PL229043B1 - Sposób wyciszania genu rośliny zbożowej oraz wektor wirusowy do wyciszania genu rośliny zbożowej - Google Patents
Sposób wyciszania genu rośliny zbożowej oraz wektor wirusowy do wyciszania genu rośliny zbożowejInfo
- Publication number
- PL229043B1 PL229043B1 PL396949A PL39694911A PL229043B1 PL 229043 B1 PL229043 B1 PL 229043B1 PL 396949 A PL396949 A PL 396949A PL 39694911 A PL39694911 A PL 39694911A PL 229043 B1 PL229043 B1 PL 229043B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- silencing
- gene
- symptoms
- pds
- plant growth
- Prior art date
Links
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 title claims abstract description 145
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 title claims description 8
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 title claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 17
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 101
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 62
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 36
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 24
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 21
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 claims description 17
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 12
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000724681 Barley yellow mosaic virus Species 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 abstract description 4
- 102100033279 Prostaglandin-H2 D-isomerase Human genes 0.000 description 136
- 208000035736 spondylodysplastic type Ehlers-Danlos syndrome Diseases 0.000 description 136
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 131
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 117
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 241000724306 Barley stripe mosaic virus Species 0.000 description 19
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 15
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 15
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 15
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 15
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 15
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 15
- 241000743776 Brachypodium distachyon Species 0.000 description 13
- 241000702463 Geminiviridae Species 0.000 description 13
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 12
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 10
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 10
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 101150108119 PDS gene Proteins 0.000 description 7
- 108050006628 Viral movement proteins Proteins 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 7
- 241000702451 Begomovirus Species 0.000 description 6
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 241000499511 Cabbage leaf curl virus Species 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 108010001545 phytoene dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 description 4
- 101710110284 Nuclear shuttle protein Proteins 0.000 description 4
- 101150084101 RNA2 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100353432 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP2 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000710155 Turnip yellow mosaic virus Species 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 4
- 241000724256 Brome mosaic virus Species 0.000 description 3
- 241001533462 Bromoviridae Species 0.000 description 3
- 241000724253 Cucumovirus Species 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 101150023114 RNA1 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 3
- 230000028604 virus induced gene silencing Effects 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 101710193592 ORF3a protein Proteins 0.000 description 2
- 241000723575 Pea early-browning virus Species 0.000 description 2
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020005089 Plant RNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000944 RNA Helicases Proteins 0.000 description 2
- 102000004409 RNA Helicases Human genes 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 101710136899 Replication enhancer protein Proteins 0.000 description 2
- 101100191561 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP3 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 230000009215 host defense mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000001743 silencing effect Effects 0.000 description 2
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 108010052418 (N-(2-((4-((2-((4-(9-acridinylamino)phenyl)amino)-2-oxoethyl)amino)-4-oxobutyl)amino)-1-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-1-oxoethyl)-6-(((-2-aminoethyl)amino)methyl)-2-pyridinecarboxamidato) iron(1+) Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 101001078197 Barley stripe mosaic virus RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101000804667 Barley stripe mosaic virus Suppressor of RNA silencing Proteins 0.000 description 1
- 241000743774 Brachypodium Species 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101800000653 Helper component proteinase Proteins 0.000 description 1
- 101000947178 Homo sapiens Platelet basic protein Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036154 Platelet basic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710189610 Protein 2b Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 101710119847 RNA silencing suppressor Proteins 0.000 description 1
- 101710094523 Replication enhancer Proteins 0.000 description 1
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 101710203837 Replication-associated protein Proteins 0.000 description 1
- 241000702479 Squash leaf curl virus Species 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 101710149950 Suppressor of silencing 2b Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 101000717237 Tobacco streak virus (strain WC) RNA-directed RNA polymerase 2a Proteins 0.000 description 1
- 241000710136 Tymovirus Species 0.000 description 1
- 101710117021 Tyrosine-protein phosphatase YopH Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 208000034575 androgenetic 3 alopecia Diseases 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 108700014631 geminivirus AC1 Proteins 0.000 description 1
- 230000037440 gene silencing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000007539 photo-oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036435 stunted growth Effects 0.000 description 1
- JDFUJAMTCCQARF-UHFFFAOYSA-N tatb Chemical compound NC1=C([N+]([O-])=O)C(N)=C([N+]([O-])=O)C(N)=C1[N+]([O-])=O JDFUJAMTCCQARF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Wynalazek dotyczy metody otrzymywania roślin ze zmienioną ekspresją genów będącą wynikiem wyciszania transkrypcyjnego ekspresji określonego genu przy użyciu wektorów wirusowych.
Description
Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania roślin ze zmienioną ekspresją genów będącą wynikiem wyciszania transkrypcyjnego ekspresji określonego genu przy użyciu wektorów wirusowych. W szczególności metoda ta służy do otrzymywania roślin o nowej charakterystyce dziedziczonej w kolejnych pokoleniach generatywnych i/lub wegetatywnych, które zostały uzyskane bez korzystania z metod transformacji genetycznej i integracji obcego materiału genetycznego do genomu tej rośliny.
Celem wynalazku jest zaproponowanie sposobu i narzędzi do jego realizacji, które pozwalałyby uzyskać rośliny o nowych dziedzicznych cechach fenotypowych będących efektem wyciszenia ekspresji genu natywnego.
Nieoczekiwanie okazało się, że efekt wyciszenia genu roślinnego może być uzyskany sposobem według wynalazku w wyniku wprowadzenia do komórek roślinnych wektora wiruso wego zawierającego RNA komplementarne do DNA będącego fragmentem promotora wyciszanego genu. Nieoczekiwanie okazało się, że indukowane wirusem potranskrypcyjne wyciszenie wybranego genu może być skuteczne również w przypadku, gdy jest ono ukierunkowane na sekwencję promotorową wyciszanego genu.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wyciszania genu rośliny zbożowej, w którym:
(i) otrzymuje się DNA należące do promotora wyciszanego genu, (ii) uzyskuje się wektor wirusowy nadający się do wprowadzania do komórki roślinnej RNA komplementarne do DNA będącego fragmentem promotora wyciszanego genu, przy czym wektor ten zawiera: fragment genomu wirusa roślinnego obejmujący sekwencje zapewniające replikację RNA wirusa, fragment genomu wirusa roślinnego obejmujący sekwencje zapewniające systemiczny transport wirusa w infekowanej roślinie oraz sprzężony z nimi fragment DNA należącego do promotora wyciszanego genu otrzymanego w etapie (i), przy czym DNA należący do promotora wyciszanego genu jest wbudowany do wektora wirusowego w orientacji sensowej lub antysensowej, (iii) prowadzi się syntezę RNA in-vitro stosując jako matrycę cDNA wektora wirusowego otrzymanego w etapie (ii), (iv) wprowadzonym do komórek roślin RNA uzyskanym w etapie (iii) wycisza się ekspresję genu, którego promotor jest częścią wektora wirusowego otrzymanego w etapie (ii), przy czym wspomniany gen pozostaje wyciszony również w roślinach potomnych uzyskanej rośliny.
Korzystnie, wyciszany gen jest natywnym genem rośliny zbożowej. Korzystnie, jako wektor wirusowy stosuje się cDNA wirusa paskowej mozaiki jęczmienia lub jego fragmenty posiadające sekwencję nukleotydową wybraną spośród przedstawionych jako sekwencje od 1 do 8.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor wirusowy do wyciszania genu rośliny zbożowej charakteryzujący się tym, że zawiera:
- fragment genomu wirusa roślinnego obejmujący sekwencje zapewniające replikację RNA wirusa,
- fragment genomu wirusa roślinnego obejmujący sekwencje zapewniające systemiczny transport wirusa w infekowanej roślinie oraz
- sprzężony z nimi fragment DNA należącego do promotora wyciszanego genu, przy czym fragment genomu wirusa roślinnego wybiera się spośród fragmentów cDNA wirusa paskowej mozaiki jęczmienia przedstawionych jako sekwencje od 1 do 8.
Szczegółowy opis korzystnych realizacji
Jako natywny promotor roślinny może być wykorzystany dowolny aktywny w komórkach roślin jednoliściennych promotor genu lub fragment tego promotora o długości przynajmniej 21 nukleotydów.
Jako wektor może być wykorzystany każdy roślinny wirus RNA lub DNA, przystosowany tak, aby można było klonować w nim fragment obcego DNA i jednocześnie nie inaktywować procesów niezbędnych do infekcji roślin, zachowując przy tym zdolność replikacji genomu wirusa w komórkach gospodarza oraz systemicznego transportu wirusa w organizmie gospodarza.
