулярную массу с помощью различных химических и физико-химических методов.A conjugate that contains a CPS with a high molecular weight and a large amount of protein of varying degrees of hydrophobicity is often prone to partial loss of solubility. In this regard, in the case of some CPS, it is necessary to reduce its molecular weight using various chemical and physicochemical methods.
Помимо этого, обращают на себя внимание сложности, связанные с воспроизводимостью процесса конъюгации, а также анализа полученных конструктов на предмет присутствия в них исходных биополимеров. Перечисленные проблемы подробно обсуждаются в обзорах [4, 5]. Довольно высокая стоимость конъюгированных полисахарид-белковых вакцинных препаратов также существенно ограничивает их применение.In addition, attention is drawn to the difficulties associated with the reproducibility of the conjugation process, as well as the analysis of the resulting constructs for the presence of the original biopolymers in them. The listed problems are discussed in detail in reviews [4, 5]. The rather high cost of polysaccharide-protein conjugated vaccine preparations also significantly limits their use.
Известно техническое решение US4356170, в котором антигенные менингококковые полисахариды модифицируют путем восстановления моносахарида, расположенного на восстанавливающем конце полисахарида, боргидридом натрия с последующим окислением периодатом натрия для получения терминально расположенной альдегидной группы, которую затем ковалентно связывают со свободной аминогруппой выбранного белка, посредством -CH2-NH-белок связи.A known technical solution US4356170, in which antigenic meningococcal polysaccharides are modified by reducing the monosaccharide located at the reducing end of the polysaccharide with sodium borohydride, followed by oxidation with sodium periodate to obtain a terminal aldehyde group, which is then covalently linked to the free amino group of the selected protein, via -CH2-NH -protein connection.
За ближайший аналог можно принять техническое решение WO199640795, в котором описано использование для конъюгирования с белком с помощью восстановительного аминирования свободных альдегидных групп терминальных остатков 2,5-ангидро-D-маннозы, образующихся при деполимеризации капсульных полисахаридов Streptococcus серотипа II или типа III, с помощью мягкого N-дезацетилирования с последующим дезаминированием для конъюгирования с белком с помощью восстановительного аминирования.The closest analogue can be taken as technical solution WO199640795, which describes the use of terminal 2,5-anhydro-D-mannose residues formed during depolymerization of capsular polysaccharides of Streptococcus serotype II or type III for conjugation with protein by reductive amination of free aldehyde groups. mild N-deacetylation followed by deamination to conjugate to the protein via reductive amination.
Таким образом, несмотря на то, что в распоряжении врачей есть конъюгированные вакцины против S. pneumoniae, все вышеперечисленные проблемы требуют поиска новых подходов к повышению эффективности конъюгированных вакцин на основе КПС S. pneumoniae.Thus, despite the fact that doctors have conjugate vaccines against S. pneumoniae at their disposal, all of the above problems require the search for new approaches to increasing the effectiveness of conjugate vaccines based on S. pneumoniae CPS.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the invention
Технической задачей настоящего изобретения является повышение эффективности и оптимизации технологии получения конъюгированных вакцин на основе КПС S. pneumoniae.The technical objective of the present invention is to increase the efficiency and optimize the technology for producing conjugate vaccines based on S. pneumoniae CPS.
Технический результат заключается в получении с помощью дезаминирования модифицированных капсульных полисахаридов (м-КПС) S. pneumoniae, не содержащих примеси общего полисахаридного антигена пневмококков (ОПАП), удобных для последующей конъюгации с матрицей белковой или иной природы, включающей активные аминогруппы, обладающие более высокой растворимостью в водных буферах, чем исходные (природные) КПС, что позволяет повысить технологичность процессов конъюгации, и которые могут быть использованы для получения поливалентных пневмококковых полисахаридных вакцин, а также пневмококковых гликоконъюгированных вакцин.The technical result consists in obtaining, by deamination, modified capsular polysaccharides (m-CPS) of S. pneumoniae that do not contain impurities of the common polysaccharide antigen of pneumococci (CPAP), convenient for subsequent conjugation with a matrix of a protein or other nature, including active amino groups with higher solubility in aqueous buffers than the original (natural) CPS, which makes it possible to increase the manufacturability of conjugation processes, and which can be used to obtain polyvalent pneumococcal polysaccharide vaccines, as well as pneumococcal glycoconjugate vaccines.
Указанный технический результат достигается тем, что получены соединения общей формулы 4-О-(β-N-ацетил-D-мурамил)-6-О-R-2,5-ангидро-D-манноза: This technical result is achieved by obtaining compounds of the general formula 4-O-(β-N-acetyl-D-muramyl)-6-O-R-2,5-anhydro-D-mannose:
(I), (I),
где R - остаток капсульного полисахарида S. pneumoniae, любого серотипа, за исключением серотипов 1 и 3, а Lac- обозначает лактил[-CH(CH3)COOH], причем R представляет собой остаток капсульного полисахарида штамма S. pneumoniae серотипа 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 15F, 18C, 19F, 19A, 22F, 23A, 23F или 33F.where R is the capsular polysaccharide residue of S. pneumoniae , any serotype except serotypes 1 and 3, and Lac- denotes lactyl[-CH(CH 3 )COOH], and R is the capsular polysaccharide residue of S. pneumoniae strain serotype 4, 5 , 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 15F, 18C, 19F, 19A, 22F, 23A, 23F or 33F.
Кроме того, указанный технический результат достигается тем, соединение общей формулы (I) применяется для получения конъюгированных полисахарид-белковых вакцин против S. pneumoniae, при этом полисахарид-белковый конъюгат представляет собой конструкт с мостиковыми связями соединения общей формулы (I) и белковой матрицы (белка-носителя). Кроме того, полисахарид-белковый конъюгат представляет собой конструкт, в котором соединение общей формулы (I) присоединяется к белковой матрице с участием только активной альдегидной группы - СНО остатка 2,5-ангидро-D-маннозы с образованием «звездной» структуры. При этом белковая матрица (белок-носитель) представляет собой бычий сывороточный альбумин, столбнячный анатоксин, или холерный анатоксин, или мутантный дифтерийный анатоксин CRM197, или рекомбинантный детоксифицированный токсин CRM197, или консервативный белковый антиген пневмококка, но не ограничивается ими.In addition, this technical result is achieved by the fact that a compound of general formula (I) is used to obtain conjugated polysaccharide-protein vaccines against S. pneumoniae, wherein the polysaccharide-protein conjugate is a construct with bridged connections between a compound of general formula (I) and a protein matrix ( carrier protein). In addition, a polysaccharide-protein conjugate is a construct in which a compound of general formula (I) is attached to a protein matrix with the participation of only the active aldehyde group - the CHO residue of 2,5-anhydro-D-mannose to form a “star” structure. In this case, the protein matrix (carrier protein) is bovine serum albumin, tetanus toxoid, or cholera toxoid, or mutant diphtheria toxoid CRM197, or recombinant detoxified toxin CRM197, or conserved pneumococcal protein antigen, but is not limited to them.
Также технический результат достигается за счет разработки способа получения соединения общей формулы (I), включающий следующие последовательные этапы:Also, the technical result is achieved by developing a method for producing a compound of general formula (I), including the following successive steps:
i) культивируют S. pneumoniae с получением культуральной жидкости S. pneumoniae;i) cultivate S. pneumoniae to obtain a culture liquid of S. pneumoniae;
ii) проводят центрифугирование или микрофильтрацию полученной культуральной жидкости с разделением надклеточной жидкости и клеточной массы;ii) centrifugation or microfiltration of the resulting culture fluid is performed to separate the supercellular fluid and cell mass;
iii) выделяют неочищенный исходный капсульный полисахарид (КПС) S. pneumoniae путем ультра- и диафильтрации полученной на этапе ii) надклеточной жидкости с последующей лиофилизацией; получают очищенный исходный КПС S. pneumoniae путем обработки лиофилизата нуклеазами и затем протеиназой К с последующей очисткой диафильтрацией и лиофилизацией;iii) isolate the crude original capsular polysaccharide (CPS) of S. pneumoniae by ultra- and diafiltration of the supracellular fluid obtained in step ii) followed by lyophilization; purified initial S. pneumoniae CPS is obtained by treating the lyophilisate with nucleases and then with proteinase K, followed by purification by diafiltration and lyophilization;
iv) проводят реакцию дезаминирования исходного КПС S. pneumoniae добавлением 3-8 мас % водного раствора нитрита натрия к раствору очищенного исходного КПС в 10-50 мас % водном растворе уксусной кислоты; iv) carry out the deamination reaction of the initial S. pneumoniae CPS by adding a 3-8 wt% aqueous solution of sodium nitrite to a solution of the purified initial CPS in a 10-50 wt% aqueous solution of acetic acid;
или or
iii) промывают и суспендируют клеточную массу, полученную на этапе ii), деионизированной водой с получением клеточной суспензии;iii) washing and suspending the cell mass obtained in step ii) with deionized water to obtain a cell suspension;
iv) проводят реакцию дезаминирования путем добавления 3-8 мас % водного раствора нитрита натрия к реакционной смеси, представляющей собой смесь полученной клеточной суспензии с 10-50 мас % водным раствором уксусной кислоты; iv) carry out the deamination reaction by adding 3-8 wt% aqueous solution of sodium nitrite to the reaction mixture, which is a mixture of the resulting cell suspension with 10-50 wt% aqueous solution of acetic acid;
v) реакционную смесь, полученную в результате реакции дезаминирования на этапе iv), разбавляют деионизированной водой и затем нейтрализуют путем добавления NaOH, KOH, NH4OH или NaHCO3;v) the reaction mixture resulting from the deamination reaction in step iv) is diluted with deionized water and then neutralized by adding NaOH, KOH, NH4OH or NaHCO3;
vi) полученный раствор подвергают диализации или диафильтрации с последующей лиофилизацией с получением целевого соединения.vi) the resulting solution is dialized or diafiltrated followed by lyophilization to obtain the target compound.
Определения и терминыDefinitions and terms
Следующие термины и определения применяются в рамках данного изобретения, если иное не указано явно. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.The following terms and definitions apply within the scope of this invention unless otherwise expressly stated. References to techniques used in the description of this invention refer to well known techniques, including modifications of these techniques and replacement thereof with equivalent techniques known to those skilled in the art.
КПС (капсульный полисахарид) - полисахарид, построенный из повторяющихся олигосахаридных звеньев уникальной структуры, характерной для каждого серотипа S. pneumoniae.CPS (capsular polysaccharide) is a polysaccharide built from repeating oligosaccharide units of a unique structure characteristic of each serotype of S. pneumoniae .
п-КПС (природный капсульный полисахарид) или «исходный КПС» - КПС S. pneumoniae,выделяемый из надклеточной жидкости после культивирования и лизиса бактериальных клеток (в частности, при получении вакцин против S. pneumoniae). p-CPS (natural capsular polysaccharide) or “original CPS” - CPS S. pneumoniae , isolated from the supracellular fluid after cultivation and lysis of bacterial cells (in particular, when receiving vaccines against S. pneumoniae).
м-КПС (модифицированный капсульный полисахарид) - модифицированный КПС S. pneumoniae, представляющий собой соединение общей формулы (I), где R - остаток капсульного полисахарида S. pneumoniae, причем восстанавливающий конец R связан с остатком 2,5-ангидро-D-маннозы путем образования гликозидной связи в положении 6остатка 2,5-ангидро-D-маннозы; R представляет собой остаток капсульного полисахарида штамма S. pneumoniae любого серотипа (за исключением серотипов 1 и 3) и имеет строение, соответствующее выбранному серотипу.m-CPS (modified capsular polysaccharide) is a modified CPS of S. pneumoniae , which is a compound of general formula (I), where R is the residue of the capsular polysaccharide of S. pneumoniae, and the reducing end R is associated with a 2,5-anhydro-D-mannose residue by forming a glycosidic bond at position 6 of the 2,5-anhydro-D-mannose residue; R is a capsular polysaccharide residue of a strain of S. pneumoniae of any serotype (except serotypes 1 and 3) and has a structure corresponding to the selected serotype.
