PL228558B1 - Koniugat kwasu jasmonowego i tetrapeptydu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest koniugat kwasu jasmonowego i tetrapeptydu.

Kwas jasmonowy należy do jasmonidów - klasy hormonów roślinnych. Jest pochodną kwasu linolenowego. Główną funkcją kwasu jasmonowego i jego metabolitów jest regulacja odpowiedzi roślin na stresy abiotyczne i biotyczne, jak również wzrostu i rozwoju roślinnego. Kwas jasmonowy i jego pochodne są stosowane w kosmetykach.

Michelet J. F i współpracownicy (1) przeprowadzili badania nad zastosowaniem pochodnych kwasu jasmonowego w kosmetykach do pielęgnacji skóry. Pochodna kwasu jasmonowego, sól sodowa kwasu tetrahydrojasmonowego (nazwa handlowa LR2412) została opracowana w celu zmniejszenia widocznych oznak starzenia się skóry. Badania in vivo potwierdzające skuteczność działania LR2412 przeprowadzono na zrekonstruowanym modelu skóry-Episkin™. Zaobserwowano wzrost procentu ke-ratynocytów posiadających antygen Ki67 (białko jądrowe będące markerem komórkowej proliferacji) w warstwie podstawnej naskórka. Stwierdzono również wzrost grubości naskórka. Ponadto, wyniki badań RTQPCR dowiodły wzrostu ekspresji syntezy hialuronianu 2 (HAS2) oraz syntezy hialuronianu 3 (HAS3). Ponadto stwierdzono ilość zawartości kwasu hialuronowego w podstawnej i ponadpodstawnej warstwie naskórka.

Tran, C., wraz z współpracownikami (2) badali in vitro skuteczność działania przeciwstarzenio-wego LR2412. Ocenę zdolności penetracyjnych LR2412 oceniono z wykorzystaniem wycinka ludzkiej skóry z powłok brzusznych oraz komory dyfuzyjnej Franza oraz wycinka ludzkiej skóry. Zaaplikowano 2 mg LR2412 na 1 cm2 skóry (4% roztwór, niestety brak informacji, jaki to rozpuszczalnik). Badania te wykazały, że LR2412 penetruje naskórek oraz górne warstwy skóry właściwej, które są celem działania aktywnych substancji przeciwstarzeniowych. Po 24 godzinach umyto wycinki skóry i zbadano zawartość procentową substancji LR2412 w poszczególnych warstwach skóry. Stwierdzono zawartość 0,93% zaaplikowanej ilości w warstwie rogowej, 0,74% głębszych warstwach naskórka oraz 0,27% w górnych warstwach skóry właściwej. W wyniku badan stwierdzono, że z formulacji uwolniło się ok 5,53% LR2412. Oceniono, że właściwości złuszczające cząsteczki LR2412 oraz jej zdolność do interakcji z warstwą rogową naskórka zbadano metodą mikroskopii elektronowej i dyfrakcji rentgenowskiej (eksperymenty przeprowadzono na modelu skóry ludzkiej). Na podstawie wyników badań stwierdzono, że LR2412 przyspiesza złuszczanie górnych warstw stratum corneum oraz poprawia właściwości mechaniczne naskórka. Ponadto, badania in vivo wykorzystujące testy płatkowe na skórze pacjentów z objawami foto-starzenia dowiodły, że LR2412 ma wpływ na odkładanie się w warstwie brodawkowatej skóry właściwej włókien mikrofibrylowych bogatych w fibrylinę.

Pochodna kwasu jasmonowego w postaci soli sodowej kwasu tetrahydrojasmonowego (LR2412) wykazuje niewielki procent uwolnienia z aplikowanej formulacji co sugeruje słabą efektywność działania formulacji zawierających tę pochodną, ze względu na niewielki procent uwalniania z formulacji ją zawierających.

Celem wynalazku było opracowanie/ związku będącego pochodną kwasu jasmonowego, która charakteryzuje się lepszym uwalnianiem z formulacji kosmetycznej.

