PL227982B1 - Fluorofosforanowe analogi konca 5’ mRNA (kapu), sposób ich otrzymywania i zastosowanie - Google Patents
Fluorofosforanowe analogi konca 5’ mRNA (kapu), sposób ich otrzymywania i zastosowanieInfo
- Publication number
- PL227982B1 PL227982B1 PL406893A PL40689314A PL227982B1 PL 227982 B1 PL227982 B1 PL 227982B1 PL 406893 A PL406893 A PL 406893A PL 40689314 A PL40689314 A PL 40689314A PL 227982 B1 PL227982 B1 PL 227982B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- dcps
- enzyme
- formula
- compound
- fluorophosphate
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- DWYMPOCYEZONEA-UHFFFAOYSA-L fluoridophosphate Chemical class [O-]P([O-])(F)=O DWYMPOCYEZONEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 title claims abstract description 39
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 101100438361 Drosophila melanogaster capu gene Proteins 0.000 title description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 79
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 65
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 58
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 42
- 101150087322 DCPS gene Proteins 0.000 claims abstract description 28
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 9
- 101100386724 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) nhm1 gene Proteins 0.000 claims abstract 27
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 claims description 58
- -1 fluoride ions Chemical class 0.000 claims description 25
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 23
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 13
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 101000871498 Homo sapiens m7GpppX diphosphatase Proteins 0.000 claims description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 102000050769 human DcpS Human genes 0.000 claims description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 30
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 21
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 12
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 abstract description 12
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 abstract description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 4
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000000806 fluorine-19 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 abstract 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical class CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 18
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 11
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 8
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 7
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical group [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 6
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 6
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 5
- 101000617738 Homo sapiens Survival motor neuron protein Proteins 0.000 description 5
- 102100021947 Survival motor neuron protein Human genes 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150015954 SMN2 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Chemical compound C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 3
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N hydrogen carbonate;triethylazanium Chemical compound OC(O)=O.CCN(CC)CC AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 3
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GNGSOPFGGKKDQP-UHFFFAOYSA-N (phosphonoamino)phosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)NP(O)(O)=O GNGSOPFGGKKDQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 7-methylguanosine Chemical compound C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150081851 SMN1 gene Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical group [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- ZSJHIZJESFFXAU-UHFFFAOYSA-N boric acid;phosphoric acid Chemical compound OB(O)O.OP(O)(O)=O ZSJHIZJESFFXAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical class O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- VWFFMMQJLCFPJE-UHFFFAOYSA-N fluorophosphonic acid 1H-imidazole Chemical class P(=O)(O)(O)F.N1C=NC=C1 VWFFMMQJLCFPJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Polymers OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 2
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- DIDGPCDGNMIUNX-UUOKFMHZSA-N 2-amino-9-[(2r,3r,4s,5r)-5-(dihydroxyphosphinothioyloxymethyl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-3h-purin-6-one Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=S)[C@@H](O)[C@H]1O DIDGPCDGNMIUNX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- SBASPRRECYVBRF-KQYNXXCUSA-N 7-methylguanosine 5'-diphosphate Chemical compound C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O SBASPRRECYVBRF-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229940122361 Bisphosphonate Drugs 0.000 description 1
- 101150085479 CHS2 gene Proteins 0.000 description 1
- JUAZPXDEUDCELC-KQYNXXCUSA-N C[N+]1=CN([C@@H]([C@@H]2O)O[C@H](COP([O-])(F)=O)[C@H]2O)C(N=C(N)N2)=C1C2=O Chemical compound C[N+]1=CN([C@@H]([C@@H]2O)O[C@H](COP([O-])(F)=O)[C@H]2O)C(N=C(N)N2)=C1C2=O JUAZPXDEUDCELC-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000957776 Escherichia coli O157:H7 Mannose-1-phosphate guanylyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-K GDP(3-) Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-K 0.000 description 1
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 108091069668 HIT family Proteins 0.000 description 1
- 102000040061 HIT family Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100386720 Homo sapiens DCPS gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229910013684 LiClO 4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- AOKQNZVJJXPUQA-KQYNXXCUSA-N N(7)-methylguanosine 5'-phosphate Chemical compound C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O AOKQNZVJJXPUQA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 238000012565 NMR experiment Methods 0.000 description 1
- TVCSYFXGDHQNSH-UHFFFAOYSA-N P(=O)([O-])([O-])F.C(C)[NH+](CC)CC.C(C)[NH+](CC)CC Chemical compound P(=O)([O-])([O-])F.C(C)[NH+](CC)CC.C(C)[NH+](CC)CC TVCSYFXGDHQNSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIQYPPGTNIFAPO-CABCVRRESA-N PS(6:0/6:0) Chemical compound CCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCC)COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O MIQYPPGTNIFAPO-CABCVRRESA-N 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WALLWKZHDGCMSS-UUOKFMHZSA-N [(2R,3S,4R,5R)-5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-fluorophosphinic acid Chemical compound [C@@H]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)F)O1)N1C=NC=2C(=O)NC(N)=NC12 WALLWKZHDGCMSS-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YDHWWBZFRZWVHO-UHFFFAOYSA-H [oxido-[oxido(phosphonatooxy)phosphoryl]oxyphosphoryl] phosphate Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O YDHWWBZFRZWVHO-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000002152 aqueous-organic solution Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000005460 biophysical method Methods 0.000 description 1
- 150000004663 bisphosphonates Chemical class 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- IPENDKRRWFURRE-UHFFFAOYSA-N fluoroimide Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1N1C(=O)C(Cl)=C(Cl)C1=O IPENDKRRWFURRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 description 1
- 102100033718 m7GpppX diphosphatase Human genes 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- MBKDYNNUVRNNRF-UHFFFAOYSA-N medronic acid Chemical compound OP(O)(=O)CP(O)(O)=O MBKDYNNUVRNNRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001510 metal chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N methyloxidanyl Chemical compound [O]C GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 125000001181 organosilyl group Chemical group [SiH3]* 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 102220132006 rs763918203 Human genes 0.000 description 1
- 238000011894 semi-preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M sodium;(2r)-2-[6-(4-chlorophenoxy)hexyl]oxirane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].C=1C=C(Cl)C=CC=1OCCCCCC[C@]1(C(=O)[O-])CO1 RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M 0.000 description 1
- ZHZRSXKCIPFRLW-UHFFFAOYSA-N sodium;[5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O ZHZRSXKCIPFRLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- FGTJJHCZWOVVNH-UHFFFAOYSA-N tert-butyl-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-dimethylsilane Chemical compound CC(C)(C)[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C(C)(C)C FGTJJHCZWOVVNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku są nukleotydy, analogi końca 5' mRNA (kapu), zawierające ugrupowanie fluorofosforanowe w łańcuchu fosforanowym. Ujawnione związki są rozpoznawane (wiązane lub hydrolizowane) przez enzym DcpS (Decapping Scavenger) i dzięki temu, mogą być wykorzystane, jako cząsteczki reporterowe w badaniach przesiewowych, których celem jest poszukiwanie inhibitorów DcpS. DcpS jest specyficznym dla kapu enzymem o aktywności pirofosfatazy, który został zidentyfikowany jako cel terapeutyczny w leczeniu rdzeniowej atrofii mięśniowej (SMA). Badania przesiewowe wykorzystujące nukleotydy będące przedmiotem wynalazku mogą być oparte na zjawisku blokowania oddziaływania cząsteczki reporterowej z enzymem DcpS lub hamowania reakcji hydrolizy cząsteczki reporterowej przez enzym DcpS. Niektóre z ujawnionych związków posiadają dodatkowe modyfikacje w łańcuchu fosforanowym, które mogą modulować podatność związków na degradację przez DcpS oraz ich powinowactwo do enzymu DcpS. Wynalazek dotyczy również sposobu przeprowadzenia testów enzymatycznych, umożliwiających określenie zdolności potencjalnych inhibitorów do hamowania reakcji katalizowanej przed DcpS oraz sposobu przeprowadzenia testów umożliwiających selekcję związków mających zdolność do wiązania się w miejscu aktywnym enzymu DcpS. Wymienione testy oparte są na użyciu ujawnionych związków zawierających grupę fluorofosforanową jako cząsteczki reporterowej i sprzężone są z monitorowaniem zmiany wybranego parametru sygnału (przesunięcie chemiczne, intensywność, czas relaksacji) na widmie 19F NMR lub fluorymetryczną detekcją jonu fluorkowego uwolnionego w trakcie reakcji. Opisane testy są możliwe do zastosowania w badaniach wysokoprzepustowych.