Восстанавливающий конец полисахарида - терминальный моносахаридный остаток полисахарида со свободной аномерной ОН-группой, не вовлеченный в образование гликозидной связи. При размыкании цикла такого моносахаридного остатка возможно образование свободной альдегидной группы. Линейные полисахариды имеют один невосстанавливающий и один восстанавливающий конец; в разветвленных полисахаридах (в том числе в капсульных полисахаридах) также может быть только один восстанавливающий конец, при этом число невосстанавливающих концевых моносахаридных остатков превышает число разветвлений.The reducing end of a polysaccharide is the terminal monosaccharide residue of a polysaccharide with a free anomeric OH group that is not involved in the formation of a glycosidic bond. When the ring of such a monosaccharide residue is opened, a free aldehyde group can be formed. Linear polysaccharides have one non-reducing end and one reducing end; Branched polysaccharides (including capsular polysaccharides) can also have only one reducing end, and the number of non-reducing terminal monosaccharide residues exceeds the number of branches.
Под серотипом штамма S. pneumoniae подразумевается группа микроорганизмов S. pneumoniae, объединяемых общей антигенной структурой, определяемой первичной химической структурой КПС.The serotype of a S. pneumoniae strain means a group of S. pneumoniae microorganisms united by a common antigenic structure determined by the primary chemical structure of the CPS.
Соединения по изобретению представляют собой любые соединения общей формулы (I), получение которых возможно с точки зрения химии и/или биологии. Это означает, что соединение по изобретению может включать остаток капсульного полисахарида (КПС) любого серотипа S. pneumoniae, строение клеточной стенки которого позволяет получить соединение общей формулы (I). В частности, КПС не должны содержать моносахаридных фрагментов, подверженных деградации в условиях реакции дезаминирования, используемой для получения соединений общей формулы (I) (см. подробнее далее); кроме того, КПС S. pneumoniae должен присоединяться к пептидогликану (ПГ) непосредственно гликозидной связью. Такое строение клеточной стенки присуще подавляющему большинству известных серотипов S. pneumoniae, за исключением серотипов 1 и 3 (см. подробнее далее).The compounds of the invention are any compounds of general formula (I), the preparation of which is possible from a chemical and/or biological point of view. This means that the compound of the invention may comprise a capsular polysaccharide (CPS) moiety of any serotype of S. pneumoniae whose cell wall structure allows the preparation of a compound of general formula (I). In particular, CPS should not contain monosaccharide fragments susceptible to degradation under the conditions of the deamination reaction used to obtain compounds of general formula (I) (see below for more details); in addition, the S. pneumoniae CPS must be attached to the peptidoglycan (PG) directly by a glycosidic bond. This cell wall structure is characteristic of the vast majority of known serotypes of S. pneumoniae, with the exception of serotypes 1 and 3 (see more details below).
Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.Unless otherwise defined, technical and scientific terms in this application have their standard meanings commonly accepted in the scientific and technical literature.
Краткое описание фигурBrief description of the figures
Фиг.1 Схема дезаминирования остатка N-дезацетилированного глюкозамина в составе пептидогликана клеточной стенки с получением м-КПС, на восстанавливающем конце которого локализован остаток 2,5-ангидро-D-маннозы (из D-глюкозамина), несущий в положении 4 остаток N-ацетил-D-мурамовой кислоты, а в положении 6 - остаток КПС. Обозначения: Ас - ацетил, MurNAc-остаток N-ацетил-D-мурамовой кислоты, GlcN-остаток D-глюкозамина, 2,5-anhydro-Man - остаток 2,5-ангидро-D-маннозы, Lac - остаток молочной кислоты (лактил, -CH(CH3)COOH), n- целое число, характеризующее количество повторяющихся звеньев в полисахаридной цепи пептидогликана.Figure 1 Scheme of deamination of the N-deacetylated glucosamine residue in the peptidoglycan of the cell wall to obtain m-CPS, at the reducing end of which a 2,5-anhydro-D-mannose residue (from D-glucosamine) is localized, carrying an N- residue in position 4 acetyl-D-muramic acid, and at position 6 there is a CPS residue. Designations: Ac - acetyl, MurNAc - N-acetyl-D-muramic acid residue, GlcN - D-glucosamine residue, 2,5-anhydro-Man - 2,5-anhydro-D-mannose residue, Lac - lactic acid residue ( lactyl, -CH(CH 3 )COOH), n is an integer characterizing the number of repeating units in the polysaccharide chain of peptidoglycan.
Фиг.2: А - 1H-ЯМР спектр исходного п-КПС бактериального штамма S. pneumonia серотипа 6А, Б - 1H-ЯМР спектр м-КПС бактериального штамма S. pneumonia серотипа 6А.Figure 2: A - 1 H-NMR spectrum of the original p-KPS bacterial strain S. pneumonia serotype 6A, B - 1 H-NMR spectrum m-KPS bacterial strain S. pneumonia serotype 6A.
a- сигнал остатка холина; b - сигналы N-ацетильных групп аминосахаров из ОПАП и ПГ; с - сигнал метильной группы остатка α-L-рамнозы.a- signal of choline residue; b - signals of N-acetyl groups of amino sugars from OPAP and PG; c - signal of the methyl group of the α-L-rhamnose residue.
Фиг.3: А - Спектр 1Н-ЯМР адипиндигидразидного производного м-КПС 6А; Б - Спектр 1Н-ЯМР стандартного образца адипиндигидразида.Figure 3: A - 1 H-NMR spectrum of the adipine dihydrazide derivative m-KPS 6A; B - 1 H-NMR spectrum of a standard sample of adipine dihydrazide.
Фиг.4. Динамика веса животных в контрольной и опытных группах в ходе исследования. Fig.4. Dynamics of the weight of animals in the control and experimental groups during the study.
Обозначения: PBS - контрольная группа; «КПС 0,5 мкг» - экспериментальная группа животных, иммунизированных м-КПС в дозе 0,5 мкг; «КПС 5 мкг» - экспериментальная группа животных, иммунизированных м-КПС в дозе 5 мкг. И1, И2, И3 - время первой, второй и третьей иммунизации соответственно.Designations: PBS - control group; “KPS 0.5 μg” - experimental group of animals immunized with m-KPS at a dose of 0.5 μg; “KPS 5 μg” - experimental group of animals immunized with m-KPS at a dose of 5 μg. I1, I2, I3 are the times of the first, second and third immunization, respectively.
Фиг.5: А- Продукция специфических антител IgG в сыворотке крови иммунизированных животных в ответ на введение м-КПС серотипа 6В; Б - Продукция специфических антител IgМ в сыворотке крови иммунизированных животных в ответ на введение м-КПС серотипа 6В;Figure 5: A - Production of specific IgG antibodies in the blood serum of immunized animals in response to the introduction of m-KPS serotype 6B; B - Production of specific IgM antibodies in the blood serum of immunized animals in response to the introduction of m-KPS serotype 6B;
Обозначены статистически значимые отличия между группами.Statistically significant differences between groups are indicated.
Фиг.6 Бактериостатическая активность сыворотки крови иммунизированных животных после третьей иммунизации. Figure 6 Bacteriostatic activity of blood serum of immunized animals after the third immunization.
Обозначения: GC - контроль роста культуры. PBS - контрольная группа; «КПС 0,5 мкг» - экспериментальная группа животных, иммунизированных м-КПС в дозе 0,5 мкг; «КПС 5 мкг» - экспериментальная группа животных, иммунизированных м-КПС в дозе 5 мкг. Обозначены статистически значимые отличия между группами. Designations: GC - culture growth control. PBS - control group; “KPS 0.5 μg” - experimental group of animals immunized with m-KPS at a dose of 0.5 μg; “KPS 5 μg” - experimental group of animals immunized with m-KPS at a dose of 5 μg. Statistically significant differences between groups are indicated.
Фиг.7 Уровень IgG антител, связывающихся с п-КПС и м-КПС в сыворотке крови мышей, иммунизированных м-КПС. Сравнение групп с помощью парного двустороннего t-критерия Стьюдента.Figure 7 Level of IgG antibodies binding to p-KPS and m-KPS in the blood serum of mice immunized with m-KPS. Comparison of groups using paired two-tailed Student's t test.
Обозначения: GC - контроль роста культуры. PBS - контрольная группа; «КПС 0,5 мкг» - экспериментальная группа животных, иммунизированных м-КПС в дозе 0,5 мкг; «КПС 5 мкг» - экспериментальная группа животных, иммунизированных м-КПС в дозе 5 мкг. Обозначены статистически значимые отличия между группами. Designations: GC - culture growth control. PBS - control group; “KPS 0.5 μg” - experimental group of animals immunized with m-KPS at a dose of 0.5 μg; “KPS 5 μg” - experimental group of animals immunized with m-KPS at a dose of 5 μg. Statistically significant differences between groups are indicated.
Осуществление изобретенияCarrying out the invention
В рамках проведения исследований, авторами настоящего изобретения, с использованием традиционного поэтапного подхода к выделению и очистке (концентрирование и диализ с помощью тангенциальной ультрафильтрации, обработка нуклеазами и затем протеиназой К, высаживание в спирт) из надклеточной жидкости, полученной в результате культивирования в ферментере, были выделены п-КПС более 20 эпидемически значимых серотипов S. pneumoniae. Данные спектроскопии 1Н-ЯМР полученных п-КПС полностью совпадали с литературными. Каждый и выделенных п-КПС содержал по данным 1Н-ЯМР-спектроскопии от 5 до 17% ОПАП (см. Пример 1).As part of our research, the present inventors, using a traditional stepwise approach to isolation and purification (concentration and dialysis by tangential ultrafiltration, treatment with nucleases and then proteinase K, precipitation in alcohol) from the supracellular fluid obtained as a result of cultivation in the fermentor, were more than 20 epidemically significant serotypes of S. pneumoniae were isolated by p-KPS. The 1H -NMR spectroscopy data of the obtained p-CPSs completely coincided with the literature data. Each isolated p-CPS contained, according to 1 H-NMR spectroscopy, from 5 to 17% OPAP (see Example 1).
Для очистки п-КПС от примеси ОПАП был использован способ, описанный в публикации [6]. Однако условия проведения реакции дезаминирования п-КПС были изменены: был использован водный раствор уксусной кислоты в соотношении CH3COOН: Н2О 1:3, вместо 5%-ной уксусной кислоты, которую вводили в реакцию дезаминирования авторы статьи [6]. В результате реакций, проведенных с выделенными п-КПС, были получены модифицированные п-КПС (далее обозначаемые как м-КПС). 1Н-ЯМР-спектры полученных в результате реакции дезаминирования м-КПС, как и следовало ожидать, не отличались от спектров исходных п-КПС, за исключением отсутствия в м-КПС сигнала при 3.2 м.д., характерного для (СН3)3N-группы остатка холина - непременного компонента ОПАП [5].To purify p-CPS from OPAP impurities, the method described in publication [6] was used. However, the conditions for the deamination reaction of p-CPS were changed: an aqueous solution of acetic acid was used in the ratio CH 3 COOH: H 2 O 1:3, instead of 5% acetic acid, which was introduced into the deamination reaction by the authors of the article [6]. As a result of the reactions carried out with the isolated p-CPS, modified p-CPS (hereinafter referred to as m-CPS) were obtained. 1 H-NMR spectra of m-CPS obtained as a result of the deamination reaction, as expected, did not differ from the spectra of the initial p-CPS, with the exception of the absence of a signal in m-CPS at 3.2 ppm, characteristic of (CH 3 ) 3 N-groups of the choline residue, an essential component of OPAP [5].