Przedmiotem wynalazku jest koniugat kwasu jasmonowego i tetrapeptydu o wzorze 1

(I)

Koniugat o wzorze 1 otrzymuje się m.in. w wyniku następującej reakcji:

Peptydy zostały zsyntezowane manualnie metodą Fmoc/tBu na fazie stałej. Fazę stałą stanowiła żywica Wanga [(4-hydroksymetylo)-fenoksymetylo-kopoli(styren-1% diwinylobenzen)] o stopniu osadzenia 0,6 mmol/g. Syntezę wykonywano w skali 0,3 mmol, a do jej przeprowadzenia stosowano pięciokrotny nadmiar Fmoc-pochodnych aminokwasów. DIC i HOBt użyte zostały jako odczynniki podczas sprzęgania, które każdorazowo prowadzone było przez 60 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem naczynia reakcyjnego. Stosunek molowy poszczególnych substratów - Fmoc-AA-OH:DIC:HOBt odpowiada stosunkowi 1:1:1. Użyto następujących pochodnych aminokwasów: Fmoc-L-Phe-OH, Fmoc--L-Pro-OH, Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH. Przyłączanie kwasu jasmonowego do N-końca tetrapeptydu odbywało się na żywicy analogicznie jak w przypadku pochodnych aminokwasów.

Surowy peptyd był odszczepiany od żywicy za pomocą mieszaniny TFA:H20:TIS w proporcji objętościowej 92,5:2,5:5 przez okres 1,5 godziny w temperaturze pokojowej, zaś całość mieszana była za pomocą mieszadła magnetycznego przy 500 rpm. Na 100 mg żywicy przypadał 1 ml mieszaniny. Następnie otrzymany roztwór poddano filtracji w celu oddzielenia ziaren żywicy. Za pomocą schłodzonego eteru dietylowego z przesączu wytrącono surowy peptyd, który przed oczyszczaniem zliofilizowano.

Szczegółowy opis syntezy podano w poniższym przykładzie wykonania. W syntezie stosowano kwas jasmonowy (JA) pochodził z firmy TCI (ΤΟΚΥΟ CHEMICAL INDU-STRY CO., LTD.; mieszanina izomerów, czystość >85,0%, CAS 221682-41-3), zaś pozostałe odczynniki z firmy Sigma-Aldrich, Polska.

Synteza JA-YPFE w skali 0,3 mmol na żywicy Wanga (1% DVB, 200-400 mesh). Przed przystąpieniem do syntezy żywicę (1 g) umieszczono w mieszaninie DCM/DMF (v/v, 9:1; 15 ml mieszaniny na 1 g żywicy) na okres jednej godziny w temperaturze pokojowej w zamkniętej szklanej fiolce z wciskaną zatyczką w celu napęcznienia jej ziaren. Przyłączenie pierwszego aminokwasu - Fmoc-L-Phe-OH do polimeru żywicy odbywało się z użyciem 2,5 nadmiaru pochodnej aminokwasu względem zakładanego stopnia osadzenia żywicy (0,6 mmol/g). W związku z tym na 1 gram żywicy wykorzystano 1,5 mmol pochodnej aminokwasu. Ilość wykorzystanej pochodnej Fmoc-L-Phe-OH (MW = 387,4 g/mol) wynosiła 585,1 mg. Zastosowana procedura przyłączania pierwszego aminokwasu do żywicy Wanga wymagała także użycia 1,5 mmol HOBt (HOBt monohydrat; MW= 153,1 g/mol), czyli 229,7 mg. Żywicę przeniesiono do naczynia reakcyjnego o pojemności 14 ml. Następnie usunięto rozpuszczalniki poprzez sączenie pod zmniejszonym ciśnieniem. Do żywicy dodano Fmoc-L-Phe-OH i HOBt uprzednio całkowicie rozpuszczone w 10 mL mieszaniny DCM/DMF (v/v, 9:1). W osobnym naczyniu rozpuszczono 0,06 mmol DMAP (MW = 122,2 g/mol), czyli 7,3 mg w 0,2 ml DMF. W pierwszej kolejności do żywicy dodano mieszaninę pochodnej aminokwasu i HOBt, a następnie 1,5 mmol DIC, a więc 232,3 μΙ (MW = 126,2 g/mol, p20°c = 0,815 g/ml).

