PL225342B1 - Sposób monitorowania stopnia pokrycia żywymi komórkami, zwłaszcza komórkami śródbłonka ludzkiego, powierzchni kapilarnych membran półprzepuszczalnych, zamkniętych w bioreaktorze - Google Patents

Abstract

Sposób monitorowania stopnia pokrycia żywymi komórkami, zwłaszcza komórkami śródbłonka ludzkiego, powierzchni kapilarnych membran półprzepuszczalnych, zamkniętych w bioreaktorze, polega na tym, że w ustalonych odstępach czasowych od 20 minut do 96 godzin, mierzy się przepuszczalność membran kapilarnych z osadzonymi na powierzchni komórkami, określając zmiany w czasie tej przepuszczalności w ten sposób, że przepuszczalność membran określa się mierząc parametry związane matematycznie z wartością ciśnienia transmembranowego (PTM), określanego zgodnie ze wzorem (1). PTM=P1-P2 (1) gdzie: P1 - wartość ciśnienia zmierzona w wewnętrznym kompartmencie kapilar, P2 - wartość ciśnienia zmierzona w zewnętrznym kompartmencie kapilar.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób monitorowania w czasie prowadzenia hodowli, stopnia pokrycia żywymi komórkami, zwłaszcza komórkami śródbłonka ludzkiego, powierzchni membran półprzepuszczalnych zwłaszcza kapilarnych zamkniętych w bioreaktorze, polegający na pomiarze zmian przepuszczalności tych membran dla płynu (medium hodowlanego) przy wykorzystaniu pomiaru ciśnienia transmembranowego, nie powodującego apoptozy komórek.

Ocena stanu materiału biologicznego osadzonego na powierzchniach membran półprz epuszczalnych umieszczonych w zamkniętej konstrukcji bioreaktora jest przypadkiem szczególnie trudnym ze względu na to, że konstrukcja bioreaktora uniemożliwia bezpośrednią obserwację komórek.

Dotychczas do oceny stanu materiału biologicznego hodowanego w naczyniach hodowlanych opracowano wiele metod, np.: metody określające integralność błon komórkowych (np. przy użyciu barwnika błękit trypanu), analizujące potencjał błon mitochondrialnych (np. przy wykorzystaniu barwnika JC-1), zawartość białek w populacji komórek (np. metody kolorymetryczne), ocena współczynnika proliferacyjnego (np. cytometryczna analiza DNA), ocenę żywotności (np. analiza MTT oceniająca aktywność przemian energetycznych w mitochondriach), ocenę aktywności metabolicznej komórek (np. analiza fosforylacji i defosforylacji enzymów wewnątrzkomórkowych), ocenę stanu hodowli przy wykorzystaniu obserwacji mikroskopowej po zakończeniu hodowli i wybarwieniu jąder komórek barwnikami (np. hematoxyliną, DAPI, bromkiem etydyny, jodkiem propidyny) i/lub cytoplazmy (np. dwuoctanem fluoresceiny, eozyną), stanu funkcjonalnego komórek (analiza ekspresji genów na poziomie RNA). Metody te mogą być wykorzystane do oceny stanu biologicznego żywych komórek osadzonych na wewnętrznych powierzchniach membran kapilarnych umieszczonych w zamkniętej konstrukcji bioreaktora, ale jako skutek uboczny przeprowadzanej analizy komórki zwykle podlegają apoptozie (przykładowy opis monitoringu związanego z apoptozą komórek: Janke D, Jankowski J, Ruth M, Buschmann I, Lemke H-D, et al. The „Artificial Artery” as In Vitro Perfusion Model. PLoS ONE (2013) 8(3): e57227). W wyniku przeprowadzonej w taki sposób oceny niemożliwe jest prowadzenie docelowych badań na opracowanym modelu (np. badania biotoksyczności leków), w którym żywe komórki mają pokrywać wewnętrzną część membran kapilarnych. Inną opisaną w literaturze metodą monitoringu hodowli nie powodującą śmierci komórek w bioreaktorze kapilarnym jest zastosowanie analizy Alamar Blue (analiza aktywności metabolicznej polegająca na zastosowaniu resauryny o barwie niebieskiej, która w procesach oksydoredukcyjnych jest przekształcana przez komórkę w resorufinę o mocno czerwonej fluorescencji), która zakłóca warunki prowadzenia hodowli - jest związana z zatrzymaniem wzrostu komórek do momentu, usunięcia z nich barwnika (H. Gloeckner et al. Monitoring of cell viability and cell growth in a hollow-fiber bioreactor by use of the dye Alamar Blues. Journal of Immunological Methods, 252(2001) 131-138). Jedyną znaną metodą oceny aktywności metabolicznej komórek w bioreaktorze kapilarnym nie mającą wpływu na jakość hodowli jest oznaczenie zużycia przez komórki glukozy i produkcji mleczanu z próbek pobranych z medium hodowlanego. Metoda ta jednak nie daje jednoznacznej odpowiedzi o stopniu pokrycia powierzchni wewnętrznych membran kapilarnych przez komórki. Zgodnie z wiedzą autorów żadna ze znanych metod nie opiera się na sposobie opisanym w niniejszym wynalazku.

Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest opracowanie metody pozwalającej na monitorowanie, zwłaszcza w sposób quasi ciągły, w czasie trwania hodowli, stopnia pokrycia komórkami, zwłas zcza komórkami śródbłonka ludzkiego, powierzchni wewnętrznych i/lub zewnętrznych membran kapilarnych umieszczonych w zamkniętej konstrukcji bioreaktora poprzez pomiar zmian przepuszczalności membran w czasie.

Sposób monitorowania stopnia pokrycia żywymi komórkami, zwłaszcza komórkami śródbłonka ludzkiego, powierzchni kapilarnych membran półprzepuszczalnych, zamkniętych w bioreaktorze, według wynalazku, polega na tym, że w ustalonych odstępach czasowych, wynoszących od 20 minut do 96 godzin, w zależności od rodzaju osadzanych żywych komórek i szybkości ich rozprzestrzeniania się na powierzchni membran, mierzy się przepuszczalność membran kapilarnych z osadzonymi na powierzchni komórkami, określając zmiany w czasie tej przepuszczalności, poprzez mierzenie parametrów związanych matematycznie z wartością ciśnienia transmembranowego (PTM) określanego zgodnie ze wzorem (1).

PL 225 342 B1

PTM = P1 - P2 (1) gdzie:

P1 - wartość ciśnienia zmierzona w wewnętrznym kompartmencie kapilar,

P2 - wartość ciśnienia zmierzona w zewnętrznym kompartmencie kapilar.

Sposób według wynalazku, korzystnie polega na tym, że monitorowanie prowadzi się w sposób quasi - ciągły polegający na powtarzającym się, w określonych momentach pomiarowych, blokowaniu, zgodnie z fig. 7, przepływu bezpośrednio za kompartmentem wewnętrznym kapilar w miejscu A, mającym na celu przeforsowanie tego przepływu przez pory w strukturze kapilar z kompartmentu wewnętrznego kapilar do ich kompartmentu zewnętrznego. Pompa kompartmentu zewnętrznego kapilar jest na czas pomiaru zatrzymywana, a wejście B do kompartmentu zewnętrznego kapilar jest blokowane zgodnie z fig. 7.

Sposób według wynalazku, korzystnie polega na tym, że monitorowanie prowadzi się w układzie z krążącym medium, w połączonych, zwłaszcza zamkniętych, obwodach zewnętrznym i wewnętrznym, jak pokazano na fig. 1.

Sposób według wynalazku, korzystnie polega na tym, że monitorowanie prowadzi się w układzie z krążącym medium w połączonych, zwłaszcza otwartych, obwodach zewnętrznym i wewnętrznym, jak pokazano na fig. 2.

Sposób według wynalazku, korzystnie polega na tym, że monitorowanie prowadzi się w układzie z krążącym medium w niezależnych zwłaszcza zamkniętych obwodach zewnętrznym i wewnętrznym, jak pokazano na fig. 3.

Sposób według wynalazku, korzystnie polega na tym, że monitorowanie prowadzi się w układzie z krążącym medium w niezależnych zwłaszcza otwartych obwodach zewnętrznym i wewnętrznym, jak pokazano na fig. 4.

Sposób według wynalazku, korzystnie polega na tym, że monitorowanie prowadzi się w układzie z krążącym medium w niezależnych otwarto-zamkniętych obwodach, zwłaszcza otwartym obwodzie zewnętrznym i zamkniętym obwodem wewnętrznym, jak pokazano na fig. 5.

Sposób według wynalazku, korzystnie polega na tym, że monitorowanie prowadzi się w układzie z krążącym medium w niezależnych zamknięto-otwartych obwodach, zwłaszcza zamkniętym obwodzie zewnętrznym i otwartym obwodzie wewnętrznym, jak pokazano na fig. 6.

Sposób według wynalazku, korzystnie polega na tym, że monitorowanie prowadzi się w sposób ręczny lub automatyczny.

Sposób według wynalazku, korzystnie polega na tym, że jako pomiar parametru związanego matematycznie z wartością ciśnienia transmembranowego, prowadzi się pomiar czasu osiągnięcia ustalonej dla wszystkich kolejnych pomiarów takiej samej wartości wzorcowej założonej różnicy ciśnienia transmembranowego (APTMw).

Sposób według wynalazku, korzystnie polega na tym, że jako pomiar parametru związanego matematycznie z wartością ciśnienia transmembranowego, prowadzi się pomiar wartości różnicy c iśnienia transmembranowego (APTM) przez ten sam ustalony dla wszystkich kolejnych pomiarów, wzorcowy czas mierzony od momentu zblokowania przepływu płynu wzdłuż osi kapilar, za wyjściem bioreaktora.

Sposób według wynalazku, korzystnie polega na tym, że podczas kolejnych pomiarów, po ustabilizowaniu się wartości ciśnienia transmembranowego, jako pomiar parametru związanego matem atycznie z wartością ciśnienia transmembranowego, mierzy się wartość współczynnika ultrafiltracji, zgodnie ze wzorem 2.

UFC =

Q_P

S*PTM (2) gdzie:

Qp - objętość zwłaszcza medium hodowlanego przepływającego w jednostce czasu w kierunku poprzecznym do powierzchni membrany zmierzona po ustabilizowaniu się ciśnienia transmembranowego PTM

S - powierzchnia membrany

PTM - ciśnienie transmembranowe zgodne z wzorem 1.