Однако при анализе молекулярно-массового распределения полученных таким образом м-КПС с помощью ВЭЖХ было обнаружено, что для большинства м-КПС время элюции значительно меньше времени элюции исходных п-КПС, что должно было бы указывать на то, что в результате дезаминирования происходит образование м-КПС с большей молекулярной массой, чем молекулярная масса исходных п-КПС, тогда как реакция дезаминирования должна была привести к дезинтеграции ОПАП без изменения молекулярной массы исходного биополимера. Проведение ВЭЖХ в различных буферах и в присутствии детергентов показало, что порядок элюции исходных п-КПС и м-КПС неизменен. Авторы настоящего изобретения предположили, что с наибольшей вероятностью обнаруженный хроматографический эффект может быть объяснен неспецифическим связыванием с ВЭЖХ-фазой необычных по своей архитектонике исходных молекул п-КПС S. pneumonia и отсутствием этого связывания у молекул м-КПС. Поскольку известно, что КПС и С-ПС S. pneumoniae присоединены ковалентной связью к ПГ[4, 5], авторы настоящего изобретения предположили, что «традиционные» п-КПС S. pneumoniae, используемые для получения вакцин, на самом деле представляют собой образующиеся в результате аутолизиса бактериальных клеток сложные «биоконъюгаты», в которых остатки КПС и С-ПС присоединены посредством гликозидных связей терминальных восстанавливающих моносахаридов к фрагменту ПГ, причем молекула такого трехкомпонентного конструкта может включать не один остаток КПС и С-ПС. Количество «биоконъюгата», образующегося в результате лизиса клеток S. pneumoniae как в процессе глубинного культивирования, так и во время стерилизации клеток после выращивания, зависит от условий проведения этих процедур. Так, в патенте компании VAJET (US) [8] предложен ускоренный метод получения «традиционного» п-КПС с высоким выходом, который включает лизис бактериальных клеток «посредством добавления детергента или другого реагента, который способствует разрушению клеточной стенки и освобождению аутолизинов, которые вызывают ускоренный лизис клеток по достижении стационарной фазы». Таким образом, следует полагать, что все лицензированные вакцинные препараты на основе п-КПС (включая конъюгированные) содержат описанный выше «биоконъюгат», примесь С-ПС из которого (ввиду наличия ковалентной связи С-ПС и КПС с ПГ) удалить обычными методами, естественно, невозможно. Архитектоника трехкомпонентной биомолекулы п-КПС обусловливает технические трудности, связанные с низкой растворимостью вакцинного препарата, и, как следствие, с необходимостью перед конъюгацией с белком снижать его молекулярную массу с помощью химических и физико-химических методов. Описанный выше эффект неспецифического связывания п-КПС в процессе ВЭЖХ обусловлен сложной разветвленной структурой «биоконъюгата» п-КПС. Выделенные из «биоконъюгата» м-КПС таким свойством не обладают, и их молекулярные массы могут быть определены стандартным образом с помощью ВЭЖХ.However, when analyzing the molecular weight distribution of m-CPS obtained in this way using HPLC, it was found that for most m-CPS the elution time is significantly less than the elution time of the original p-CPS, which should indicate that the formation of m-CPS with a higher molecular weight than the molecular weight of the original p-CPS, while the deamination reaction should have led to the disintegration of OPAP without changing the molecular weight of the original biopolymer. HPLC in various buffers and in the presence of detergents showed that the order of elution of the original p-CPS and m-CPS is unchanged. The authors of the present invention suggested that most likely the detected chromatographic effect can be explained by nonspecific binding to the HPLC phase of the original p-CPS molecules of S. pneumonia, which are unusual in their architecture, and the absence of this binding in m-CPS molecules. Since S. pneumoniae CPS and C-PS are known to be covalently attached to PG[4, 5], the authors of the present invention hypothesized that the “traditional” S. pneumoniae p-CPS used to produce vaccines are in fact formed as a result of autolysis of bacterial cells, complex “bioconjugates” in which CPS and S-PS residues are attached through glycosidic bonds of terminal reducing monosaccharides to a PG fragment, and the molecule of such a three-component construct may include more than one CPS and S-PS residue. The amount of “bioconjugate” formed as a result of lysis of S. pneumoniae cells both during submerged cultivation and during cell sterilization after cultivation depends on the conditions of these procedures. Thus, the patent of the company VAJET (US) [8] proposes an accelerated method for obtaining “traditional” p-CPS with high yield, which includes the lysis of bacterial cells “by adding a detergent or other reagent that promotes the destruction of the cell wall and the release of autolysins that cause accelerated cell lysis upon reaching the stationary phase.” Thus, it should be assumed that all licensed vaccine preparations based on p-CPS (including conjugates) contain the “bioconjugate” described above, from which the S-PS impurity (due to the presence of a covalent bond of S-PS and CPS with PG) is removed by conventional methods, naturally, impossible. The architecture of the three-component p-CPS biomolecule causes technical difficulties associated with the low solubility of the vaccine preparation, and, as a consequence, with the need to reduce its molecular weight using chemical and physicochemical methods before conjugation with the protein. The above-described effect of nonspecific binding of p-CPS during HPLC is due to the complex branched structure of the p-CPS “bioconjugate”. m-CPS isolated from the “bioconjugate” do not have this property, and their molecular weights can be determined in a standard manner using HPLC.
В результате дезаминирования происходит деполимеризация С-ПС, что позволяет избавиться от его примеси в п-КПС, и при этом образуется м-КПС [6].As a result of deamination, depolymerization of S-PS occurs, which makes it possible to get rid of its impurity in p-CPS, and in this case m-CPS is formed [6].
В грамположительном микроорганизме S. pneumonia строение узла связи КПС-ПГ имеет уникальный характер. КПС грамположительных бактерий присоединены в положение С-6 остатка N-ацетил-D-мурамовой кислоты через фосфодиэфирный мостик, в случае же S. pneumoniae местом присоединения КПС является С-6 остатка N-ацетил-D-глюкозамина, причем 80% остатков этого моносахарида и 10% остатков N-ацетил-D-мурамовой кислоты лишены N-ацетильной группы [9]. Наличие в узле связи до 90% N-дезацетилированных остатков обоих аминосахаров очевидно связано с механизмом защиты микроорганизма от действия лизирующих ферментов организма хозяина, которые распознают лишь N-ацетилированные остатки. Ранее [7] было показано, что дезаминирование 2-амино-2-дезоксиглюкозы (глюкозамина) и 2-амино-2-дезоксигалактозы (галактозамина) приводит к перегруппировке шестичленных циклов обоих моносахаридов с образованием 2,5-ангидроманнозы и 2,5-ангидроталозы, соответственно. Если остаток глюкозамина или галактозамина присоединен гликозидной связью, перегруппировка с сужением цикла сопровождается разрывом этой связи, причем в случае локализации остатка глюкозамина или галактозамина внутри полисахаридной цепи (но не в ответвлении) происходит деполимеризация полисахарида с образованием олигосахаридов с остатком 2,5-ангидропроизводного на восстанавливающем конце. При наличии связи остатков КПС с фрагментом ПГ, в котором присутствует до 90% N-дезацетилированных остатков обоих аминосахарных компонентов ПГ, в результате дезаминирования происходит расщепление «биоконъюгата», сопровождающееся освобождением м-КПС, на восстанавливающем конце которого локализован остаток 2,5-ангидро-D-маннозы (образуется из D-глюкозамина), несущий в положении 4 остаток N-ацетил-D-мурамовой кислоты, а в положении 6 - остаток КПС (Фиг.1).In the gram-positive microorganism S. pneumonia, the structure of the KPS-PG connection node has a unique character. The KPS of gram-positive bacteria are attached to the C-6 position of the N-acetyl-D-muramic acid residue through a phosphodiester bridge, while in the case of S. pneumoniae the site of attachment of the KPS is the C-6 of the N-acetyl-D-glucosamine residue, with 80% of the residues of this monosaccharide and 10% of N-acetyl-D-muramic acid residues lack an N-acetyl group [9]. The presence of up to 90% N-deacetylated residues of both amino sugars in the connection site is obviously associated with the mechanism of protection of the microorganism from the action of lysing enzymes of the host organism, which recognize only N-acetylated residues. Previously [7], it was shown that deamination of 2-amino-2-deoxyglucose (glucosamine) and 2-amino-2-deoxygalactose (galactosamine) leads to rearrangement of the six-membered rings of both monosaccharides with the formation of 2,5-anhydromannose and 2,5-anhydrothalose , respectively. If the glucosamine or galactosamine residue is attached by a glycosidic bond, the rearrangement with ring narrowing is accompanied by the rupture of this bond, and in the case of localization of the glucosamine or galactosamine residue within the polysaccharide chain (but not in the branch), depolymerization of the polysaccharide occurs with the formation of oligosaccharides with a 2,5-anhydro derivative residue on the reducing end. In the presence of a connection between KPS residues and a PG fragment, which contains up to 90% N-deacetylated residues of both amino sugar components of PG, as a result of deamination, the “bioconjugate” splits, accompanied by the release of m-KPS, at the reducing end of which a 2,5-anhydro residue is localized -D-mannose (formed from D-glucosamine), carrying an N-acetyl-D-muramic acid residue at position 4, and a CPS residue at position 6 (Figure 1).
Как показали проведенные в рамках данного изобретения исследования, спектры1H-ЯМР исходных п-КПС и образующихся в результате дезаминирования м-КПС отличаются лишь наличием в спектрах п-КПС минорных сигналов, соответствующих ОПАП и ПГ. В качестве примера на Фиг.2 приведены спектры 1H-ЯМР п-КПС и м-КПС бактериального штамма S. pneumoniae серотипа 6А, повторяющееся звено которого имеет следующую структуру: As studies carried out within the framework of this invention have shown, the 1 H-NMR spectra of the original p-CPS and the m-CPS formed as a result of deamination differ only in the presence in the spectra of p-CPS of minor signals corresponding to OPAP and PG. As an example, Figure 2 shows the 1 H-NMR spectra of p-KPS and m-KPS of the bacterial strain S. pneumoniae serotype 6A, the repeating unit of which has the following structure:
[→2)-α-D-GaIp-(1→3)-α-D-Glcp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-D-Ribitol-(5→P→]n [→2)-α-D-GaIp-(1→3)-α-D-Glcp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)-D-Ribitol-(5→P→ ] n
Идентифицировать дисахаридный фрагмент с 2,5-ангидро-D-маннозой методом ЯМР-спектроскопии или ГЖХ-масс-спектрометрии не представляется возможным в силу чрезвычайно малого количества этого терминального моносахаридного компонента в м-КПС. Однако, в случае м-КПС бактериальных штаммов S. pneumoniae серотипов 6А и 6В удалось идентифицировать альдегидную группу остатка 2,5-ангидро-D-маннозы и определить ее количественное содержание. п-КПС серотипа 6А резко отличается по физико-химическим и иммунологическим характеристикам от всех остальных КПС. Несмотря на высокую распространенность этого серотипа, он не включен в 23-валентную вакцину из-за своей необъяснимо низкой иммуногенности [10]. Лишь конъюгат с белком на основе п-КПС серотипа 6А приобретает способность к индукции протективных антител (входит в состав всех конъюгированных пневмококковых вакцин). В рамках настоящего исследования установлено, что, в отличие от штаммов S. pneumoniae всех других серотипов (см. выше), время удерживания м-КПС серотипа 6А при ВЭЖХ значительно больше, чем у исходного п-КПС серотипа 6А (м-КПС имеет молекулярную массу, не превышающую 10 кДа), что резко отличает его ото всех остальных м-КПС S. pneumoniae. Это, с одной стороны, позволяет объяснить низкую иммуногенность п-КПС серотипа 6А [11], а, с другой стороны, констатировать, что у «биоконъюгата» с низкой молекулярной массой остатков КПС отсутствует способность к неспецифической адсорбции на ВЭЖХ-фазе.It is not possible to identify the disaccharide fragment with 2,5-anhydro-D-mannose by NMR spectroscopy or GLC-mass spectrometry due to the extremely small amount of this terminal monosaccharide component in m-CPS. However, in the case of m-KPS of bacterial strains S. pneumoniae serotypes 6A and 6B, it was possible to identify the aldehyde group of the 2,5-anhydro-D-mannose residue and determine its quantitative content. p-KPS serotype 6A differs sharply in physicochemical and immunological characteristics from all other KPS. Despite the high prevalence of this serotype, it is not included in the 23-valent vaccine due to its inexplicably low immunogenicity [10]. Only a conjugate with a protein based on p-KPS serotype 6A acquires the ability to induce protective antibodies (included in all conjugate pneumococcal vaccines). The present study found that, in contrast to S. pneumoniae strains of all other serotypes (see above), the HPLC retention time of m-KPS serotype 6A is significantly longer than that of the original p-KPS serotype 6A (m-KPS has a molecular mass not exceeding 10 kDa), which sharply distinguishes it from all other m-CPS S. pneumoniae. This, on the one hand, allows us to explain the low immunogenicity of p-CPS serotype 6A [11], and, on the other hand, to state that a “bioconjugate” with a low molecular weight of CPS residues does not have the ability for nonspecific adsorption on the HPLC phase.