Kolejnym etapem było dodanie roztworu DMAP. Reakcję prowadzono przez trzy godziny w temperaturze pokojowej z jednoczesnym wytrząsaniem naczynia reakcyjnego na wytrząsarce laboratoryjnej. Po tym czasie do mieszaniny dodano 1,2 mmol bezwodnika octowego oraz 1,2 mmol DIPEA -odpowiednio 113,4 μΙ oraz 204,0 μΙ (Ac20, MW = 102,1 g/mol, p20°c = 1,08 g/ml; DIPEA, MW = 129,2 g/mol, p20 C = 0,76 g/ml); w celu zabezpieczenia nieprzereagowanych grup hydroksylowych obecnych na żywicy. Reakcję prowadzono przez 30 minut w temperaturze pokojowej wytrząsając naczynie reakcyjne. Następnie żywicę przepłukano serią rozpuszczalników (każde płukanie trwało 1 minutę, a objętość rozpuszczalnika wynosiła 10 ml), kolejno: dwukrotne płukanie DMF, dwukrotne przemywanie mieszaniną DMF/DCM (v/v, 1:1), dwukrotne przemywanie DCM, trzykrotne przemywanie eterem dietylo-wym. Rozpuszczalniki sączone były pod zmniejszonym ciśnieniem. Po wykonaniu serii płukań żywica poddana była suszeniu w eksykatorze próżniowym przez dobę. Po tym czasie żywicę zważono i na podstawie przyrostu masy określono stopień osadzenia żywicy. Dodatkowo dokonano określenia stopnia osadzenia za pomocą metody spektra fotometrycznej, która opiera się na pomiarze absorbancji roztworu zawierającego uwolniony chromofor w postaci adduktu piperydyna-dibenzofulwen, przy długości fali równej 290 nm. Dokonuje się tego poprzez traktowanie żywicy 20% roztworem piperydyny w DMF (w tym przypadku 2 mg na 3 ml roztworu w trzech powtórzeniach) przez 10 minut z wytrząsaniem. Jako odniesienie służy absorbancja zmierzona dla 20% roztworu wyjściowego piperydyny w DMF. Wzór pozwalający określić osadzenie - Osadzenie [mmol/g] = Absorbancja290mn/(rnasa żywicy [mg] x 1,75). Wykorzystując metodę wagową określono stopień obsadzenia na 0,75 mmol/g, zaś wartość wyznaczona za pomocą metody spektrofotometrycznej to 0,65 mmol/g. Wartości te uśredniono traktując metody jako równoważne, w związku z czym uzyskano wartość osadzenia 0,70 mmol/g. Jako, że dalsza synteza odbywała się w skali ok. 0,3 mmol, do kolejnych etapów wykorzystano 430 mg żywicy. Wysuszoną żywicę należało ponownie poddać procesowi pęcznienia poprzez umieszczenie jej w mieszaninie DCM/DMF (v/v, 9:1) na jedną godzinę w naczyniu reakcyjnym. Po tym czasie dokonano deprotekcji grupy α-aminowej, odszczepiając ugrupowanie Fmoc (9-fluorenylometoksykarbonylowe) za pomocą 20% roztworu piperydyny w DMF (8 ml), w czasie 10 minut przy jednoczesnym wytrząsaniu. Po etapie deprotekcji żywicę przemywanie tak jak opisano uprzednio z pominięciem przemywania eterem diety-lowym (sumarycznie sześć przemywać, ostatnie za pomocą DCM). Pobrano kilka ziaren żywicy za pomocą szklanej kapilary i umieszczono w roztworze do testu chloranilowego na 10 minut, po czym dokonywano obserwacji zabarwienia ziaren (150 μΙ; 1% acetaldehyd, 1% p-chloranil, w DMF). Identyczny co do procedury test oraz przemywania miały miejsce po każdym etapie deprotekcji i sprzęgania, w tym z kwasem jasmonowym. Pozytywny wynik testu chloranilowego (ziarna przybierają barwę od zielonej do granatowej; obecne są wolne grupy aminowe) po etapie deprotekcji był rezultatem pożądanym i pozwalał na przejście do etapu sprzęgania, zaś w przypadku wyniku negatywnego (ziarna transpa-rentne) etap deprotekcji należałoby powtórzyć (nie zaobserwowano). Reakcja sprzęgania z kolejnymi aminokwasami oraz z kwasem jasmonowym przebiegała z pięciokrotnym nadmiarem każdego z nich w stosunku do skali syntezy (skala 0,3 mmol, pięciokrotny nadmiar - 1,5 mmol). W związku ze stechiometrią reakcji do każdej z reakcji kondensacji wykorzystano 1,5 mmol HOBt (229,7 mg) oraz 1,5 mmol DIC (232,3 μΙ). Do Fmoc- pochodnej aminokwasu (także kwasu jasmonowego) oraz HOBt wprowadzano 8 ml mieszaniny DMF/DCM (v/v, 1:1), a następnie dodano DIC. Po całkowitym rozpuszczeniu składników mieszaninę przenoszono do naczynia reakcyjnego zawierającego żywicę. Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej przez godzinę umieszczając naczynie na wytrząsarce laboratoryjnej. Po reakcji sprzęgania oczekiwano negatywnego wyniku testu chloranilowego, zaś w przypadku uzyskania potwierdzenia obecności wolnych grup aminowych etap sprzęgania powtarzano w tych samych warunkach. Dokładne ilości wykorzystanych pochodnych aminokwasów i kwasu jasmonowego w kolejnych etapach: 585,1 mg Fmoc-L-Phe-OH (MW = 387,4 g/mol), 506,1 mg Fmoc-L-Pro-OH (MW=337,37 g/mol), 689,3 mg Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH, 371,1 mg kwasu jasmonowego (MW = 210,3 g/mol, uwzględniono czystość >85,0%).