Sposób według wynalazku, korzystnie polega na tym, że podczas kolejnych pomiarów wykonywanych w czasie prowadzenia hodowli dobiera się wartość przepływu Q_p tak, aby ustabilizowana war4

PL 225 342 B1 tość ciśnienia transmembranowego PTM osiągnęła za każdym razem taką samą ustaloną wcześniej wartość wzorcową.

Sposób, według wynalazku, korzystnie polega na tym, że podczas kolejnych pomiarów jako pomiar parametru związanego matematycznie z wartością ciśnienia transmembranowego, mierzy się ustabilizowaną wartość ciśnienia transmembranowego dla takiej samej ustalonej wcześniej wzorcowej wartości przepływu Q_p.

W sposobie według wynalazku, korzystnie odstępy czasowe ustala się w trakcie hodowli zależnie od szybkości zmian przepuszczalności membrany, tzn. są zwiększane, gdy zmiany przepuszczalności są wolniejsze i zmniejszane, gdy są one szybsze, zależnie od wymaganej dokładności interpolacji zmian przepuszczalności.

Osadzone komórki na powierzchniach membran, zanim bioreaktor zostanie wykorzystany do planowanych na nim badań, mogą rozmnażać się, migrować, zmieniać kształt i wytwarzać połączenia pomiędzy sobą w celu utworzenia jednorodnej warstwy. Wraz z wytwarzaniem połączeń pomiędzy komórkami przepuszczalność membran zmienia się, zwłaszcza zwiększa się w przypadku użycia do badania medium hodowlanego zawierającego w swoim składzie białka.

Bioreaktor z osadzonymi komórkami podłącza się do obwodu cyrkulacyjnego wypełnionego przepływającym w sposób ciągły medium hodowlanym do układów:

- zamkniętych, zwłaszcza układu hodowlanego cyrkulacyjnego z bioreaktorem z połączonymi zamkniętymi obwodami cyrkulacyjnymi zewnętrznym i wewnętrznym, jak pokazano na fig. 1,

- zamkniętych, zwłaszcza układu hodowlanego cyrkulacyjnego z bioreaktorem z oddzielnymi zamkniętymi obwodami cyrkulacyjnymi zewnętrznym i wewnętrznym, jak pokazano na fig. 3,

- otwartych, zwłaszcza układu hodowlanego cyrkulacyjnego z bioreaktorem z połączonymi otwartymi obwodami cyrkulacyjnymi zewnętrznym i wewnętrznym, jak pokazano na fig. 2,

- otwartych, zwłaszcza układu hodowlanego cyrkulacyjnego z bioreaktorem z oddzielnymi otwartymi obwodami cyrkulacyjnymi zewnętrznym i wewnętrznym, jak pokazano na fig. 4,

- otwarto-zamkniętych, zwłaszcza układu hodowlanego cyrkulacyjnego z bioreaktorem z oddzielnymi obwodami cyrkulacyjnymi zewnętrznym i wewnętrznym, przy czym obwód zewnętrzny jest otwarty, a wewnętrzny zamknięty, jak pokazano na fig. 5,

- zamknięto-otwartych, zwłaszcza układu hodowlanego cyrkulacyjnego z bioreaktorem z oddzielnymi obwodami cyrkulacyjnymi zewnętrznym i wewnętrznym, przy czym obwód zewnętrzny jest zamknięty, a wewnętrzny otwarty, jak pokazano na fig. 6.

Przepływ w kompartmencie zewnętrznym kapilar może być zgodny lub przeciwny do kierunku przepływu w kompartmencie wewnętrznym kapilar zależnie od wymagań hodowli. Wartości przepływów w tych kompartmentach mogą być identyczne lub różne zgodnie z wymaganiami hodowli.

Na fig. 1, przedstawiono schemat układu hodowlanego cyrkulacyjnego z bioreaktorem z połączonymi zamkniętymi obwodami cyrkulacyjnymi zewnętrznym i wewnętrznym, gdzie 1 oznacza wejście do kompartmentu wewnętrznego kapilar, 2 oznacza wejście do kompartmentu zewnętrznego kapilar, 3 oznacza wyjście z kompartmentu zewnętrznego kapilar, 4 oznacza wyjście z kompartmentu wewnętrznego kapilar. Punkty oznaczone jako 1, 2, 3, 4 oraz powierzchnia medium w zbiorniku wyrównawczym i wlot medium do zbiornika z medium hodowlanym w chwili rozpoczęcia pomiarów m uszą znajdować się w tej samej płaszczyźnie poziomej.

Na fig. 2, przedstawiono schemat układu hodowlanego cyrkulacyjnego z bioreaktorem z połączonymi otwartymi obwodami cyrkulacyjnymi zewnętrznym i wewnętrznym. 1 oznacza wejście do kompartmentu wewnętrznego kapilar, 2 oznacza wejście do kompartmentu zewnętrznego kapilar, 3 oznacza wyjście z kompartmentu zewnętrznego kapilar, 4 oznacza wyjście z kompartmentu wewnętrznego kapilar. Punkty oznaczone jako 1, 2, 3, 4 oraz powierzchnia medium w zbiorniku wyrównawczym i wlot medium do zbiornika z medium hodowlanym wyjściowym w chwili rozpoczęcia pomiarów muszą znajdować się w tej samej płaszczyźnie poziomej.

