PL226873B1 - Sposób wytwarzania nanoemulsji typu olej wwodzie - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest nanoemulsja i sposób wytwarzania nanoemulsji typu olej w wodzie, przeznaczonych do stosowania farmaceutycznego, jako nanonośniki hydrofobowych substancji aktywnych użytecznych w terapiach przeciwnowotworowych. Zgodnie z wynalazkiem, sposób wytwarzania nanoemulsji typu olej w wodzie, na bazie biokompatybilnych olejów, które stabilizowane są niejonowymi surfaktantami wybranymi z grupy polioksyetylatów, polega na tym, że miesza się surfaktant niejonowy w proporcji od 1 do 40% wagowych z fazą olejową, którą stanowią bikompatybilne oleje mirystynian izopropylu i olej sojowy, w zakresie od 0,1 do 20% wag. i z fazą wodną w zakresie od 60 do 99% wag., a następnie trzyskładnikową mieszaninę poddaje się działaniu ultradźwięków i otrzymuje półprzeźroczystą, opalizującą nanoemulsję, której biologiczne bezpieczeństwo zostało przebadane na liniach komórkowych.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania biokompatybilnych niejonowych nanoemulsji typu olej w wodzie, przeznaczonych do stosowania w formulacjach farmaceutycznych, jako nośniki hydrofobowych substancji aktywnych w terapii antynowotworowej.

Nanoemulsje, zwane również miniemulsjami, ultradrobnymi emulsjami lub submikronowymi emulsjami [C. Solans, C. Solans, P. Izquierdo, J. Nolla, N. Azemar and M.J. Garcia-Celma, Current Opinion in Colloid & Interface Science 10, 2005, 102-110], to przezroczyste lub półprzezroczyste, wizualnie jednorodne, dyspersje wodno-olejowe stabilizowane odpowiednio dobranymi związkami powierzchniowo czynnymi. Od typowych emulsji odróżnia je stopień rozdrobnienia fazy zdyspergowanej, który w przypadku nanoemulsji jest, co najmniej o rząd wielkości mniejszy i jak podają różne źródła literaturowe, ich rozmiar kropel może wynosić mniej niż 100 nm [T.G. Mason et al. Journal of Physics, Condensed matter 18, 2006, R635-R666], 20-200 nm [L. Wang et al. Journal of Colloid and Interface Science 314, 2007, 230-235], poniżej 300 nm [N. Anton et al. International Journal of Pharmaceutics 344, 2007, 44-52] lub dochodzić do 500 nm [B.G. Zanetti-Ramos et al. Materials Science and Engineering C 28, 2008, 526-531]. W zestawieniu z klasycznymi emulsjami, ich nanoodpowiedniki posiadają liczne zalety, do których należy między innymi prosty sposób wytwarzania poprzez wymieszanie przygotowanych faz w odpowiedniej (najczęściej pokojowej) temperaturze a proces ten wymaga znacznie mniejszych nakładów energii niż w przypadku układów emulsyjnych i w większości przypadków nie ma problemów z powiększeniem jego skali. Nanoemulsje wykazują wiele cech charakterystycznych dla układów mikroemulsyjnych, tj. nanoskopowy rozmiar, wysoką stabilność kinetyczną, jednorodność oraz mała lepkość. Ponadto pomimo, że w przeciwieństwie do mikroemulsji, wykazują termodynamiczną niestabilność, to ich przygotowanie nie wymaga żmudnego równowagowania. [N. Anton et al. Int J Pharm. 344, 2007, 44-52; L. Wang et al. Langmuir 24, 2008, 6092-6099; J.M. Gutierre et al. Current Opinion in Colloid & Interface Science 13, 2008, 245-251]. Właściwości nanoskopowych formulacji zależą nie tylko od termodynamicznych warunków (tj. kompozycji, temperatury i ciśnienia), ale również od metody ich przygotowania oraz kolejności dodawania poszczególnych składników układu [L. Wang et al. Langmuir 2008, 24, 6092-6099; J.M. Gutierrez, Current Opinion in Colloid & Interface Science 13, 2008, 245-251].