Description
Enzym DcpS (Decapping Scavenger) to enzym zaangażowany w proces degradacji mRNA u organizmów eukariotycznych. W komórkach eukariotycznych istnieją dwie główne ścieżki degradacji mRNA, degradacja w kierunku 5' >3' oraz degradacja w kierunku 3' >5'. (Coller and Parker 2004) Obie ścieżki degradacji inicjowane są przez deadenylację. W toku degradacji w kierunku 5>3' następuje potem usunięcie kapu z mRNA (decapping) w wyniku rozcięcia wiązania pomiędzy fosforanami a i β i degradacja przez 5'-egzonukleazę. W toku degradacji w kierunku 3'>5' mRNA jest degradowane przez egzosom począwszy od końca 3'. W wyniku takiej degradacji uwalniane są dinukleotydowe reszty kapu lub zakończone kapern krótkie oligonukleotydy, które są następnie degradowane przez enzym DcpS. DcpS należy do pirofosfataz z rodziny HIT i hydrolizuje kap pomiędzy fosforanami γ i β uwalniając 5'-monofosforan 7-metyloguanozyny (m7GMP) i drugi produkt, który jest odpowiednio 5'-difosforanem nukleozydu lub krótkiego oligonukleotydu (Fig. 1). Dłuższe mRNA zakończone kapern nie są substratami dla DcpS. Substratem DcpS nie jest również 5'-difosforan 7-metyloguanozyny (m7GDP), który jest produktem degradacji mRNA w kierunku 5'>3'. Aktywność enzymu DcpS jest uważana za kluczową dla homeostazy komórki, gdyż zbędne reszty kapu uwolnione z mRNA w tra kcie degradacji 3'>5' mogłyby niekorzystnie wpływać na inne procesy komórkowe zależne od kapu. DcpS zlokalizowany jest zarówno w cytoplazmie jak i jądrze komórkowym, gdzie prawdopodobnie zaangażowany jest w regulację splicingu (Shen, Liu et al. 2008). W związku z tym zasugerowano, że rola DcpS w komórce wykracza poza jego dobrze scharakteryzowaną funkcję pełnioną w 3'>5' degradacji mRNA (Bail and Kiledjian 2008).
W roku 2008 doniesiono, że hamowanie aktywności DcpS może przynieść efekt terapeutyczny w rdzeniowej atrofii mięśniowej (spinal muscular atrophy, SMA). SMA jest powszechnie występującą chorobą neurodegeneracyjną występującą średnio raz na 6000 urodzeń (Singh, Salcius et al. 2008). Jest spowodowana niskim poziomem białka SMN (Survival Motor Neuron), które kodowane jest przez geny SMN. U ludzi występują dwa geny SMN: SMN1 oraz SMN2. Główną różnicą między nimi jest zmiana sekwencji w egzonie 7, która wpływa na splicing pre-mRNA. W rezultacie ekspresja genu SMN1 prowadzi do stabilnego i funkcjonalnego białka, natomiast białko eksprymowane z SMN2 jest skrócone. Mutacje w obu kopiach genu SMN1, w tym delecje, konwersje do genu przypominającego SMN2 i mutacje punktowe skutkują chorobą SMA. Osoby, które mają tylko jedną defektywną kopię SMN1 są nosicielami SMA, ale nie wykazują objawów chorobowych.
Homologiczny gen SMN2 nie może dostarczyć wystarczających ilości funkcjonalnego białka SMN, ale zaobserwowano, że więcej kopii genu SMN2 towarzyszy bardziej łagodnemu przebiegowi choroby. Dlatego też, uważa się, że związki powodujące wzrost ilości białka kodowanego przez gen SMN2 w komórce mogą być terapeutykami przeciwko SMA. Signh i współpracownicy przy użyciu badań przesiewowych odkryli, że niektóre 5-podstawione chinazoliny mogą zwiększać ekspresje genu SMN2 nawet dwukrotnie. Próbując rozwikłać mechanizm molekularny leżący u podstaw tej aktywacji, w innej pracy autorzy wykorzystując znakowanie radioaktywnie zidentyfikowali DcpS, jako białko wiążące 5-podstawioną chinazolinę.
Te eksperymenty pozwoliły na identyfikację DcpS, jako celu terapeutycznego w leczeniu SMA.
Dalsze badania wykazały, że różne C5-podstawione chinazoliny są silnymi inhibitorami enzymu DcpS (w stężeniach nanomolowych) i że potencjał inhibitora skorelowany jest z poziomem aktywacji promotora genu SMN2. Potencjał terapeutyczny tych związków wykazano następnie in vivo, w modelu mysim. (Butchbach, Singh et al. 2010) Niedawno, doniesiono, że jeden z inhibitorów DcpS, związek RG3039', poprawia działanie funkcji motorycznych u myszy z SMA (Van Meerbeke, Gibbs et al.).
Pomimo trwających badań przedklinicznych i klinicznych, wciąż nie ma skutecznej terapii przeciwko SMA, a stąd ciągłe zapotrzebowanie na nowe związki o potencjale terapeutycznym. Jedną z metod poszukiwania tego typu związków jest przeszukiwanie bibliotek związków pod kątem inhibitorów enzymu DcpS. Wymaga to jednak odpowiednio wydajnej metody badania potencjalnych inhibitorów. Idealna metoda powinna być szybka, czuła, dokładna, tania i możliwa do dostosowania, do warunków wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS).
W badaniu licznych białek metodami HTS zastosowanie znajdują związki znakowane fluorem. Z jednej strony atom fluoru wprowadza się do cząsteczki aby poprawić właściwości farmakokinetyczne, trwałość metaboliczną i biodostępność potencjalnych terapeutyków. Dodatkowo, wprowadzenie fluoru do analogów związków naturalnych ma na celu zwiększenie ich użyteczności w badaniach 19F NMR.
1
Właściwości spektroskopowe jądra F, czyli spin /2, wysoki współczynnik giromagnetyczny i 100%
PL 227 982 B1 abundancja czynią spektroskopię fluoru niemalże tak samo czułą jak spektroskopia H NMR. Jednakże w przeciwieństwie, do protonu, zawartość fizjologiczna fluoru jest bardzo niska, co sprawia, że fluor jest niezwykle przydatny jako znacznik do badań NMR dla związków naturalnych i biomolekuł (Dalvit, Fagerness et al. 2003).
Promień van der Waalsa fluoru (1.35 A) jest pośredni pomiędzy wodorem (1.2 A) i grupą hydroksylową i dlatego, często modyfikacji związków naturalnych fluorem dokonuje się poprzez zamianę atomu wodoru lub grupy OH na atom fluoru. Z powodu niewielkich rozmiarów i dużej elektroujemności podstawnik fluorowy jest uważany za bioizoster grupy hydroksylowej. Jednakże, podstawnik fluorowy może odgrywać rolę jedynie akceptora wiązania, ale nie donora, gdyż, w przeciwieństwie do grupy hydroksylowej nie posiada jonizowalnego protonu.
Eksperymenty F NMR znalazły zastosowanie w poszukiwaniu ligandów wiążących cele terapeutyczne (Dalvit, Fagerness et al. 2003). Eksperymenty takie można podzielić na oparte na kompetycji testowanego związku z ligandem związanym z białkiem (direct binding) oraz oparte na zmianie aktywności enzymu pod wpływem testowanego związku (activity based). Jedną z technik stosowanych do badania bibliotek inhibitorów jest FAXS (fluorine Chemical shift anisotropy and exchange for screening). FAXS to szybki test kompetycyjny, pozwalający na znalezienie cząsteczek o wysokim powinowactwie do wybranego celu białkowego poprzez testowanie mieszaniny potencjalnych ligandów w obecności ligandu (cząsteczki reporterowej) znakowanego F o słabym lub średnim powinowactwie do białka. Metoda oparta jest na fakcie, że sygnał F NMR cząsteczki reporterowej związanej z białkiem charakteryzuje się innymi parametrami niż sygnał wolnej cząsteczki reporterowej w roztworze.
Zastosowanie F NMR w tego typu badaniach pozwala na ominięcie większości problemów towarzy19 szących badaniom F NMR takich jak pokrywanie się sygnału, czy konieczność stosowania kosztownych deuterowanych rozpuszczalników i składników buforujących. FAXS jak i inne metody screeningu zbliżone koncepcyjnie, są szybkie i wymagają niewielkich ilości białka, przez co są konkurencyjne w stosunku do innych metod HTS opartych na technikach innych niż NMR.
Innym przykładem badań przesiewowych są badania oparte na zmianie aktywności enzymu. W tego rodzaju testach fluorowana cząsteczka reporterowa jest substratem reakcji enzymatycznej, w trakcie której ulega przekształceniu w produkt charakteryzujący się odmiennym przesunięciem
19 chemicznym na widmie F NMR. Umożliwia to monitorowanie postępu reakcji metodą F NMR. W obecności inhibitora szybkość reakcji jest mniejsza, co skutkuje zmniejszeniem stopnia konwersji substratu w porównaniu z reakcją bez inhibitora i innym stosunkiem powierzchni sygnałów na widmie NMR. Tego typu podejście zastosowano do poszukiwania inhibitorów różnych celów terapeutycznych. Przykładowo, fluorowane nukleotydy (2'-fluroATP i 2-fluoroATP) wykorzystano do testowania inhibitorów dwóch enzymów zależnych od ATP (Stockman 2008). Jeśli pod wpływem działania enzymu na substrat, jako produkt uwalniany jest jon fluorkowy możliwe jest zastosowanie także innych metod detekcji np. przy użyciu sond fluorogenicznych, kolorymetrycznych , czy elektrod jonoselektywnych (Frant and Ross 1966; Cametti and Rissanen 2013).
Niniejszy wynalazek dotyczy nowej klasy nukleotydowych analogów końca 5' mRNA. Nowe analogi zawierają resztę fluorofosforanową, tzn. jeden z atomów tlenu w terminalnej grupie fosforanowej został zastąpiony atomem fluoru. Niespodziewanie, odkryliśmy, że nowe analogi są dobrymi substratami dla enzymu DcpS. W trakcie reakcji z DcpS substraty przekształcane są w m 7GMP oraz odpowiedni anion fluoro(oligo)fosforanowy lub fluorkowy. Obecność reszty fluorofosforanowej w tych substratach i powstawanie w trakcie reakcji anionu fluoro(oligo)fosforanowego lub jonu fluorkowego, umożliwia badanie postępu reakcji metodami F NMR lub przy pomocy testów na obecność jonów fluorkowych. W związku z tym, nowe związki mogą być stosowane jako cząsteczki reporterowe do poszukiwania inhibitorów enzymu DcpS.