Na fig. 3, przedstawiono schemat układu hodowlanego cyrkulacyjnego z bioreaktorem, z oddzielnymi zamkniętymi obwodami cyrkulacyjnymi zewnętrznym i wewnętrznym. 1 oznacza wejście do kompartmentu wewnętrznego kapilar, 2 oznacza wejście do kompartmentu zewnętrznego kapilar, 3 oznacza wyjście z kompartmentu zewnętrznego kapilar, 4 oznacza wyjście z kompartmentu wewnętrznego kapilar. Punkty oznaczone jako 1, 2, 3, 4 oraz powierzchnia medium w zbiorniku wyrówPL 225 342 B1 nawczym i wlot medium do zbiornika z medium hodowlanym w chwili rozpoczęcia pomiarów muszą znajdować się w tej samej płaszczyźnie poziomej.

Na fig. 4, przedstawiono schemat układu hodowlanego cyrkulacyjnego z bioreaktorem z oddzielnymi otwartymi obwodami cyrkulacyjnymi zewnętrznym i wewnętrznym. 1 - wejście do kompartmentu wewnętrznego kapilar, 2 - wejście do kompartmentu zewnętrznego kapilar, 3 - wyjście z kompartmentu zewnętrznego kapilar, 4 - wyjście z kompartmentu wewnętrznego kapilar. Punkty oznaczone jako 1, 2, 3, 4 oraz powierzchnia medium w zbiorniku wyrównawczym i wlot medium do zbiornika z medium hodowlanym wyjściowym w chwili rozpoczęcia pomiarów muszą znajdować się w tej samej płaszczyźnie poziomej.

Na fig. 5, przedstawiono schemat układu hodowlanego cyrkulacyjnego z bioreaktorem z oddzielnymi obwodami cyrkulacyjnymi zewnętrznym i wewnętrznym, przy czym obwód zewnętrzny jest otwarty, a wewnętrzny zamknięty. 1 - wejście do kompartmentu wewnętrznego kapilar, 2 - wejście do kompartmentu zewnętrznego kapilar, 3 - wyjście z kompartmentu zewnętrznego kapilar, 4 - wyjście z kompartmentu wewnętrznego kapilar. Punkty oznaczone jako 1, 2, 3, 4 oraz powierzchnia medium w zbiorniku wyrównawczym i wlot medium do zbiornika z medium hodowlanym wyjściowym w chwili rozpoczęcia pomiarów muszą znajdować się w tej samej płaszczyźnie poziomej.

Na fig. 6, przedstawiono schemat układu hodowlanego cyrkulacyjnego z bioreaktorem z oddzielnymi obwodami cyrkulacyjnymi zewnętrznym i wewnętrznym, przy czym obwód zewnętrzny jest zamknięty, a wewnętrzny otwarty. 1 - wejście do kompartmentu wewnętrznego kapilar, 2 - wejście do kompartmentu zewnętrznego kapilar, 3 - wyjście z kompartmentu zewnętrznego kapilar, 4 - wyjście z kompartmentu wewnętrznego kapilar. Punkty oznaczone jako 1, 2, 3, 4 oraz powierzchnia medium w zbiorniku wyrównawczym i wlot medium do zbiornika z medium hodowlanym w chwili rozpoczęcia pomiarów muszą znajdować się w tej samej płaszczyźnie poziomej z medium hodowlanym w chwili rozpoczęcia pomiarów muszą znajdować się w tej samej płaszczyźnie poziomej.

Jak pokazano na fig. 7 pomiaru dokonuje się korzystnie, poprzez zatrzymanie przepływu w kompartmencie zewnętrznym kapilar, zmianę przepływu w kompartmencie wewnętrznym kapilar Q_w do odpowiednio ustalonej przez badacza wartości Q_p, zblokowanie bezpośrednio za wyjściem kapilar przepływu medium hodowlanego (lub innego płynu) Q_p w kompartmencie wewnętrznym kapilar w celu wymuszenia przepływu Q_p przez pory membran, zwłaszcza w kierunku prostopadłym do ich powierzchni.

Schemat układu hodowlanego pomiarowego z zamkniętym wyjściem z kompartmentu wewnętrznego kapilar A i zamkniętym wejściem do kompartmentu zewnętrznego kapilar B, który może być stosowany do wszystkich podłączeń układu hodowlanego przedstawionego na fig. 1 do fig. 6. Na rysunku pokazano tylko fragment układu, który jest identyczny dla wszystkich podłączeń układu hodowlanego.

Dla każdego z układów przedstawionych na fig. 1 do fig. 6 można dokonywać pomiarów zwłaszcza w układzie przestawionym na fig. 7.

Przepuszczalność membran określa się mierząc parametry związane matematycznie z wartością ciśnienia transmembranowego PTM określanego zgodnie ze wzorem (1).