Прямое доказательство наличия на восстанавливающем конце м-КПС серотипа 6А альдегидной группы было получено с помощью анализа 1Н-ЯМР-спектра гидразидного производного, полученного взаимодействием м-КПС серотипа 6А с избытком адипиндигидразида в условиях реакции восстановительного аминирования [12] (цианборгидрид натрия в натрий-фосфатном буфере, рН 7,2). После очистки с помощью гель-хроматографии на колонке TSK40 (TOYOSODA) в 0,05н АсОН по данным 1Н-ЯМР-спектроскопии было получено производное м-КПС серотипа 6А с H2NNHCO(CH2)4CONHNH-группой на восстанавливающем конце (Фиг.3). Из сравнения величин интегральных интенсивностей сигналов аномерного протона остатка рамнозы (1Н) и сигнала 2,5(4Н)- или 3,4(4Н)- метиленовых групп остатка адипиндигидразида следовало, что на один терминальный гидразидный остаток приходится около 30 повторяющихся олигосахаридных звеньев м-КПС. Таким же способом на примере м-КПС серотипа 6В также было подтверждено наличие в нем терминальной альдегидной группы на восстанавливающем конце. Для этого м-КПС серотипа 6В был подвергнут гель-хроматографии на колонке с TSK55 (TOYOSODA) в 0,2М NaCl, и выделенная при этом самая низкомолекулярная фракция после диализа и лиофилизации была обработана как описано выше для м-КПС серотипа 6А. В 1Н-ЯМР спектре гидразидного производного также присутствовали сигналы H2NNHCO(CH2)4CONHNH-группы, а интегрирование показало, что низкомолекулярный м-КПС серотипа 6В содержит не менее 40 повторяющихся олигосахаридных звеньев.Direct evidence of the presence of an aldehyde group at the reducing end of m-KPS serotype 6A was obtained by analyzing the 1 H-NMR spectrum of a hydrazide derivative obtained by reacting m-KPS serotype 6A with an excess of adipine dihydrazide under the conditions of a reductive amination reaction [12] (sodium cyanoborohydride to sodium -phosphate buffer, pH 7.2). After purification using gel chromatography on a TSK40 column (TOYOSODA) in 0.05 N AcOH, according to 1 H-NMR spectroscopy, a m-KPS derivative of serotype 6A was obtained with an H 2 NNHCO(CH 2 ) 4 CONHNH group at the reducing end ( Fig.3). From a comparison of the integral intensities of the signals of the anomeric proton of the rhamnose residue (1H) and the signal of the 2,5(4H)- or 3,4(4H)- methylene groups of the adipine dihydrazide residue, it follows that there are about 30 repeating oligosaccharide units of m- for one terminal hydrazide residue. KPS. In the same way, using the example of m-KPS serotype 6B, the presence of a terminal aldehyde group at the reducing end was also confirmed. For this purpose, m-KPS serotype 6B was subjected to gel chromatography on a TSK55 (TOYOSODA) column in 0.2 M NaCl, and the isolated lowest molecular weight fraction after dialysis and lyophilization was processed as described above for m-KPS serotype 6A. The 1 H-NMR spectrum of the hydrazide derivative also contained signals of the H 2 NNHCO(CH 2 ) 4 CONHNH group, and integration showed that low-molecular-weight m-KPS serotype 6B contains at least 40 repeating oligosaccharide units.
В рамках проводимого авторами изобретения исследования из всех выделенных эпидемически значимых п-КПС S. pneumonia были дезаминированы п-КПС с получением м-КПС для всех серотипов, кроме серотипов 1 и 3: п-КПС серотипа 1 содержит в своем составе 4-аминосахар, подверженный деградации в условиях этой реакции [6, 13], а п-КПС серотипа 3, в отличие от остальных п-КПС S. pneumoniae, не связан с ПГ [14], As part of the study conducted by the authors of the invention, p-KPS were deaminated from all isolated epidemically significant S. pneumonia p-KPS to obtain m-KPS for all serotypes, except for serotypes 1 and 3: p-KPS of serotype 1 contains a 4-amino sugar, susceptible to degradation under the conditions of this reaction [6, 13], and p-KPS serotype 3, unlike other p-KPS S. pneumoniae , is not associated with PG [14],
Таким образом, в результате проведенных исследований были получены м-КПС - новые соединения, общая структурная формула которых представлена формулой (I): Thus, as a result of the research, m-CPS were obtained - new compounds, the general structural formula of which is represented by formula (I):
, ,
где R - остаток капсульного полисахарида S. pneumoniae любого серотипа, за исключением серотипов 1 и 3.where R is the residue of the capsular polysaccharide of S. pneumoniae of any serotype, with the exception of serotypes 1 and 3.
Способ получения м-КПС (соединений общей формулы (I)) по изобретению включает следующие последовательные этапы:The method for producing m-CPS (compounds of general formula (I)) according to the invention includes the following sequential steps:
I. - культивирование S. pneumoniae с получением культуральной жидкости S. pneumoniae; I. - cultivation of S. pneumoniae to obtain S. pneumoniae culture fluid;
II. - центрифугирование или микрофильтрация полученной культуральной жидкости для разделения надклеточной жидкости и клеточной массы;II. - centrifugation or microfiltration of the resulting culture fluid to separate the supercellular fluid and cell mass;
III. - выделение неочищенного п-КПС S. pneumoniae путем ультра - и диафильтрации полученной надклеточной жидкости с последующей лиофилизацией;III. - isolation of crude p-KPS S. pneumoniae by ultra- and diafiltration of the resulting supercellular fluid, followed by lyophilization;
IV. - получение очищенного п-КПС S. pneumoniae путем обработки лиофилизата нуклеазами и затем протеиназой К с последующей очисткой диафильтрацией и лиофилизацией;IV. - obtaining purified S. pneumoniae p-KPS by treating the lyophilisate with nucleases and then with proteinase K, followed by purification by diafiltration and lyophilization;
V. - дезаминирование п-КПС с последующей очисткой целевого продукта (м-КПС) диафильтрацией и лиофилизацией.V. - deamination of p-CPS followed by purification of the target product (m-CPS) by diafiltration and lyophilization.
Дезаминирование п-КПС на этапе V. проводят следующим образом: к водному раствору п-КПС добавляют 10-50%-ый водный раствор уксусной кислоты и после этого добавляют 3-8%-ый водный раствор нитрита натрия. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 0,5-2 часов при температуре 4 - 25°С, после чего ее разбавляют водой и нейтрализуют водным раствором неорганического основания, выбранного из NaOH, KOH, NH4OH, или, преимущественно, твердым NaHCO3.Далее полученный раствор подвергают диализации или диафильтрации с последующей лиофилизацией с получением м-КПС (соединения общей формулы (I)).Deamination of p-KPS at stage V. is carried out as follows: a 10-50% aqueous solution of acetic acid is added to an aqueous solution of p-KPS, and then a 3-8% aqueous solution of sodium nitrite is added. The resulting reaction mixture is stirred for 0.5-2 hours at a temperature of 4 - 25°C, after which it is diluted with water and neutralized with an aqueous solution of an inorganic base selected from NaOH, KOH, NH 4 OH, or, preferably, solid NaHCO 3 . Next, the resulting solution is dialized or diafiltrated, followed by lyophilization to obtain m-CPS (compounds of general formula (I)).
В некоторых частных вариантах дезаминирование проводят следующим образом: к раствору 20 мг п-КПС в 1-3 мл (в наиболее предпочтительном варианте в 1 мл) деионизованной воды прибавляют при перемешивании 1-2,5 мл (в наиболее предпочтительном варианте 1 мл) раствора уксусной кислоты с концентрацией от 10 до 50 мас % (в наиболее предпочтительном варианте 30 мас %) и затем 1,5-2,5 мл (в наиболее предпочтительном варианте 1 мл) водного раствора нитрита натрия с концентрацией от 3 до 8 мас % 1,5-2,5 мл (в наиболее предпочтительном варианте 5 мас %). Через 0,5 - 2 часа (в наиболее предпочтительном варианте 1 час) перемешивания при температуре 4 - 25°С (в наиболее предпочтительном варианте 20°С) реакционную смесь разбавляют в 3 раза деионизованной водой, нейтрализуют водным раствором неорганического основания (NaOH, KOH, NH4OH), или, преимущественно, твердым NaHCO3. Полученный раствор далее диализуют против деионизованной воды или подвергают диафильтрации с использованием мембраны с пределом отсечения 10 кДа, 20 кДа, 50 кДа или 100 кДа в зависимости от молекулярной массы полученного м-КПС и полученный водный раствор лиофилизуют.In some particular embodiments, deamination is carried out as follows: to a solution of 20 mg of p-CPS in 1-3 ml (in the most preferred embodiment, 1 ml) of deionized water, 1-2.5 ml (in the most preferred embodiment, 1 ml) of the solution is added with stirring acetic acid with a concentration of 10 to 50 wt% (in the most preferred embodiment, 30 wt%) and then 1.5-2.5 ml (in the most preferred embodiment, 1 ml) of an aqueous solution of sodium nitrite with a concentration of 3 to 8 wt% 1 .5-2.5 ml (in the most preferred embodiment 5 wt%). After 0.5 - 2 hours (in the most preferred embodiment, 1 hour) stirring at a temperature of 4 - 25°C (in the most preferred embodiment, 20°C), the reaction mixture is diluted 3 times with deionized water, neutralized with an aqueous solution of an inorganic base (NaOH, KOH , NH 4 OH), or, mainly, solid NaHCO 3 . The resulting solution is further dialyzed against deionized water or subjected to diafiltration using a membrane with a cut-off limit of 10 kDa, 20 kDa, 50 kDa or 100 kDa depending on the molecular weight of the resulting m-KPS and the resulting aqueous solution is lyophilized.
Так как аутолитические процессы, протекающие при культивировании S. pneumoniae и после его окончания, полностью не разрушают ПГ, часть КПС остается с ним связанной, и поэтому дополнительное количество м-КПС может быть получено с помощью реакции дезаминирования из бактериальных клеток S. pneumoniae, выделенных после удаления надклеточной жидкости с помощью центрифугирования (т.е. из клеточной массы, выделенной на этапе II).Для этого проводят дезаминирование бактериальных клеток (т.е. полученной клеточной массы) с последующим удалением центрифугированием нерастворимого компонента и выделением из супернатанта с помощью диафильтрации дополнительного количества целевого продукта (м-КПС). Полученные при этом м-КПС после ультрафильтрации не содержат ОПАП и не требуют дополнительной очистки от белков и нуклеиновых кислот (см. Пример 3).Since the autolytic processes that occur during the cultivation of S. pneumoniae and after its completion do not completely destroy PG, part of the KPS remains associated with it, and therefore an additional amount of m-KPS can be obtained using a deamination reaction from bacterial cells of S. pneumoniae isolated after removal of the supercellular fluid by centrifugation (i.e. from the cell mass isolated at stage II). To do this, deamination of bacterial cells (i.e. the resulting cell mass) is carried out, followed by removal of the insoluble component by centrifugation and isolation from the supernatant using diafiltration additional amount of the target product (m-CPS). The resulting m-CPS after ultrafiltration do not contain OPAP and do not require additional purification from proteins and nucleic acids (see Example 3).