Opisane w literaturze techniki wytwarzania nanoemulsji można podzielić na dwie zasadnicze grupy: sposoby typu „high-energy emulsification methods” i sposoby typu „Iow energy emulsification methods”. Pierwsze z nich należą do tzw. metod dyspersyjnych wymagających większego nakładu energii, ponieważ do tworzenia nanoemulsji wykorzystuje się wysokociśnieniowe homogenizatory i generatory ultradźwięków. Ich główną zaletą jest szybkość tworzenia układów, stabilność oraz możliwość sterowania pożądanym rozmiarem kropel emulsji. Sposoby te są szeroko stosowane i opisane w literaturze patentowej.

Znane z amerykańskiego opisu patentowego nr US200136450 nanoemulsje typu olej w wodzie są stabilizowane surfaktantami niejonowymi wybranymi z grupy estrów lub eterów glikolu polietylenowego i wytwarzane w procesie wysokociśnieniowej homogenizacji.

W amerykańskim opisie patentowym nr US2003087967 nanoemulsja jest otrzymywana również w procesie wysokociśnieniowej homogenizacji, natomiast emulgator stanowi mieszanina, co najmniej dwóch surfaktantów niejonowych - oksyetylenowane estry kwasów tłuszczowych oraz estry sorbitanu i kwasów tłuszczowych lub, co najmniej jeden jonowy surfaktant wybrany spośród soli metali alkalicznych fosforanu cetylu i soli metali alkalicznych sarkozynianu palmitoilu.

Znane z amerykańskiego opisu patentowego nr US2007036831 nanoemulsje o niskiej toksyczności, wykazujące szerokie spektrum działania na mikroorganizmy, stabilizowane są surfaktantami niejonowymi, jonowymi lub ich mieszaniną.

Tym samym sposobem, zgodnie ze zgłoszeniem międzynarodowym WO2009020280 otrzymuje się nanoemulsje stabilizowane niejonowym surfaktantem - monooleinianem polioksytetylenosorbitolu, w których fazę olejową stanowi mieszanina żywicy i olejków eterycznych.

Zgodnie z polskim opisem patentowym nr PL 187493 metodą wysokociśnieniowej homogenizacji można otrzymać nanoemulsję typu olej w wodzie, obejmującą lipidową fazę amfifilową, w której krople oleju mają średni rozmiar niższy niż 150 nm.

Do drugiej grupy “low energy emulsificatin methods“ zalicza się najtańszą i najczęściej stosowaną metodę spontanicznej emulsyfikacji, zwaną również metodą miareczkowania, poszczególnych

PL 226 873 B1 składników nanoemulsji w prostych homogenizatorach, która znajduje powszechne zastosowanie w poniższych opisach patentowych.

W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO2006028339 opisano nanoemulsję zawierającą polioksypropylenowaną-polioksyetylenowaną witaminę E jako emulgator oraz kopolimery kwasu poliakrylowego lub ich pochodne, jako ko-surfaktanty, charakteryzującą się wysoką stabilnością i bardzo małym rozmiarem kropel fazy zdyspergowanej (od 43 do 96 nm).

Zgodnie z amerykańskim opisem patentowym nr US2007237731 znana jest nanoemulsja stabilizowana mieszaniną trzech emulgatorów w odpowiednich proporcjach, stabilna w wysokiej temperaturze i kompatybilna z wieloma różnymi składnikami kompozycji kosmetycznych; wytwarzana metodą „na zimno”, co umożliwia solubilizację składników aktywnych nie odpornych na wysoką temperaturę.

Z amerykańskiego opisu patentowego nr US2009118380 znany jest niskoenergetyczny sposób wytwarzania stabilnych nanoemulsji, charakteryzujący się tym, że emulgator stanowi mieszanina związków powierzchniowo czynnych o różnym wskaźniku HLB (Hydrophilic Lipophilic Balance - równowaga hydrofilowo-hydrofobowa), wybranych z grupy związków niejonowych, anionowych, polimerycznych.

W znanych z europejskiego opisu patentowego nr WO2009067734 nanoemulsjach, fazę olejową stanowią trójglicerydy o długości łańcucha alkilowego 12 atomów węgla i więcej, natomiast emulgator wybrany jest z grupy związków niejonowych, dla których liczba HLB wynosi, co najmniej 7.