Korzystnie, parametry powiązane matematycznie z wartością ciśnienia transmembranowego, które mierzy się w odstępach czasowych od 20 minut do 96 godzin w celu określenia zmiany przepuszczalności membrany w czasie to:

I. Pomiar czasu At, koniecznego do osiągnięcia określonej przez badacza, wzorcowej założonej wartości różnicy ciśnień transmembranowych APTM_w po zblokowaniu wyjścia kapilar w miejscu A zgodnie z fig. 7, korzystnie od 1 mmHg, do 50 mmHg, stałej dla wszystkich kolejnych pomiarów, przy czym zmieniający się podczas kolejnych pomiarów czas konieczny do osiągnięcia tej wartości różnicy ciśnień transm embranowych APTM_w, świadczy o zmianie przepuszczalności membrany. Czas ten określa się zgodnie ze wzorem 3:

Δ t = t p _{τ M 0}+_Δρ τ Mw — t p _{T M 0} (3) gdzie:

t_PTMo - czas w którym rozpoczęto pomiar - zblokowano wyjście kapilar w miejscu A zgodnie z fig. 7, a w którym ciśnienie transmembranowe było równe PTM₀ tp_TMo+_Ap_TMw - czas, w którym ciśnienie transmembranowe PTM zmieniło się od wartości równej PTM₀ w chwili rozpoczęcia pomiaru do wartości PTM₀+APTM_w.

PL 225 342 B1

Parametrem, który stanowi miarę przepuszczalności membrany jest współczynnik ultrafiltracji UFC (wzór 2), ale pozostałe 4 parametry, których monitorowanie opisano w zgłoszeniu są także związane z UFC. Na przykład, przy pomiarze At im większa wartość UFC, tym większa część medium, które dostarczone jest przez pompę do zbiorniczka wyrównawczego na wejściu do kapilar w jednostce czasu - wypłynie przez membrany do obwodu zewnętrznego i tym dłużej trwało będzie narastanie ciśnienia transmembranowego do osiągnięcia docelowej wartości PTM₀+PTM_w. W sposobie według wynalazku przedstawiono sposób mierzenia/wyznaczania 5 różnych parametrów, z których każdy z osobna może być wykorzystany jako wskaźnik stopnia przepuszczalności membrany zależnego od stopnia ich pokrycia komórkami. Żaden z tych 5 parametrów nie jest jednak miernikiem stopnia pokrycia membrany komórkami (a jedynie wskaźnikiem), tzn. jego konkretna wartość nie może być wprost uznana za wartość odpowiadającą np. pokryciu membrany komórkami w 50% czy 100%. Można jednak obserwując zmiany tych parametrów wnioskować o szybkości zmian stopnia pokrycia membrany i np. określić moment, w którym stopień ten przesiał się zmieniać. Dla konkretnego typu komórek, rodzaju bioreaktora, medium, warunków hodowli oraz parametrów pomiarowych stosując sposób według wynalazku można skalibrować wartości wybranego wskaźnika, aby móc używać go jako miernika.

II. Pomiar wartości różnicy ciśnień transmembranowych APTM, przez ten sam ustalony dla wszystkich kolejnych pomiarów wzorcowy okres Atw, dokonywany od momentu zblokowania przepływu płynu wzdłuż osi kapilar na ich wyjściu z bioreaktora A zgodnie z fig. 7, przy czym zmieniająca się w czasie kolejnych pomiarów wartość ciśnienia transmembranowego świadczy o zmianie przepuszczalności membrany.

Różnicę pomiędzy wartościami ciśnień transmembranowych APTM określa się zgodnie ze wzorem 4:

Δ ^p TM — ^p T M t0+Δ tw ^p T Mt 0 (⁴) gdzie:

PTM_t0 - ciśnienie transmembranowe zmierzone w momencie t₀, w którym rozpoczęto pomiar, tj. zblokowano wyjście kapilar w miejscu A zgodnie z fig. 7

PTM_t0+_Atw - ciśnienie transmembranowe zmierzone po upływie okresu wzorcowego Atw.

III. Pomiar wartości współczynnika ultrafiltracji, obliczanego zgodnie ze wzorem 2 po zblokowaniu wyjścia kapilar w miejscu A zgodnie z fig. 7 i po ustabilizowaniu się wartości ciśnienia transmembranowego - zmieniająca się wartość współczynnika ultrafiltracji podczas kolejnych pomiarów będzie wskazywała na zmianę przepuszczalności membrany. Wartość współczynnika UFC określa się zgodnie ze wzorem 2:

UFC =

Qp

S*PTM (5) gdzie:

Qp - objętość zwłaszcza medium hodowlanego przepływającego w jednostce czasu w kierunku poprzecznym do powierzchni membrany zmierzona po ustabilizowaniu się ciśnienia transmembranowego PTM

S - powierzchnia membrany

PTM - ciśnienie transmembranowe obliczane zgodnie ze wzorem 1 .

IV. Dobór wartości, przepływu Q_p podczas kolejnych pomiarów wykonywanych w czasie prowadzenia hodowli tak, aby ustabilizowana wartość ciśnienia transmembranowego po zblokowaniu wyjścia kapilar w miejscu A zgodnie z fig. 7, osiągnęła za każdym razem tę samą, ustaloną przez badacza wartość wzorcową od 1 mmHg do 50 mmHg, przy czym zmieniająca się wartość przepływu podczas kolejnych pomiarów wskazuje na zmianę przepuszczalności membrany, w tym przypadku parametr będący wskaźnikiem stopnia pokrycia membrany komórkami, tzn. wartość ciśnienia transmembranowego pochodzi bezpośrednio z pomiarów, w związku z tym nie jest on obliczany z żadnej zależności. Aczkolwiek wartość tego ciśnienia i przepływu, dla którego ciśnienie to jest uzyskiwane związane są ze sobą wzorem 2. Alternatywnie można potraktować tę metodę jako inny sposób wyznaczenia współczynnika UFC opisaną w pkt. III.