Как указывалось, выше, при культивировании S. pneumoniae и после его завершения в процессе стерилизации клеток после выращивания происходит лизис микроорганизмов, сопровождающийся разрушением ПГ клеточной стенки с помощью освобождающихся аутолитических ферментов и образованием «биоконъюгата». Таким образом, часть «биоконъюгата» оказывается в надклеточной жидкости, а другая часть - остается в составе не лизированных или частично лизированных бактериальных клеток. Из полученного после центрифугирования осадка таких нативных и полуразрушенных бактериальных клеток с помощью реакции дезаминирования, протекающей в гетерогенной фазе, может быть получено дополнительное количество м-КПС. Для этого полученный клеточный осадок промывают, а затем суспендируют водой. К полученной суспензии добавляют при перемешивании 10-50%-ый водный раствор уксусной кислоты и после этого добавляют 3-8 % водный раствор нитрита натрия. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 0,5-2 часов при температуре 4 - 25°С, после чего ее разбавляют водой и центрифугируют. Полученный супернатант нейтрализуют водным раствором неорганического основания, выбранного из NaOH, KOH, NH4OH, или, преимущественно, твердым NaHCO3. Далее полученный раствор подвергают диализации или диафильтрации с последующей лиофилизацией с получением м-КПС (соединения общей формулы (I)).As mentioned above, during the cultivation of S. pneumoniae and after its completion in the process of cell sterilization after cultivation, lysis of microorganisms occurs, accompanied by the destruction of the cell wall PG with the help of released autolytic enzymes and the formation of a “bioconjugate.” Thus, part of the “bioconjugate” ends up in the supracellular fluid, and the other part remains in the composition of unlysed or partially lysed bacterial cells. From the sediment of such native and half-destroyed bacterial cells obtained after centrifugation, an additional amount of m-CPS can be obtained using a deamination reaction occurring in a heterogeneous phase. To do this, the resulting cell pellet is washed and then suspended with water. A 10-50% aqueous solution of acetic acid is added to the resulting suspension with stirring, and then a 3-8% aqueous solution of sodium nitrite is added. The resulting reaction mixture is stirred for 0.5-2 hours at a temperature of 4 - 25°C, after which it is diluted with water and centrifuged. The resulting supernatant is neutralized with an aqueous solution of an inorganic base selected from NaOH, KOH, NH 4 OH, or, preferably, solid NaHCO 3 . Next, the resulting solution is dialized or diafiltrated, followed by lyophilization to obtain m-CPS (compounds of general formula (I)).
В некоторых частных вариантах для получения м-КПС из клеточной массы 20 г влажного клеточного осадка суспендируют в 100-300 мл деионизованной воды (предпочтительно, в 200 мл деионизованной воды), центрифугируют, и полученный осадок обрабатывают еще раз описанным выше способом. Промытый осадок суспендируют в 10 - 30 мл деионизованной воды (предпочтительно, в 20 мл деионизованной воды), к полученной суспензии прибавляют при перемешивании 15 - 45 мл (в наиболее предпочтительном варианте 30 мл) раствора уксусной кислоты с концентрацией от 10 до 50 мас % (в наиболее предпочтительном варианте 30 мас %) и затем 15 - 45 мл (в наиболее предпочтительном варианте 30 мл) водного раствора нитрита натрия с концентрацией от 3 до 8 мас % (в наиболее предпочтительном варианте 5 мас %). Через 0,5 - 2 часа (в наиболее предпочтительном варианте 1 час) перемешивания при температуре 4 - 25°С (в наиболее предпочтительном варианте 20°С) реакционную смесь разбавляют в 3 раза деионизованной водой и центрифугируют. Супернатант нейтрализуют водным раствором неорганического основания (NaOH, KOH, NH4OH), или, преимущественно, твердым NaHCO3. Полученный раствор далее диализуют против деионизованной воды или подвергают диафильтрации с использованием мембраны с пределом отсечения 10 кДа, 20 кДа, 50 кДа или 100 кДа в зависимости от молекулярной массы полученного м-КПС и полученный водный раствор лиофилизуют.In some particular embodiments, to obtain m-CPS from a cell mass, 20 g of wet cell pellet is suspended in 100-300 ml of deionized water (preferably 200 ml of deionized water), centrifuged, and the resulting pellet is processed again in the manner described above. The washed sediment is suspended in 10 - 30 ml of deionized water (preferably 20 ml of deionized water), 15 - 45 ml (in the most preferred embodiment, 30 ml) of acetic acid solution with a concentration of 10 to 50 wt % is added to the resulting suspension with stirring. in the most preferred embodiment, 30 wt%) and then 15 to 45 ml (in the most preferred embodiment, 30 ml) of an aqueous solution of sodium nitrite with a concentration of from 3 to 8 wt% (in the most preferred embodiment, 5 wt%). After 0.5 - 2 hours (in the most preferred embodiment, 1 hour) of stirring at a temperature of 4 - 25°C (in the most preferred embodiment, 20°C), the reaction mixture is diluted 3 times with deionized water and centrifuged. The supernatant is neutralized with an aqueous solution of an inorganic base (NaOH, KOH, NH 4 OH), or, preferably, solid NaHCO 3 . The resulting solution is further dialyzed against deionized water or subjected to diafiltration using a membrane with a cut-off limit of 10 kDa, 20 kDa, 50 kDa or 100 kDa depending on the molecular weight of the resulting m-KPS and the resulting aqueous solution is lyophilized.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.The implementation of the invention is confirmed by the following examples.
Пример 1. Культивирование S. pneumoniaе и выделение п-КПСExample 1. Cultivation of S. pneumoniae and isolation of p-KPS
I. Культивирование I. Cultivation S. pneumoniaеS. pneumoniae
Клинические изоляты бактериальных штаммов S. pneumonia 20-тиразличных эпидемически значимых серотипов (1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 15F, 18C, 19F, 19A, 22F, 23A, 23F, 33F) были получены из коллекции «Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» ФГБУ МЗ РФ. Культивирование штаммов проводили методом глубинного культивирования по известной методике [Chase, M.W., Methods of Immunology and Immunochemistry 1, 52 (1967)] в 10-литровом ферментере при температуре 37°С с использованием питательной среды, содержащей дрожжевой экстракт (ультрафильтрат) и декстрозу (25 г/л). Культивирование продолжалось 8-26 часов в зависимости от серотипа S. pneumoniaе при контроле рН 6.0-7.2 добавлением 1н раствора NaOH. Процесс завершался при оптической плотности 2.5-3.5 (измерение при 660 нм) и прекращении поглощения декстрозы, о чем свидетельствовала неизменность величины рН в течение 20-30 минут. Немедленно в ферментер прибавляли 90%-ный водный раствор фенола до концентрации 1% и перемешивание продолжали 12-14 часов при комнатной температуре. Clinical isolates of bacterial strains of S. pneumonia of 20 different epidemically significant serotypes (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 15F, 18C, 19F, 19A, 22F, 23A, 23F, 33F) were obtained from the collection of the National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of the Federal State Budgetary Institution of the Ministry of Health of the Russian Federation. Cultivation of strains was carried out by deep cultivation according to a well-known method [Chase, MW, Methods of Immunology and Immunochemistry 1, 52 (1967)] in a 10-liter fermenter at a temperature of 37°C using a nutrient medium containing yeast extract (ultrafiltrate) and dextrose ( 25 g/l). Cultivation lasted 8-26 hours depending on the serotype of S. pneumoniae with pH control of 6.0-7.2 by adding a 1N NaOH solution. The process was completed at an optical density of 2.5-3.5 (measured at 660 nm) and the cessation of dextrose absorption, as evidenced by the unchanged pH value for 20-30 minutes. A 90% aqueous solution of phenol was immediately added to the fermenter to a concentration of 1% and stirring was continued for 12-14 hours at room temperature.
II-III. Отделение надклеточной жидкости и выделение неочищенного п-КПСII-III. Separation of supracellular fluid and isolation of crude p-CPS S. pneumoniaеS. pneumoniae
Суспензию бактериальных клеток подвергли тангенциальной микрофильтрации с использованием мембраны 0.22 мкм (Владисарт), фильтрат сконцентрировали, для удаления компонентов питательной среды и низкомолекулярных продуктов, образующихся в процессе культивирования, провели диафильтрацию (0.2М хлорид натрия, затем деионизованная вода) с использованием мембраны с пределом отсечения 100 кДа. После концентрирования и лиофилизации получили неочищенный п-КПС с выходом 20-110мг/л в зависимости от серотипа S. pneumoniaе. A suspension of bacterial cells was subjected to tangential microfiltration using a 0.22 μm membrane (Vladisart), the filtrate was concentrated, and diafiltration (0.2 M sodium chloride, then deionized water) was performed to remove components of the nutrient medium and low molecular weight products formed during the cultivation process using a membrane with a cutoff limit 100 kDa. After concentration and lyophilization, crude p-CPS was obtained with a yield of 20-110 mg/l, depending on the serotype of S. pneumoniae.
IV. Получение очищенного п-КПС IV. Preparation of purified p-KPS S. pneumoniaеS. pneumoniae
К раствору неочищенного п-КПС в 0.2М хлориде натрия (10 мг/ мл) рН 7.2-7.4, добавляли рибонуклеазу (30-100 мкг/мл) и дезоксирибонуклеазу (10-50 мкг/мл), через 1-2 часа перемешивания при температуре 37°С рН смеси доводили до 8.0, добавляли протеиназу К (10-50 мкг/мл) и перемешивание продолжали 16-18 часов при температуре 56°С. Реакционную смесь подвергли диафильтрации (деионизованная вода) и после концентрирования и лиофилизации получали п-КПС S. pneumoniaе, содержащий не более 1-2% примеси нуклеиновых кислот и белков. Определение проводили в соответствии с рекомендациями Государственной Фармакопеи РФ. To a solution of crude p-KPS in 0.2 M sodium chloride (10 mg/ml) pH 7.2-7.4, ribonuclease (30-100 μg/ml) and deoxyribonuclease (10-50 μg/ml) were added, after 1-2 hours of stirring at at a temperature of 37°C, the pH of the mixture was adjusted to 8.0, proteinase K (10-50 μg/ml) was added, and stirring was continued for 16-18 hours at a temperature of 56°C. The reaction mixture was subjected to diafiltration (deionized water) and after concentration and lyophilization, S. pneumoniae p-CPS was obtained, containing no more than 1-2% admixture of nucleic acids and proteins. The determination was carried out in accordance with the recommendations of the State Pharmacopoeia of the Russian Federation.
В результате проведенной работы были выделены п-КПС более 20 эпидемически значимых серотипов S. pneumoniae. Подтверждение подлинности полученных п-КПС следовало из сопоставления 1Н-ЯМР-спектров выделенных препаратов и соответствующих литературных данных. Анализ опубликованных ранее результатов исследований показал, что п-КПС каждого серотипа S. pneumoniae обладает уникальным набором сигналов в слабопольной области спектра 1Н-ЯМР (сигналы аномерных протонов) и в области сильного поля (сигналы О- и N-ацетильных групп, 6-дезоксигрупп и остатков пировиноградной кислоты), тогда как сопоставление областей циклических протонов спектров в данной ситуации не информативен. Каждый из выделенных п-КПС содержал по данным 1Н-ЯМР-спектроскопии от 5 до 15% ОПАП. Примеры1Н-ЯМР спектров п-КПС S. pneumoniae приведены на Фиг.2А.As a result of the work, more than 20 epidemically significant serotypes of S. pneumoniae were isolated by p-KPS. Confirmation of the authenticity of the obtained p-CPS followed from a comparison of the 1 H NMR spectra of the isolated preparations and the corresponding literature data. An analysis of previously published research results showed that p-KPS of each S. pneumoniae serotype has a unique set of signals in the low-field region of the 1 H-NMR spectrum (signals of anomeric protons) and in the high-field region (signals of O- and N-acetyl groups, 6- deoxy groups and pyruvic acid residues), while comparison of the cyclic proton regions of the spectra in this situation is not informative. Each of the isolated p-CPS contained, according to 1 H-NMR spectroscopy, from 5 to 15% OPAP. Examples of 1 H-NMR spectra of p-CPS of S. pneumoniae are shown in Fig. 2A.