Jedną z odmian metod spontanicznej emulsyfikacji, dzięki której można otrzymać stabilną nanoemulsję jest tzw. „crash dilution metod”, metoda gwałtownych rozcieńczeń. Technika ta opisana przez L. Wang et al. [Journal of Colloid and Interface Science 314, 2007, 230-235] oraz [Langmuir, 24, 2008, 6092-6099], polega na otrzymywaniu nanoemulsji olej wodzie w wyniku gwałtownego rozcieńczenia mikroemulsji dwuciągłej lub typu o/w o odpowiednim składzie. Technikę tę zastosowano w amerykańskim opisie patentowym nr US2010/0041629. Do metod wymagających niskich nakładów energii zaliczyć można także proces temperaturowej inwersji fazowej (ang. phase invertion temperature - PIT), którą stosuje się do otrzymywania nanoemulsji stabilizowanych niejonowymi oksyetylenowanymi emulgatorami. Mimo że metoda ta jest jednak dość skomplikowana, to jednak jest stosowana w wymienionej poniżej literaturze patentowej.

W amerykańskim opisie patentowym nr US2007160651 scharakteryzowano nanoemulsje zawierające alkilo- lub alkenylooligoglukozydy kwasów karboksylowych jako emulgator a ich średnica kropel fazy zdyspergowanej mieści się w przedziale od 20 do 250 nm.

Znane z europejskiego opisu patentowego nr W02009121069 nanoemulsje zawierają, co najmniej jeden związek powierzchniowo czynny wybrany z grupy surfaktantów polioksyetylenowanych, zdolnych do wywołania inwersji faz w wyniku zmian temperatury.

W literaturze patentowej spotka się również połączenie metody PIT z metodą wysokociśnieniowej homogenizacji.

Znane z amerykańskiego opisu patentowego nr US6375960B1 stabilne i transparentne nanoemulsje, zawierają co najmniej jeden surfaktant występujący w stanie stałym w temperaturze niższej bądź równej 45°C, wybrany z grupy oksyetylenowanych eterów, estrów kwasów tłuszczowych lub ich mieszaniny, oraz co najmniej jeden olej o masie molowej powyżej 400 g/mol, stanowiący fazę olejową; przy czym stosunek wagowy oleju do wody waha się w granicach od 2 do 10.

Z amerykańskiego opisu patentowego nr US2009208541 znane są nanoemulsje typu olej w wodzie o wielkości kropel od 50 do 200 nm, stabilizowane mieszaniną związków, w skład których wchodzą: polioksyetylenowane etery nasyconych alkoholi tłuszczowych (20 oraz 12 jednostek oksyetylenowych), stearynian glicerolu, alkohol cetearylowy i palmitynian cetylu, wytwarzane w oparciu o metodę PIT połączoną z wysokociśnieniową homogenizacją.

Metody oparte na stosowaniu wysokociśnieniowej homogenizacji lub metodzie PIT okazały się być kosztowne i skomplikowane. Zgodnie z powyższym, istnieje potrzeba znalezienia innego rodzaju emulgatorów oraz odpowiednio dobranych, farmaceutycznie wskazanych, faz olejowych, tworzących jednocześnie stabilne i biolokompatybilne formulacje przy zastosowaniu prostej i taniej metody spontanicznej emulsyfikacji z użyciem zwykłych homogenizatorów. Metodę tę można dodatkowo wspomóc zastosowaniem niedrogich łaźni ultradźwiękowych w celu uzyskania nośników o rozmiarach nanoskopowych. Stabilne i nietoksyczne układy nanoemulsyjne w połączeniu z małym rozmiarem cząstek przy dużej ładowności i z szybką preparatyką stają się atrakcyjnymi mediami do solubilizacji cząstek, a tym samym zastosowania jako nośników leków w różnych terapiach w tym, przeciwrakowych.

