PL226967B1

PL226967B1 - Biopreparat do zaprawiania nasion roślin warzywnych, sposób wytwarzania biopreparatu oraz kompozycja

Info

Publication number: PL226967B1
Application number: PL408647A
Authority: PL
Inventors: Danuta Witkowska; Magdalena Szczech; Anna Kancelista; Regina Stempniewicz; Marta Pasławska; Michał Piegza; Jan Sobolewski
Original assignee: Inst Ogrodnictwa; Univ Przyrodniczy We Wrocławiu
Priority date: 2014-06-24
Filing date: 2014-06-24
Publication date: 2017-10-31
Also published as: PL408647A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest biopreparat mikrobiologiczny do zaprawiania nasion roślin warzywnych, zwłaszcza marchwi, sposób wytwarzania tego biopreparatu oraz kompozycja środka do zaprawiania nasion i/lub ochrony roślin. Wynalazek może znaleźć zastosowanie w ogrodnictwie do ochrony roślin przed fitopatogenami. Biopreparat charakteryzuje się tym, że stanowi go sucha, rozdrobniona masa, zwłaszcza w postaci proszku, o wilgotności 5-10%, która końcowo zawiera zarodniki Trichoderma atroviride TRS 20, w ilości co najmniej 108 żywych zarodników/g s.m., oraz w pozostałej ilości produkty pohodowlane.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest biopreparat mikrobiologiczny do zaprawiania nasion roślin warzywnych, zwłaszcza marchwi, sposób wytwarzania tego biopreparatu oraz kompozycja środka do zaprawiania nasion i/lub ochrony roślin. Wynalazek może znaleźć zastosowanie w ogrodnictwie do ochrony roślin przed fitopatogenami.

Powszechnie znane są technologie produkcji preparatów biologicznych do ochrony roślin przed patogenami, zarówno na bazie żywej jak i martwej biomasy drobnoustrojów.

Z polskiego opisu patentowego PL195422 znany jest sposób otrzymywania biopreparatu zawierającego martwą biomasę fitopatogenu i poddanego hydrolizie enzymatycznej płynem pohodowlanym z Trichoderma viride F-19.

Inny opis patentowy PL160468 charakteryzuje sposób wytwarzania biologicznego preparatu do ochrony roślin przy użyciu Trichoderma viride B-35 w dwóch etapach, przy czym w pierwszym etapie hodowlę prowadzi się w podłożu płynnym, metodą wgłębną, a w drugim etapie uzyskaną hodowlę płynną miesza się ze sterylnym organicznym podłożem sypkim.

Znane są także inne sposoby wytwarzania suszonych biopreparatów w oparciu o zarodniki Trichoderma, zwłaszcza Trichoderma viride 85/1 i Trichoderma harzianum Rafii 658 uzyskane w hodowlach na wysłodkach lub na perlicie i stosowane w ochronie przed Fusarium oxysporum szczególnie takich roślin jak szparag, goździk, gipsówka /Weber Z. i in., Progress In Plant Protection, 2001,41,2, 769-772/.

Innym znanym sposobem jest produkcja zarodników grzybów Trichoderma, zwłaszcza Trichoderma harzianum sp., Trichoderma viride sp. na otrębach pszennych w ilościach odpowiednio 2,8x10⁹/g s.m. oraz 2,4x10⁹/g s.m. (Cavalcante R.S. i in., Food Bioprocess Technol., 2008,1,100-104).

Na rynku istnieje ponad 50 zarejestrowanych biopestycyd ów, biostymulatorów i bionawozów, opartych o zarodniki szczepów Trichoderma (Woo i in., Phytopathology, 2006, 96, 181-185). W poszukiwaniu efektywnych w zwalczaniu fitopatogenów szczepów Trichoderma ważnym jest, aby skupić uwagę na rodzimych szczepach, występujących w glebie w danym regionie /Kredics i in., Food Technology and Biotechnology, 2003, 41, 37-42/. Niektóre szczepy są zdolne do supresji patogenów roślin tylko w środowiskach o bardzo dużej wilgotności i wysokiej temperaturze (np. w krajach tropikalnych), podczas gdy inne potrafią efektywnie wzrastać i zwalczać fitopatogeny nawet w temperaturze 4-10°C. Dlatego w konstruowaniu biopreparatów o potencjalnych zastosowaniu na danym obszarze bada się szczepy wyizolowane z gleb regionalnych. Jako mechanizmy wykorzystywane przez Trichoderma w zwalczaniu patogenów roślin wymienia się przede wszystkim: konkurencję, mykoparazytyzm, antybiozę i indukcję mechanizmów obronnych u roślin. Pod pojęciem biokontroli często występującym w dostępnej literaturze, rozumie się synergistyczne oddziaływanie wszystkich wyżej wymienionych mechanizmów w zwalczaniu fitopatogenów.