Ujawnione fluorofosforanowe analogi kapu mogą być dodatkowo zmodyfikowane w obrębie reszty (oligo)fosforanowej lub reszty rybozy. Te dodatkowe modyfikacje będą wpływały na właściwości substratowe związków względem enzymu DcpS, zmieniając ich powinowactwo do enzymu i podatność na hydrolizę enzymatyczną. Niektóre z modyfikacji fosforanowych prowadzą do otrzymania analogów zawierających resztę fluorofosforanową i odpornych na działanie enzymu DcpS. Takie związki mogą być zastosowane w testach opartych na kompetycji cząsteczki reporterowej z testowanym ligandem (jak np. FAXS).
W Tabeli 1 wymieniono fluorofosforanowe analogi kapu, które zostały lub zostaną zsyntetyzowane, następnie scharakteryzowane metodami biofizycznymi i biochemicznymi. Modyfikacje łańcucha (oligo)fosforanowego możliwe do wprowadzenia do nukleotydów razem z ugrupowaniem fluorofos4
PL 227 982 Β1 foranowym opracowanymi przez nas metodami syntezy obejmują: metylenobisfosfonian i jego pochodne, imidodifosforan, tiofosforan i boranofosforan. W kilku przypadkach, połączenie modyfikacji fluorofosforanowej z innym ugrupowaniem daje w rezultacie nowy rodzaj modyfikacji. Przykładowo przyłączenie atomu fluoru w pozycji β difosforanu nukleozydu z grupą NH zamiast mostkowego tlenu w pozycji α, β daje w rezultacie ugrupowanie fluoroimidodifosforanowe nukleozydu, które nigdy wcześniej nie zostało opisane.
Sposrod związków przedstawionych w Tabeli 1 szczególnie korzystne w badaniach F NMR opartych na śledzeniu aktywności enzymu DcpS są fluorofosforan 7-metyloguanozyny (m7GMPF 1), fluorodifosforan 7-metyloguanozyny (m7GDPF 2) oraz fluorotrifosforan 7-metyloguanozyny (m7GTPF 3). Związki, które są szczególnie korzystne jako cząsteczki reporterowe do badań kom petycyjnych to fluoroboranofosforan 7-metyloguanozyny (m7GMPBH3, 6), fluorotiofosforan 7-metyloguanozyny (m7GMPS, 7) fluoroimidodifosforan 7-methoguanozyny m7GpNHpF (8), fluorometylenobisfosfonian 7-methoguanozyny m7GpCH2pF (9), fluoroimidotrifosforan 7-methoguanozyny m7GpNHppF (13) oraz fluorometylenotrifosfonian 7-methoguanozyny m7GpCH2ppF (12).
Tabela 1
Fluorofosforanowe analogi kapu
| r3 n: N' -0-^ 1 R2 | 0 |-'N ^Ni^'NH2 | |||||||||
| R | ||||||||||
| No | R3 | Rz | Ra | m | n | k | X | Y | z | |
| 1 | rrfGMPF | OH | OH | ch3 | 0 | 1 | 0 | 0 | ||
| 2 | rrfGDPF | OH | OH | ch3 | 1 | 1 | 0 | 0 | O | |
| 3 | rrfGTPF | OH | OH | CHs | 2 | 1 | 1 | 0 | O | 0 |
| 4 | m2 72'-°GMPF | OCHs | OH | CH3 | 0 | 1 | 0 | O | ||
| 5 | brfGMPF | OH | OH | PheCH2 | 0 | 1 | 0 | O | ||
| 6 | m7GMPBH3F | OH | OH | ch3 | 0 | 1 | 0 | bh3 | ||
| 7 | rrfGMPSF | OH | OH | ch3 | 0 | 1 | 0 | s | ||
| 8 | nfGpNHpF | OH | OH | ch3 | 1 | 1 | 0 | NH | o | |
| 9 | m7GpCH2pF | OH | OH | ch3 | 1 | 1 | 0 | ch2 | 0 | |
| 10 | rrfGpspF | OH | OH | ch3 | 1 | 1 | 0 | o | s | |
| 11 | m7GpsH3pF | OH | OH | ch3 | 1 | 1 | 0 | 0 | bh3 | |
| 12 | m7GpCH2ppF | OH | OH | ch3 | 1 | 1 | 1 | ch2 | 0 | 0 |
| 13 | rrfGpNHppF | OH | OH | ch3 | 1 | 1 | 1 | NH | o | 0 |
Cytowane w opisie publikacje oraz podane w nich odniesienia są również niniejszym włączone jako referencje.
Dla lepszego zrozumienia wynalazku, został on zilustrowany w przykładach wykonania oraz na załączonych rysunkach, na których:
Fig. 1 przedstawia hydrolizę naturalnego dinukleotydowego substratu przez enzym DcpS. „Zasada” oznacza dowolną zasadę, która może występować w RNA;
Fig. 2 przedstawia syntezę nukleotydów zawierających resztę fluorofosforan ową. „Zasada” oznacza zasadę azotową;
Fig. 3 przedstawia syntezę przykładowych analogów kapu zawierających grupę fluorofosforanową: a) m7GMPF b) m7GDPF c) m7GTPF d) m7GpNHpF;
Fig. 4 przedstawia siedzenie metodą F NMR hydrolizy fluorofosforanowego analogu kapu, m7GMPF, przez enzym DcpS. A) Schemat reakcji B) Przebieg reakcji w czasie śledzony metodą 19F NMR;
1Q
Fig. 5 przedstawia siedzenie metodą F NMR hydrolizy fluorofosforanowego analogu kapu,
1 o m GDPF, przez enzym DcpS. F NMR A) Schemat reakcji B) Przebieg reakcji w czasie śledzony metodą 19F NMR. PF oznacza sygnał anionu fluorofosforanowego;
Fig. 6 przedstawia siedzenie metodą F NMR hydrolizy fluorofosforanowego analogu kapu, m7GTPF, przez enzym DcpS. A) Schemat reakcji B) Przebieg reakcji w czasie śledzony metodą
1Q
F NMR. PPF oznacza anion fluorodifosforanowy;
Fig. 7 przedstawia badania kinetyki reakcji hydrolizy m7GMPF przez enzym DcpS. A) Wykres Michaelisa-Menten dla hydrolizy opracowany na podstawie wyników badań HPLC B) Schemat detekcji
PL 227 982 B1 jonu fluorkowego przy użyciu sililowanej sondy fluorogenicznej C) Hydroliza 10 μΜ m7GMPF bez dodatku inhibitora oraz z dodatkiem 10 μΜ inhibitora 1, inhibitora 2, inhibitora 3 śledzony przy użyciu sondy fluorogenicznej (test 1) D) Reakcje hydrolizy takie same jak w punkcie C, ale śledzone przy pomocy HPLC;
Fig. 8 przedstawia struktury przykładowych sond fluorogenicznych pozwalających na detekcję jonów fluorkowych;
Fig. 9 przedstawia A) Struktury związków użytych do wstępnych badań enzymu DcpS i B) Wyniki testu inhibitorów z punktu A) wykonanego według testu 1.
Fig. 10 przedstawia hydrolizę A) m7GDPF oraz B) m7GTPF przez DcpS bez i w obecności trzech różnych inhibitorów.
Chemiczna synteza fluorofosforanowych analogów kapu jest twórczym rozwinięciem syntezy nukleotydów opartej na chemii imidazolowych pochodnych nukleotydów (patrz M. Kadokura et al., „Efficient synthesis of γ-methyl-capped guanosine 5'-triphosphate as a 5'-terminal unique structure of U6 RNA via a new triphosphate bond formation involving activation of methyl phosphorimidazolidate using ZnCl2 as a catalyst in DMF under anhydrous conditions”, Tefrahedron Lett., vol. 38, pp. 8359-8362 (1997); J. Stępiński et al. (2001); M. Kalek et al., „Enzymatically stable 5' mRNA cap analogs”, Bioorg. Med. Chem., vol. 14, pp. 3223-3230 (2006); i J. Kowalska et al. (2008)).
Aby zsyntetyzować analogi kapu zawierające resztę fluorofosforanową opracowaliśmy trzy komplementarne podejścia, które całościowo umożliwiają syntezę całej gamy fluorofosforanowych analogów mono-, di- i trifosforanów nukleozydów (Fig. 2). Podejście A (Fig. 2A) obejmuje podstawienie nukleofilowe imidazolu przez jon fluorkowy, którego źródłem jest TBAF. Drugie podejście (podejście B, Fig. 2B) jest podobne, z tym, że jako nukleofil stosuje się fluorofosforan (w postaci soli trietyloamoniowej). Trzecie podejście (podejście C, Fig. 2C), które jest szczególnie przydatne w syntezie związków bardzo polarnych (np. analogów czterofosforanowych) lub tych zawierających dodatkowe modyfikacje w łańcuchu oligofosforanowym, nie wymaga elektrofilowej aktywacji nukleotydu, ale wykorzystuje elektrofilową pochodną fluorofosforanu (P-imidazolid fluorofosforanu). Istnienie kilku komplementarnych podejść daje dostęp do syntezy szerokiej gamy fluorofosforanowych analogów końca 5' mRNA, zarówno nie zawierających dodatkowych modyfikacji, jak i w połączeniu z modyfikacją bisfosfonianową, tiofosforanową, boranofosforanową, imidodifosforanową.