Jako przykładowe komponenty potrzebne do replikacji wirusa można wskazać otwarte ramki odczytu, będące częścią wektora wirusowego, kodujące białka takie jak:
- 1 a-metylotransferaza/helikaza oraz 2a polimeraza kodowane przez cząsteczki RNA1 i RNA2 wirusa BMV (Brome mosaic virus) (Kao i Ahlquist, 1992; Quadt i Jaspars, 1990);
PL 229 043 B1
- białka 1 a i 2a warunkujące replikację wirusa CMV Cucumber mosaic virus genus Cucumovirus family Bromoviridae. three genomie RNAs (Palukaitis i Garcia-Arenal, 2003);
- białko 3a oraz białko płaszcza (CP) wirusa CMV Cucumber mosaic virus genus Cucumovirus family Bromoviridae. three genomic RNAs niezbędne do transportu wirusa z komórki do komórki oraz trasnportu systemicznego (cell-to-cell and long-distance movement) (Palukaitis i Garda -Arenal, 2003);
- białka AC1 Geminiwirusów - kluczowe dla replikacji wirusowego DNA, kodowane przez DNA-A wirusów z grupy Geminiwirusów - dwucząsteczkowe wirusy DNA (Hanley-Bowdoin i in., 2000);
- białka AC2 będące aktywatorem transkrypcji (TrAP) kodowanym przez cząsteczkę DNA-A wirusów z grupy Geminiwirusów dwucząsteczkowych wirusy DNA (Sunter i Bisaro, 1992);
- białko AC3 o aktywności wspomagającej replikację (replication enhancer protein (REn) Geminiviruses DNA-A (majority of begomoviruses) DNA bipartite (Sunter i in.,1990);
- białko AL1 białko związane z replikacją (replication-associated protein) kodowane przez cząsteczkę DNA-A CaLCuV Cabbage leaf curl virus. Wirus, którego genomem są dwie koliste cząsteczki jednoniciowego DNA ssDNA. Wirus ten należy do Begomovirusów, rodziny Geminiviridae (Hill i in., 1998; Paximadis i in., 1999);
- białko AL2 aktywator transkrypcji kodowany przez DNA-A (CaLCuV Cabbage leaf curl virus genus Begomovirus, family Geminiviridae. Wirus z grupy Begomovirusów, z genomem są dwie koliste cząsteczki jednoniciowego DNA ssDNA. Wirus ten należy do rodziny Geminiviridae (Hill i in., 1998; Paximadis i in., 1999);
- białko AL3, wzmacniacz replikacji kodowany przez cząsteczką DNA-A CaLCuV Cabbage leaf curl virus genus Begomovirus, family Geminiviridae. Wirus, którego genomem są dwie koliste cząsteczki jednoniciowego DNA ssDNA (Hill i in., 1998; Paximadis i in., 1999);
- białko 206kDa będący prekursorem jedynego białka niezbędnego do replikacji TYMV, Turnip yellow mosaic virus, genus Tymovirus, wirus positive-strand RNA (Chen i in., 2004; Jakubiec i in., 2007; Weiland i Dreher, 1989);
- białko kodowane przez otwarte ramki odczytu aa i ya wirusa BSMV Barley strie mosaic virus o aktywności helikazy i polimerazy RNA (Petty i in., 1990).
Jako przykładowe komponenty wymagane do transportu wirusa z komórki do komórki (virus cellto-cell movement) oraz transportu systemicznego (long distance transport) można wskazać otwarte ramki odczytu, będące częścią wektora wirusowego, kodujące białka takie jak:
- białko movement protein (MP) kodowane przez cząsteczkę RNA3 wirusa BMV (Rao i Grantham 1996; Flasinski i in., 1995; Takeda i in., 2005); białko płaszcza (CP) kodowane przez cząsteczką RNA3 wirusa BMV (Rao i Grantham 1996; Flasinski i in., 1995; Takeda i in., 2005);
- białko 3a oraz białko płaszcza (CP) kodowane przez CMV Cucumber mosaic virus (Palukaitis i Garcia-Arenal, 2003; Palukaitis i in., 1992);
- białka AV1 (białko płaszcza) i AV2 (prekursor białka płaszcza (pre-coat protein) kodowane przez DNA-A dwucząsteczkowych Geminiwirusów (Padidam i in., 1996);
- białka movement protein (MP) oraz nuclear shuttle proteins (NSP) kodowane przez cząsteczkę DNA-B dwucząsteczkowych Geminiwirusów (Sanderfoot i in., 1995);
- białka kodowane przez cząsteczką RNA1 wirusa PEBV Pea early browning virus - genom - dwucząsteczkowy RNA1 i RNA2 (MacFarlane, 1999);
- białko płaszcza (CP) kodowane prze RNA2 wirusa PEBV Pea early browning virus - genom dwucząsteczkowy RNA1 i RNA2 (MacFarlane, 1999);
- białko płaszcza (CP) 20kDa kodowane przez jednocząsteczkowy positive-strand RNA genom TYMV, Turnip yellow mosaic virus (Chen i in., 2004; Jakubiec i in., 2007; Weiland i Dreher, 1989);
- białka BR1 i BL1 movement proteins kodowane przez DNA-B wirusa CaLCuV Cabbage leaf curl virus należącego do Begomowirusów genom dwucząsteczkowy kolisty ssDNA (Hill i in., 1998; Paximadis i in., 1999);
- białka BV1 (nuclear-shuttle protein - NSP) i BC1 (movement protein - MP) Geminiwirusów (Sanderfoot i Lazarowitz, 1995);
- białka kodowane przez cząsteczki yb ya i odpowiadające za systemiczny transport wirusa BSMV (Petty i in., 1990).
PL 229 043 Β1
Ponadto w korzystnej realizacji wektor powinien być pozbawiony genów kodujących supresory wyciszania. Wektor nie powinien zawierać otwartych ramek odczytu, w których kodowane są białka takie jak:
- białko 2b kodowane przez CMV Cucumber mosaic virus i będące supresorem wyciszania RNA i antagonistą mechanizmów obronnych gospodarza (Anandalakshmi i in., 1998; Brigneti i in., 1998),
- białko HC-Pro Potywirusów (Anandalakshmi i in., 1998; Brigneti i in., 1998),
- białka AV1 coat protein i AV2 pre-coat protein kodowane przez DNA-A Geminiwirusów (Padidam i in., 1996),
- białko 2b CMV Cucumber mosaic vims genus Cucumovirus family Bromoviridae. three genomie RNAs będące supresorem wyciszania RNA o funkcji antagonistycznej w stosunku do mechanizmów obronnych komórki gospodarza ( Palukaitis i Garcia-Arenal, 2003).
W szczególności może to być wektor skonstruowany na bazie wirusa paskowanej mozaiki jęczmienia (Barley stripe mosaic virus, BSMV) przystosowanego w do klonowania obcego fragmentu w cząsteczce β i lub w cząsteczce a tego wirusa.
Korzystnie promotor lub fragment promotora klonowany jest w plazmidach zawierających cDNA odpowiednio cząsteczki β i plazmidzie zawierającym cDNA cząsteczki a wirusa paskowanej mozaiki jęczmienia.
Infekcyjne RNA wirusa stosowane na etapie (iv) sposobu według wynalazku zdolne wyciszenia genu może być otrzymane w wyniku syntezy in vitro lub in vitro. Pierwszy wariant, szczegółowo opisany w przykładach, obejmuje transkrypcję in vitro przy użyciu polimerazy RNA zależnej od DNA oraz cDNA wektora jako matrycy. Drugi wariant, obejmujący syntezę infekcyjnego RNA wirusa in vivo, zachodzi wówczas gdy do komórki roślinnej wprowadzi się DNA składający się z roślinnego promotora (korzystnie silny promotor konstytutywny) i cDNA wektora. Wprowadzenie takiego DNA do komórki roślinnej (np. w wyniki wstrzeliwania lub użycia Agrobacterium) powoduje, że staje się on matrycą do transkrypcji. Jest to tzw. ekspresja przejściowa (‘transient’) wprowadzonego genu zachodząca bez konieczności wbudowania tego genu do genomu.
W przypadku stosowanego w korzystnej realizacji wektora BSMV wprowadzane do komórek DNA powinno obejmować trzy cząsteczki DNA, każda o strukturze według poniższego schematu, osobno dla zmodyfikowanych cząsteczek α, β i γ z>E promotor roślinny cDNA wektora wirusowego
Korzystnie otrzymane plazmidy służą, jako matryca do transkrypcji in vitro w warunkach pozwalających na otrzymanie RNA, które na swoim końcu 5’ zawiera tzw. strukturę CAP.
Korzystnie otrzymane infekcyjne RNA jest użyte do inokulacji siewek rośliny jednoliściennej.
Dla ułatwienia lepszego zrozumienia istoty wynalazku niniejszy opis został zilustrowany poniższymi przykładami oraz następującymi figurami:
Figura 1 zawiera schemat cząsteczek α, 3BamHI i yMCS wektora wirusa paskowanej mozaiki jęczmienia. Prawe panele reprezentują otwarte ramki odczytu oraz wielkość transkryptu. Panel a - niezmieniona cząsteczka α z zaznaczoną otwartą ramką odczytu. Panel 3BamHI - cząsteczka β zmodyfikowana tak, aby zawierała pojedyncze miejsce cięcia BamHI służące do klonowania fragmentu DNA. Zaznaczono otwarte ramki odczytu, miejsce BamHI, miejsca przyłączenia starterów flankujących klonowany fragment DNA. Ramką zaznaczono klonowany fragment promotora BdPDS o długości 269pz. Panel yMCS - cząsteczka γ (Bruun-Rasmussen et al. 2007). Zaznaczono otwarte ramki odczytu, region do klonowania z pojedynczymi miejscami restrykcyjnymi MCS w tym miejscem BamHI, miejsca przyłączania staterów flankujących klonowane DNA. Ramką zaznaczono klonowany fragment promotora BdPDS o długości 269pz.
Figura 2 zawiera schemat genomowego DNA chromosomu 1 Brachypodium distachyon. Zaznaczono pozycję kodonów Start i Stop, fragmentu wyciszającego amplifikowanego z regionu pro motorowego i klonowanego do wektorów BSMV: βΒθίτιΗΙ i BSMV: yMCS. Na rysunku zaznaczono pozycję kodonu START i kodonu STOP oraz położenie fragmentu wyciszającego zgodnie z numeracją nukleotydów w opisie chromosomu 1 Brachypodium distachyon.
PL 229 043 B1
Figura 3 prezentuje objawy wyciszenia genu PDS u Brachypodium distachyon 10 dni po inokulacji przez RNA wektora wirusowego BSMV zawierającego fragment promotora genu PDS (A). Objawy wyciszenia PDS oraz zahamowany wzrost u roślin w pokoleniu S1(B).
Figura 4 prezentuje objawy wyciszenia genu PDS u roślin jęczmienia odmiany Black Hulless 10 dni po inokulacji przez RNA wektora wirusowego BSMV zawierającego fragment promotora genu PDS (A), 24 dni po inokulacji wyżej wymienionym wektorem (B). Objawy wyciszenia PDS oraz zahamowany wzrost roślin obserwowany w roślinach jęczmienia w pokoleniu S1 (C).