Z kolei proces zaprawiania nasion znany jest od dawna, ale istotnym w tym procesie jest dobór odpowiednich szczepów grzybów strzępkowych w biopreparacie, efektywnie chroniących przed patogenami odpowiednią roślinę, zwłaszcza warzywną. Szczególnie w uprawach ekologicznych, zakaz stosowania zapraw chemicznych, wymusza konieczność poszukiwania innych metod zabezpieczenia wschodów roślin przed patogenami.

Wszystkie dotychczas znane preparaty do zaprawiania nasion i ochrony roślin, nie wykorzystują Trichoderma atroviride TRS 20, który jest szczepem rodzimym (endemicznym), pochodzącym z regionu Polski (Trichoderma atroviride isolate TRS20 RAPD marker R08-1283 genomic sequence.GenBank: KF364339.1; Bartoszewski,G., Skoneczny,D. and Oskiera,M. Direct Submission, Submitted (08-JUL-2013) Department of Plant Genetics Breeding and Biotechnology, Warsaw University of Life Sciences, Faculty of Horticulture and Landscape Architecture, 159 Nowoursynowska Street, Warsaw 02-776, Poland). Sekwencję nukleotydów genu szczepu Trichoderma atroviride TRS20 przedstawia Fig. 1 na rysunku.

Niespodziewanie okazało się, że sposób otrzymywania biopreparatu Trichoderma atroviride TRS 20, pozwala na uzyskanie produktu zawierającego co najmniej 10⁸ - 10⁹ żywych zarodników na 1 g s.m. podłoża i jego przeżywalność po procesie suszenia w temperaturach 50-70°C wynosi 90-100%. Biopreparat ten po zastosowaniu w zaprawianiu nasion marchwi, korzystnie wpływa na wzrost i masę siewek oraz na ograniczenie zgorzeli siewek spowodowanej przez Pythium spp.

PL 226 967 B1

Istotą wynalazku jest biopreparat, który jest suchą, rozdrobnioną masą, zwłaszcza w postaci proszku, o wilgotności 5-10%, zawierający końcowo żywe zarodniki Trichoderma atroviride TRS 20, w ilości od 10⁸ do 10⁹ zarodników/g s.m., oraz w pozostałej ilości produkty pohodowlane.

Korzystnie jest gdy biopreparat dodatkowo zawiera od 90 do 100 g maltodekstryny w kg preparatu.

Istotą wynalazku jest również kompozycja, którą stanowi wodny roztwór biopreparatu według wynalazku, w proporcji 1 g biopreparatu na 10 I wody, przy czym końcowe stężenie zarodników wynosi od 10⁴ do 10⁵/ml.

Istotą sposobu jest natomiast to, że wytwarzanie biopreparatu prowadzi się w dwóch etapach, przy czym w pierwszym etapie podłoże stałe, składające się z co najmniej jednego produktu odpadowego przemysłu rolno-spożywczego, sterylizuje się w autoklawie, korzystnie dwukrotnie w odstępie h, przez 10 do 30 minut, następnie po schłodzeniu, wprowadza się inokulum w postaci zarodników

7 6

Trichoderma atroviride TRS 20 w ilości 10 - 10 zarodników/g s.m. podłoża, korzystnie 10 zarodników/g s.m. Wilgotność podłoża wynosi od 60 do 80%, a hodowlę prowadzi się przez okres od 10 do 12 dni, w temperaturze od 23°C do 26°C. Proces namnażania kończy się w momencie uzyskania zarodników grzyba, co najmniej w ilości 10⁸ - 10¹⁰ komórek/g s.m. podłoża. W drugim etapie podłoże z biomasą grzyba i zarodnikami suszy się powietrzem w suszarce fontannowej w temperaturze na wlocie od 50°C do 70°C, do momentu uzyskania wilgotności biopreparatu od 5 do 10%, co równoważne jest z suszeniem 1 kg od 5 do 6 godzin.