PL 226 873 B1

W literaturze przedmiotu nie są znane sposoby wytwarzania zespolonymi metodami, spontanicznej emulsyfikacji i sonifikacji, niejonowych nanoemulsji stabilizowanych polioksyetylenowymi surfaktantami przy użyciu biokompatybilnych faz olejowych, mających biologiczny potencjał do zastosowania jako nośników substancji aktywnych (np. fotouczulaczy) w terapiach antynowotworowych.

Istotą wynalazku jest sposób wytwarzania nanoemulsji typu olej w wodzie, polegający na tym, że miesza się związek powierzchniowo czynny w postaci surfaktantu niejonowego w proporcji od 1 do 40% wagowych, wybranego spośród emulgatorów polioksyetylenowanych, z fazą olejową, wybraną spośród biokompatybilnych olejów z grupy naturalnych olejów roślinnych lub estrów izopropylowych kwasów tłuszczowych, w zakresie 0,1-20% wag. i fazą wodną w zakresie 60-99% wag., a następnie mieszaninę poddaje się działaniu ultradźwięków i otrzymuje półprzezroczystą nanoemulsję.

Korzystnie, jako związek powierzchniowo czynny stosuje się monooleinian polioksyetylenosorbitolu lub monolaurynian polioksyetylenosorbitolu.

Korzystnie, jako fazę olejową stosuje się olej sojowy lub mirystynian izopropylu (IPM).

Korzystnie, mieszaninę poddaje się działaniu ultradźwięków przez okres od 10 do 30 min.

w temperaturze pokojowej.

Korzystnie, mieszaninę poddaje się działaniu ultradźwięków przez 20 min.

Zasadniczą zaletą układów nanoemulsyjnych, wytworzonych sposobem według wynalazku, jest wysoka stabilność kinetyczna, jednorodność, mała lepkość oraz wysoka pojemność załadunkowa pożądaną substancją aktywną jak np. fotouczulacz, który może być solubilizowany w ciekłym olejowym rdzeniu nanoemulsji. Co więcej nanoemulsje wytworzone sposobem według wynalazku charakteryzują się minimalną polidyspersyjnością oraz nanoskopowym rozmiarem (<300 nm) idealnym do zastosowania ich jako nośniki leków w terapii antynowotworowej. Dodatkowo antynowotworowy potencjał i możliwość zastosowania w terapii fotodynamicznej został udowodniony za pomocą niskiej aktywności hemolitycznej oraz minimalnej cytotoksyczności nanoemulsji, załadowanych przykładową substancją fotouczulającą-cyjaniną IR-786 iodide wobec modelowych linii komórkowych nowotworu piersi: MCF-7.

Ponadto, dodatkową korzyść stanowi dogodne wytwarzanie nanoskopowych formulacji typu olej w wodzie (o/w), tanią metodą, bez konieczności stosowania dużych nakładów energii. Formulacje te stanowią bardzo dobrą formułę bazową dla wielu zastosowań farmaceutycznych i również kosmetycznych, jako nośniki trudno rozpuszczalnych związków hydrofobowych.

Przedmiot wynalazku objaśniony jest w przykładach wytwarzania nanoemulsji stabilizowanych surfaktantami niejonowymi typu polioksyetylatów oraz na rysunku, na którym na fig. 1-3 przedstawiono trójskładnikowe diagramy fazowe, w oparciu, o które wyznacza się obszary występowania nanoemulsji (Ne), E-obszar emulsyjny, 2F-obszar dwufazowy.

Charakterystykę nanoemulsji: składy, średnicę hydrodynamiczną (DH) oraz współczynnik polidyspersyjności (Pdl) przedstawiono w Tabeli 1.

T a b e l a 1

Skład oraz parametry opisujące otrzymane układy nanoemulsyjne

Nr próbki	Nanoemulsja	skład [%]	Dh [nm]	Pdl
surfaktant	olej	woda
1	mirystynian izopropylu /Tween 20/ woda	5	2	93	149,9	0,073
2	mirystynian izopropylu /Tween 20/ woda	10	2	88	114,0	0,134
3	mirystynian izopropylu /Tween 80/ woda	5	2	93	217,3	0,110
4	mirystynian izopropylu /Tween 80/ woda	10	2	88	172,4	0,155
5	olej sojowy /Tween 80/ woda	5	2	93	284,5	0,110
6	olej sojowy /Tween 80/ woda	10	2	88	247,9	0,107