Po zakończonej syntezie i serii płukań żywicę wysuszono w eksykatorze próżniowym, a następnie koniugat odszczepiano od żywicy poprzez zastosowanie mieszaniny TFA:H20:TIS w proporcji objętościowej 92,5:2,5:5 (1 ml na 100 g) przez okres 1,5 godziny w temperaturze pokojowej, w efekcie otrzymując surowy peptyd, tak jak opisano to w punkcie 1.2. Teoretyczna masa produktu przy 100% wydajności powinna wynosić 226,5 mg (0,7 mmol/g x 430 mg x 752,4 g/mol). Otrzymano 211,5 mg surowego koniugatu. Po jego oczyszczeniu uzyskano 168,6 mg (wydajność 74,4%) produktu o czystości >97%.

Zsyntezowany koniugat kwasu jasmonowego i peptydu oczyszczono za pomocą wysokospraw-nego chromatografu cieczowego w układzie faz odwróconych (RP-HPLC), przy wykorzystaniu kolumny Phenomenex Luna, 5 μηι, C18(2), 100 A, 10 x250 mm. Jako eluenty zastosowano wodę i acetonitryl zawierające 0,1% TFA. Oczyszczanie prowadzono w gradiencie rozpuszczalników przy wzrastającym udziale acetonitrylu (10-60%), w czasie 40 min, oraz przy objętościowym natężeniu przepływu 5 ml/min. Analizy czystości produktu dokonano w analogicznym układzie RP-HPLC, przy wykorzystaniu kolumny Phenomenex Luna, 5 μηι, C18(2), 100 A, 4,6x150 mm. Czystość produktu końcowego koniugatu określono na >97%.

Koniugat JA-YPFF-NH2, według wynalazku, charakteryzuje się następującymi właściwościami:

Masa związku: 764 Da.

Postać: biały proszek

Rozpuszczalność: związek dobrze rozpuszczalny w metanolu, etanolu; słabo rozpuszczalny w wodzie

Stabilność związku: związek stabilny; na podstawie analizy widma ESI-MS związku stwierdzono, że struktura koniugatu nie uległa zmianie przez okres roku przechowywania zarówno w temperaturze 4 jak i 25°C. Stabilność związku w warunkach badania kinetyki uwalniania również została potwierdzona w oparciu o analizę widma spektrometrii mas (fig. 6), gdzie zidentyfikowano pik o masie molekularnej 765,6 [JA-YPFF-NH2+H]+.

Na rysunku na fig. 1 przedstawiono widmo mas związku JA-YPFF-NH2 wykonane techniką ESI-MS, które potwierdza masę cząsteczkową koniugatu.