Korzystnie jest, gdy podłoże do hodowli składa się z wysłodków buraczanych i/lub otrąb pszennych, i/lub wytłoków jabłkowych, w stosunku 1:1:1.

Korzystnie również jest, gdy podłoże zawiera 0,01 g-0,06 g monooleinianu polioksyetylenosorbitolu w 100 g podłoża.

Korzystnie także jest, gdy po zakończeniu hodowli, do biomasy przed suszeniem dodaje się roztwór maltodekstryny w proporcji 100 ml/100 g stałych części.

Ważne jest, aby w procesie suszenia zagwarantować jak największą przeżywalność zarodników.

Biopreparat według wynalazku ze względu na swoje cenne właściwości, może być stosowany w ochronie roślin warzywnych, zwłaszcza w zaprawianiu nasion marchwi, co korzystnie stanowi ochronę przed fitopatogenicznymi grzybami z rodzaju Pythium, Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotina.

Zasada działania biologicznego preparatu do zaprawiania nasion warzyw, według wynalazku, oparta jest na hamowaniu przez grzyb strzępkowy Trichoderma atroviride TRS 20 wzrostu i rozwoju grzybów patogenicznych znajdujących się zarówno na nasionach jak i w glebie, chroniąc w ten sposób młode kiełkujące rośliny, korzystnie poprzez wytwarzanie różnych metabolitów, m.in. enzymów litycznych, zwłaszcza chitynaz, beta-1,3-glukanaz, atakujących ściany komórkowe fitopatogenów, powodując ich destrukcję.

Ponadto grzyby z rodzaju Trichoderma, w tym także Trichoderma atriviride TRS 20, są zdolne do wytwarzania antybiotyków o charakterze izonitryli, polikektydów, alkilii peronowych, peptaiboli, które działają jako elicitory, czyli związki indukujące biochemiczne reakcje obronne roślin, wspomagając tym dodatkowo antagonistyczną aktywność grzybów z rodzaju Trichoderma względem patogenów. Tabela przedstawia wyniki przeprowadzonych badań, potwierdzających skuteczność biopreparatu, według wynalazku, w ochronie przed patogenem Pythium spp.

T a b e l a

Wpływ zaprawiania nasion marchwi na zdrowotność i wzrost siewek w glebie skażonej Pythium spp.

Badany środek ochronny	Średni procent zdrowych siewek po 2 tyg. [%]	Średnia masa roślin po 6 tygodniach [g]	Średnia wysokość roślin po 6 tygodniach. [cm]
Kontrola	57,9	10,4	8,9
Konwencjonalna zaprawa nasienna T75 DS./WS 5 g/kg nasion, wg etykiety	69,5	18,2	10,3
Biopreparat TRS 20 50 ml/10 g nasion; 10⁶/ml	77	39,2	11,6

PL 226 967 B1

Zaletą biopreparatu, według wynalazku, jest to, że jest przyjazny dla środowiska, ulega naturalnej degradacji i jego wytwarzanie opiera się o wykorzystanie odpadów przemysłu rolno-spożywczego. Dodatkowo, zastosowana metoda wytwarzania biopreparatu, charakteryzuje się dużą przeżywalnością zarodników Trichoderma atroviride TRS 20 na poziomie 90-100% przeżywalności po suszeniu.

P r z y k ł a d 1:

Do kolby Roux o objętości 1000 ml, wprowadza się podłoże stałe, składające się z 25 g wysłodków buraczanych, 25 g otrąb pszennych, 25 g wytłoków jabłkowych z dodatkiem 75 ml wody wodociągowej dla zachowania wilgotności podłoża na poziomie 70%. Po dwukrotnej sterylizacji i schłodzeniu, do podłoża wprowadza się inokulum w postaci zawiesiny zarodników grzyba strzępkowego Trichoderma atroviride TRS 20 w 40 ml 0,1% monooleinianu polioksyetylenosorbitolu, do początkowej gęstości 10⁶ konidiów/g s.m. podłoża. Zawiesinę zarodników pozyskuje się z 1 0-dobowej hodowli grzyba na znanym podłożu agarowym PDA. Całość po zaszczepieniu inkubuje się przez 10 dni w komorze fitotronowej, przy zachowaniu stałej wilgotności komory na poziomie 75% i temperatury 25°C. Po zakończeniu hodowli biomasę suszy się fontannowo w temperaturze 60°C, do wilgotności 7%.