P r z y k ł a d 1
Wyciszanie genu roślinnego sposobem według wynalazku.
Kolejne etapy wyciszania genu sposobem według wynalazku obejmowały:
- uzyskanie wektora wirusowego pozwalającego wprowadzić do komórki roślinnej RNA komplementarne do DNA będącego fragmentem promotora wyciszanego genu,
- identyfikację promotora wyciszanego genu, amplifikację fragmentu tego promotora i klonowanie go do plazmidów zawierających cDNA wektora wirusowego,
- użycie plazmidów (uzyskanych w pierwszym etapie) zawierających cDNA wektora wirusowego z fragmentem promotora wyciszanego genu, jako matrycy do syntezy in vitro RNA a następnie użycie tego RNA do inokulacji siewek roślin,
- obserwacja zmian będących efektem wyciszenia ekspresji wybranego genu.
W przykładowej realizacji opisanej poniżej wyciszanym genem był gen desaturazy fitoenowej (dalej PDS) występujący w Brachypodium distachyon. Kodowany przez ten gen enzym desaturaza fitoenowa warunkuje jeden z etapów syntezy karotenoidów. Wyciszenie ekspresji PDS i brak tego enzymu powoduje brak karotenoidów, co skutkuje fotooksydacją chlorofilu. Końcowy fenotypowy efekt wyciszenia PDS widoczny jest w postaci wybielonych, pozbawionych chlorofilu fragmentów liści. Ze względu na łatwo obserwowalny fenotypowy efekt wyciszenia, gen ten został wybrany w przykładowej realizacji, jako wizualny marker potranskrypcyjnego wyciszania ekspresji genu.
P r z y k ł a d 2
Uzyskanie wektora wirusowego
W przykładowej realizacji wynalazku do konstrukcji wektora użyto plazmidów zawierających cDNA wirusa paskowanej mozaiki jęczmienia (barley stripe mozaik wirus BSMV). Wiadomo, że wektor ten nadaje się do indukowania potranskrypcyjnego wyciszania ekspresji genów w procesie określanym jako indukowane wirusem wyciszenie genów (Virus induced gene silencing VIGS).
BSMV jest wirusem roślinnym typu RNA, którego genom składa się z trzech cząsteczek positive-sense RNA określanych, jako cząsteczka α, β i γ (patrz Fig. 1). Wszystkie trzy komponenty są niezbędne do przebiegu pełnego cyklu życiowego wirusa w tym skoordynowanej replikacji RNA wirusa oraz systemicznego transportu w całej roślinie (Petty i in., 1990). Zdolność do replikacji w protoplastach komórek roślinnych obydwu cząsteczek α i γ, dowodzi, że białka kodowane przez otwarte ramki odczytu zlokalizowane na tych cząsteczkach wystarczają do funkcji replikacji. Główną funkcją białek kodowanych przez geny zlokalizowane na cząsteczce β jest systemiczny transport wirusa w roślinie (Petty i in., 1990). Szczegółowa analiza funkcji wykazała, że cykl życiowy wirusa jest efektem aktywności wszystkich białek.
Cząsteczka α
Białko kodowane przez gen aa zawiera motywy helikazy i polimerazy RNA, co wskazuje, że jest ono kluczowym czynnikiem w procesie replikacji RNA wirusa (Petty i in., 1990). Sekwencja nukleotydowa genu aa została przedstawiona jako Sekw. Id. Nr 1.
Cząsteczka β
W cząsteczce β znajduje się pięć otwartych ramek odczytu. W pierwszej βa kodowane jest białko płaszcza wirusa (capsid protein - CP) (Petty i in., 1990). Sekwencja nukleotydowa genu βa została przedstawiona jako Sekw. Id. Nr 2.
Kolejne, geny stanowiące tzw. subgenomowe RNA: β^ βο, βd i βό’ kodują białka TGB1, TGB2 i TGB3 określane, jako triple gene block proteins (TGP). Białka te wspólnie warunkują transport wirusa w roślinie (Petty i in., 1990; Zhou i Jackson, 1996; Lawrence i Jackson, 2001; Johnson i in., 2003). Białko kodowane przez βb zawiera dwa regiony bogate w cysteinę co wskazuje na potencjalną rolę w powinowactwie i wiązaniu kwasów nukleinowych. Białko to zawiera ponadto motyw helikazy jednak analiza funkcji nie wykazała jego udziału w procesie replikacji RNA wirusa (Petty i in., 1990; Bragg i in., 2004).
Sekwencja nukleotydowa genu βb została przedstawiona jako Sekw. Id. Nr 3.
PL 229 043 B1
Sekwencja nukleotydowa genu βο została przedstawiona jako Sekw. Id. Nr 4.
Sekwencja nukleotydowa genu βd została przedstawiona jako Sekw. Id. Nr 5.
Sekwencja nukleotydowa genu pd’ została przedstawiona jako Sekw. Id. Nr 6.
Cząsteczka γ
Białko kodowane przez γa zawiera motyw helikazy i polimerazy RNA. Analiza funkcji wykazała, że białko to jest niezbędnym czynnikiem procesu replikacji RNA wirusowego (Petty i in., 1990). Dodatkowo białko γa wspomaga systemiczny transport wirusa - proces w głównym stopniu warunkowany przez białko γb (Petty i in., 1990).
Białko kodowane przez γb determinuje transport systemiczny typu long distance cząsteczek wirusa, wpływa na ekspresję innych genów wirusa i w ten sposób, pośrednio moduluje replikację RNA oraz wirulencję. Natomiast brak γb obniża akumulację białka płaszcza wirusa (kodowanego przez βa) i najprawdopodobniej na tej drodze upośledza systemiczne rozprzestrzenianie wirusa w roślinie (Petty i in., 1990; Yelina i in., 2002).
Wzajemna interakcja cząsteczek białka kodowanego przez γb oraz formowanie przez to białko oligomerów (proces warunkowany obecnością motywów typu coiled-coil) są kluczowe w procesie wirulencji oraz wpływają na supresję mechanizmów obronnych gospodarza. Motywy palców cynkowych obecne w γb wskazują na zdolność wiązania kwasów nukleinowych i jonów cynku oraz są krytyczne dla procesów patogenezy (Donald i in., 1997; Bragg i in., 2004).
Sekwencja nukleotydowa genu γa została przedstawiona jako Sekw. Id. Nr 7.
Sekwencja nukleotydowa genu γb została przedstawiona jako Sekw. Id. Nr 8.
Użyte w przykładowej realizacji plazmidy pBSMV-T7-a, pBSMV-T7^ i pBSMV-T7--/MCS zawierające pełnokopijne cDNA cząsteczek α, β i γMCS otrzymano od Dr Merete Albrechtsen (Uniwersytet Aarhus, Dania).
W uzyskanym komplecie trzech plazmidów tylko cDNA cząsteczki γ było zmienione w stosunku do oryginalnej cząsteczki γ. Zmiana ta (wykonana w zespole Dr Albrechtsen) polegała na wprowadzeniu do tej cząsteczki odcinka DNA z miejscami restrykcyjnymi Pad, Xmal i BamHI (MCS multiple cloning site), który umożliwiał klonowanie dowolnego fragmentu cDNA transkryptu wyciszanego genu w celu indukowania potranskrypcyjnego wyciszania. W dalszej części przedmiotowego opisu cząsteczka ta jest opisywana, jako γMCS (Fig. 1).
Drugi z plazmidów - pBSMV-T7^ został dodatkowo zmieniony przez twórców tak, aby również do niego można było klonować fragmentu cDNA transkryptu wyciszanego genu lub fragment promotora wyciszanego genu. Uzyskano to w następujący sposób: cDNA cząsteczki β będącej częścią plazmidu pBSMV-T7^ został zmodyfikowany poprzez wprowadzenie fragmentu DNA zawierającego kodon STOP oraz miejsce restrykcyjne BamHI pomiędzy otwartą ramkę odczytu genu βc (ORF βφ a fragment poli(A).
Konstruowanie nowej cząsteczki zaczęto od dwóch reakcji amplifikacji używając niezmodyfikowanego plazmidu pBSMV-T7^ jako matrycy. W pierwszej reakcji amplifikowano fragment od pojedynczego miejsca SacI do otwartej ramki odczytu βc (ORF βφ przy użyciu starterów: B_SacI_Forward i B_BamHI_Reverse (Tab. 2). W drugiej reakcji amplifikowano fragment od końca ORF βc do pojedynczego miejsca restrykcyjnego Spel przy użyciu starterów: B_BamHI_Forward i B_SpeI_Reverse (Tab. 2). Startery B_BamHI_Forward i B_BamHI_Reverse zawierały 9-nukleotydowy fragment z kodonem STOP oraz miejscem BamHI (nukleotydy podkreślone) pozwalającym na dalszą wzajemną ligację tak otrzymanych fragmentów. Produkty amplifik acji trawiono enzymami odpowiednio SacI i BamHI pierwszy amplikon oraz BamHI i Spel amplikon drugi, oczyszczano elektroforetycznie i izolowano z agarozy. Obydwa tak uzyskane fragmenty łączono z fragmentem Sacl-Spel o długości 5087 pz pochodzącym z oryginalnego plazmidu pBSMV-T7^ i wykonano trzykomponentową reakcję ligacji. Otrzymany w wyniku tej ligacji plazmid pT7^BamHI miał niezmienione ramki odczytu oryginalnej cząsteczki β oraz dodatkowo zawierał pojedyncze miejsce BamHI, służące do ligacji potencjalnego fragmentu wyciszającego. Otrzymana cząsteczka została oznaczona, jako βBamHI lub β(-).
P r z y k ł a d 3
Identyfikację promotora wyciszanego genu, amplifikację fragmentu tego promotora i klonowanie go do plazmidów zawierających cDNA wektora wirusowego.