Пример 2. Дезаминирование очищенного п-КПС S. pneumoniaе Example 2. Deamination of purified p-KPS from S. pneumoniae
На этапе V. к раствору 20 мг п-КПС в 1 мл воды добавляли 1.5 мл 33.3 %-ного водного раствора уксусной кислоты (в соотношении CH3COOН : Н2Оот 1:3 до 1:5) и 1.5 мл 5%-ного водного раствора нитрита натрия, через 60 минут перемешивания при комнатной температуре реакционную смесь разбавляли 10 мл деионизованной воды, нейтрализовали бикарбонатом натрия, диализовали против деионизированной воды, диализат лиофилизовали, раствор сухого остатка в деионизированной воде центрифугировали 60 минут при 20000 об/мин, супернатант лиофилизовали. Выход м-КПС (соединения формулы (I)), составлял 11-17 мг в зависимости от серотипа S. pneumoniaе. At stage V., to a solution of 20 mg of p-CPS in 1 ml of water, 1.5 ml of a 33.3% aqueous solution of acetic acid was added (in the ratio CH 3 COOH : H 2 O from 1:3 to 1:5) and 1.5 ml of 5% - aqueous solution of sodium nitrite, after 60 minutes of stirring at room temperature, the reaction mixture was diluted with 10 ml of deionized water, neutralized with sodium bicarbonate, dialyzed against deionized water, the dialysate was lyophilized, a solution of the dry residue in deionized water was centrifuged for 60 minutes at 20,000 rpm, the supernatant was lyophilized . The yield of m-KPS (compound of formula (I)) was 11-17 mg, depending on the serotype of S. pneumoniae.
Пример1Н-ЯМР спектра м-КПС бактериального штамма S. pneumoniaе серотипа 6А приведен на Фиг.2Б.Example 1 H-NMR spectrum of m-KPS of the bacterial strain S. pneumoniae serotype 6A is shown in Fig. 2B.
Пример 3. Получение м-КПС путем дезаминирования клеток S. pneumoniaе Example 3. Preparation of m-KPS by deamination of S. pneumoniae cells
Клеточную массу, полученную в результате отделения надклеточной жидкости (см. Пример 1), трижды промывали 0,2 M раствором NaCl и далее деионизованной водой. 10 г влажной бактериальной массы суспензировали в 50 мл деионизированной воды, к перемешиваемой суспензии добавляли 75 мл разбавленной уксусной кислоты (в соотношении CH3COOН: Н2О 1:3) и 75 мл 5%-ного водного раствора нитрита натрия. Через 1 час перемешивания суспензию центрифугировали, супернатант нейтрализовали бикарбонатом натрия и после диафильтрации и лиофилизации получили очищенный м-КПС. Выход м-КПС (соединения формулы (I)), составляет 100 -150 мг в зависимости от серотипа S. pneumoniae. The cell mass obtained by separating the supercellular fluid (see Example 1) was washed three times with a 0.2 M NaCl solution and then with deionized water. 10 g of wet bacterial mass was suspended in 50 ml of deionized water, 75 ml of diluted acetic acid (in the ratio CH3COOH : H2O 1:3) and 75 ml of a 5% aqueous solution of sodium nitrite were added to the stirred suspension. After 1 hour of stirring, the suspension was centrifuged, the supernatant was neutralized with sodium bicarbonate, and after diafiltration and lyophilization, purified m-KPS was obtained. The yield of m-KPS (compound of formula (I)) is 100 -150 mg, depending on the serotype of S. pneumoniae.
Пример 4. Получение конъюгата м-КПС S. pneumoniaе, серотип 6B и бычьего сывороточного альбумина (БСА) с использованием многоточечной схемы соединения полисахаридного и белкового антигеновExample 4. Preparation of a conjugate of m-KPS S. pneumoniae , serotype 6B and bovine serum albumin (BSA) using a multipoint scheme for connecting polysaccharide and protein antigens
9 мг м-КПС S. pneumoniaе, серотип 6В растворяли в 1 мл 0,01М раствора периодата натрия, через 30 минут перемешивания при температуре 40°С, что приводило к частичному окислению остатков рибитаи образованию альдегидных групп на полисахаридной цепи (см. строение повторяющегося звена полисахарида на стр. 12), к реакционной смеси прибавляли 50 мкл этиленгликоля, диализовали против воды и лиофилизовали. 7,7 мг полученного лиофилизата растворяли в 1 мл 0,1М натрий-ацетатного буфера, рН 5,8, затем прибавляли последовательно 21,8 БСА и 19,5 мг цианборгидрида, через 16 часов перемешивания при 37°С реакционную смесь нейтрализовали разбавленной соляной кислотой и хроматографировали на колонке (1,5 х 75 см) с сефарозой 6В, уравновешенной 0,05н АсОН. Конъюгат (выход 27,0 мг) элюировался вблизи фронта, не вступившего в реакцию БСА в результате гель-хроматографии не обнаружено. Спектр ЯМР содержал две серии близких по интегральной интенсивности сигналов, принадлежащих исходному полисахариду и БСА.9 mg of m-KPS S. pneumoniae , serotype 6B was dissolved in 1 ml of 0.01 M sodium periodate solution, after 30 minutes of stirring at a temperature of 40°C, which led to partial oxidation of ribitai residues and the formation of aldehyde groups on the polysaccharide chain (see structure of the repeating element polysaccharide unit on page 12), 50 μl of ethylene glycol was added to the reaction mixture, dialyzed against water and lyophilized. 7.7 mg of the resulting lyophilisate was dissolved in 1 ml of 0.1 M sodium acetate buffer, pH 5.8, then 21.8 BSA and 19.5 mg of cyanoborohydride were added successively, after 16 hours of stirring at 37°C, the reaction mixture was neutralized with dilute hydrochloric acid acid and chromatographed on a column (1.5 x 75 cm) with Sepharose 6B equilibrated with 0.05 N AcOH. The conjugate (yield 27.0 mg) eluted near the front, and no unreacted BSA was detected as a result of gel chromatography. The NMR spectrum contained two series of signals with similar integrated intensity, belonging to the original polysaccharide and BSA.
Пример 5. Получение конъюгата м-КПС S. pneumoniaе, серотип 6B и бычьего сывороточного альбумина (БСА) с использованием активной альдегидной группы остатка 2.5-ангидроманнозы,Example 5. Preparation of a conjugate of m-KPS S. pneumoniae, serotype 6B and bovine serum albumin (BSA) using the active aldehyde group of the 2.5-anhydromannose residue,
К раствору 5,2 мг м-КПС S. pneumoniaе, серотип 6B в 1 мл 0,1М натрий-ацетатного буфера, рН 5,8 прибавляли последовательно 9,8 БСА (избыток) и 9,5 мг цианборгидрида натрия, через 16 часов перемешивания при 37°С реакционную смесь нейтрализовали разбавленной соляной кислотой и хроматографировали на колонке (1,5 х 75 см) с сефарозой 6В, уравновешенной 0,05н АсОН. Конъюгат элюировался вблизи фронта, тогда как БСА (избыток), не вступивший в реакцию, элюировался значительно позже. Выход конъюгата после лиофилизации составил 5,7 мг. Спектр ЯМР конъюгата представлял собой суперпозицию мажорных сигналов спектра исходного м-КПС S. pneumoniaе, серотип 6B и минорных сигналов, характерных для белков.To a solution of 5.2 mg m-KPS S. pneumoniae , serotype 6B in 1 ml of 0.1 M sodium acetate buffer, pH 5.8, 9.8 BSA (excess) and 9.5 mg sodium cyanoborohydride were added successively, after 16 hours After stirring at 37°C, the reaction mixture was neutralized with dilute hydrochloric acid and chromatographed on a column (1.5 x 75 cm) with Sepharose 6B equilibrated with 0.05 N AcOH. The conjugate eluted near the front, while BSA (excess), which did not react, eluted much later. The yield of the conjugate after lyophilization was 5.7 mg. The NMR spectrum of the conjugate was a superposition of the major signals of the spectrum of the original m-KPS S. pneumoniae , serotype 6B and minor signals characteristic of proteins.
Пример 6. Исследование антигенной активности м-КПС S. pneumoniaе, серотип 6BExample 6. Study of the antigenic activity of m-KPS S. pneumoniae, serotype 6B
Исследование проводили на мышах линии C57BL/6 (5-6 недель, поставщик ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий федерального медико-биологического агентства» филиал «Столбовая»), методом трехкратной подкожной иммунизации с двухнедельным перерывом между введениями (дни 0, 14, 28). Вес животных к началу введения составлял 18-20 г. Препарат вводили в двух дозах - 0,5 и 5 мкг/животное м-КПС серотипа 6B. В исследование были отобраны животные без признаков отклонений в состоянии здоровья (после клинического осмотра и карантина) с учетом массы тела: разброс массы тела между животными, отобранными в группы, не превышал 10%, среднее значение массы тела статистически не различалось между группами. Животных распределяли по группам случайным образом. Исследуемые группы и дозы приведены в таблице 1.The study was carried out on mice of the C57BL/6 line (5-6 weeks, supplier of the Federal State Budgetary Institution “Scientific Center for Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency” branch “Stolbovaya”), using the method of three-time subcutaneous immunization with a two-week break between administrations (days 0, 14, 28) . The weight of the animals at the beginning of administration was 18-20 g. The drug was administered in two doses - 0.5 and 5 μg/animal m-KPS serotype 6B. Animals without signs of abnormal health conditions (after clinical examination and quarantine) were selected for the study, taking into account body weight: the spread of body weight between animals selected into groups did not exceed 10%, the average body weight did not differ statistically between groups. Animals were randomly assigned to groups. Study groups and doses are shown in Table 1.
Перед первой иммунизацией (0 день), перед второй иммунизацией (14 день) и через неделю после третьей иммунизации (35 день) проводили забор образцов крови с последующим получением сывороток. Для всех образцов сывороток проводили анализ продукции иммуноглобулинов классов M и G (IgM и IgG) методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА); для образцов сывороток, собранных на 35 сутки после первой иммунизации, дополнительно проводили анализ бактериостатической активности с использованием бактериального штамма S. pneumoniae серотипа 6B.Before the first immunization (day 0), before the second immunization (day 14), and a week after the third immunization (day 35), blood samples were taken, followed by serum collection. For all serum samples, the production of immunoglobulins of classes M and G (IgM and IgG) was analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); For serum samples collected on day 35 after the first immunization, an additional analysis of bacteriostatic activity was performed using the bacterial strain S. pneumoniae serotype 6B.
I. Динамика набора массы животными в экспериментальных группахI. Dynamics of weight gain by animals in experimental groups
В результате проведенного исследования было установлено, что динамика набора веса животными контрольной и опытных групп не различалась (Фиг.4 А, Б). Статистически значимые отличия веса мышей не были выявлены вплоть до конца наблюдения. As a result of the study, it was found that the dynamics of weight gain in animals of the control and experimental groups did not differ (Figure 4 A, B). Statistically significant differences in the weight of mice were not detected until the end of the observation.
II. Оценка уровня продукции специфических иммуноглобулинов IgG и IgM методом ИФАII. Assessment of the level of production of specific immunoglobulins IgG and IgM by ELISA
Уровень специфических антител к м-КПС бактериального штамма S. pneumoniae серотипа 6В в сыворотке крови мышей после трехкратной иммунизации оценивали методом непрямого неконкурентного ИФА. Для этого предварительно проводили сорбцию антигена (0,4 мкг/лунку м-КПС серотипа 6B) на плашку (Greiner, Германия) в течение ночи при 4°С. Сыворотку крови мышей разводили ИФА-буфером S011 (Хема, Россия) в соотношении 1:100. Для детекции специфических иммуноглобулинов IgG и IgM использовали, соответственно, конъюгат с пероксидазой хрена поликлональных антител козы к IgG мыши (0,8 мг/мл, HyTest) и конъюгат с пероксидазой хрена поликлональных антител козы к IgM мыши 100X (Alpha Diagnostic H-MsM.211) в соответствии с инструкцией производителя. The level of specific antibodies to m-KPS of the bacterial strain S. pneumoniae serotype 6B in the blood serum of mice after triple immunization was assessed using indirect non-competitive ELISA. To do this, the antigen was previously adsorbed (0.4 μg/well of m-KPS serotype 6B) onto a plate (Greiner, Germany) overnight at 4°C. Mouse blood serum was diluted with ELISA buffer S011 (Khema, Russia) in a ratio of 1:100. To detect specific immunoglobulins IgG and IgM, we used, respectively, a horseradish peroxidase conjugate of goat polyclonal antibodies to mouse IgG (0.8 mg/ml, HyTest) and a horseradish peroxidase conjugate of goat polyclonal antibodies to mouse IgM 100X (Alpha Diagnostic H-MsM. 211) in accordance with the manufacturer's instructions.