Otrzymuje się 30 g suchego preparatu, zawierającego żywe zarodniki Trichoderma atroviride TRS 20, w ilości 10⁸/g s.m., przy stopniu przeżywalności w czasie suszenia na poziomie 90%, oraz w pozostałej ilości produkty pohodowlane. Po rozdrobnieniu w młynku, biopreparat ma postać proszku. Biopreparat przenosi się do foliowych woreczków, zamyka próżniowo i przechowuje w temperaturze pokojowej.

Do zastosowania w zaprawianiu nasion marchwi, rozprowadza się biopreparat w wodzie w proporcji: 1 g preparatu w 10 I wody, przy czym uzyskuje się końcowe stężenie zarodników w ilości

10⁴/ml.

P r z y k ł a d 2:

Postępuje się jak w przykładzie 1, z tym, że podłoże stałe składa się z 37,5 g wysłodków buraczanych i 37,5 g otrąb pszennych oraz pozostałych składników jak w przykładzie 1. Dalej postępuje się jak w przykładzie 1, z tym, że hodowlę prowadzi się przez 12 dni.

Otrzymuje się 50 g suchego preparatu, zawierającego żywe zarodniki Trichoderma atroviride TRS 20, w ilości 10⁹/g s.m., przy stopniu przeżywalności w czasie suszenia na poziomie 90%, oraz w pozostałej ilości produkty pohodowlane.

P r z y k ł a d 3:

Postępuje się jak w przykładzie 1, z tym, że po zakończeniu hodowli, do biomasy dodaje roztwór 20% maltodekstryny w proporcji 100 ml/100 g stałych części pohodowlanych. Dalej postępuje się jak w przykładzie 1.

Otrzymuje się 40 g suchego preparatu, zawierającego żywe zarodniki Trichoderma atroviride TRS 20, w ilości 10⁸/g s.m., przy stopniu przeżywalności w czasie suszenia na poziomie 100%, 4 g maltodekstryny oraz w pozostałej ilości produkty pohodowlane.

P r z y k ł a d 4:

Postępuje się jak w przykładzie 2, z tym, że po zakończeniu hodowli, do biomasy dodaje roztwór 20% maltodekstryny w proporcji 100 ml/100 g stałych części pohodowlanych. Dalej postępuje się jak w przykładzie 2.

Otrzymuje się 55 g suchego preparatu, zawierającego żywe zarodniki Trichoderma atroviride TRS 20, w ilości 10⁹/g s.m., przy stopniu przeżywalności w czasie suszenia na poziomie 100%, 5 g maltodekstryny oraz w pozostałej ilości produkty pohodowlane.

Do zastosowania w zaprawianiu nasion marchwi, rozprowadza się preparat w wodzie w propor-

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Biopreparat do zaprawiania nasion roślin warzywnych, zawierający zarodniki grzybów strzępkowych z rodzaju Trichoderma, znamienny tym, że stanowi go sucha, rozdrobniona masa, zwłaszcza w postaci proszku, o wilgotności 5-10%, która zawiera żywe zarodniki Trichoderma atroviride TRS 20, w ilości końcowej, od 10⁸ do 10⁹ zarodników/g s.m., oraz w pozostałej ilości produkty pohodowlane.
2. Biopreparat według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi go sucha, rozdrobniona masa, która dodatkowo zawiera od 90 do 100 g maltodekstryny w kg preparatu.