Na fig. 2 przedstawiono widmo IR koniugatu JA-YPFFNH2. W tabeli 1 podano analizę widma IR. Analiza widma IR potwierdza strukturę koniugatu.

Tabela 1. Analiza wiązań chemicznych występujących w koniugacie.

W celu wykazania właściwości koniugatu przygotowano i przebadano serie emulsji oraz żeli zawierających koniugat w celu określenia, która z formulacji gwarantuje większą biodostępność substancji czynnej, tj. z której formulacji uwalnia się najwięcej substancji aktywnej.

Przygotowanie formulacji kosmetycznych zawierających koniugat JA-YPFF.

Przygotowano cztery różne formulacje kosmetyczne: • Emulsja 1 (typu o/w, przygotowana na ciepło), • Emulsja 2 (typu w/o, przygotowana na ciepło), • Emulsja 3 (typu o/w, przygotowana na zimno), • Żel.

Każda z przygotowanych formulacji zawierała 0,5% wagowych substancji aktywnej. W Tabeli 2 przedstawiono uogólniony skład formulacji zawierających substancję aktywną.

Do badań eksperymentalnych przygotowano formulacje kosmetyczne (Tabela 3); każda z przygotowanych formulacji zawierała 0,5% substancji aktywnej.

Tabela 2

Preparatyka Emulsji 1 (typu o/w, przygotowana w temperaturze 70°C)

Składniki tworzące fazę tłuszczową emulsji (olej słonecznikowy, monostearynian glicerolu oraz alkohol cetylowy) odważono w temperaturze pokojowej, a następnie wprowadzono do umieszczonej na mieszadle magnetycznym zlewki, której zawartość ogrzano do temperatury 70°C. W tym samym czasie do kolejnej zlewki wprowadzono wodę demineralizowaną i kwas cytrynowy (w temperaturze pokojowej), składniki mieszano aż do całkowitego rozpuszczenia kwasu a następnie ogrzewano do uzyskania temperatury 75°C. Po całkowitym roztopieniu składników fazy tłuszczowej, dodano do nich wodę demineralizowaną i rozpuszczony w niej kwas cytrynowy, cały czas mieszając układ na mieszadle magnetycznym aż do całkowitego połączenia się fazy tłuszczowej i wodnej (prędkość mieszania 1200 obrotów/mi-nuta - maksymalna prędkość mieszadła; prędkość ta jest kluczowa w tworzeniu emulsji ze względu na lepszą dyspersję składników fazy tłuszczowej w fazie wodnej). Po schłodzeniu otrzymanej emulsji do temperatury 30°C dodano do niej substancję aktywną w procencie wagowym 0,50 i wstępnie wymieszano. Gotową emulsję zawierającą substancję aktywną homogenizowano 5 minut w celu zwiększenia jednorodności 195 uzyskanej formulacji (homogenizator YellowLine by IKA).

Preparatyka Emulsji 2 (typu w/o, przygotowana w temperaturze 70°C)

Składniki tłuszczowe (alkohol cetearylowy, parafina ciekła, palmitynian izopropylu, wazelina biała) odważono w temperaturze pokojowej, a następnie wprowadzono do zlewki umieszczonej na mieszadle magnetycznym. Zawartość zlewki ogrzano do temperatury 70°C. Jednocześnie w drugiej zlewce rozpuszczono odmierzoną ilość kwasu cytrynowego w wodzie demineralizowanej w temperaturze pokojowej (faza wodna), którą następnie ogrzano do uzyskania tej samej temperatury, co dla składników fazy tłuszczowej. Po całkowitym roztopieniu składników fazy tłuszczowej, dodano do nich ogrzaną fazę wodną, układ cały czas mieszano intensywnie na mieszadle magnetycznym (prędkość mieszania 1200 obro-tów/minuta- maksymalna prędkość mieszadła; prędkość ta jest kluczowa w tworzeniu emulsji ze względu na lepszą dyspersję składników fazy wodnej w fazie tłuszczowej). Po otrzymaniu emulsji o jednolitej konsystencji i schłodzeniu jej do 30°C, dodano do niej substancję aktywną w procencie wagowym 0,50 i wstępnie wymieszano. Gotową emulsję zawierającą substancję aktywną homogenizowano przez 5 minut w celu zwiększenia jednorodności uzyskanej formulacji (homogenizator YellowLine by IKA).