Na figurach 4, 5, 6, przedstawiono odpowiednio przykładowe (dla nanoemulsji opisanych w przykładach I, II, V) pomiary średnicy hydrodynamicznej kapsuł uzyskany techniką dynamicznego rozpraszania światła (ang. Dynamie Light Scattering - DLS), zaś na fig. 7 pokazano medyczny potencjał wynalazku (przykładowe wyniki dla nanokapsuł również podanych w przykładach I, II, V) poprzez wykresy cytotoksyczności nanonośników będących przedmiotem wynalazku. Dokonano oceny cytotokPL 226 873 B1 syczności nanoemulsji wytworzonych sposobem według wynalazku, w komórkach MCF-7/WT testem MTT po 24 godzinnej inkubacji zadanych komórek w temperaturze 37°C.

Stwierdzono, że cytotoksyczność nanoemulsji mirystynian izopropylu /Tween 80/ woda, mirystynian izopropylu /Tween 20/ woda, jest niewielka w komórkach raka gruczołu sutkowego, przy dużych rozcieńczeniach badanych prób. Nanoemulsja olej sojowy /Tween 80/ woda jest bezpieczna w całym zakresie stosowanych rozcieńczeń (fig. 7).

W Tabeli 2 umieszczono wyniki hemolizy dla nanoemulsji wytworzonych sposobem według wynalazku, które pokazują ich niski potencjał hemolityczny, zwłaszcza w większych rozcieńczeniach, niezbędnych do zastosowań biologicznych.

T a b e l a 2

Właściwości hemolityczne charakteryzujące układy nanoemulsyjne

Nr próbki	Nanoemulsja	Objętość [μ]	PBS [μ]	Rozcieńczenie w zawiesinie RBC	A540	H [%]
		1,25	48,75	1:200	0,044	1
		1,40	48,60	1:175	0,047	1,3
	Olej sojowy /	1,70	48,30	1:150	0,048	1,3
	Tween 80/woda	2,0	48,00	1:125	0,048	1,5
1		2,5	47,50	1:100	0,050	1,7
		3,3	46,70	1:75	0,061	3
		5,0	45,00	1:50	0,071	4,2
		1,25	48,75	1:200	0,061	3
		1,40	48,60	1:175	0,110	9
	mirystynian	1,70	48,30	1:150	0,160	15
3	izopropylu /Tween 80/	2,0	48,00	1:125	0,300	32
	woda	2,5	47,50	1:100	0,432	48
		3,3	46,70	1:75	0,840	97
		5,0	45,00	1:50	0,863	100
		1,25	48,75	1:200	0,072	4,2
		1,40	48,60	1:175	0,090	6,5
	mirystynian	1,70	48,30	1:150	0,104	8,2
5	izopropylu /Tween 20/	2,0	48,00	1:125	0,114	9,5
	woda	2,5	47,50	1:100	0,152	14
		3,3	46,70	1:75	0,185	18
		5,0	45,00	1:50	0,243	25

Nanoemulsje wytworzone sposobem według wynalazku wykazują niski potencjał hemolityczny (Tabela 2) i brak efektu cytotoksycznego, zwłaszcza przy większych rozcieńczeniach w środowisku komórkowym. Można je zatem uznać za bezpieczne nośniki terapeutyków w układzie krążenia i ich nietoksyczność wobec docelowych komórek.

Uzyskane wyniki dowodzą niskiej cytotoksyczności nanoemulsji już po stukrotnym rozcieńczeniu, które przy aplikacjach biologicznych jest zwykle o wiele większe. Stanowi to tym samym o biokompatybilności nanokontenerów wytworzonych sposobem według wynalazku.

P r z y k ł a d I

Miesza się 0,20 g mirystynianu izopropylu (IPM), 0,50 g monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu (Tween 20) i 9,30 g wody destylowanej. Następnie, całość poddaje się działaniu ultradźwięków przez ok. 20 minut. Po tym czasie otrzymuje się opalizującą nanoemulsję o zawartości fazy olejowej 2% wag. oraz emulgatora 5% wag., której średnica hydrodynamiczna kropel DH wynosi 149,9 nm, a współczynnik polidyspersyjności (Pdl) równy jest 0,073.