W przykładowej realizacji wykorzystano fragment promotora genu desaturazy fitoenowej z genomu Brachypodium distachyon.
PL 229 043 B1
Identyfikacja promotora genu desaturazy fitoenowej w genomie Brachypodium distachyon.
Gen kodujący desaturazę fitoenową Brachypodium distachyon BRADI1G72400, (nazwa genu IFV4_BRADI oraz numer ID transkryptu BRADI1G72400.1) został zidentyfikowany w bazie Gramene przy użyciu programu BrachBlast. Gen PDS B. distachyon leży na chromosomie 1 w regionie oznaczonym numerami nukleotydów od 70130861 do 70136510. Długość genu to 2236 pz a długość kodowanego peptydu 578 aminokwasów.
Zlokalizowano następujące elementy wyżej opisanego genu: region promotorowy w regionie oznaczonym numerami nukleotydów od 70136225 do 70136278, TATA box: 70136051, kodon START: 70135578 oraz kodon STOP: 70131166 (Fig. 2).
Sekwencja cDNA transkryptu genu BRADI1G72400 została przedstawiona jako Sekw. Id. Nr 9. Fragmenty 1-187 oraz 1934-2237 reprezentują obszary 5’- oraz 3' - UTR.
Amplifikacja fragmentu promotora genu BdPDS oraz klonowanie go do cząsteczek 3BamHI i yMCS wektora BSMV-VIGS.
Wyznaczenie lokalizacji genu i sekwencji regulatorowej pozwoliło zaprojektować startery BdpPDSFR oraz BdpPDSRe (Tab. 2). Użycie tych starterów i genomowego DNA B. distachyon, jako matrycy pozwoliło amplifikować fragment promotora o długości 256 pz. Fragment ten jest zlokalizowany na chromosomie 1 w regionie oznaczonym numerami nukleotydów od 70136011 do 70136267.
Sekwencja nukleotydowa amplifikowanego fragmentu promotora genu BdPDS została przedstawiona jako Sekw. Id. Nr 10.
Startery zostały zaprojektowane tak, aby przy końcu 5’ zawierały sekwencję rozpoznawaną i ciętą przez BamHI (fragment podkreślony). Uzyskany w reakcji PCR amplikon cięto enzymem BamHI i po oczyszczeniu z buforu reakcyjnego ligowano do miejsc BamHI w plazmidach pBSMV-T7-3BamHI i pBSMV-T7-3MCS. Obecność klonowanego fragmentu w plazmidzie sprawdzono wykonując reakcję PCR z użyciem odpowiedniego plazmidu jako matrycy i starterów: BinsB_FR, Bins_Re i Gins_FR (Tab. 1, Fig. 2). Wynik klonowania dodatkowo weryfikowano wykonując analizę restrykcyjną otrzymanych plazmidów.
P r z y k ł a d 4
Synteza infekcyjnego RNA w reakcji transkrypcji in vitro oraz inokulacja siewek Brachypodium distachyon i siewek jęczmienia odmiany Black Hulles.
Plazmidy zawierające cDNA wektora BSMV tj. pBSMV-T7-a, pBSMV-T7-3BamHI, pBSMV-T73prom_BdPDS, pBSMV-T7-yMCS i pBSMV-T7-yprom_BdPDS użyto, jako matryc w transkrypcji in vitro do otrzymania infekcyjnego RNA wektora BSMV. Plazmidy izolowano z E. coli przy użyciu zestawu Plasmid Mini Kit (Aabiot, Gdynia, Polska), linearyzowano używając enzymów Mlul or Bcul (Tab. 1), oczyszczano przez dwukrotną ekstrakcję mieszaniną fenol : chloroform (1:1 v/v), jednokrotną ekstrakcję mieszaniną chloroform : IAA i precypitację octanem amonowym. Infekcyjne RNA syntezowano przy użyciu zestawu do transkrypcji in vitro AmpliCap-Max T7 HighYield Message Maker Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, USA), zgodnie z instrukcją producenta. Jedna reakcja transkrypcji pozwalała otrzymać od 30 do 40 μg RNA. Pobierano po jednym μl z każdej reakcji syntezy RNA na matrycach a, 3prom_BdPDS, i yprom_BdPDS, mieszano je ze sobą i dodawano do 18 μl bufory FES (Pogue i in., 1998). Otrzymano 21 μl mieszaniny, którą używano do inokulacji liści siedmiodniowych siewek Brachypodium i jęczmienia Black Hulles.
Bezpośrednio przed inokulacją na liście siewek nanoszono cienką warstwę proszku węgliku krzemu (Silicon carbide 400 mesh, Sigma-Aldrich, USA) pozwalającego na bardziej skuteczną inokulację. Do liści roślin kontrolnych był wcierany sam bufor FES bez RNA lub bufor FES zawierający RNA bez insertu. Bezpośrednio po inokulacji rośliny przenoszono do komory z wysoką wilgotnością (26°C, 100% wilgotność względna, 16 godzinny fotoperiod, oświetlenie 130-230 μM fotonów s-1m-2). Po 4 dniach rośliny przenoszono do standardowych warunków wzrostu. Inokulowano 34 rośliny. Wszystkie enzymy restrykcyjne oraz T4 ligaza pochodziły z firmy Fermantas (Wilno, Litwa).
PL 229 043 Β1
Tabela 1
Lista plazmidów zawierających cDNA cząsteczek α, β i γ wektora BSMV-VIGS, wykaz enzymów restrykcyjnych użytych do linearyzacji plazmidów w celu przygotowania matryc do transkrypcji in vitro oraz lista otrzymanych transkryptów
| Plazmid | Linearyzacja plazmidu | Oznaczenie tran skryptu |
| pBSMV-T7-a | MluI | α |
| pBSMV-T7-pBaznHI | Bcul | β(-) |
| pB S M V-T7-3prom Bi/P£>5 | Bcul | fiprom BdPDS |
| pBSMV-T7-yMCS | MluI | γ(-) |
| pBSMV-T7- -/pmmBdPDS | MluI | Yprom 2? dPDS |
Na Fig. 1 zaprezentowano schemat wykorzystanych cząsteczek α, β BamHI i yMCS wektora wirusa paskowanej mozaiki jęczmienia.
Tabela 2
Sekwencje nukleotydowe starterów
| Numer rośliny | Opis roślin So | Liczba nasion S i | Opis roślin pokolenia Si |
| 1 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 2 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 3 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | 7 nasion | 7 roślin - silne objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin |
| 4 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | Brak nasion | Brak roślin |
| 5 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | Brak nasion | Brak roślin |
| 6 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | Brak nasion | Brak roślin |
| 7 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 8 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
Przykład 5
Wyciszanie ekspresji genu PDS w roślinach Brachypodium distachyon
Inokulacji infekcyjnym RNA otrzymanym z wektora BSMV a, \1pmm_BdPDS, yprom_BdPDS poddano 34 siewki Brachypodium distachyon. Objawy obserwowane dziesięć dni po inokulacji przedstawiały się następująco. Objawy braku chlorofilu widoczne, jako wybielone fragmenty liści wystąpiły u 12 roślin. Obserwacje wykonane po dalszych 14 dniach potwierdziły brak chlorofilu. Dodatkowo stwierdzono zahamowanie wzrostu u tych roślin i słabsze zawiązywanie nasion. Pięć roślin, u których opisano objawy braku chlorofilu nie zawiązało nasion. Pozostałe 7 roślin zawiązało od 3 do 8 nasion. Nasiona te stanowiące kolejne pokolenie generatywne Si zostały wysiane. Rośliny sześciu tak uzyskanych linii wykazywały objawy braku chlorofilu będące efektem wyciszenia PDS. Potomstwo jednej linii nr 36 nie wykazało żadnych zmian zarówno we wzroście jak i zawartości chlorofilu (Tab. 3). Pozostałe 22 rośliny nie wykazały zmian fenotypowych w pokoleniu So ani w kolejnym pokoleniu generatywnym Si (Tab. 3). Przykładowe rośliny pokolenia So i Si wykazujące zmiany fenotypowe będące wynikiem wyciszenie PDS u roślin przedstawiono na Fig. 3.
Objawy wyciszenia PDS w tych roślinach były wynikiem transkrypcyjnego wyciszenia ekspresji PDS indukowanego wektorem wirusowym w roślinach inokulowanych (So) i przekazanego następnie do kolejnego pokolenia generatywnego (Si). Zmiany obserwowane w drugim pokoleniu generatywnym
PL 229 043 Β1 wskazywały, że wyciszenie PDS może być stabilnie przekazane do następnego pokolenia generatywnego mimo braku pierwotnego sygnału tj. RNA wektora wirusowego z fragmentem promotora wyciszanego genu.