Preparatyka Emulsji 3 (typu o/w, przygotowana w temperaturze 25°C)

Do zlewki umieszczonej na mieszadle magnetycznym wprowadzono składniki Creagel EZ7 (polakry-lamid, uwodorniony polidecen, eter laurylowy polioksyetylenu-Laureth-7) oraz Alphaflow (uwodorniony poli-decen), stopniowo dodawano do nich wodę, cały czas intensywnie mieszając (prędkość mieszania 1200 obrotów/minuta - maksymalna prędkość mieszadła; prędkość ta jest kluczowa w tworzeniu emulsji ze względu na lepszą dyspersję składników Creagel EZ7 oraz Alphaflow 20 w fazie wodnej). Po całkowitym wymieszaniu składników dodano substancję aktywną w ilościach wagowych 0,50 i wstępnie wymieszano, a następnie homogenizowano otrzymaną emulsję przez 5 minut (homogenizator YellowLine by IKA). Preparatyka żelu (przygotowano w temperaturze 25°C)

Karbomer kwasu akrylowego dyspergowano w wodzie w temperaturze pokojowej za pomocą mieszadła magnetycznego przez dwie godziny (prędkość mieszania 1200 obrotów/minuta - maksymalna prędkość mieszadła; prędkość ta jest kluczowa w tworzeniu tej kompozycji ze względu na lepszą dyspersję karbomeru w wodzie). Po upływie tego czasu dodano 2-propanol, a następnie intensywnie mieszając, wprowadzano porcjami roztwór wodorotlenku sodu do osiągnięcia wartości pH równej 6,5. Po uzyskaniu żelowej konsystencji produktu, dodano do niego substancję aktywną w procencie wagowym 0,50. Po dodaniu substancji aktywnej układ wstępnie wymieszano, a następnie poddano homogenizacji (czas homogenizacji 5 minut) w celu zwiększenia jednorodności uzyskanej formulacji (homogenizator YellowLine by IKA). W tabeli 3 podano szczegółowy skład poszczególnych emulsji.

Tabela 3

cd. tabeli 3

Badanie lepkości przygotowanych formulacji kosmetycznych

Zbadano lepkość formulacji kosmetycznych (bazy). Badania wykonano na wiskozymetrze rotacyjnym RC02 firmy Rheotec z nastawianym momentem ścinającym. Do zmierzenia lepkości przygotowanych formulacji wykorzystano wrzeciono R6.

Na fig. 3 przedstawiono wykres lepkość poszczególnych preparatów zawierających koniugat JA-YPFF-NH2 lub kwas jasmonowy JA. Największą lepkością charakteryzuje się Emulsja 2, natomiast najmniejszą-żel. Następnie po dodaniu składników aktywnych (JA lub koniugat JA-YPFF-NH2) i schłodzeniu preparatów do temperatury pokojowej ponownie zbadano lepkość. Nie zaobserwowano wpływu dodatku substancji czynnych na lepkość przygotowanych formulacji.

Badanie kinetyki uwalniania substancji czynnej z formulacji kosmetycznych

Badania uwalniania in vitro przeprowadzono z wykorzystaniem aparatury USP Apparatus 2 (Van-kel 7010, Varian, USA), połączonej ze spektrofotometrem UV-Vis Cary 50 Bio (Varian, USA). Każda formulacja kosmetyczna została umieszczona w komorze ekstrakcyjnej. Następnie nałożono membranę dializacyjną o kształcie dopasowanym do komory ekstrakcyjnej. W badaniach wykorzystano membranę celulozową (Cuprophan, Agilent Technologies Inc., USA, nr kat. 121370), która została uprzednio inku-bowana w roztworze akceptorowym przez godzinę przed jej użyciem. Całość zabezpieczono nakrętką w celu unieruchomienia preparatu i membrany. Do badań wykorzystano roztwór akceptorowy (medium), który stanowił mieszaniną etanolu oraz buforu fosforanowego (K2HPO4 + KOH) (pH 5,8) w stosunku objętościowym 35:65. Pomiary uwalniania koniugatu z otrzymanych preparatów kosmetycznych prowadzono temperaturze 32,3±0,5°C z prędkością, mieszania 100 rpm. Czas każdego pomiaru trwał łącznie 24 godziny, a próbki były pobierane co 30 min. Stężenie substancji aktywnej uwolnionej z formulacji kosmetycznych do medium było monitorowane za pomocą spektrofotometru UV-Vis przy długości fali 279 nm (dla AcYPFF-NFh), przy 277 nm (dla JA-YPFF-NH2) oraz przy 290 nm (dla JA).