Wszystkie opisane metody, do wydajnego przebiegu wymagały obecności chlorków metali dwuwartościowych. Optymalne warunki reakcji imidazolowej pochodnej z jonem fluorkowym było tra ktowanie 4-krotnym nadmiarem TBAF (fluorek tetrabutyloamoniowy) w obecności 8-krotnego nadmiaru ZnCI2 w DMSO. W metodzie B optymalne warunki to reakcja imidazolowej pochodnej nukleotydu z 2-krotnym nadmiarem fluorofosforanu w obecności MgCI2 w DMF. Dla trzeciego podejścia (C), które wykorzystuje, optymalne warunki to 4-krotny nadmiar imidazolowej pochodnej fluorofosforanu i 8-krotny nadmiar ZnCI2 lub MgCI2. Aktywacji fluorofosforanu imidazolem dokonano w wygodny sposób przy użyciu imidazolu w obecności ditiodipirydyny i trifenylofosfiny.
Do chwili obecnej zsyntezowaliśmy 4 różne analogi kapu zawierające ugrupowanie fluorofosforanowe oraz kilka nukleotydów guanozynowych, które mogą zostać przekształcone w analogi kapu (zmetylowane w pozycji N7) za pomocą traktowania jodkiem metylu w DMSO. Otrzymane analogi k apu zostały oczyszczone za pomocą chromatografii jonowymiennej DEAE Sephadex A-25 i, jeśli czystość nie była wystarczająca, dodatkowo na HPLC. Struktury i czystość otrzymanych związków zostały potwierdzone metodami spektrometrii mas oraz H, P oraz F NMR. Żadne z otrzymanych (oraz planowanych do otrzymania) analogów kapu nie zostały ujawnione wcześniej.
Otrzymane analogi kapu zostały następnie przetestowane, jako substraty ludzkiego enzymu DcpS. Jak ustalono przy użyciu HPLC w odwróconej fazie (RP HPLC) trzy spośród analogów: m7GMPF (1), m7GDPF (2) i m7GTPF (3) są wydajnie hydrolizowane przez DcpS. Odkrycie, że m7GMPF i m7GDPF są dobrymi substratami dla DcpS jest nieoczekiwane, gdyż m 7GDPF jest analogiem m7GDP, o którym wiadomo, że nie jest substratem dla ludzkiego DcpS, natomiast m7GMPF jest analogiem m7GMP, czyli produkty reakcji katalizowanej przez DcpS (Wypijewska, Bojarska et al. 2012). Analiza RP HPLC z detekcją UV wykazała, że we wszystkich trzech przypadkach produktem hydrolizy badanych związków przez DcpS jest m7GMP (drugi produkt reakcji zawierający atom fluoru nie jest wykrywane na HPLC, gdyż nie wykazuje absorpcji). Natomiast badania F NMR pozwoliły ustalić, że drugim produktem reakcji są: anion fluorkowy dla m7GMPF, anion fluorofosforanowy dla m7GDPF i anion fluorodifosforanowy dla m7GTPF (Fig. 4-6). Połączenie tych faktów sugeruje, że hydroliza wymienionych związków przebiega przez nukleofilowy atak na grupę fosforanową sąsiadującą
PL 227 982 Β1 z 7-metyloguanozyną, co jest zgodne z katalitycznym mechanizmem ustalonym dla naturalnych substratów (Fig. 1). Wstępne badania wykazały również, że reakcja z m7GTPF jest około 2 razy szybsza niż reakcja z m7GDPF i około 5 razy szybsza niż reakcja z m7GMPF. Różnice w podatności różnych fluorofosforanowych analogów kapu na hydrolizę enzymem DcpS dają większe możliwości optymalizacji testów enzymatycznych dla różnych inhibitorów.
W przeciwieństwie do związków 1-3, analog 8 (m7GpNHpF), który został dodatkowo zmodyfikowany ugrupowaniem imidodifosforanowym, był odporny na hydrolizę enzymu DcpS. Stosując miareczkowanie fluorescencyjne wyznaczyliśmy powinowactwo (stałą asocjacji) tego analogu do enzymu. Wartość stałej asocjacji wskazuje na niższe powinowactwo tego związku do enzymu DcpS w porównaniu z innymi analogami kapu. Sprawia to, że związek taki może być użyteczny w badaniach enzymu DcpS z użyciem podejścia FAXS, gdyż w metodzie tej wymagane jest użycie znakowanej fluorem cząsteczki reporterowej o niskim lub średnim powinowactwie do enzymu.
Tabela 2
Powinowactwo analogu 8 (m7GpNHpF) do enzymu DcpS.
Dla porównania podano również dane dla niemodyfikowanych fluorem odpowiedników
| Związek | Kas dla kompleksu kap-DcpS |
| m7GDP | 114±8μΜ-1 |
| m7GpNHpF (8) | 12.23+0.65 μΜ'1 |
| m7GpNHp | 104.0 ± 4.7 μΜ'1 |
Ujawnione fluorofosforanowe analogi kapu mogą więc zostać zastosowane jako cząsteczki reporterowe w eksperymentach służących identyfikacji związków o właściwościach inhibitorowych względem enzymu DcpS. Eksperymenty te obejmują użycie enzymu kodowanego przez gen DCPS lub jego homolog lub jego funkcjonalny fragment. Jeden z korzystnych sposobów przeprowadzenia takiego eksperymentu składa się z następujących etapów (i) inkubacji fluorofosforanowego analogu kapu z kompozycją enzymatyczną posiadającą aktywność enzymu DcpS oraz związkiem, który jest potencjalnym inhibitorem enzymu DcpS (ii) oznaczenie po określonym czasie ilości produktu hydrolizy fluorofosforanowego analogu kapu zawierającego atom fluoru. Jeden z korzystnych sposobów przeprowadzenia eksperymentu obejmuje oznaczenie ilości produktu hydrolizy zawierającego atom fluoru za pomocą F NMR lub fluorymetrycznie. Te sposoby oznaczeń są możliwe ponieważ nowe analogi zawierają w swej strukturze ugrupowanie fluorofosforanowe. Fluorofosforanowe analogi kapu korzystne do zastosowania w tego typu eksperymencie, to analogi nie zawierające dodatkowych modyfikacji w mostku fosforanowym (1-3), a także analogi, które zawierają dodatkowe modyfikacje np. w łańcuchu oligofosforanowym, lub reszcie rybozy, pod warunkiem, że ulegają hydrolizie enzymem DcpS.
Jednym ze sposobów realizacji wynalazku jest zastosowanie fluorofosforanowych analogów kapu w prostej, wydajnej i szybkiej metodzie umożliwiającej przetestowanie dużej liczby związków jako inhibitorów enzymu DcpS i selekcję potencjalnych terapeutyków przeciwko SMA, poprzez oznaczanie aktywności pirofosfatazowej enzymu DcpS in vitro. Metodę taką można opracować adaptując opisane wyżej korzystne sposoby przeprowadzenia eksperymentu do formatu 96-dołkowego lub 384-dołkowego. Opisane wyżej eksperymenty można z łatwością zaadaptować do tego formatu ze względu na małe objętości reakcyjne i czułość detekcji są one więc całkowicie kompatybilne z podejściem HTS.
W innym korzystnym sposobie przeprowadzenia eksperymentu m7GMPF (1) jest zastosowany jako cząsteczka reporterowa, która pod wpływem enzymu DcpS przekształcana jest do m7GMP i jonu fluorkowego. Stężenie jonu fluorkowego można oznaczyć za pomocą szeregu znanych metod włączając w to metody F NMR, fluorymetryczne, a także kolorymetryczne, czy elektrochemiczne. W jednym z korzystnych sposobów realizacji wynalazku jon fluorkowy uwolniony podczas hydrolizy m7GMPF przez DcpS oznaczany jest fluorymetrycznie, wykorzystując zjawisko wysokiego powinowactwa jonów fluorkowych do elektrofilowych atomów krzemu. Przeprowadzenie detekcji fluorymetrycznej w ten sposób wymaga użycia sondy fluorogenicznej zawierającej sililowe grupy zabezpieczające. Jon fluorkowy uwolniony w trakcie reakcji katalizowanej przez DcpS atakuje nukleofilowo atom krzemu sondy fluorogenicznej powodując odbezpieczenie sondy i przekształcenie jej w formę fluorescencyjną (Fig. 7B). Na rysunkach 7C i D przedstawiono śledzenie postępu reakcji hydrolizy m7GMPF przez DcpS metodą HPLC i przy pomocy opisanej wyżej detekcji fluorescencyjnej (porównanie) w obecności
PL 227 982 B1 różnych inhibitorów, których struktury przedstawiono na Fig. 8. Warto podkreślić, że analiza tych s amych próbek metodą HPLC wymaga 5x więcej materiału oraz znacznie więcej czasu (1 punkt pomiarowy dla jednego związku w metodzie HPLC to pomiar trwający ok. 10 min, natomiast w przypadku detekcji fluorescencyjnej przeprowadzonej w formacie 96-dołkowym z zastosowaniem czytnika fluorescencji, jeden punkt pomiarowy dla 80 związków jednocześnie można uzyskać w czasie około 5 min). W literaturze opisano wiele sond fluorogenicznych nadających się do detekcji jonu fluorkowego w roztworach wodnych lub wodno-organicznych. Przykłady sond korzystnych do detekcji jonu fluorkowego zebrano na Fig. 9. Zastosowanie sondy fluorogenicznej, TBDS-fluoresceiny (Fig. 9), umożliwiło nam oznaczanie jonu fluorkowego metodą fluorymetryczną z bardzo dużą czułością (zakres liniowy od 0 do 100 μmoli F-) w 10 μl mieszaniny reakcyjnej. Ten eksperyment jest całkowicie kompatybilny z formatem 96-dołkowym i może zostać wykorzystany do wysokoprzepustowego badania potencjalnych inhibitorów DcpS. Wysoka czułość metody umożliwia zminimalizowanie ilości związku użytego jako inhibitor. Wyniki wstępnego screeningu 14 inhibitorów przedstawiono na Fig. 9.