PL 225 342 B1

V. Pomiar ustabilizowanej wartości ciśnienia transmembranowego PTM dla stałej ustalonej przez badacza wartości wzorcowej przepływu Q_p dobranej z zakresu od 0,01 ml/min do ml/min - zmieniająca się podczas kolejnych pomiarów wartość ciśnienia transmembranowego będzie wskazywała na zmianę przepuszczalności membrany.

Wszystkie czynności związane z pomiarami i rejestracją mogą być wykonane w sposób zautomatyzowany lub ręczny.

Poniżej przedstawiono przykłady monitorowania stopnia pokrycia żywymi komórkami śródbłonka ludzkiego, powierzchni wewnętrznych półprzepuszczalnych membran zamkniętych w bioreaktorze, podczas których wykorzystano sposoby pomiarów opisanych w punktach I-VI. Dla opisanych niżej przykładów wszystkie czynności związane z pomiarami i rejestracją były wykonywane w sposób ręczny. Badania opisane w poniższych przykładach wykonano na medium hodowlanym zawierającym w swoim składzie 20% FBS (płodowej surowicy bydlęcej). Stopień pokrycia żywymi komórkami, powierzchni kapilarnych membran półprzepuszczalnych, zamkniętych w bioreaktorze dla wszystkich opisanych poniżej przykładów monitorowano co 3 h przez 48 h.

P r z y k ł a d I. Wykorzystanie do monitorowania stopnia pokrycia komórkami powierzchni membran półprzepuszczalnych pomiaru czasu At opisanego w punkcie I

1. Założenie hodowli komórek, podłączenie bioreaktora do zewnętrznego (połączonego z zewnętrzną częścią kapilar) i wewnętrznego (połączonego z wewnętrzną częścią kapilar) obwodu cyrkulacyjnego zgodnie z fig. 1-6 i uruchomienie przepływów w obydwóch obwodach cyrkulacyjnych o wartości Q_w = 17,8 ml/min.

2. Uruchomienie rejestracji pomiaru ciśnień wykorzystywanych do obliczenia wartości ciśnienia transmembranowego - P1 (P2=0) na fig. 7.

3. Zatrzymanie przepływu w zewnętrznym obwodzie cyrkulacyjnym.

4. Zblokowanie wejścia B (fig. 7) do kompartmentu zewnętrznego kapilar.

5. Zmiana przepływu płynu płynącego wzdłuż osi kapilar w ich wnętrzu Q_w do określonej przez badacza wartości Q_p = 0,1 ml/min.

6. Zblokowanie ujścia kapilar A (fig. 7) w celu wymuszenia przepływu Q_p przez ścianki kapilar z jednoczesnym uruchomieniem pomiaru czasu i zapisaniem wartości t_PTMo.

7. Zatrzymanie pomiaru czasu w momencie osiągnięcia ustalonej przez badacza stałej dla kolejnych pomiarów wzorcowej założonej wartości różnicy ciśnień, transmembranowych APTM_w = 20 mmHg i zapisanie zmierzonej wartości I_PTMo+_APTMw w protokole badania.

8. Odblokowanie ujścia kapilar A.

9. Zmiana wartości przepływu Q_p do wartości Q_w w celu przywrócenia optymalnych warunków hodowlanych.

10. Odblokowanie wejścia B (fig. 7) do kompartmentu zewnętrznego kapilar.

11. Uruchomienie przepływu w zewnętrznym obwodzie cyrkulacyjnym w celu przywrócenia optymalnych warunków hodowlanych.

12. Zatrzymanie rejestracji pomiaru ciśnień.

13. Obliczenie wartości At zgodnie ze wzorem 3.

Wymienione czynności w punktach 2-13 powtarzane były cyklicznie co 3 h przez pierwsze 48 h hodowli. Po zakończeniu monitorowania na podstawie otrzymanych danych sporządzono wykres zależności czasu At od czasu hodowli zgodny z fig. 8. Jak widać na zamieszczonym wykresie w ciągu pierwszych 6 h od założenia hodowli czas At wydłużał się gwałtownie, a od godziny 24. był stabilny. Wynik ten oznacza, że przez pierwsze 6 h hodowli przepuszczalność membrany zwiększała się w szybkim tempie, co wskazuje na gwałtowne rozprzestrzenianie się komórek na powierzchniach membran, a po 24 h hodowli przepuszczalność membrany ustabilizowała się, czyli rozprzestrzenianie się komórek uległo zahamowaniu.

P r z y k ł a d II. Wykorzystanie do monitorowania stopnia pokrycia komórkami powierzchni membran półprzepuszczalnych pomiaru wartości ciśnienia transmembranowego APTM opisanego w punkcie II

Punkty 1-5 są identyczne jak dla przypadku opisanego w przykładzie I.