Tabela 3
Opis roślin Brachypodium distachyon uzyskanych po inokulacji wektorem BSMV: α, β prom_BdPDS, γ prom_ BdPDS (pokolenie So) oraz opis roślin pokolenia Si
| Numer rośliny | Opis roślin So Liczba nasion Si | Opis roślin pokolenia Si | |
| 1 | Brak objawów wyciszenia Kilkadziesiąt PDS, normalny wzrost roślin. nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | |
| 2 | Brak objawów wyciszenia Kilkadziesiąt PDS, normalny wzrost roślin. nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | |
| 3 | Objawy wyciszenia PDS. _ , . ... 7 nasion zahamowany wzrost roślin. | 7 roślin - silne objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin | |
| 4 | Objawy wyciszenia PDS. _ , , ... Brak nasion zahamowany wzrost roślin. | Brak roślin | |
| 5 | Objawy wyciszenia PDS. _ , , '1 Brak nasion zahamowany wzrost roślin. | Brak roślin | |
| 6 | Objawy wyciszenia PDS. „ , , ... Brak nasion zahamowany wzrost roślin. | Brak roślin | |
| 7 | Brak objawów wyciszenia Kilkadziesiąt PDS, normalny wzrost roślin. nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | |
| 8 | Brak objawów wyciszenia Kilkadziesiąt PDS, normalny wzrost roślin. nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | |
| 9 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | Brak nasion | Brak roślin |
| 10 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | Brak nasion | Brak roślin |
| 11 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | 8 nasion | Jedno nasiono nie wykielkowalo 4 rośliny - brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin 3 rośliny - silne objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin |
| 12 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | 4 nasiona | 4 rośliny - objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin |
| 13 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin | 6 nasion | 6 roślin - objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin |
| 14 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 15 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 16 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 17 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 20 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS} normalny wzrost roślin |
| 21 | Brak objawów7 wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 22 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | 3 nasiona | Jedno nasiono nie wykielkowalo, 2 rośliny - silne objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost |
| 24 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 25 | Brak objawów' wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 30 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
PL 229 043 Β1
| 31 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 32 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 33 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 34 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. |
| 35 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 36 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | 6 nasion | 6 roślin, brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 37 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 38 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 39 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
| 40 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | 4 nasiona | 4 rośliny, silne objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin |
| 41 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin | Kilkadziesiąt nasion | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin |
Przykład 6
Wyciszanie ekspresji genu PDS w roślinach jęczmienia odmiany Black Huiles Inokulacji infekcyjnym RNA otrzymanym z wektora BSMV a, fiprom_BdPDS, yprom_BdPDS poddano 19 siewek jęczmienia odmiany Black Hulless (Tabela 4).
Objawy obserwowane dziesięć dni po inokulacji przedstawiały się następująco. Objawy braku chlorofilu widoczne, jako wybielone fragmenty liści wystąpiły u 7 roślin. Obserwacje wykonane po dalszych 14 dniach potwierdziły brak chlorofilu i zahamowanie wzrostu roślin. Rośliny te charakteryzowały się słabszym zawiązywaniem nasion. Dwie rośliny, u których obserwowano brak chlorofilu i zahamowany wzrost nie zawiązały nasion. Pozostałe 5 roślin zawiązało od 22 do 46 nasion. Nasiona te stanowiące kolejne pokolenie generatywne oznaczone jako Si zostały wysiane. We wszystkich pięciu tak uzyskanych liniach otrzymano rośliny, u których obserwowano objawy braku chlorofilu będące efektem wyciszenia PDS (Tabela 4). W pokoleniu Si, podobnie jak w So, objawy silnego wyciszenia PDS związane były z zahamowaniem wzrostu roślin. Przykładowe rośliny jęczmienia pokolenia So i Si wykazujące zmiany fenotypowe będące wynikiem wyciszenie PDS przedstawiono na Fig. 4.
Objawy wyciszenia PDS w roślinach jęczmienia były wynikiem transkrypcyjnego wyciszenia ekspresji PDS indukowanego wektorem wirusowym w roślinach inokulowanych (So) i przekazanego następnie do kolejnego pokolenia generatywnego (Si). Zmiany obserwowane w drugim pokoleniu generatywnym wskazywały, że wyciszenie PDS może być stabilnie przekazane do następnego pokolenia generatywnego mimo braku pierwotnego sygnału tj. RNA wektora wirusowego z fragmentem promotora wyciszanego genu.
Tabela 4
Opis roślin jęczmienia odmiana Black Hulless uzyskanych po inokulacji wektorem BSMV: α, β prom_BdPDS, γ prom_BdPDS (pokolenie So) oraz opis roślin pokolenia Si
| Numer rośliny | Opis roślin So | Liczba nasion S| | Opis roślin pokolenia Si |
| BH 1 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | 46 | Testowano 14 nasion 4 rośliny - silne objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin, 3 rośliny - słabe objawy wyciszenia PDS, 5 roślin - brak objawów wyciszenia PDS, 2 nasiona nie wykielkowaly |
| BH2 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | 94 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. |
| BH3 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | Brak nasion | - |
PL 229 043 Β1
| BH4 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | 22 | Testowano 11 nasion: 2 rośliny - silne objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin, 6 roślin - brak wyciszenia PDS, 3 nasiona - nie wykielkowaty |
| BH5 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | 68 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. |
| BH6 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | 74 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. |
| BH7 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | 69 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. |
| BH8 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | 75 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. |
| BH9 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | Brak nasion | - |
| BH iO | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | |
| BH 12 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | 83 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. |
| BH 13 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | 87 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. |
| BH 14 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | 98 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. |
| BH 17 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | 79 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. |
| BH 19 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | 29 | Testowano 14 nasion: 5 rośliny - silne objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin, 4 rośliny - brak wyciszenia PDS. 5 nasion nie wykietkowato |
| BH 20 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | 26 | Testowano 15 nasion: 6 roślin — silne objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin, 4 rośliny - słabe objawy wyciszenia PDS, 1 roślina - brak objawów wyciszenia PDS, dobry wzrost rośliny. 4 nasiona nie wykielkowały, |
| BH 22 | Objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin. | 31 | Testowano 14 nasion: 8 roślin - silne objawy wyciszenia PDS, zahamowany wzrost roślin, 6 roślin - brak wyciszenia PDS, |
| BH 25 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | 95 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. |
| BH 27 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. | 92 | Brak objawów wyciszenia PDS, normalny wzrost roślin. |
Literatura
Anandalakshmi R., Pruss G. J., Ge X., Marathe R., Mallory A. C., Smith Τ. H., Vance V. B., 1998. Aviral suppressor of gene silencing in plants. Proc. Natl Acad Sci USA 95: 13079-13084.
Bragg J. N., Jackson A.O., 2004. The C-terminal region ofthe Barley stripe mosaic virus yb protein participates in homologous interactions and is required for suppression of RNA silencing. Molecular Plant Pathology 5: 465-481.
Brigneti G., Voinnet O., Li W. X., Ji L. H., Ding S. W., Baulcombe D., 1998. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBO J 17:
6739-6746.
Bruun-Rasmussen M., Madsen C.T., Jessing S. and Albrechtsen M., 2007. Stability of Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in barley. Mol. Plant-Microbe In. 20: 1323-1331.
Chen J., Li W.X., Xie D., Peng J. R. and Ding S. W., 2004. Viral virulence protein suppresses RNA silencing - mediated defense but upregulates the role of microRNA in host gene expression. Plant Cell. 16. 1302-1313.
PL 229 043 B1
Donald R. G. K., Lawrence D. M., Jackson A. O., 1997. The Barley Stripe Mosaic Virus 58-kilodalton 3b protein is a multifunctional RNA binding protein. Journal of Virology 71: 1538-1546.
Flasinski S., Dzianott A., Pratt S. and Bujarski J. J., 1995. Mutational analysis of the coat protein gene of brome mosaic virus: Effects on replication and movement in barley and in Chenopodium hybridum. Mol. Plant-Microbe Interact. 8:23-31.
Hanley-Bowdoin L. et al., 2000. Geminiviruses: models for plant DNA replication, transcription, and cell cycle regulation. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 35, 105-140.
Hill J. E., Strandberg J. O., Hiebert E., Lazarowitz S. G., 1998. Asymmetric infectivity of pseudorecombinants of cabbage leaf curl virus and squash leaf curl virus: implications for bipartite geminivirus evolution and movement. Virology 250: 283-292.
Holzberg S., Brosio P., Gross C., Pogue G. P., 2002. Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant. The Plant Journal 30: 315-327.
Jakubiec A., Drugeon G., Camborde L. Jupin I., 2007. Proteolytic processing of Turnip yellow mosaic virus replication proteins and functional impact on infectivity. J. Virol. 81, 11402-11412.
Johnson J. A., Bragg J. N., Lawrence D. M., Jackson A. O., 2003. Mapping of the subgenomic RNA promoters of barley stripe mosaic virus. Virology 313: 66-80.
Kao C. C., Ahlquist P., 1992. Identification of the domains required for direct interaction of the helicase-like and polymerase-like RNA replication proteins of brome mosaic virus. J. Virol. 66: 7293-7302.
Lawrence D. M., Jackson A. O., 2001. Requirements for cell-to-cell movement of Barley stripe mosaic virus in monocot and dicot hosts. Molecular Plant Pathology 2: 65-75.
MacFarlane S. A., 1999. Molecular biology of the tobraviruses. J. Gen. Virol. 80, 2799-2807.
Padidam M. et al., 1996. The role of AV2 („precoat”) and coat protein in viral replication and movement in tomato leaf curl geminivirus. Virology 224, 390-404.
Palukaitis P. Garcia -Arenal F., 2003. Cucumoviruses. Adv. Virus Res. 62, 241-323.
Palukaitis P., Roossinck M. J., Dietzgen R. G., Francki R. I. B., 1992. Cucumber mosaic virus. Adv. Virus Res. 41,281-348.
Paximadis et al. (1999). Paximadis M., Idris A. M., Torres-Jerez I., Villarreal A., Rey M.E., Brown J. K. (1999) Characterization of tobacco gemini viruses in the Old and New World. Arch Virol 144: 703-717.
Petty I. T. D., R. French R. W. Jones, A. O. Jackson, 1990. Identification of barley stripe mosaic virus genes involved in viral RNA replication and systemic movement. The EMBO Journal vol.9 no. 1 1 pp. 3453-3457.
Petty I. T. D., French R., Jones' R. W., Jackson A. O., 1990. Identification of Barley stripe mosaic virus genes involved in viral RNA replication and systemic movement. The EMBO Journal 9: 3453-3457.
Pogue G. P., Lindbo J. A., Dawson W. O. and Turpen T. H. (Eds.), 1998. Tobamovirus transient expression vectors: tools for plant biology and high-level expression of foreign proteins in plants. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands.
Quadt, R., Jaspars, E. M. J. 1990. Purification and characterization of brome mosaic virus RNAdependent RNA polymerase. Virology 178: 189-194.