P r z y k ł a d II

Miesza się 0,20 g mirystynianu izopropylu (IPM), 1,0 g monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu (Tween 20) i 8,80 g wody destylowanej. Następnie, całość poddaje się działaniu ultradźwięków przez ok. 20 minut. Po tym czasie otrzymuje się opalizującą nanoemulsję o zawartości fazy olejowej 2% wag. oraz emulgatora 10% wag., w której średnica hydrodynamiczna kropel DH wynosi 114,0 nm, a współczynnik polidyspersyjności (Pdl) równy jest 0,134.

P r z y k ł a d III

Miesza się 0,20 g mirystynianu izopropylu (IPM), 0,50 g monooleinianu polioksyetylenosorbitolu (Tween 80) i 9,30 g wody destylowanej. Następnie, całość poddaje się działaniu ultradźwięków

PL 226 873 B1 przez ok. 20 minut. Po tym czasie otrzymuje się opalizującą nanoemulsję o zawartości fazy olejowej 2% wag. oraz emulgatora 5% wag., w której średnica hydrodynamiczna kropel DH wynosi 217,3 nm, a współczynnik polidyspersyjności (Pdl) równy jest 0,110.

P r z y k ł a d IV

Miesza się 0,20 g mirystynianu izopropylu (IPM), 10 g monooleinianu polioksyetylenosorbitolu (Tween 80) i 8,80 g wody destylowanej. Następnie, całość poddaje się działaniu ultradźwięków przez ok. 20 minut. Po tym czasie otrzymuje się opalizującą nanoemulsję o zawartości fazy olejowej 2% wag. oraz emulgatora 10% wag, w której średnica hydrodynamiczna kropel DH wynosi 172,4 nm, a współczynnik polidyspersyjności (PdI) równy jest 0,155.

P r z y k ł a d V

Miesza się 0,20 g oleju sojowego, 0,50 g monooleinianu polioksyetylenosorbitolu (Tween 80) i 9,30 g wody destylowanej. Następnie, całość poddaje się działaniu ultradźwięków przez ok. 20 minut. Po tym czasie otrzymuje się opalizującą nanoemulsję o zawartości fazy olejowej 2% i wag. oraz emulgatora 5% wag., w której średnica hydrodynamiczna kropel DH wynosi 284,5 nm, a współczynnik polidyspersyjności (Pdl) równy jest 0,110.

P r z y k ł a d VI

Miesza się 0,20 g oleju sojowego, 1,0 g monooleinianu polioksyetylenosorbitolu (Tween 80) i 8,80 g wody destylowanej. Następnie, całość poddaje się działaniu ultradźwięków przez ok. 20 minut. Po tym czasie otrzymuje się opalizującą nanoemulsję o zawartości fazy olejowej 2% wag. oraz emulgatora 10% wag., w której średnica hydrodynamiczna kropel DH wynosi 247,9 nm, a współczynnik polidyspersyjności (Pdl) równy jest 0,107.

Claims (5)

1. Sposób wytwarzania nanoemulsji typu olej w wodzie, znamienny tym, że miesza się związek powierzchniowo czynny w postaci surfaktantu niejonowego w proporcji od 1 do 40% wag., wybranego spośród emulgatorów polioksyetylenowanych, z fazą olejową, wybraną spośród biokompatybilnych olejów z grupy naturalnych olejów roślinnych lub estrów izopropyłowych kwasów tłuszczowych, w zakresie 0,1-20% wag. i fazą wodną w zakresie 60-99% wag., a następnie mieszaninę poddaje się działaniu ultradźwięków i otrzymuje półprzezroczystą nanoemulsję.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako związek powierzchniowo czynny stosuje się monooleinian polioksyetylenosorbitolu lub monolaurynian polioksyetylenosorbitolu.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako fazę olejową stosuje się olej sojowy lub mistrynian izopropylu.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszaninę poddaje się działaniu ultradźwięków przez okres od 10 do 30 min. w temperaturze pokojowej.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszaninę poddaje się działaniu ultradźwięków przez 20 min.