W innym korzystnym sposobie przeprowadzenia eksperymentu m7GMPF, m7GDPF lub m7GTPF poddawany jest hydrolizie enzymem DcpS w obecności potencjalnego inhibitora. Ilość uwolnionego jonu fluorkowego oznaczana jest za pomocą F MNR. Fig. 4, 5 i 6 przedstawiają monitoro19 wanie przebiegu czasowego wymienionych reakcji. W każdym przypadku sygnały F NMR substratu i produktu charakteryzowały się odmiennym przesunięciem chemicznym δ (ppm), co umożliwiło monitorowanie zmian ilości produktu w czasie. Na rys 10. przedstawiono badanie postępu reakcji hydrolizy m7GDPF oraz m7GTPF w obecności w obecności różnych inhibitorów. Ten sposób przeprowadzenia eksperymentu również jest kompatybilny z podejściem HTS.
Opisane fluorofosforanowe analogi kapu mogą zostać użyte w testach enzymatycznych mających na celu wyselekcjonowanie najbardziej inhibitorów DcpS, jako potencjalnych terapeutyków przeciwko SMA. Jak opisano powyżej testy te można przeprowadzić na wiele korzystnych sposobów, gdyż optymalne warunki i sposób detekcji uzależnione są od struktury fluorofosforanowego substratu. Przykładowe sposoby realizacji testów opisano poniżej (test 1, test 2, test 3). W zakresie wynalazku jest także przeprowadzenie testów w sposób pozwalający na wyznaczenie wartości IC50 (stężenie inhibitora, przy którym aktywność enzymu jest równa połowie aktywności maksymalnej) (test 4). W zakresie wynalazku jest też wykorzystanie ujawnionych związków i procedur do oznaczenia aktywności podobnej do aktywności enzymu DcpS w materiale biologicznym, np. komórkach i ekstraktach komórkowych w celu oceny aktywności potencjalnych inhibitorów.
Podsumowując, niniejszy wynalazek opisuje struktury i metody syntezy różnych analogów końca 5' mRNA (kapu) zawierających ugrupowanie fluorofosforanowe. Żadne z opisanych analogów k apu, ich właściwości względem enzymu DcpS, ani sposoby ich zastosowania nie zostały wcześniej ujawnione w literaturze. Kompozycje enzymatyczne korzystne dla oznaczania aktywności enzymu DcpS mogą być izolowane z ekstraktów komórkowych lub metodami biologii molekularnej przez rekombinację genetyczną. Te techniki są znane dla specjalistów z dziedziny biochemii i biologii molekularnej.
Poniższe przykłady zostały umieszczone jedynie w celu zilustrowania wynalazku oraz wyjaśnienia poszczególnych jego aspektów, a nie w celu jego ograniczenia i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach. W poniższych przykładach, jeśli nie wskazano inaczej stosowano standardowe materiały i metody stosowane w dziedzinie lub postępowano zgodnie z zaleceniami producentów dla określonych materiałów i metod.
P r z y k ł a d y
Informacje ogólne związane z syntezą, izolacją i charakteryzacją nowych analogów kapu
Nukleotydy będące związkami pośrednimi oczyszczano za pomocą chromatografii jonowymiennej na złożu DEAE Sephadex A-25 (forma HCO3 -) stosując liniowy gradient wodorowęglanu trietyloamoniowego (TEAB) w wodzie dejonizowanej. Po odparowaniu pod zmniejszonym ciśnieniem podczas, którego kilkukrotnie dodawano 96% etanol w celu rozłożenia buforu TEAB, związki pośrednie izolowano w postaci soli trietyloamoniowych. Produkty ostateczne (analogi kapu) oczyszczano w ten sam sposób, po czym dodatkowo oczyszczano je za pomocą semi-preparatywnego HPLC i po poddaniu kilkukrotnej liofilizacji izolowano w postaci soli amoniowych. HPLC analityczne w odwróconych fazach (RP HPLC) wykonywano na aparacie Agilent Technologies 1200 Series, używając kolumny Supelcosil LC-18-T RP (4.6x250 mm, przepływ 1.3 ml/min) z liniowym gradientem 0-25% metanolu w 0.05 M octanie amonu (pH 5.9). Eluowane związki wykrywano z pomocą detektora UV-Vis (przy 260 nm) oraz detektora fluorescencyjnego (wzbudzenie 280 nm, emisja 337 nm). Preparatywne RP HPLC
PL 227 982 B1 wykonywano na tym samym aparacie stosując kolumnę Discovery RP Amide C16 (21.2 mmx250 mm, przepływ 5.0 ml/min) jako fazę ruchomą stosując liniowy gradient acetonitrylu w 0.05 M octanie amonu (pH 5.9). Widma H NMR, P NMR i F NMR rejestrowano w temperaturze 25° C na aparacie Varian UNITY-plus przy częstotliwości odpowiednio 399.94 MHz, 161.90 MHz i 376.25. Przesunięcia chemiczne H NMR podane są względem TSP (3-trimetylosililo-[2,2,3,3-D4]-propionianu sodu) w D2O (standard wewnętrzy). Przesunięcia chemiczne P NMR podane są względem 20% kwasu ortofosfo31 rowego w D2O (standard zewnętrzny). Przesunięcia chemiczne P NMR podane są względem 20% kwasu ortofosforowego w D2O (standard zewnętrzny). Przesunięcia chemiczne F NMR podane są względem 10 mM NaF (standard drugiego rzędu, δ = -121.5 ppm). Widma mas wysokiej rozdzielczości w trybie jonów ujemnych [(ESI MS (-)) rejestrowano na aparacie Micromass QToF 1 MS. Odczytu fluorescencji dokonywano na czytniku płytek Infinit 200 ® PRO stosując wzbudzenie przy 480 nm i obserwując emisję przy 535 nm. Próbki umieszczano w czarnej płytce 96-dołkowej (Greiner). Rozpuszczalniki i inne odczynniki zamówiono z firmy Sigma-Aldrich i używano bez dodatkowych modyfikacji, chyba, że w tekście poniżej stwierdzono inaczej. Handlowo dostępne sole sodowe GMP i GDP i fluorofosforanu przekształcono w sole trietyloamoniowe stosując chromatografię jonowymienną na złożu Dowex 50 WX8. Sole trietyloamoniowe m7GMP and m7GDP oraz sole sodowe, m7GMP-lm and m7GDP-lm otrzymano tak jak opisano w literaturze (Jemielity, Fowler et al. 2003; Kowalska, Lewdorowicz et al. 2008). Sól trietyloamoniową GpNHp otrzymano tak jak opisano w literaturze (Rydzik, Kulis et al. 2012). Fluorogeniczną pochodną fluoresceiny (TBDS-fluoresceina) otrzymano tak jak opisano w literaturze (Yang, Ye et al. 2007) Stałe asocjacji m7GpNHpF (8) z enzymem DcpS wyznaczono tak jak opisano w literaturze (Darzynkiewicz, Bojarska et al. 2007).
P r z y k ł a d 1
Synteza i izolacja nowych analogów kapu
Otrzymywanie soli litowej imidazolowej pochodnej fluorofosforanu (ImpF)
Sól trietyloamoniową fluorofosforanu otrzymaną z 1 g fluorofosforanu trietyloamoniowego (4,95 mmol; 1 eq), który zawieszono w 5 ml dimetyloformamidu (DMF) i dodano 3,4 g (10 eq) imidazolu, 3,2 g (3 eq) 2,2’-ditiodipirydyny (2,2'-DTDP), 1 ml trietyloaminy (TEA) oraz po 2 minutach mieszania 3,9 g (3 eq) trifenylofosfiny (Ph3P). Mieszano na mieszadle magnetycznym przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej, po czym produkt wytrącono za pomocą roztworu 2,5 g (5 eq) LiCIO4 w 100 ml acetonitrylu. Osad odwirowano w 4°C, supernatant odrzucono, a osad na zmianę przemywano acetonitrylem i odwirowywano do utraty barwy supernatantu. Biały osad suszono i przechowywano w eksykatorze próżniowym nad P2O5.