Rao A. L. N., Grantham G. L. 1996. Molecular studies on bromovirus capsid protein. II. Functional analysis of the amino-terminal arginine-rich motif and its role in encapsidation, movement, and pathology. Virology 226: 294-305.
Sanderfoot A. A., Lazarowitz S. G., 1995. Cooperation in viral movement: the geminivirus BL1 movement protein interacts with BRI and redirects it from the nucleus to the cell periphery. Plant Cell 7, 1185-1194.
Sanderfoot A. A., Lazarowitz S. G., 1995. Cooperation in viral movement: the geminivirus BL1 movement protein interacts with BR1 and redirects it from the nucleus to the cell periphery. Plant Cell 7, 1185-1194.
Sunter G., Bisaro D. M., 1992. Transactivation of geminivirus AR1 and BRI gene expression by the viral AL2 gene product occurs at the level of transcription. Plant Cell 4, 1321-1331.
Sunter G. et ah, 1990. Genetic analysis of tomato golden mosaic virus: ORF AL2 is required for coat protein accumulation while ORF AL3 is necessary for efficient DNA replication. Virology 179, 69-77.
Takeda A., Nakamura W., Sasak N., Goto K., Kaido M., Okuno T., Mise K., 2005. Natural isolates of Brome mosaic virus with the ability to move from cell to cell independently of coat protein. J. Gen. Virol. 86: 1201 -1211.
PL 229 043 Β1
Weiland J. J., Dreher T. W., 1989. Infectious TYMV RNA from cloned cDNA: effects in vitro and in vivo of point substitutions in the initiation codons oftwo extensively overlapping ORFs. NucleicAcids Res. 17, 4675-4687.
Yelina N. E., SavenkovE. L., SolovyevA. G., MorozovS. Y., Valkonen JPT., 2002. Long-distance movement, virulence, and RNA silencing suppression controlled by a single protein in Hordei- and Potyviruses: complementary functions between virus families. Journal of Virology 76: 12981-12991.
Zhou H., Jackson A. O., 1996. Expression of the Barley stripe mosaic virus RNA β ‘triple gene błock’. Virology 216: 367-379.
Wykaz sekwencji
Sekw. Id. Nr: 1
Sekwencja nukleotydowa aa:
5'gtatgtaagttgcctttgggtgtaaaatttcttgcatgcacataatcgtaatcgattcttcttgatctctaaa caacactttcccgttagcatggctagcgatgagattgtccgcaatctgatctcccgtgaggaggtgatgggtaat ttgattagcacagcttctagctcagtaaggtcacccttacatgacgtactgtgctcgcacgtaaggaccatcgtc gattccgtggataagaaagcggtcagtcgcaagcatgttgatgtacggcgcaacatctcctctgaagagttacag atgttgataaatgcatatcctgaatatgccgtttcatcctcagcttgtgaatctggtactcatagcatggcggct tgttttcgatttctggagacagaatacctcttagatatggttccaatgaaagagacttttgtttatgacattggt ggtaactggttttctcatatgaagtttcgtgctgatagagaaattcattgttgctgtccgatcttatctatgaga gattctgaaagactggaaacacgcatgatggcaatgcaaaaatatatgcgtggatcgaaagacaaaccgttacgc ttgttaagccgttatcaaaatatcctgcgtgaacaagcggcgagaacaactgcctttatggcaggtgaggtgaat gcgggtgttctcgatggagatgtgttttgtgagaacacttttcaagactgtgtgagacaggtgcccgaaggtttt ttgaagacagctatagcagttcatagcatctacgatatcaaagtggaagaatttgcgtctgcattgaaaagaaaa ggtataacacaggcttatgggtgcttcctgtttcctcctgctgtattgataggtcagaaggaaggtatt.ttacct tccgtggacggtcattacttggtggagaatggcaggattaagttcttctttgcgaatgatccgaatgccggttac tctcatgaccttaaggattatctgaagtatgtggaaaaaacctacgtggatataaaggatggagtgtttgctatt gagctgatgcaaatgcgaggtgataccatgttctttaagatcacggatgtcaccgcagcaatgtatcatatgaaa tacagaggtatgaaacgtgatgaaacattcaaatgcattccgttgctaaaaaattcatccgttgtcgtacctcta ttttcgtgggacaaccgttctttaaagatcacaagtggtttattaccacgaactttggtcgagcaaggtgcggcg tttaLLaLgaaaaacaaggagaaggacttgaacgttgcLgLgLtgaagaacLatcttLccgctgtgaacaactca tacattttcaacggatcccaggttagagatggtgtgaaaattgccccggatttaatctccaaattggcagtgact ctgtacctgagagaaaaggtctatcgacaaagagaaaattcaatcataagttatttcgagcaagaaatgcttcac gatcccaacttgaaagccatgtttggagactttctgtggtttgttccaaatactctctcgagtgtctggaagaac atgcgaaaatcactgatggaatggtttggctacgcagaatttgacttgactacttttgatatttgcgatcccgtt ctctacgtagagatagtggat cggtataagatcattcaaaaagggcgaattccacttggtgagttttttgattgt catgaagaatgcgagaattacgaactgcgtgagaaggagaaaaatgacctagcggtgaaaatggcccagaaggta acagggacggtgaccgaatgcgagaaggacctgggacctcttgttcaaccgataaaacagatattggttcaactt gtgatgcccaaLL LggtcagagcgctgLgtagacctcg LagcccaacgtctccttLggacttaaatatcccaggg tcaactccatcacactcaagttcagattctgaacaatctatgactgaagaagcgagctgcgccattgcgggtagc gtaccaacatgggaaattgcgactaagaaagatctaacctttcagcgaattgatgaagatatgtctcgacgaact ggtatgcctccaagaccaaaagtaacttctagttacaacatgaatgccagagctgagtttctctactatcaactg tgtagcgtgatttgtgaaagggctcagattttgagtgtcatcgaagactttcgtcagaatttgatattctcagat aaagtggccgttccattgaacgctagattctacagttttcagtcattgcaacccggatgggtgttcaagactcca tcgcatagtgaagtaggccacagttatgcagtacattttgacttcaagacagttggaaccgatttggaagagagc ctagctttttgccgaatggtaccgatttcatgggataaaagcggcaaatacatcgcgacaactcctcattttccc gagagacatggttactacgtgatttgtgacaacactaaattgtgtaacaattggcttatttacaataagttagtt gatgtctacgcacgagtggctgatagacctctgagatttgagttgattgacggagttcctggctgcggaaagtca accatgattttaaacagctgtgatattcgacgcgaagttgttgttggtgaaggaaggaatgcaactgatgactta agggagaggttcaagcgtaagaaaaatttgaatagtaagactgctaatcatagagttcgaacgcttgacagctta ttacttgctgaaggaccttgtgtaccgcaagctgataggtttcattttgatgaagctctaaaagttcattacggc gccataatgttctgtgctgataagcttggtgcctcagaaattctcgctcagggagatagggctcaactgccgatg atctgtcgtgtagaaggtattgaacttcaatttcaatctcctgattacacgaagacgatcataaatcctaagcta cgatcataccgtatccctggagatgttgccttctatttgagtgctaaggaattttacaaagttaaaggaatacct caaaaggttacaacttctaacagtgtgaaacgttccctgtacgctagaggcgaaacaactccggaaagattcgtg agtttgettgatgttccggtgagaaaaaacacccattatctaaccttcttaeaagctgagaaggaaagtttgatg agtcatttgattccaaagggtgtgaagaaagagtctatttcaacgattcatgaggcgcagggtggtacctatgaa aatgtgattctggtccgtttgcaacggacgcccaatgaaatttatccgggtggacctaggtccgccccttacatt gtggttgggacttcaaggcatacaaaaactttcacttattgtagtgttacggacgataagttgcttttagatatc gccgacgtcggtggtattgcacatacacctattcgtacttttgaatctcatatagtttaaaaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatgtttgatcagatcattcaaatctgatggtgcccatcaaccatatgatg ggagtgtttgcaagtccactanaatcgaacttgaaaacgatgcctgaattggaaaccatgaatcttaacggattc tggagagaaaatttaggaattggtatgtaagctacaacttccggtagctgcgtcacactttaagagtgtgcatac tgagccgaagctcagcttcggtcccccaagggaagacca-3'
PL 229 043 Β1
Sekw. Id. Nr: 2
Sekwencja nukleotydowa pa:
5'atgccgaacgtttctttgactgctaagggtggaggacactacaacgaggatcaatgggatacacaagttgtgg aagccggagtatttgacgattggtgggtccacgtagaagcctggaataaatttctagacaatttacgtggtatea actttagcgttgcttcctctcggtcgcaagtcgctgaatgcttagctgcgttagatcgtgatctacctgctgatg tagacagacggtttgcaggtgctagaggacaaattggtttacccaattatcttcctgcgccaaaattctttcgtc tcgataagcgaactatcgctgaactgactagactctctcgtcttacggatcagccgcacaacaatcgtgatatag agcttaaccgagcgaaaagagccacaactaacccatctcccccggcgcaggcaccgtcggagaatcttactcttc gtgatgttoaaccgttaaaggatagtgcgttgoattatcaatacgtgttgattgacctacagagtgcgagactcc cagtgtataccaggaagactttcgaacgtgaactcgcŁttgqaatggatcattccagatgccgaggaagcg--3' Sekw. Id. Nr: 3
Sekwencja nukleotydowa pb:
5'atggacatgacgaaaactgttgaggaaaagaaaacaaatggaactgattcagtgaaaggtgtttttgaaaact cgacgattcccaaagttccgactggacaggaaatgggtggtgacgattcttctacttctaaattaaaggaaactc taaaagttgccgatcagactccattgtccgttgacaacggtgccaaatccaaat.tggattcttctgatagacaag ttcctggtcctaagttggcaacaactgtggaaaaggaacctgagttgaaacccaacgttaagaagtccaagaaga aaagaatccaaaaacctgctcaaccgagtaggcccaatgaccttaaaggcgggactaagggatcatctcaagtgg gtgaaaatgtgagtgagaactatactgggatttctaaggaagcagctaagcaaaagcagaagacacccaagtctg tgaaaatgcaaagcaatctggccgataagttcaaagcgaatgatactcgtagatcggaattaattaacaagtttc agcaatttgtgcatgaaacctgtcttaaatctgattttgagtacactggtcgacagtatttcagagctagatcaa atttctttgaaatgattaagctcgcatccttgtatgacaaacatctaaaggaatgtatggcgcgagcctgcacec tagaacgagaacgattgaagcgtaagttactcctagtacgagctttgaaaccagcagttgacttccttacgggaa tcatctctggagttcctggctcaggaaaatcaaccattgtgcgtactttgctcaaaggtgaatttccggctgttt gtgctttggccaatcctgccttaatgaacgactattctggtattgaaggcgtttacgggttagatgacctgttgc tttctgcagttccgataacgtctgatttattgatcatagatgaatatacacttgctgagagcgcggaaatcctgt tgtt.acaacgaagactcagagcct.ctatggtgttgtt.agtcggggatgtagctcaaggaaaagccaccact.gct.t ccagtattgagtatttaactctgccggtgatctacagatcagagacgacttatcgtttgggacaagagactgctt cgcttLgcagcaagcagggLaacagaaLggtttcaaagggtggaagggacacagtgaLcaLLactgaLLacgaLg gcgaaacagatggaacggagaaaaatatcgcttttactgtcgatacagttcgagatgtgaaagattgcgggtacg attgtgccctggcaattgatgtgcaagggaaagaattcgattcagtgactttattcctaaggaacgaagaccgga aagctttagcagataagcatttgcgtttagtcgctttgagcagacataagtcgaagttaatcatcagggccgacg cggaaattcgtcaagcattcctgacaggtgatattgacttgagctctaaggcgagtaactctcatcgttattctg caaaaccggatgaagaccacagttggttcaaggccaaa-3'
Sekw. Id. Nr: 4
Sekwencja nukleotydowa pc:
5'atggcaatgcctcatcccctggaatgttgttgcccgcaatgcttaccatcatcggaatcatttcctatttatg gcgaacaagagattccgtgctcggagactcaggcggaaacaattcctgcggagaagactgtcagggcgaatgtct taacggacattctcgacgatcattactatgcgatattggctagtctttttatcattgctctatggttattgtata tatatctaagcagtatacctacggagactggtccctacttctatcaagatctgaactctgtgaagatctatggaa taggggctacgaatccagaagttattgcggccatccaccattggcagaagtacccttttggggaatctccgatgt ggggaggtttagtcagtgttttgagcgttcttcttaaaccgctgacgttagtttttgcgttaagcttttttctct tactttcttcaaaaagg-3'
Sekw. Id. Nr: 5
Sekwencja nukleotydowa pd:
5'atgaagaccacagttggttcaaggccaaataagtattggccaattgtcgccggaatcggtgtcgttggattgt ttgcgtatttgatcttttcaaatcaaaaacattctacggaatccggcgataatattcacaaattcgccaacggag gtagttacagggacgggtcaaagagtataagttataatcgtaatcatccttttgcctatggcaatgcctcatccc ctggaatgttgttgcccgcaatgcttaccatcatcggaatcatttcctatttatggcgaacaagagattccgtgc tcggagactcaggcggaaacaattcctgcggagaagactgtcagggcgaatgtcttaacggacattctcgacgat cattactatgcgatattggc-3 '
Sekw. Id. Nr: 6
Sekwencja nukleotydowa Pd':
PL 229 043 Β1
E'atggttattgtatatatatctaagcagtatacctacggagactggtccctacttctatcaagatctgaactct gtgaagatctatggaataggggctacgaatccagaagttattgcggccatccaccattggcagaagtaccctttt ggggaatctccgatgtggggaggtttagtcagtgttttgagcgttcttct-3'
Sekw. Id. Nr: 7
Sekwencja nukleotydowa γη:
5'atggatgttgtgaagaaattcgccgtcatgtcagtgactgtagtagcaggtcccgtccttacgctttcatcac ctgtggtggtgacgtttggaacaggcttaattgccgtatctttggtgaaacggttgctacaggaacaaccccgtg taattgctcacgatcacgaacattacccaggtggttctgagagcagttctagctcttgtgctaccgcgcctattt tacgtaatctttcgcgagatcagtgcgattcagagaatattggatgcagttctagcgcctgttctccgtctgaaa ttgtgaaagttacaaggcaggtagtgggagttgaacgtggtctttaccgggacatttttcaggacaacgaaatcc catcagt.cat.ggaagagaaactgcagaaactcct-tt.actctgagggtgagaagattcgaagacgt-t.gccaatttg aagcatcaacgatgcactcacgcaaagtaaaggttccggaggtaggtactatcccagatatccaaacttggttcg atgctacgtttcctggtaactccgttaggttttctgatttcgacggttatactgttgctacggaggacattaaca LggatgŁLcaggat_tgLagacttaagttcgggaagacttttcgacctLatgaaLttaaggaaLcactgaaaccag tactgaggacagcaatgccagaaaaacgacagggtagtttgattgaaagtgtgctggcctttcgtaaaagaaatt tggctgcgcccagattacaaggagctttgaatgaatggcacacaattgagaatgtgctaacgaaggcgttaaagg tattcttctttgaagatttaattgatcgaacggatcactgcacttacgagtcagcgctcagatggtgggataaac aatcagtgacagctcgagcgcagctcgtggcggatcagcggaggttatgtgatgttgacttcacgacttataact tcatgataaaaaatgatgtaaagccgaagttagatctaacacctcaagttgaatatgcagctttgcagactgttg tatatcctgataagatagtcaatgctttctttggtccgatcataaaggagattaatgaacggatcatcagagcgc ttagacctcatgtggtctttaattctcgtatgactgctgatgaactgaatgaaacagctgcctttttgacacctc ataagtacagagccttagagattgatttttcaaaatttgataaatcaaagactgggcttcatatcaaagctgtca ttggactctataagctctttggcctagatggcctgttaaaagtgctctgggaaaaatcgcaatatcagacttacg LgaaagaLagaaacttcggtctcgaggcataLcLattgtaLcagcaaaag LcaggaaaLLgLgacact Lacggtt cgaacacctggtctgccgccttggcgttgttagattgtcttcctttggaagatgcacatttctgtgtatttggtg gtgatgattcattgatattgtttgatcagggatacataatttccgacccatgccggcaacttgccggtacttgga atcttgaatgtaaagtgttcgacttcaagtaccccgcattttgtggtaaatttctgctgtgcatagatggaaaat atcaatttgttccagatgcggcaaaatttatcacaaaattaggtagaactgatgtgagagatgtagaagttttga gtgagatttatatctctatcaatgacaattacaaatcttacaaagactttaaggtgcttgatgctttggataagg ctttagtggatagatatcgatccccttatagtgctatttctgctttggtttctttatgttatcatatctttgact ttaataagtttaagttgctgtttaattgtgaagggaaatttgtggataagaagctgagaaaagacttcgagtggt ga-3'
Sekw. Id. Nr: 8
Sekwencja nukleotydowa yb:
5'atgatggctactttctcttgtgtgtgttgtggtaccttaactacaagtacttactgtggtaagagatgtgagc gaaagcatgtatattctgaaacaagaaataagagattggaactttacaagaagtatctattggaaccgcaaaaat gcgccctgaatggaatcgttggacacagttgtggaatgccatgctccattgcggaagaggcttgtgatcaactgc caatcgtgagtaggttctgtggccaaaagcatgcggatctgtatgattcacttctgaaacgttctgaacaggagt LacttcttgaatttcLccagaagaagatgcaggagcLgaaactttctcataLcgLaaaaatggcLaagcLLgaaa gtgaggttaacgcaatacgtaagtccgtagcttcttcttttgaagattctgttggatgtgatgattcttcttccg LLyctagcLaa-3'
Sekw. Id. Nr: 9
Sekwencja cDNA transkryptu genu BRADI1G72400 s i ΙβΒβΙβΙββΜΐ ®
181 ||SieSiSelŚle|ATGGATACTGGGTGTerGTCATĆTATGAACATAAGTGGAGeTA 241 ACęAAGTAAGATCTTTCGTGGGACAACTiCATATĄCAAAGAGGGiTCACAAGTAG cagcg 301 iccaaacacttaaaggtagccgccgtgcgagctitagcttgaaaactcctgtcitaagga 361 ATAAAGGAAAAGGATSGCGTGGfGGACĆTGGTGTTCTACAGGTTGTiTGCCAGGATTtTC 421 CAAGAC C TCGACTG C-AAAGCACAATCAAęTATT TGGAAGCTGGACASCTCTCTTGAIOTT 481 TTCGGAGCAGCGAACGCCCCAGTAAACCATTACAGGTCGTGATTGCTGGTGCAGGATTGG 541 CTGGTTTAtdGACTG:CAAAGTATCTGGCAGATGtTGGCCATAAACCCATATiGCTrGAGG 601 CAAGAGATGTTTTGGGTGGAAAGATAGCTGCTTSGAAGGATGAAGATGGCGAfTGGTACG 661 AGACTGGCCTTCATATTTTTTTIGGAGCTTATCęCAACATACAGAATTTGTTTGGCGAGC 721 TTGGTATTAATGACĆGCTTGCAATGGAAGGAACACTCGATGATATTTGCCATGCCGAACA 781 AGĆeftGGAGAATACAGCCGTtTTGATTTĆCCAGAAACTTTGCCA6CACCCT2AAATĆGAG
PL 229 043 Β1
841 TAT:GSGCCA|CCTGAGiaACAATGAAATęiCTTĄOTGGÓĆSGAGAĄgGTGAAGTTTGGi;A 901 TA|GACTT|G|CCAGGAATG||iGGTSSGCAAG||TATG|lGAA3G|CAA|A| GGCSTSA 961 CTGGlTCAGAGTGGATGGAAAAGCAGGGfGTTGGIGATGGAGTCAAGGATGAGGTTTIIA
1021 TTGGAATGlGGAAG&ęiCTCAAlTTCteAAACeOGATSAGTTATGlATGGAGTGCAlil C 1081 TGAllGCTG|AAACeGATTTGleCAGGAGAAGGAlGGT|eGAAA.ffil|GCASflTTG;GA|G 1141 gtaagcctGGggaaagsctaGGśatgGgGattggIaacG&iattgAStctIggggtsGGg 1201 AGG:l|CGCGiGAATTGiCGTA|iCAGASAATAGSSCTGAAlCCGSSGAGAAGTGTGAA§C 12 61 ACiTiGTAGTiAGCGASGGSlGlAACAil^CGGGAGATGGlGAGSO TTTGGAGCAGGAG 1321 TTGAGATCi|@AAA®®gGTTG|ACCG£ftAGAGlGSAAAGAGATC:ii||TATlWeAAGffi»i3C 1381 TGGaiAAGfGAGTGGGAGTCSiiGTCAGŚAATGifCATlGATGGTSlGACaGAAAAeiEGA 1441 AAieACGG|eGACGA|CTTGliTTC|®AGGA|iTCA|iiGTA5®GTT|AiGCASAgA 1501 TGlG|GTA@GeiGCĄASGAGOGTATGAECCA@®GCGT|CAATGG|GGAG|GGGTC:Tl|G 15 61 GTGGAGCĄGA§GAAGGGATTGGACGGSS|GACA&f GAASGGATlGASGCAffiGiATGGASG 1621 AGGGAGCCOGiTAriiCCTaAtGAAAliGCTGmGATGAGAGTAASGCAAAGATTGTfA 1681 AAGAlCATilϊGTAAA|ACA|||AGA|i!GTAi|SAAAlGiGTCG|2iGAT|GGGAAŚl|T 1741 GTGaACCT|g|cAAGGATCAG|ÓATTGAAGGG|i|TATB||GCTC>iGAC|A.CACAAAAC 1801 AGA3^TACSl|GCTGG|ATGgiS|CCTSGAGTTl|3STCT8SGAAC|||TCT|g|CAC8|gA 1861 TAG8GCAGG&TTCTA2y^TGG|STCTGG8AGGA@GCAGAAĄAGCCiSCAAGGCGAAG8GC 19 21 GT@GlGCTiGGTAG||i|B8l|GlS®eiiSlGG||i®eM||SilGGeillg:
2041 iiioiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii
2 21 AAAAilGAGGGAG AAG A
Sekw. Id. Nr: 10
Sekwencja nukleotydowa amplifikowanego fragmentu promotora genu BdPDS
GGATCCTTTGGTGATTGGGCAGAAGAATCGGCGGGTGGGGCGCGGATTAGCTCTAGAATCGGGGAATTTCTCAGG
GTTTTTCCTTTAGAACCCTTCCAAATTACCCATCGACTCCCCAAACCACCCCCTTACGCATCCTCTATCGTTCAT
TATTCTGCTAGTTCATTGACTTCAATTCCCCAAACTATGAGCCACAGCCGCATGGAAGGAAACACACGGAGTATT
AATATTACGGAATGAAACTCACTTTTCCACTCCCAGATGGATCC
Claims (4)
1. Sposób wyciszania genu rośliny zbożowej, znamienny tym, że:
(i) otrzymuje się DNA należący do promotora wyciszanego genu, (ii) uzyskuje się wektor wirusowy nadający się do wprowadzania do komórki roślinnej RNA komplementarne do DNA będącego fragmentem promotora wyciszanego genu, przy czym wektor ten zawiera: fragment genomu wirusa roślinnego obejmujący sekwencje zapewniające replikację RNA wirusa, fragment genomu wirusa roślinnego obejmujący sekwencje zapewniające systemiczny transport wirusa w infekowanej roślinie oraz sprzężony z nimi fragment DNA należącego do promotora wyciszanego genu otrzymanego w etapie (i), przy czym DNA należący do promotora wyciszanego genu jest wbudowany do wektora wirusowego w orientacji sensowej lub antysensowej, (iii) prowadzi się syntezę RNA in vitro stosując jako matrycę cDNA wektora wirusowego otrzymanego w etapie (ii), (iv) wprowadzonym do komórek roślin RNA uzyskanym w etapie (iii) wycisza się ekspresję genu, którego promotor jest częścią wektora wirusowego otrzymanego w etapie (ii), przy czym wspomniany gen pozostaje wyciszony również w roślinach potomnych uzyskanej rośliny.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wyciszany gen jest natywnym genem rośliny zbożowej.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wektor wirusowy stosuje się cDNA wirusa paskowej mozaiki jęczmienia lub jego fragmenty posiadające sekwencję nukleotydową wybraną spośród przedstawionych jako sekwencje od 1 do 8.
PL 229 043 Β1
4. Wektor wirusowy do wyciszania genu rośliny zbożowej, znamienny tym, że zawiera:
- fragment genomu wirusa roślinnego obejmujący sekwencje zapewniające replikację RNA wirusa,
- fragment genomu wirusa roślinnego obejmujący sekwencje zapewniające systemiczny transport wirusa w infekowanej roślinie oraz
- sprzężony z nimi fragment DNA należącego do promotora wyciszanego genu, przy czym fragment genomu wirusa roślinnego wybiera się spośród fragmentów cDNA wirusa paskowej mozaiki jęczmienia przedstawionych jako sekwencje od 1 do 8.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL396949A PL229043B1 (pl) | 2011-11-11 | 2011-11-11 | Sposób wyciszania genu rośliny zbożowej oraz wektor wirusowy do wyciszania genu rośliny zbożowej |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL396949A PL229043B1 (pl) | 2011-11-11 | 2011-11-11 | Sposób wyciszania genu rośliny zbożowej oraz wektor wirusowy do wyciszania genu rośliny zbożowej |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL396949A1 PL396949A1 (pl) | 2013-05-13 |
| PL229043B1 true PL229043B1 (pl) | 2018-06-29 |
Family
ID=48522640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL396949A PL229043B1 (pl) | 2011-11-11 | 2011-11-11 | Sposób wyciszania genu rośliny zbożowej oraz wektor wirusowy do wyciszania genu rośliny zbożowej |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL229043B1 (pl) |
-
2011
- 2011-11-11 PL PL396949A patent/PL229043B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL396949A1 (pl) | 2013-05-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Development of Bean pod mottle virus-based vectors for stable protein expression and sequence-specific virus-induced gene silencing in soybean | |
| US6777588B2 (en) | Methods and means for producing barley yellow dwarf virus resistant cereal plants | |
| Asad et al. | Transgenic tobacco expressing geminiviral RNAs are resistant to the serious viral pathogen causing cotton leaf curl disease | |
| Sudarshana et al. | Dynamics of bean dwarf mosaic geminivirus cell-to-cell and long-distance movement in Phaseolus vulgaris revealed, using the green fluorescent protein | |
| Soler et al. | Transformation of Mexican lime with an intron‐hairpin construct expressing untranslatable versions of the genes coding for the three silencing suppressors of Citrus tristeza virus confers complete resistance to the virus | |
| Namgial et al. | Topical application of double-stranded RNA molecules containing sequences of Tomato leaf curl virus and Cucumber mosaic virus confers protection against the cognate viruses | |
| Ghorbel et al. | Transgenic citrus plants expressing the Citrus tristeza virus p23 protein exhibit viral‐like symptoms | |
| Sharma et al. | Tomato leaf curl Java virus V2 protein is a determinant of virulence, hypersensitive response and suppression of posttranscriptional gene silencing | |
| US11659807B2 (en) | Virus-resistant tobacco and breeding method therefor | |
| Naylor et al. | Construction and properties of a gene-silencing vector based on Poplar mosaic virus (genus Carlavirus) | |
| AU2001297906A1 (en) | Method and means for producing barley yellow dwarf virus resistant cereal plants | |
| Selth et al. | Host responses to transient expression of individual genes encoded by Tomato leaf curl virus | |
| Lentz et al. | Cassava geminivirus agroclones for virus-induced gene silencing in cassava leaves and roots | |
| Rajeswaran et al. | Interactions of Rice tungro bacilliform pararetrovirus and its protein P4 with plant RNA-silencing machinery | |
| Xie et al. | Simultaneous gene expression and multi-gene silencing in Zea mays using maize dwarf mosaic virus | |
| Morilla et al. | A versatile transreplication-based system to identify cellular proteins involved in geminivirus replication | |
| Chen et al. | Resistance to viral yellow leaf curl in tomato through RNAi targeting two Begomovirus species strains | |
| Nahid et al. | RNA interference-based resistance against a legume mastrevirus | |
| Kulshreshtha et al. | AC4 protein of tomato leaf curl Palampur virus is an RNA silencing suppressor and a pathogenicity determinant | |
| Isogai et al. | The 1b gene of raspberry bushy dwarf virus is a virulence component that facilitates systemic virus infection in plants | |
| Bagyalakshmi et al. | Identification of the RNA silencing suppressor activity of Sugarcane streak mosaic virus P1 gene | |
| Pignatta et al. | Quantitative analysis of efficient endogenous gene silencing in Nicotiana benthamiana plants using tomato bushy stunt virus vectors that retain the capsid protein gene | |
| CN105039388A (zh) | 重组单链负义植物病毒侵染性克隆构建方法及质粒和病毒 | |
| PL229043B1 (pl) | Sposób wyciszania genu rośliny zbożowej oraz wektor wirusowy do wyciszania genu rośliny zbożowej | |
| WO2002057301A2 (en) | Gene silencing suppressor |