6. Zblokowanie ujścia kapilar A (fig. 7) w celu wymuszenia przepływu Q_p przez ścianki kapilar z jednoczesnym uruchomieniem pomiaru czasu i zapisaniem w protokole badania wartości ciśnienia transmembranowego PTM_t0.

PL 225 342 B1

7. Zatrzymanie pomiaru czasu w momencie osiągnięcia ustalonej przez badacza stałej dla kolejnych pomiarów wzorcowej wartości czasu pomiaru ciśnienia transmembranowego Atw=30 s i zapisanie zmierzonej wartości ciśnienia transmembranowego

PTMt0+tw w protokole badania.

Punkty 8-12 są identyczne jak dla przypadku opisanego w przykładzie I.

13. Obliczenie wartości APTM zgodnie ze wzorem 4.

Wymienione czynności w punktach 2-13 powtarzane były cyklicznie co 3 h przez pierwsze 48 h hodowli. Po zakończeniu monitorowania na podstawie otrzymanych danych sporządzono wykres zależności różnicy pomiędzy wartościami ciśnień transmembranowych APTM od czasu hodowli zgodny z fig. 9. Jak widać na zamieszczonym wykresie w ciągu 6. pierwszych godzin od założenia hodowli wartość różnicy ciśnienia transmembranowego APTM zmniejszała się gwałtownie, a od godziny 24 była stabilna. Wynik ten oznacza że przez pierwsze 6 h hodowli przepuszczalność membrany zwiększała się, co wskazuje na gwałtowne rozprzestrzenianie się komórek na powierzchniach membran. W ciągu kolejnych 18 h tempo zmian APTM obniżyło się a po 24 h hodowli przepuszczalność membrany ustabilizowała się, czyli rozprzestrzenianie się komórek uległo wyhamowaniu.

P r z y k ł a d III. Wykorzystanie do monitorowania stopnia pokrycia komórkami powierzchni membran półprzepuszczalnych pomiaru wartości współczynnika ultrafiltracji UFC opisanego w punkcie III

Punkty 1-4 są identyczne jak dla przypadku opisanego w przykładzie I.

5. Zmiana przepływu płynu płynącego wzdłuż osi kapilar w ich wnętrzu Q_w do określonej przez badacza w tym przypadku dowolnej wartości Q_p z zakresu 0,1-0,3 ml/min.

6. Zblokowanie ujścia kapilar A (fig. 7) w celu wymuszenia przepływu Q_p przez ścianki kapilar.

7. Zapisanie zmierzonej ustabilizowanej wartości ciśnienia transmembranowego PTM w protokole badania.

Punkty 8-12 są identyczne jak dla przypadku opisanego w przykładzie I.

13. Obliczenie wartości UFC zgodnie ze wzorem 2.

Wymienione czynności w punktach 2-13 powtarzane były cyklicznie co 3 h przez 48 h. Po zakończeniu monitorowania na podstawie otrzymanych danych sporządzono wykres zależności wartości współczynnika ultrafiltracji UFC od czasu hodowli zgodny z fig. 10. Jak widać na zamieszczonym wykresie w ciągu pierwszych 6 h od założenia hodowli wartość współczynnika ultrafiltracji UFC rosła, a od godziny 24. była stabilna. Wynik ten oznacza, że przez pierwsze 6 h hodowli przepuszczalność membrany zwiększała się, co wskazuje na gwałtowne rozprzestrzenianie się komórek na powierzchniach membran, a po 24 h hodowli przepuszczalność membrany ustabilizowała się, czyli rozprzestrzenianie się komórek uległo wyhamowaniu.

P r z y k ł a d IV. Wykorzystanie do monitorowania stopnia pokrycia komórkami powierzchni membran półprzepuszczalnych doboru wartości przepływu Q_p wykonywanego w czasie prowadzenia hodowli tak, aby ustabilizowana wartość ciśnienia osiągnęła za każdym razem tę samą, ustaloną przez badacza wartość (wzorcową) opisanego w punkcie IV

Punkty 1-4 są identyczne jak dla przypadku opisanego w przykładzie I.

5. Zmiana przepływu płynu płynącego wzdłuż osi kapilar w ich wnętrzu Q_w do określonej przez badacza w tym przypadku wartości Q_p z zakresu 0,1-0,3 ml/min.

6. Zblokowanie ujścia kapilar A (fig. 7) w celu wymuszenia przepływu Q_p przez ścianki kapilar.

7. Dobór wartości przepływu Q_p tak, aby ustabilizowana wartość ciśnienia transmembranowego osiągnęła wartość PTM = 20 mmHg i zapisanie dobranej wartości przepływu Qp w protokole badania.

Punkty 8-12 są identyczne jak dla przypadku opisanego w przykładzie I.

Wymienione czynności w punktach 2-12 powtarzane były cyklicznie co 3 h przez 48 h. Po zakończeniu monitorowania na podstawie otrzymanych danych sporządzono wykres zależności dobranych wartości przepływu Q_p od czasu hodowli zgodny z fig. 11. Jak widać na zamieszczonym wykresie w ciągu pierwszych 6 h od założenia hodowli wartość przepływu Q_p rosła gwałtownie, a od godziny 24 ustabilizowała się. Wynik ten oznacza, że przez pierwsze 6 h hodowli przepuszczalność membrany

PL 225 342 B1 zwiększała się, co wskazuje na gwałtowne rozprzestrzenianie się komórek na powierzchniach membran, a po 24 h hodowli przepuszczalność membrany ustabilizowała się, czyli rozprzestrzenianie komórek uległo wyhamowaniu.