Synteza monofluorofosforanu guanozyny (GMPF)
GMPF otrzymano mieszając GMP-lm/sól Na (100 mg, 2400 opt.mu, 0.199 mmol), TBAF (1 M roztwór w THF, 1610 pl, 1.61 mmol), DMSO (1.8 mL) i ZnCl2 (250 mg, 1.84 mmol). Po oczyszczaniu otrzymano 83 mg GMPF (2105 opt.mu, 0.174 mmol, 88%). Czas reakcji: 1.5 h. HR MS(-)ES m/z 364.04614 calc, for C10H12N5O7PF: 364.0464; 1H NMR (400 MHz, D2O) δ = 8.13 (s, 1 H), 5.94 (d, J=5.5 Hz, 1 H), 4.74 (t, J=5.5 Hz, 1 H) 4.49 (dd, J=5.5 Hz J=3.7 Hz, 1 H), 4.35 (m, 1 H), 4.25 (m, 2 H); 31P NMR (162 MHz, D2O) δ = -5.78 (d, J=934 Hz, 1 P); 19F NMR (376 MHz, D2O) δ = -78.98 (d, J=934 Hz, 1 F).
Synteza monofluorofosforanu 7-metyloguanozyny
Metoda A:
m7GMPF otrzymano mieszając GMPF/Na+ (55 mg, 920.15 opt. mu, 0.151 mmol), CH3I (75 pl, 1.208 mmol) w DMSO (0.8 mL). Po oczyszczaniu otrzymano 64 mg soli trietyloamoniowej m7GMPF (692 opt.mu, 0.057 mmol, 75%). Czas reakcji: 2.5 h; 1H NMR (400 MHz, D2O) δ = 6.06 (d, J=3,5 Hz, 1 H), 8.69 (dd, J=5.0 Hz J=3.5 Hz, 1 H), 4.46 (t, J=5.23 Hz, 1 H), 4.41 (częściowo nałożony z 4', 1H), 4.22-4.39 (m, 1 H), 4.10 (s, 3 H); 31P NMR (162 MHz, D2O) δ = -5.62 (d, J=933 Hz ,1 P); 19F NMR (376 MHz, D2O) δ = -79.06 (d, J=933 Hz, 1 F).
Synteza 2-fluorodifosforanu guanozyny (GDPF)
GDPF otrzymano mieszając GMP/TEA (200 mg, 0.431 mmol), imidazolową pochodną fluorofosforanu -pF-lm/Li (269 mg, 1.73 mmol), DMF (3.5 mL) i MgCI2 (662 mg, 6.9 mmol). Czas reakcji: 2 h. Po oczyszczaniu otrzymano 110 mg of GDPF (3584 opt.mu, 0.297 mmol, 69%). HR MS(-)ES m/z 444.01248 calc, for C10H13N5O10P2F: 444.0127; 1H NMR (400 MHz, D2O) δ = 8.08 (s, 1 H), 5.93 (d, J=6.2 Hz, 1 H), 4.76 (częściowo nałożony z HDO) 4.51 (dd, J=5.0 Hz, J=3.2 Hz, 1 H), 4.36 (m, 1 H), 4.22 (m, 2 H); 31P NMR (162 MHz, D2O) δ = -10.55 (d, J=20 Hz, 1 P), -17.00 (dd, J=934 Hz J=20 Hz, 1P); 19F NMR (376 MHz, D2O) δ = -72.7 (d, J=934 Hz, 1 F).
PL 227 982 B1
Synteza fluorodifosforanu 7-metyloguanozyny
Metoda A:
m7GDPF otrzymano mieszając GDPF/TEA+ (5065 opt. mu), CH3I (143 μ|, 2.3 mmol), DMSO (3 mL). Czas reakcji: 2.5 h. Po oczyszczaniu otrzymano 100 mg of soli trietyloamonionwej m7GDPF (3335 opt.mu, 65.8%); 1H NMR (400 MHz, D2O) δ = 6.06 (d, J=3.6 Hz, 1 H), 4.67 (dd, J=5.0 Hz, J=3.5 Hz, 1 H), 4.48 (dd, J=5.2 Hz J=5.0 Hz, 1 H), 4.42 (m, 1H), 4.37-4.20 (m, 1 H), 4.11 (s, 3 H); 31P NMR (162 MHz, D2O) δ = -11.10 (d, J=20 Hz ,1 P), -17.5 (dd, J=20 Hz J=934 Hz, 1 P); 19F NMR (376 MHz, D2O) δ = -72.58 (d, J=934 Hz, 1 F).
Metoda B:
m7GDPF otrzymano mieszając GDPF/TEA+ (10 mg, 0.02 mmol), (CH3O)2SO2 (160 μ! 1.7 mmol), wodę dejonizowaną (1 mL), i kwas octowy CH3COOH (10 ul). Czas reakcji: 4 h. Otrzymano 100 mg soli trietyloamoniowej m7GDPF (3335 opt.mu, 65.8%); 1H NMR (400 MHz, D2O) δ = 6.06 (d, J=3.6 Hz,
H), 4.67 (dd, J=5.0 Hz J=3.5 Hz, 1 H), 4.48 (dd, J=5.2 Hz J=5.0 Hz, 1 H), 4.42 (m, 1H), 4.37-4.20 (m, 1 H), 4.11 (s, 3 H); 31P NMR (162 MHz, D2O) δ = -11.10 (d, J=20 Hz, 1 P), -17.5 (dd, J=20 Hz J=934 Hz, 1 P); 19F NMR (376 MHz, D2O) δ = -72.58 (d, J=934 Hz, 1 F).
Synteza fluorotrifosforanu 7-metyloguanozyny (m7GTPF) m7GTPF otrzymano mieszając m7GDP/TEA+ (120 mg, 0.181 mmol), imidazolową pochodną fluorofosforanu pF-lm/Li (120 mg, 0.77 mmol), DMF (3.5 mL) i ZnCI2 (194 mg, 1.43 mmol). Czas reakcji:
h. Po oczyszczaniu uzyskano 51.5 mg m7GTPF (1560.4 opt.mu, 0.140 mmol, 77%); 1H NMR (500 MHz, D2O) δ = 9.20 (s, 1 H), 6.08 (d, J=3.66 Hz 1 H), 4.69 (dd, J=4.76 Hz J=3.7 Hz 1 H), 4.52 (t, J= 5.5 Hz J=4.76 Hz 1 H), 4.42 (dd, J=5.5 Hz J=2.56 Hz 1 H), 4.31 (m, 2 H), 4.13 (s, 3 H); 31P NMR (203 MHz, D2O) δ = -7.04 (d, J=19.44 Hz ,1 P), -13.56 (dd, J=934 Hz J=18 Hz 1 P), -18.69 (dd, J=19.5 Hz J=18 Hz 1 P); 19F NMR (471 MHz, D2O) δ = -72.28 (d, J=934 Hz, 1 F).
Synteza 2-fluoro-imidodifosforanu guanozyny GpNHpF
GpNHpF otrzymano mieszając GpNHpF-lm/Li (93 mg, 0.177 mmol), fluorek tetra-n-butyloamoniowy - TBAF (1 M roztwór w THF, 1580 μ^ 1.58 mmol), DMSO (3.3 mL) i ZnCI2 (189 mg, 1.39 mmol). Czas reakcji: 3 h ze wspomaganiem mikrofalowym. Po oczyszczaniu otrzymano 5.4 mg GpNHpF (822.51 opt.mu, 0.068, 25%). HR MS(-)ES m/z 443.02913 calc, for C10H14N6O9P2F: 443.0287; 1H NMR (400 MHz, D2O) δ = 8.22 (s, 1 H), 5.94 (d, J=6.0 Hz, 1 H), 4.98 (częściowo nałożony z HDO), 4.52 (dd, J=4.8 Hz J=3.5 Hz, 1 H), 4.35 (m, 1 H), 4.14 (m, 2 H); 31P NMR (162 MHz, D2O) δ = 3.16 (dd, J=914 Hz J=6.2 Hz 1 P), 1.15 (d, J=3.6 Hz 1P); 19F NMR (376 MHz, D2O) δ = -61.5 (d, J=914 Hz 1 F).
Synteza 2-fluoro-imidodifosforanu 7-metyloguanozyny m7GpNHpF (8) m7GpNHpF otrzymano mieszając GpNHpF/TEA+ (22 mg, 0.034 mmol, 411 opt. mu), (CH3O)2SO2 (200 μΙ, 2.1 mmol), wodę dejonizowaną (1,5 mL) i kwas octowy CH3COOH (15 μβ. Czas reakcji: 4 h. Otrzymano 8,3 mg soli amonowej m7GpNHpF. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ = 6.08 (d, J=3.5 Hz, 1 H), 4.67 (dd, J=4.7 Hz J=3.5 Hz, 1 H), 4.51 (d, J=5.5 Hz J=4.72 Hz, 1 H), 4.41 (m, 1 H), 4.30-4.12 (m, częściowo nałożony z H7, 1H), 4.11 (s, 3 H); 31P NMR (162 MHz, D2O) δ = -0.90 (ddd, J=5.5 Hz ,1 P), -3.0 (dd, J=915 Hz J= 5.5 Hz, 1 P); 19F NMR (376 MHz, D2O) δ = -61.3 (d, J=915 Hz, 1 F).