PL 226 967 B1
3. Kompozycja środka do zaprawiana nasion i/lub ochrony roślin, znamienna tym, że stanowi wodny roztwór biopreparatu według zastrz. 1 albo 2, w proporcji 1 g biopreparatu na 10 I 45 wody, przy czym końcowe stężenie zarodników wynosi od 10⁴ do 10⁵/ml.
4. Sposób wytwarzania biopreparatu do zaprawiania nasion roślin warzywnych, zawierającego grzyby strzępkowe z rodzaju Trichoderma, w którym stosuje się hodowlę w podłożu stałym, na odpadach przemysłu rolno-spożywczego, znamienny tym, że wytwarzanie biopreparatu prowadzi się w dwóch etapach, przy czym w pierwszym etapie podłoże stałe, składające się z co najmniej jednego produktu odpadowego przemysłu rolno-spożywczego, sterylizuje się w autoklawie, korzystnie dwukrotnie w odstępie 24 h, przez 10 do 30 minut, następnie po schłodzeniu, wprowadza się inokulum w postaci zarodników Trichoderma atroviride TRS 20 5 7 6 w ilości 10 - 10 zarodników/g s.m. podłoża, korzystnie 10 zarodników/g s.m. przy czym wilgotność podłoża wynosi od 60 do 80%, a hodowlę prowadzi się przez okres od 10 do 12 dni, w temperaturze od 23°C do 26°C, aż do uzyskania zarodników grzyba, co najmniej w ilości 10⁸ - 10⁹ komórek/g s.m. podłoża, natomiast w drugim etapie podłoże z biomasą grzyba i zarodnikami suszy się powietrzem w suszarce fontannowej w temperaturze na wlocie od 50°C do 70°C, do momentu uzyskania wilgotności biopreparatu od 5 do 10%, co równoważne jest z suszeniem 1 kg od 5 do 6 godzin.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że podłoże do hodowli składa się z wysłodków buraczanych i/lub otrąb pszennych, i/lub wytłoków jabłkowych, w stosunku 1:1:1.
6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że podłoże zawiera od 0,01 g do 0,06 g monooleinianu polioksyetylenosorbitolu w 100 g podłoża.
7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że po zakończeniu hodowli, do biomasy przed suszeniem dodaje się roztwór maltodekstryny w proporcji 100 ml/100 g stałych części.

PL 226 967 B1

Rysunek 1 cccgttgcct caaagttatt ctcgatagcc cactgcgtgt attcaagaag cactccaata 61 tctttggatc tatatgtagc tcccttctga agtagcaggc aaatcattgg cgtatttcgc 121 ttcatgatag ctaaccctaa tggcgttnga ccgacagtat cctgacattc tacctgcgct 181 cctttttcaa gtagcaggct tgctgttgaa tagtgotcgt tttctattgc acaccataaa 241 ggagtgcggc gacgaatttt atcttccatc tcaatgccgg ccccnttttg taaaagcagt 301 gttacgatat catcaaatcc atgactggcc gcgaaccaga gaggtgtctg gtgagttatt 361 gacgtgatat cgacttgaat ttcattctga agcaaaagca attgaacaat attaggatga 421 ccattaatag ctgcatagtg caaaggggta tacccaaatt ggtcaacgtt gttcacatcg 481 caaaaatgca aaagaatctc aatgatttct tcgtagccaa actttgctgt gagatgaatg 541 gcgggaaggc cttcgccaac taacggagca ttgcaaaatt tgctcaatga cgatctcata 601 tctggtataa gtgataataa aggtttatgc cgttctttca ctgcccatcc aaagngaccg 661 tgcagatatg agactttcga acggccgccc gatatccacg gatgaaagtt ccaagtttcg 721 ttaacacaca tcgcaagctg cgcaaacgtt tcccatgctg atgattcgca atgtatttgt 781 cttgtgtgaa atgcccaatt tgcaacagcg taatcgagaa actgatactg tgctcgactt 841 ggagctgctg gcgtacgtat tgtacggaat ggtagagaaa ttgaggtcgt ctgcttttga 901 gacttccgaa agagagcctt gaggaatcca gtgccagata ctgattgtgc aattgaatag 961 ggagatggaa tggttgttgc gattttcCtg gttgaagttc tgaccagctg aaggctgaag 1021 tccgagaaag agaggtaagt gaggcaatac tccccgcatt ctaaatcgcc attttcttct 1081 gttgggtatc ctgaaacaga cctttcctca cacgcctttt ttctgtcttc gtcgagatat 1141 tgtttcactg aagnatgtgc aaaacgtaca cagttgtcaa gagggtccag aaaaacaaga 1201 tttgcacaac agcnaattat aaaatccgtt tntggctttt tattggcatc ceaetttgta 1261 tcggtaggct ggaaggcaac ggg

Fig. 1