Obserwacja zjawiska uwalniania badanej substancji z podłoża kosmetycznego do medium jest możliwa dzięki badaniu zmian absorbancji w czasie. Do obliczenia ilości uwolnionej substancji w czasie skorzystano ze wzoru:

gdzie: AP- absorbancja próbki [-],

Aw - absorbancja wzorca [-],

Mw - masa wzorca [mg],

Vw - objętość roztworu wzorcowego [ml],

Cw- czystość wzorca,

Dw - rozcieńczenie wzorca, mP - masa substancji oznaczanej zawartej w próbce [mg], VP - objętość medium [ml].

Na figurze 4 przedstawiono profil uwalniania koniugatu JA-YPFF-NH2 z różnych formulacji kosmetycznych w czasie - Emulsja 1, Emulsja 3, Emulsja 3 oraz Żel.

Zaobserwowano, że największa ilość koniugatu uwalnia się z żelu, natomiast najmniejsza-z Emulsji 2. Spośród przygotowanych formulacji Żel charakteryzuje się najniższą (7500 mPa s_1) lepkością, natomiast Emulsja 2 ma największą lepkość (107300 mPa* s1) (Rys. 4). Wnioskować można więc, że lepkość podłoża kosmetycznego ma znaczący wpływ na ilość uwolnionej z niego substancji; im mniejsza lepkość podłoża, tym większy procent uwolnionej substancji. Na tej podstawie można stwierdzić, że najlepszym podłożem kosmetycznym dla koniugatu JA-YPFF-NH2 jest żel.

Ze względu na to, że najwięcej substancji aktywnej uwolniło się z żelu, to podłoże kosmetyczne wykorzystano w kolejnych badaniach.

Analizowano korelację pomiędzy obecnością grup chemicznych modyfikujących cząsteczkę kwasu jasmonowego a ilością uwolnionej substancji aktywnej z podłoża kosmetycznego. Porównano szybkość uwalniania kwasu jasmonowego, tetrapeptydu oraz koniugatu kwasu jasmonowego i tetra-peptydu z żelu. Na fig. 5 przedstawiono profil uwalniania JA, Ac-YPFF-NFh oraz JA-YPFF-NH2 z żelu w czasie.

Na podstawie wyników badań stwierdzono, że modyfikacja cząsteczki kwasu jasmonowego (JA) przy użyciu tetrapeptydu (koniugat JA-YPFF-NH2) znacznie zwiększa jego procent uwolnienia z formulacji kosmetycznej.

Potwierdzenie stabilności substancji czynnej po jej uwolnieniu z formulacji kosmetycznych

Po zakończeniu badań uwalniania JA-YPFF-NH2 z formulacji kosmetycznych przeprowadzono analizę stabilności koniugatu JA-YPFF-NH2 w warunkach badania uwalniania (temperatura 32,0°C ± 0,5°C, czas badania 24 godziny, roztwór akceptorowy: mieszanina buforu fosforanowego K2HPO4 + NaOH oraz etanolu w stosunku objętościowym 65:35). W tym celu dokładnie wymieszano zawartość komory dyfuzyjnej, a następnie pobrano 5 ml roztworu akceptorowego zawierającego uwolniony koniugatu. Próbkę tę poddano analizie z wykorzystaniem spektrometrii mas ESI-MS. Na fig. 6 przedstawiono Widmo ESI-MS roztworu akceptorowego zawierającego uwolniony z formulacji kosmetycznej JA-YPFF-NH2. Na widmie zidentyfikowano pik o masie molekularnej 763 [JA-YPFF-NH2 - H] , a także pik 803 [JA-YPFF+K]+, co świadczy o obecności cząsteczki koniugatu w badanej próbce a co za tym idzie, jego stabilności w warunkach badania kinetyki uwalniania.