P r z y k ł a d 2
Charakteryzacja nowych analogów kapu
Badanie podatności fluorofosforanowych analogów na degradację enzymem DcpS
Celem tego testu jest sprawdzenie, czy nowy fluorofosforanowy analog kapu jest hydrolizowany przez enzym DcpS. Rekombinowane ludzkie białko kodujące enzym DcpS otrzymuje się tak jak opisano wcześniej (Kowalska, Lewdorowicz et al. 2008). Podatność nowych analogów na hydrolizę przez DcpS sprawdza się w 50 mM buforze Tris-HCI o pH 7.9 zawierającym 150 mM NaCI i 2 mM DTT. Mieszanina reakcyjna zawiera testowany analog kapu (40 pM) i enzym DcpS (100 nM) w 400 μl buforu. W odpowiednich odstępach czasowych z mieszaniny reakcyjnej pobiera się próbkę o objętości 100 μ!. Próbkę inkubuje się w 98°C przez 2 min, a następnie chłodzi do 0°C i analizuje na RP HPLC tak jak w warunkach opisanych w informacjach ogólnych.
P r z y k ł a d 3
Wykorzystanie nowych analogów kapu w testach enzymatycznych
Test 1 - wstępne przeszukiwanie biblioteki inhibitorów
Celem tego testu jest znalezienie związków, które hamują aktywność DcpS, jako potencjalnych inhibitorów enzymu. Reakcje z udziałem enzymu DcpS prowadzi się w 50 mM buforze Tris-HCI o pH 7.9 zawierającym 150 mM NaCI i 2 mM DTT. Równolegle przygotowane mieszaniny reakcyjne zawierają m7GMPF (40 pM), enzym DcpS (100 nM) oraz jeden z testowanych związków, lub mieszaninę
PL 227 982 B1 testowanych związków w stałym stężeniu (np. 20 pM) w 100 μΙ buforu. Po odpowiednim czasie, po którym reakcja bez udziału inhibitora przebiegła w 50% ze wszystkich mieszanin reakcyjnych pobiera się próbki o objętości 10 μ!, które inkubuje się w 98°C przez 2 min, a następnie chłodzi do 0°C. Do próbek dodaje się 90 μl roztworu TBDS-fluoresceiny w DMSO o stężeniu 2.5 μM i inkubuje 30 min. Następnie do próbek dodaje się 100 μl 200 mM buforu HEPES pH 7 i dokonuje odczytu fluorescencji w sposób opisany w informacjach ogólnych. Na podstawie wyników selekcjonuje się anal ogi, które wykazują największy potencjał inhibitorowy (najniższa fluorescencja).
Test 2 - Test 19F NMR w obecności m7GMPF
Celem tego testu jest znalezienie związków, które hamują aktywność DcpS, jako potencjalnych inhibitorów enzymu. Reakcje z udziałem enzymu DcpS prowadzi się w 50 mM buforze Tris-HCI o pH 7.9 zawierającym 150 mM NaCI i 2 mM DTT. Równolegle przygotowane mieszaniny reakcyjne zawierają m7GMPF (200 μM), enzym DcpS (250 nM) oraz jeden z testowanych związków, lub mieszaninę testowanych związków w stałym stężeniu (np. 50 μM) w 100 μl buforu. Po odpowiednim czasie, po którym reakcja bez udziału inhibitora przebiegła w 50%, mieszaniny reakcyjne inkubuje się w 98°C przez 2 min, a następnie chłodzi do 0°C. Następnie próbki analizuje się metodą F NMR tak jak opisano w reakcjach ogólnych. Stopień hydrolizy substratu określa się ze wzoru x = Sf/(S1S+S2S+Sf)-100%, gdzie S1S, S2S, Sf to powierzchnie pod sygnałami odpowiednio: lewej składowej substratu, prawej składowej substratu i jonu fluorkowego. Najsilniejszymi inhibitorami są związki o małej wartości x.
Test 3 - Test 19F NMR w obecności m7GMPF
Celem tego testu jest znalezienie związków, które hamują aktywność DcpS, jako potencjalnych inhibitorów enzymu. Reakcje z udziałem enzymu DcpS prowadzi się w 50 mM buforze Tris-HCI o pH 7.9 zawierającym 150 mM NaCI i 2 mM DTT. Równolegle przygotowane mieszaniny reakcyjne zawierają m7GDPF lub m7GTPF (400 μM), enzym DcpS (250 nM) oraz jeden z testowanych związków, lub mieszaninę testowanych związków w stałym stężeniu (np. 100 μM) w 100 μl buforu. Po odpowiednim czasie, po którym reakcja bez udziału inhibitora przebiegła w 50%, mieszaniny reakcyjne inkubuje się w 98°C przez 2 min, a następnie chłodzi do 0°C. Następnie próbki analizuje się metodą
F NMR tak jak opisano w reakcjach ogólnych. Stopień hydrolizy substratu określa się ze wzoru x=(Sip+S2p)/(SiS+S2S+Sip+S2P)-100%, gdzie S1S, S2S, Sf to powierzchnie pod sygnałami odpowiednio: lewej składowej substratu, prawej składowej substratu, lewej składowej produktu i prawej składowej produktu. Najsilniejszymi inhibitorami są związki o małej wartości x.
Test 4 - wyznaczanie wartości IC50 dla wybranych inhibitorów
Celem tego testu jest wyznaczenie stężenia, przy którym dany inhibitor hamuje aktywność DcpS do 50% wartości maksymalnej w danych warunkach. Test przeprowadza się w takim samym buforze jak w teście 1. Dziesięć równolegle przygotowanych mieszanin reakcyjnych zawierało m7GMPF (40 μM), enzym DcpS (100 nM) oraz testowany związek w różnych stężeniach z zakresu 0-20 μM w 100 μl buforu. Po odpowiednim czasie, po którym reakcja bez udziału inhibitora przebiegła w 50% ze wszystkich mieszanin reakcyjnych pobierano próbki o objętości 10 μ( które inkubowano w 98°C przez 2 min, a następnie chłodzono do 0 °C. Do próbek dodawano 90 μl roztworu TBDSfluoresceiny w DMSO o stężeniu 2.5 pM i inkubowano 30 min. Następnie do próbek dodano 100 μl 200 mM buforu HEPES pH 7 i dokonano odczytu fluorescencji w sposób opisany w informacjach ogólnych. Na podstawie wyników sporządzano wykres zależności fluorescencji od stężenia inhibit ora i uzyskaną zależność dopasowywano do odpowiedniej krzywej teoretycznej w celu uzyskania wartości IC50.
PL 227 982 B1
Bibliografia
1. Bail, S. and M. Kiledjian (2008). „DcpS, a generał modulator of cap-binding protein-dependent processes?” Rna Biology 5(4): 216-219.
2. Butchbach, M. E. R., J. Singh, et al. (2010). „Effects of 2,4-diaminoquinazoline derivatives on SMN expression and phenotype in a mouse model for spinal muscular atrophy”. Human Molecular Genetics 19(3): 454-467.
3. Cametti, M. and K. Rissanen (2013). „Highlights on contemporary recognition and sensing of fluoride anion in solution and in the solid state”. Chemical Society Reviews 42(5): 2016-2038.
4. Coller, J. and R. Parker (2004). „Eukaryotic mRNA decapping”. Annual Review of Biochemistry 73: 861-890.
5. Dalvit, C., P. E. Fagerness, et al. (2003). „Fluorine-NMR Experiments for HighThroughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability”. Journal of the American Chemical Society 125(25): 7696-7703.
6. Darzynkiewicz, Z. M., E. Bojarska, et al. (2007). „Interaction of human decapping scavenger with 5' mRNA cap analogues: structural requirements for catalytic activity”. Journal of Phvsics-Condensed Matter 19(28).
7. Frant, M. S. and J. W. Ross (1966). „Electrode for Sensing Fluoride lon Activity in Solution”. Science 154(37561): 1553-1555.
8. Jemielity, J., T. Fowler, et al. (2003). „Novel anti-reverse cap analogs with superior translational properties”. Rna-a Publication of the Rna Society 9(9): 1108-1122.
9. Kowalska, J., M. Lewdorowicz, et al. (2008). „Synthesis and characterization of mRNA cap analogs containing phosphorothioate substitutions that bind tightly to elF4E and are resistant to the decapping pyrophosphatase DcpS”. RNA-a Publication of the RNA Society 14(6): 1119-1131.
10. Rydzik, A. M., M. Kulis, et al. (2012). „Synthesis and properties of mRNA cap analogs containing imidodiphosphate moiety-fairly mimicking natural cap structure, yet resistant to enzymatic hydrolysis”. Bioorq Med Chem.
11. Shen, V., H. D. Liu, et al. (2008). „DcpS scavenger decapping enzyme can modulate pre-mRNA splicing”. Rna-a Publication of the Rna Society 14(61: 1132-1142.
12. Singh, J., M. Salcius, et al. (2008). „DcpS as a Therapeutic Target for Spinal Muscular Atrophy”. Acs Chemical Biology 3(11): 711-722.
13. Stockman, B. J. (2008). „2-Fluoro-ATP as a Versatile Tool for 19F NMR-Based Activity Screening”. Journal of the American Chemical Society 130(18): 5870-5871.
14. Van Meerbeke, J. P., R. M. Gibbs, et al. (2013). „The DcpS inhibitor RG3039 improves motor function in SMA mice”. Human Molecular Genetics 22(20): 4074-4083.