Проведенное исследование специфических IgG и IgM к капсульным полисахаридам в сыворотке крови мышей подтвердило формирование иммунного ответа на введение м-КПС серотипа 6B и его достоверное увеличение по сравнению с контрольной группой PBS, начиная с момента введения первой дозы (см. Фиг.5А, Б). При этом уровень продукции антител носит дозозависимый характер и повышается при увеличении дозы иммунизации. A study of specific IgG and IgM to capsular polysaccharides in the blood serum of mice confirmed the formation of an immune response to the introduction of m-KPS serotype 6B and its significant increase compared to the PBS control group, starting from the moment of administration of the first dose (see Fig. 5A, B) . At the same time, the level of antibody production is dose-dependent and increases with increasing immunization dose.
III. Оценка бактериостатической активности сыворотки крови животных после иммунизацииIII. Assessment of bacteriostatic activity of animal blood serum after immunization
Бактериостатический эффект оценивали по способности сыворотки крови животных ингибировать рост бактериальной культуры исследуемого штамма (S. pneumoniae серотипа 6В) при инкубации в течение 20 часов. Для этого штамм выращивали на питательной среде TSB (триптон-соевый бульон) с добавлением 5% крови КРС (крупного рогатого скота) в течение 18-24 часов при 37°С. Колонии ресуспендировали в стерильном фосфатно-солевом буфере до достижения мутности по стандарту МакФарланда 0,5. Далее культуру разбавляли в 100 раз средой TSB+5% кровь КРС и вносили (50 мкл) в лунки 96-луночного планшета, содержащие 50 мкл исследуемой сыворотки. В качестве контролей использовали смесь бактериальной суспензии и среды (контроль роста) и питательную среду (контроль стерильности). После инкубации полученных смесей при 37°С в течение 20 часов, содержимое лунок хорошо перемешивали и измеряли оптическую плотность при длине волны 600 нм (OD600).The bacteriostatic effect was assessed by the ability of animal blood serum to inhibit the growth of the bacterial culture of the test strain ( S. pneumoniae serotype 6B) upon incubation for 20 hours. For this purpose, the strain was grown on TSB nutrient medium (tryptone soy broth) with the addition of 5% cattle blood for 18-24 hours at 37°C. Colonies were resuspended in sterile phosphate-buffered saline to achieve a McFarland turbidity of 0.5. Next, the culture was diluted 100 times with TSB medium + 5% cattle blood and added (50 μl) to the wells of a 96-well plate containing 50 μl of the test serum. A mixture of bacterial suspension and medium (growth control) and a nutrient medium (sterility control) were used as controls. After incubating the resulting mixtures at 37°C for 20 hours, the contents of the wells were mixed well and the optical density was measured at a wavelength of 600 nm (OD 600 ).
Спустя 20 часов инкубации сывороток с бактериальным штаммом было выявлено снижение роста бактериальной культуры в сыворотке крови животных опытной группы м-КПС 5 мкг, по сравнению с контрольной группой PBS; для сыворотки крови животных опытной группы м-КПС 0,5 мкг статистически значимых эффектов не наблюдалось. Так же, как и в случае исследования иммуногенности, наблюдается дозозависимый эффект введения (см. Фиг.6).After 20 hours of incubation of the sera with the bacterial strain, a decrease in the growth of the bacterial culture was detected in the blood serum of animals in the experimental group of m-KPS 5 μg, compared with the PBS control group; for the blood serum of animals in the experimental group m-KPS 0.5 μg, no statistically significant effects were observed. As in the case of the immunogenicity study, a dose-dependent effect of administration was observed (see Figure 6).
Таким образом, в результате проведенного эксперимента было показано, что введение м-КПС не приводит к серьезным изменениям в общем состоянии животных (не влияет на динамику набора массы в группах), обладает иммуногенностью, вызывая формирование специфических иммуноглобулинов классов M и G в дозозависимой манере, кроме того, приводит к повышению бактериостатической активности сыворотки крови животных в отношении соответствующего штамма S. pneumoniae, что позволяет применять м-КПС в качестве антигена при разработке пневмококковых вакцин на основе полисахаридов.Thus, as a result of the experiment, it was shown that the administration of m-KPS does not lead to serious changes in the general condition of the animals (does not affect the dynamics of weight gain in groups), is immunogenic, causing the formation of specific immunoglobulins of classes M and G in a dose-dependent manner, in addition, it leads to an increase in the bacteriostatic activity of animal blood serum against the corresponding strain of S. pneumoniae , which allows the use of m-KPS as an antigen in the development of pneumococcal vaccines based on polysaccharides.
Пример 7. Анализ различий эпитопного состава м-КПС и п-КПС S. pneumoniaе Example 7. Analysis of differences in the epitope composition of m-KPS and p-KPS of S. pneumoniae
Поскольку способ получения КПС может влиять на его эпитопный состав как антигена и, как следствие, на иммуногенные свойства, была проведена оценка возможных различий антигенной структуры м-КПС и п-КПС, полученных из бактериальных штаммов S. pneumoniae серотипа 6В. Для этого методом твердофазного ИФА была исследована способность антител, полученных к м-КПС, связываться с п-КПС. Since the method of obtaining KPS can affect its epitope composition as an antigen and, as a consequence, its immunogenic properties, possible differences in the antigenic structure of m-KPS and p-KPS obtained from bacterial strains of S. pneumoniae serotype 6B were assessed. For this purpose, the ability of antibodies obtained to m-KPS to bind to p-KPS was studied using solid-phase ELISA.
Образцы сыворотки крови животных, полученные на 35 сутки после первой иммунизации, исследовали методом непрямого неконкурентного ИФА по протоколу ВОЗ (http://www.vaccine.uab.edu/). В лунки ИФА планшетов (Greiner MED BINDING, Ref 655001) вносили по 5 мкг п-КПС или 0,5 мкг м-КПС и сорбировали планшеты 5 часов при 37°С, а затем ночь в холодильнике. Перед использованием планшеты трижды отмывали PBS c 0,1% Tween-20. Сыворотку крови мышей, иммунизированных м-КПС в дозах 0,5 и 5 мкг (см. Пример 4), разводили 1:100 в ИФА-буфере S011 (Хема, Россия) и вносили в лунки по 100 мкл. Планшеты с образцами инкубировали в термошейкере в течение 1 часа при 37°С и перемешивании со скоростью 600 об/мин. После окончания инкубации лунки трижды отмывали от не связавшихся антител, внося в них по 300 мкл PBS с 0,1% Твин-20, после чего инкубировали с поликлональными антивидовыми антителами козы к IgG мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (HyTest, Finland) в разведении 1:25 000. Затем планшеты отмывали 6 раз и визуализировали реакцию, внося в лунки по 100 мкл субстратного буфера с тетраметиленбензидином. Через 15 минут реакцию останавливали 10% раствором HCl и на планшетном спектрофотометре SpectrostarNano (BMG Labtech) измеряли в лунках оптическую плотность при длине волны 450 нм. Результаты измерения уровня антител IgG к п-КПС и м-КПС представлены на Фиг.7. Animal blood serum samples obtained on the 35th day after the first immunization were examined by indirect non-competitive ELISA according to the WHO protocol ( http://www.vaccine.uab.edu/ ). 5 μg of p-KPS or 0.5 μg of m-KPS were added to the wells of ELISA plates (Greiner MED BINDING, Ref 655001), and the plates were sorbed for 5 hours at 37°C, and then overnight in the refrigerator. Before use, the plates were washed three times with PBS and 0.1% Tween-20. The blood serum of mice immunized with m-KPS in doses of 0.5 and 5 μg (see Example 4) was diluted 1:100 in ELISA buffer S011 (Khema, Russia) and added to wells in 100 μl. The sample plates were incubated in a thermal shaker for 1 hour at 37°C and stirring at 600 rpm. After incubation, the wells were washed three times from unbound antibodies by adding 300 μl of PBS with 0.1% Tween-20, after which they were incubated with polyclonal anti-species goat antibodies to mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HyTest, Finland) in dilution 1:25,000. Then the plates were washed 6 times and the reaction was visualized by adding 100 μl of substrate buffer with tetramethylenebenzidine to the wells. After 15 minutes, the reaction was stopped with a 10% HCl solution and the optical density in the wells was measured at a wavelength of 450 nm using a SpectrostarNano plate spectrophotometer (BMG Labtech). The results of measuring the level of IgG antibodies to p-KPS and m-KPS are presented in Figure 7.
Как видно на приведенной диаграмме, в условиях сорбции, оптимальных для п-КПС и м-КПС, статистически значимых различий уровней IgG в группах мышей, иммунизированных м-КПС в дозах 0,5 и 5 мкг/животное, не выявлено. Таким образом, антитела, полученные к м-КПС, способны распознавать п-КПС, что может свидетельствовать о наличии у этих препаратов общих эпитопов. Различие уровней IgG, связавшихся с антигеном, в группе контрольных мышей (PBS) может быть обусловлено примесями ОПАП в препарате п-КПС.As can be seen in the diagram above, under sorption conditions optimal for p-KPS and m-KPS, no statistically significant differences in IgG levels were detected in groups of mice immunized with m-KPS at doses of 0.5 and 5 μg/animal. Thus, antibodies obtained to m-KPS are able to recognize p-KPS, which may indicate the presence of common epitopes in these drugs. The difference in the levels of IgG bound to the antigen in the control mice (PBS) group may be due to OPAP impurities in the p-KPS preparation.
Таким образом, технический результат изобретения подтверждается тем, что получены модифицированные капсульные полисахариды (м-КПС), не обладающие недостатками, присущими п-КПС, а именно, не содержащие примеси балластного общего полисахаридного антигена S. pneumoniae. Полученные м-КПС содержат остаток 2,5-ангидро-D-маннозы на восстанавливающем конце, альдегидная группа которой может быть использована для конъюгации с аминосодержащей матрицей белковой или иной природы, без необходимости дополнительной активации м-КПС при проведении конъюгации, при этом полученные м-КПС обладают более высокой растворимостью в водных буферах, чем п-КПС, что позволяет повысить технологичность процессов конъюгации и могут быть использованы для получения поливалентных пневмококковых полисахаридных вакцин, а также пневмококковых гликоконъюгированных вакцин.Thus, the technical result of the invention is confirmed by the fact that modified capsular polysaccharides (m-CPS) have been obtained that do not have the disadvantages inherent in p-CPS, namely, they do not contain impurities of the ballast common polysaccharide antigen of S. pneumoniae . The resulting m-KPS contain a 2,5-anhydro-D-mannose residue at the reducing end, the aldehyde group of which can be used for conjugation with an amino-containing matrix of a protein or other nature, without the need for additional activation of m-KPS during conjugation, and the resulting m -CPS have a higher solubility in aqueous buffers than p-CPS, which makes it possible to improve the manufacturability of conjugation processes and can be used to obtain polyvalent pneumococcal polysaccharide vaccines, as well as pneumococcal glycoconjugate vaccines.
Промышленная применимостьIndustrial applicability
Полученные модифицированные капсульные полисахариды (м-КПС), не содержащие примеси балластного общего полисахаридного антигена S. pneumonia и содержащие остаток 2,5-ангидро-D-маннозы на восстанавливающем конце, альдегидная группа которой может быть использована для конъюгации с аминосодержащей матрицей белковой или иной природы, без необходимости дополнительной активации м-КПС при проведении конъюгации могут быть использованы для получения конъюгированных вакцин против S. pneumoniae. The resulting modified capsular polysaccharides (m-CPS), which do not contain impurities of the ballast common polysaccharide antigen of S. pneumonia and contain a 2,5-anhydro-D-mannose residue at the reducing end, the aldehyde group of which can be used for conjugation with an amino-containing protein or other matrix nature, without the need for additional activation of m-KPS during conjugation, can be used to obtain conjugate vaccines against S. pneumoniae .