Ocena potencjalnego niekorzystnego działania koniugatu JA-YPFF-NH2 na ludzką skórę

Za pomocą programu Toxtree v.2.5.0 (http://toxtree.sourceforge.net/) oszacowano potencjalne niekorzystne działanie koniugatu JA-YPFF-NH2. Na podstawie wprowadzonych do programu danych o strukturze uzyskano informację że związek ten nie jest kancerogenny i nie działa negatywnie oraz niszcząco na skórę.

Ponadto, przeprowadzono analizę toksyczności i alergenności koniugatu. Probanci, którzy aplikowali Emulsję 3 zawierająca 5% wagowych koniugatu Ja-YPFF-NFh przez okres 30 dni nie zaobserwowali niepożądanych reakcji skórnych.

Otrzymany koniugat jest zbudowany z α-L-aminokwasów, będących naturalnie występującymi w organizmie aminokwasami biogennymi, dlatego są one dobrze tolerowane. D-aminokwasy występują w stanie wolnym, ścianie komórkowej bakterii oraz w antybiotykach peptydowych i są nieprzyswajalne przez zwierzęta i człowieka.

Jak wykazały przeprowadzone badania koniugat JA-YPFF-NH2 jest związkiem chemicznym, który może znaleźć zastosowanie w kosmetykach wspomagających wygładzanie naskórka i jego złusz-czanie i/lub stymulujących odnowę naskórka. Przeprowadzone badania in vivo na grupie probantów cechujących się skórą wrażliwą dowiodły, na podstawie subiektywnej ocenie probantów, że związek ten wykazuje działanie redukujące wrażliwość skóry poprzez (zmniejszenie miejscowego podrażnienia i zaczerwienienia skóry po zastosowaniu preparatu zawierającego koniugat. Badania in vitro uwalniania udowodniły, że taka modyfikacja cząsteczki kwasu jasmonowego ma pozytywny wpływ na ilość uwolnionej substancji z preparatu kosmetycznego. Związek ten jest stabilny, w związku z czym może być stosowany jako aktywna substancja kosmetyczna.

Ponadto JA-YPFF-NH2 jest związkiem chemicznym, który może wykazywać właściwości zarówno kwasu jasmonowego jak i peptydu Ac-YPFF-NFh.

Biorąc pod uwagę wszystkie te aspekty, koniugat JA-YPFF-NH2 jest innowacyjną substancją, która może być stosowana w terapii skóry wrażliwej, ponieważ zmniejsza nadwrażliwość skóry, co potwierdziły testy przeprowadzone na probantach.

Ze względu na przewidywaną aktywność prosebogeniczną, JA-YPFF-NH2 może być także substancją czynną w preparatach kosmetycznych przeznaczonych do suchej skóry z zaburzeniami prawidłowego funkcjonowania gruczołów łojowych.

Ze względu na wielofunkcyjność koniugatu JA-YPFF-NH2, istnieje wiele możliwości zastosowania tego związku w przemyśle kosmetycznym.

Literatura 1. Michelet J. F., Olive Ch., Rieux E., Fagot D., Simonetti L., Galey J. B., Dalko-Csiba M., Bernard B. A., Pereiral R. 2012. The anti-ageing potential of a new jasmonic acid derivative (LR2412): in vitro evaluation using reconstructed epidermis episkin™, Experimental Dermatology. 21 (5): 398-400. 2. Tran, C., Michelet, J. F., Simonetti, L., Fiat, F., Garrigues, A., Potter, A.,. & Lacharriere, O. (2014). In vitro and in vivo studies with tetra-hydro-jasmonic acid (LR2412) reveal its potential to correct signs of skin ageing. Journal ofthe European Academy of Dermatology and Venereology, 28(4), 415-423.

Claims (2)

1. Zastrzeżenie patentowe
2. 1. Koniugat kwasu jasmonowego i tetrapeptydu o wzorze 1

   U)