15. Wypijewska, A., E. Bojarska, et al. (2012). „7-Methylguanosine Diphosphate (m7GDP) Is Not Hydrolyzed but Strongly Bound by Decapping Scavenger (DcpS) Enzymes and Potently Inhibits Their Activity”. Biochemistry 51(40): 8003-8013.
16. Yang, X.-F., S.-J. Ye, et al. (2007). „A Fluorescein-based Fluorogenic Probe for Fluoride Ion Based on the Fluoride-induced Cleavage of tert-butyldimethylsilyl Ether”. Journal of Fluorescence 17(1): 81 -87.
Claims (13)
1. Fluorofosforanowy analog końca 5’ RNA (kapu) o wzorze 1 w którym; n = 1,2, 3 lub 4
R1 i R2 są wybrane niezależnie z grupy obejmującej H, OH, OCH3, OC2H5.
R3 jest wybrane z grupy CH3, C2H5, CH2Ph.
2. Sposób oznaczenia aktywności testowanego związku, jako inhibitora enzymu DcpS, znamienny tym, że wykorzystuje się fluorofosforanowy analog końca 5’ mRNA o wzorze 1 zgodnie z zastrzeżeniem 1 i testowany związek poddaje się procedurze składającej się z następujących etapów:
(i) inkubacji z enzymem DcpS oraz związkiem o wzorze 1 według zastrzeżenia 1, i (ii) oznaczenia ilości produktu reakcji zawierającego atom fluoru powstałego w wyniku działania enzymu DcpS na związek o wzorze 1 według zastrzeżenia 1.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że do inkubacji z enzymem DcpS stosuje się pełnej długości ludzki enzym DcpS lub jego fragment lub jego homolog lub inny enzym o specyficzności substratowej zbliżonej do enzymu DcpS.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że oznaczenie ilości produktu zawierającego atom fluoru dokonuje się na podstawie pomiaru F NMR.
5. Fluorofosforanowy analog końca 5’ RNA (kapu) o wzorze 2 w którym:
Y = O, S, Se lub BH3
R1 i R2 są wybrane niezależnie z grupy obejmującej H, OH, OCH3, OC2H5.
R3 jest wybrane z grupy CH3, C2H5, CH2Ph przy czym związek może występować w postaci jednego diastereoizomeru lub ich mieszaniny.
6. Sposób oznaczenia aktywności testowanego związku jako inhibitora enzymu DcpS, znamienny tym, że wykorzystuje się fluorofosforanowy analog końca 5’ mRNA o wzorze 2 zgodnie z zastrzeżeniem 5 i testowany związek poddaje się procedurze składającej się z następujących etapów:
(i) inkubacji z enzymem DcpS oraz ze związkiem o wzorze 2 według zastrzeżenia 5, i (ii) oznaczenia ilości jonu fluorkowego powstałego w wyniku działania enzymu DcpS na związek o wzorze 2 według zastrzeżenia 5.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że do inkubacji z enzymem DcpS stosuje się pełnej długości ludzki enzym DcpS lub jego fragment lub jego homolog lub inny enzym o specyficzności substratowej zbliżonej do enzymu DcpS.
8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jony fluorkowe powstałe w wyniku działania enzymu DcpS na związek o wzorze 2 według zastrzeżenia 5 poddaje się reakcji z sondą fluorogeniczną czułą na jony fluorkowe, a następnie stężenie jonów fluorkowych, które uległy reakcji z sondą oznacza się dokonując pomiaru fluorescencji.
PL 227 982 Β1
9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jony fluorkowe powstałe w wyniku działania enzymu DcpS na związek o wzorze 2 według zastrzeżenia 5 poddaje się reakcji z sondą kolorymetryczną czułą na jony fluorkowe, a następnie stężenie jonów fluorkowych, które uległy reakcji z sondą oznacza się dokonując pomiaru absorbancji.
10. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stężenie jonów fluorkowych powstałych w wyniku działania enzymu DcpS na związek o wzorze 2 według zastrzeżenia 5 oznacza się dokonując pomiaru potencjału z użyciem elektrody selektywnej dla jonów fluorkowych.
11. Fluorofosforanowy analog końca 5’ RNA (kapu) o wzorze 3,
Ri R2 w którym:
n wynosi 0, 1,2 lub 3, m wynosi 0 lub 1,
Y jest wybrany spośród grupy obejmującej O, S, CH2
X jest wybrany spośród grupy obejmującej O, CH2, NH, CF2 lub CCI2, przy czym X i Y nie mogą jednocześnie oznaczać O,
R1 i R2 są wybrane niezależnie z grupy obejmującej H, OH, OCH3, OC2H5,
R3 jest wybrane z grupy CH3, C2H5, CH2Ph, przy czym związek może występować w postaci jednego diastereoizomeru lub ich mieszaniny.
12. Sposób oznaczenia powinowactwa testowanego związku do enzymu DcpS, znamienny tym, że wykorzystuje się fluorofosforanowy analog końca 5’ mRNA o wzorze 3 zgodnie z zastrzeżeniem 11 i testowany związek poddaje się inkubacji z enzymem DcpS oraz związkiem o wzorze 3 według zastrzeżenia 11, po czym frakcję związku związaną z enzymem DcpS określa się mierząc wybrany parametr (przesunięcie chemiczne lub intensywność lub czas relaksacji) sygnału 19F NMR pochodzącego od związku o wzorze 3 według zastrzeżenia 11.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że do inkubacji z enzymem DcpS stosuje się pełnej długości ludzki enzym DcpS lub jego fragment lub jego homolog lub inny enzym o specyficzności substratowej zbliżonej do enzymu DcpS.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL406893A PL227982B1 (pl) | 2014-01-21 | 2014-01-21 | Fluorofosforanowe analogi konca 5’ mRNA (kapu), sposób ich otrzymywania i zastosowanie |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL406893A PL227982B1 (pl) | 2014-01-21 | 2014-01-21 | Fluorofosforanowe analogi konca 5’ mRNA (kapu), sposób ich otrzymywania i zastosowanie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL406893A1 PL406893A1 (pl) | 2015-08-03 |
| PL227982B1 true PL227982B1 (pl) | 2018-02-28 |
Family
ID=53723541
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL406893A PL227982B1 (pl) | 2014-01-21 | 2014-01-21 | Fluorofosforanowe analogi konca 5’ mRNA (kapu), sposób ich otrzymywania i zastosowanie |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL227982B1 (pl) |
-
2014
- 2014-01-21 PL PL406893A patent/PL227982B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL406893A1 (pl) | 2015-08-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Balintová et al. | Azidophenyl as a click-transformable redox label of DNA suitable for electrochemical detection of DNA–protein interactions | |
| JP5733760B2 (ja) | 蛍光発生分子および標的核酸検出方法 | |
| Zhang et al. | Near-infrared ratiometric probe with a self-immolative spacer for rapid and sensitive detection of alkaline phosphatase activity and imaging in vivo | |
| EA032482B1 (ru) | Способ анализа нуклеиновой кислоты-мишени | |
| Zalesak et al. | Structure-based design of a potent and selective YTHDC1 ligand | |
| UA127679C2 (uk) | Спосіб ідентифікації пацієнта, що характеризується наявністю сприйнятливості до лікування недрібноклітинного раку легені інгібітором prmt5 | |
| Shershov et al. | Comparative study of novel fluorescent cyanine nucleotides: Hybridization analysis of labeled PCR products using a biochip | |
| Wang et al. | A single fluorescent probe for imaging ribonucleic acid and sulfur dioxide in living systems and its unique application in tumor and normal cells | |
| EP1296997B1 (en) | Base analogues | |
| Kalesh et al. | Rapid synthesis of Abelson tyrosine kinase inhibitors using click chemistry | |
| Wang et al. | A novel boronic acid-based fluorescence turn on sensor for specific detection of adenosine in urine | |
| EP1392870B1 (en) | Screening for enzyme inhibitors | |
| EP2103616A1 (en) | Fluorescent molecule | |
| Creech et al. | Synthesis and evaluation of 2-ethynyl-adenosine-5′-triphosphate as a chemical reporter for protein AMPylation | |
| Lee et al. | Monitoring the crosstalk between methylation and phosphorylation on histone peptides with host-assisted capillary electrophoresis | |
| PL227982B1 (pl) | Fluorofosforanowe analogi konca 5’ mRNA (kapu), sposób ich otrzymywania i zastosowanie | |
| Yang et al. | 3-Phosphono-L-alanine as pyrophosphate mimic for DNA synthesis using HIV-1 reverse transcriptase | |
| WO2020246616A1 (ja) | Ｅｎｐｐ活性検出用蛍光プローブ | |
| Zhang et al. | A high-sensitivity fluorescent probe with a self-immolative spacer for real-time ratiometric detection and imaging of alkaline phosphatase activity | |
| HK1257846A1 (en) | Process for preparing phosphate compound bearing isotope | |
| Shaji et al. | A cell-permeable fluorescent probe for imaging of DNA repair protein ALKBH2 | |
| Lv et al. | Study of a 1, 8-naphtylimide derivative as uridine diphosphate selective probe: Synthesis, optical properties and in vivo imaging application | |
| KR102042182B1 (ko) | 포스포히스티딘 포스파타아제 1 검출용 프로브 및 이의 제조방법 | |
| Hacker et al. | Synthesis of γ‐Phosphate‐Labeled and Doubly Labeled Adenosine Triphosphate Analogs | |
| CN120842203B (zh) | 特异性检测shp2的近红外荧光探针的制备方法和应用 |