Цитируемые документыCited Documents
1. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016 / C. Troeger, B. Blacker, I.A. Khalil et al. // The Lancet Infectious Diseases. - 2018. - V.18. - P.1191-210. 1. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016 / C. Troeger, B. Blacker, I.A. Khalil et al. // The Lancet Infectious Diseases. - 2018. - V.18. - P.1191-210.
2. Immunologic responses of children to serious infections with Streptococcus pneumoniae / C.G. Prober, H. Frayha, M. Klein et al. // J Infect Dis - 1983. - V.148, No.3. - P.427-435. 2. Immunologic responses of children to serious infections with Streptococcus pneumoniae / CG Prober, H. Frayha, M. Klein et al. // J Infect Dis - 1983. - V.148, No.3. - P.427-435.
3. Covalent linkage between the capsular polysaccharide and the cell wall peptidoglycan of Streptococcus pneumoniae revealed by immunochemical methods // Uffe B.SkovSørensen, JørgenHenrichsen, Hao-ChiaChen, Shousun ChenSzu. //Microbial Pathogenesis - 1990. - V.8, Issue 5, - P. 325-334.3. Covalent linkage between the capsular polysaccharide and the cell wall peptidoglycan of Streptococcus pneumoniae revealed by immunochemical methods // Uffe B.SkovSørensen, JørgenHenrichsen, Hao-ChiaChen, Shousun ChenSzu. //Microbial Pathogenesis - 1990. - V.8, Issue 5, - P. 325-334.
4. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide is linked to peptidoglycan via a direct glycosidic bond to β-D- N-acetylglucosamine.// Thomas R Larson, Janet Yother // Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 May 30;114(22):5695-5700. doi: 10.1073/pnas.1620431114.4. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide is linked to peptidoglycan via a direct glycosidic bond to β-D-N-acetylglucosamine. // Thomas R Larson, Janet Yother // Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 May 30;114(22): 5695-5700. doi: 10.1073/pnas.1620431114.
5. The pneumococcal common antigen C-polysaccharide occurs in different forms. Mono-substituted or di-substituted with phosphocholine.// C Karlsson 1, P E Jansson, U B Skov Sørensen.// Eur J Biochem. 1999 Nov;265(3):1091-7. doi: 10.1046/j.1432-1327.1999.00835.x.5. The pneumococcal common antigen C-polysaccharide occurs in different forms. Mono-substituted or di-substituted with phosphocholine.// C Karlsson 1, P E Jansson, U B Skov Sørensen.// Eur J Biochem. 1999 Nov;265(3):1091-7. doi: 10.1046/j.1432-1327.1999.00835.x.
6. Removal of cell wall polysaccharide in pneumococcal capsular polysaccharides by selective degradation via deamination. // Wei Zou, Jianjun Li, Evguenii Vinogradov, Andrew Cox. // Carbohydrate Polymers. — 2019 V. 218, P. 199-2076. Removal of cell wall polysaccharide in pneumococcal capsular polysaccharides by selective degradation via deamination. // Wei Zou, Jianjun Li, Evguenii Vinogradov, Andrew Cox. // Carbohydrate Polymers. — 2019 V. 218, P. 199-207
7. Deamination of carbohydrate amines and related compounds // A Williams // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. - 1975 -31, N1, 9-797. Deamination of carbohydrate amines and related compounds // A Williams // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. - 1975 -31, N1, 9-79
8. Accelerated method of purification for obtaining capsular polysaccharides of streptococcus pneumoniae.// RU2516340C28. Accelerated method of purification for obtaining capsular polysaccharides of streptococcus pneumoniae.// RU2516340C2
9. The pgdA gene encodes for a peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylase in Streptococcus pneumoniae. // W Vollmer , A Tomasz. // J Biol Chem. 2000 Jul 7;275(27):20496-501. 9. The pgdA gene encodes for a peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylase in Streptococcus pneumoniae. // W Vollmer, A Tomasz. // J Biol Chem. 2000 Jul 7;275(27):20496-501.
10. Considerations for formulating the second-generation pneumococcal capsular polysaccharide vaccine with emphasis on the cross-reactive types within groups.// J B Robbins, R Austrian, C J Lee, S C Rastogi, G Schiffman, J Henrichsen, P H Mäkelä, C V Broome, R R Facklam, R H Tiesjema, et al.// J Infect Dis. 1983 Dec;148(6):1136-59. doi: 10.1093/infdis/148.6.1136. PMID: 6361173 DOI: 10.1093/infdis/148.6.1136.10. Considerations for formulating the second-generation pneumococcal capsular polysaccharide vaccine with emphasis on the cross-reactive types within groups. // J B Robbins, R Austrian, C J Lee, S C Rastogi, G Schiffman, J Henrichsen, P H Mäkelä, C V Broome, R R Facklam, R H Tiesjema, et al. // J Infect Dis. 1983 Dec;148(6):1136-59. doi: 10.1093/infdis/148.6.1136. PMID: 6361173 DOI: 10.1093/infdis/148.6.1136.
11. Studies on immunological paralysis. V. The influence of molecular weight on the immunogenicity, tolerogenicity and antibody-neutralizing activity of the 3 pneumococcal polysaccharide.// J G Howard, H Zola, G H Christie, B M Courtenay.// Immunology. 1971 Sep;21(3):535-46. PMID: 4398137 PMCID: PMC140815411. Studies on immunological paralysis. V. The influence of molecular weight on the immunogenicity, tolerogenicity and antibody-neutralizing activity of the 3 pneumococcal polysaccharide.// J G Howard, H Zola, G H Christie, B M Courtenay.// Immunology. 1971 Sep;21(3):535-46. PMID: 4398137 PMCID: PMC1408154
12. A Strategy for Rational Design of Fully Synthetic Glycopeptide Conjugate Vaccines. // PELE CHONG,* NEVILLE CHAN, ALI KANDIL, BRIAN TRIPET, OLIVE JAMES, YAN-PING YANG, SHAN-PAN SHI, AND MICHEL KLEIN.// INFECTION AND IMMUNITY Vol. 65, No. 12Dec. 1997, p. 4918-4925.12. A Strategy for Rational Design of Fully Synthetic Glycopeptide Conjugate Vaccines. // PELE CHONG,* NEVILLE CHAN, ALI KANDIL, BRIAN TRIPET, OLIVE JAMES, YAN-PING YANG, SHAN-PAN SHI, AND MICHEL KLEIN.// INFECTION AND IMMUNITY Vol. 65, No. 12Dec. 1997, p. 4918-4925.
13. Structural analysis and chemical depolymerization of the capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae type 1. // Stroop, C.é J.M.; Xu, Q.; Retzlaff, M.; Abeygunawardana, C.; Bush, C.A. // Carbohydrate Research 337(4): 335-344. 2002. ISSN/ISBN: 0008-6215 PMID: 11841814 DOI: 10.1016/s0008-6215(01)00318-4.13. Structural analysis and chemical depolymerization of the capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae type 1. // Stroop, C.é J.M.; Xu, Q.; Retzlaff, M.; Abeygunawardana, C.; Bush, C.A. // Carbohydrate Research 337(4): 335-344. 2002. ISSN/ISBN: 0008-6215 PMID: 11841814 DOI: 10.1016/s0008-6215(01)00318-4.
14. Characterization of the cassette containing genes for type 3 capsular polysaccharide biosynthesis in Streptococcus pneumoniae. // J P Dillard 1, M W Vandersea, J Yother. // J Exp Med. 1995 Mar 1;181(3):973-83. doi: 10.1084/jem.181.3.973. PMID: 7869055 PMCID: PMC2191931 DOI: 10.1084/jem.181.3.973.14. Characterization of the cassette containing genes for type 3 capsular polysaccharide biosynthesis in Streptococcus pneumoniae. // J P Dillard 1, M W Vandersea, J Yother. // J Exp Med. 1995 Mar 1;181(3):973-83. doi: 10.1084/jem.181.3.973. PMID: 7869055 PMCID: PMC2191931 DOI: 10.1084/jem.181.3.973.
15. Type 3-specific synthase of Streptococcus pneumoniae (Cap3B) directs type 3 polysaccharide biosynthesis in Escherichia coli and in pneumococcal strains of different serotypes.//C Arrecubieta 1, R López, E García.// J Exp Med. 1996 Aug 1;184(2):449-55. doi: 10.1084/jem.184.2.449. PMID: 8760798 PMCID: PMC2192726 DOI: 10.1084/jem.184.2.449.15. Type 3-specific synthase of Streptococcus pneumoniae (Cap3B) directs type 3 polysaccharide biosynthesis in Escherichia coli and in pneumococcal strains of different serotypes.//C Arrecubieta 1, R López, E García.// J Exp Med. 1996 Aug 1;184(2):449-55. doi: 10.1084/jem.184.2.449. PMID: 8760798 PMCID: PMC2192726 DOI: 10.1084/jem.184.2.449.
Claims (18)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2818894C1 true RU2818894C1 (en) | 2024-05-07 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019139692A2 (en) * | 2017-12-06 | 2019-07-18 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
| US20220105169A1 (en) * | 2017-08-16 | 2022-04-07 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Pneumococcal conjugate vaccine formulations |
| US11642406B2 (en) * | 2018-12-19 | 2023-05-09 | Merck Sharp & Dohme Llc | Compositions comprising Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220105169A1 (en) * | 2017-08-16 | 2022-04-07 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Pneumococcal conjugate vaccine formulations |
| WO2019139692A2 (en) * | 2017-12-06 | 2019-07-18 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
| US11642406B2 (en) * | 2018-12-19 | 2023-05-09 | Merck Sharp & Dohme Llc | Compositions comprising Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6771499B2 (en) | New polysaccharides and their use | |
| KR101446238B1 (en) | Protein Matrix Vaccines and Methods of Making and Administering Such Vaccines | |
| KR100431236B1 (en) | Antigenic Group B Streptococcus Type II and Type III Polysaccharides and Their Combination Vaccines Having a 2,5-Anhydro-D-Manno-Oster Terminal Structure | |
| AU2005302269B2 (en) | Modified streptococcal polysaccharides and uses thereof | |
| TW201718005A (en) | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof | |
| JP2004505885A (en) | Immunogenic β-propionamide linked polysaccharide-protein conjugates useful as vaccines produced using N-acryloylated polysaccharides | |
| KR101266552B1 (en) | Vaccines against group y neisseria meningitidis and meningococcal combinations thereof | |
| JP2004346084A (en) | Multi-oligosaccharide glycoconjugate bacterial meningitis vaccine | |
| JP2010532793A (en) | Modified polysaccharides for conjugate vaccines | |
| PL175595B1 (en) | Vaccines against neisseria meningitidis of c group | |
| JP2008509886A (en) | Polysaccharide derivatives and uses in inducing immune responses | |
| NO321705B1 (en) | Vaccines with modified meningococcal / polysaccharide conjugates | |
| US20140378669A1 (en) | Methods for conjugation of oligosaccharides or polysaccharides to protein carriers through oxime linkages via 3-deoxy-d-manno-octulsonic acid | |
| US11420993B2 (en) | Semi-synthetic meningococcal conjugate vaccine | |
| JP2005508854A (en) | Immunogenic conjugates of low molecular weight hyaluronic acid and polypeptide toxins | |
| RU2818894C1 (en) | C-polysaccharide-free capsular polysaccharides of streptococcus pneumoniae with a 2,5-anhydromanose residue at the reducing end | |
| ES2686875T3 (en) | Exopolysaccharide of the bacterium Shigella sonnei, method to produce it, vaccine and pharmaceutical composition containing it | |
| EP1000076A1 (en) | HEXADECASACCHARIDE-PROTEIN CONJUGATE VACCINE FOR $i(SHIGELLA DYSENTERIAE) TYPE 1 | |
| Hsu et al. | Immunochemical characterization of polysaccharide antigens from six clinical strains of Enterococci | |
| US11097000B2 (en) | Klebsiella pneumoniae capsule polysaccharide vaccines | |
| Mallick | Extraction and Purification of Capsular Polysaccharide from Streptococcus Pneumoniae and Escherichia Coli for Conjucate Vaccines Preperation |