P r z y k ł a d V. Wykorzystujący do monitorowania stopnia pokrycia komórkami powierzchni membran półprzepuszczalnych pomiar ustabilizowanej wartości ciśnienia transmembranowego dla stałej ustalonej wartości przepływu Q_p opisany w punkcie V

Punkty 1-4 są identyczne jak dla przypadku opisanego w przykładzie I.

5. Zmiana przepływu płynu płynącego wzdłuż osi kapilar w ich wnętrzu Q_w do określonej przez badacza wzorcowej wartości Q_p = 0,1 ml/min.

6. Zblokowanie ujścia kapilar A (fig. 7) w celu wymuszenia przepływu Q_p przez ścianki kapilar.

7. Zapisanie zmierzonej ustabilizowanej wartości ciśnienia transmembranowego PTM w protokole badania.

Punkty 8-12 są identyczne jak dla przypadku opisanego w przykładzie I.

Wymienione czynności w punktach 2-12 powtarzane były cyklicznie co 3 h przez 48 h. Po zakończeniu monitorowania na podstawie otrzymanych danych sporządzono wykres zależności ustabilizowanej wartości ciśnienia transmembranowego PTM od czasu hodowli zgodnie z fig. 12. Jak widać na zamieszczonym wykresie w ciągu 6 h od założenia hodowli wartość ciśnienia transmembranowego PTM maleje, a od godziny 24 stabilizuje się. Wynik ten oznacza że przez pierwsze 6 h hodowli przepuszczalność membrany zwiększa się, co wskazuje na gwałtowne rozprzestrzenianie się komórek na powierzchniach membran, a po 24 h hodowli przepuszczalność membrany ustabilizowała się, czyli rozprzestrzenianie komórek uległo wyhamowaniu.

Badania opisane w powyższych przykładach wykonano na medium hodowlanym zawierającym w swoim składzie 20% FBS (płodowej surowicy bydlęcej) zawierającej białka, w związku z czym przepuszczalność membran (a wraz z nią stopień pokrycia membran komórkami) wzrastała do określonego czasu monitorowania stopnia pokrycia membran komórkami, a następnie się stabilizowała. Wzrost ten mógł być spowodowany przez zmniejszoną adsorbcją białek do powierzchni membran. Adsorbcja białek powoduje zatykanie porów membran, co z kolei skutkuje zmniejszeniem przepuszczalności membran nawet dla wody i niskocząsteczkowych składników medium. Wraz ze zwiększającym się pokryciem membrany przez komórki jej przepuszczalność rośnie ponieważ rozprzestrzeniające się komórki chronią membranę przed kontaktem z białkami, a transport wody i substancji niskocząsteczkowych staje się możliwy w miejscach połączeń międzykomórkowych.

Claims (14)

1. Sposób monitorowania stopnia pokrycia żywymi komórkami, zwłaszcza komórkami śródbłonka ludzkiego, powierzchni kapilarnych membran półprzepuszczalnych, zamkniętych w bioreaktorze, znamienny tym, że w ustalonych odstępach czasowych od 20 minut do 98 godzin, mierzy się przepuszczalność membran kapilarnych z osadzonymi na powierzchni komórkami, określając zmiany w czasie tej przepuszczalności, w ten sposób, że przepuszczalność membran określa się mierząc parametry związane matematycznie z wartością ciśnienia transmembranowego (PTM) określanego zgodnie ze wzorem (1).

PTM = P1 - P2 (1) gdzie:

P1 - wartość ciśnienia zmierzona w wewnętrznym kompartmencie kapilar,

P2 - wartość ciśnienia zmierzona w zewnętrznym kompartmencie kapilar.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że monitorowanie prowadzi się w sposób quasi ciągły polegający na powtarzającym się w określonych momentach pomiarowych blokowaniu przepływu bezpośrednio za kompartmentem wewnętrznym kapilar mającym na celu przeforsowanie tego przepływu przez pory w strukturze kapilar z kompartmentu wewnętrznego kapilar do ich kompartmentu zewnętrznego.

PL 225 342 B1

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że monitorowanie prowadzi się w układzie z krążącym medium w połączonych, zwłaszcza zamkniętych, obwodach zewnętrznym i wewnętrznym, zgodnie z fig. 1.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że monitorowanie prowadzi się w układzie z krążącym medium w połączonych, zwłaszcza otwartych, obwodach zewnętrznym i wewnętrznym, zgodnie z fig. 2.

5. Sposób według zastrz, 1, znamienny tym, że monitorowanie prowadzi się w układzie z krążącym medium w niezależnych zwłaszcza zamkniętych obwodach zewnętrznym i wewnętrznym, zgodnie z fig. 3.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że monitorowanie prowadzi się w układzie z krążącym medium w niezależnych zwłaszcza otwartych obwodach zewnętrznym i wewnętrznym, zgodnie z fig. 4.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że monitorowanie prowadzi się w układzie z krążącym medium w niezależnych otwarto-zamkniętych obwodach, zwłaszcza otwartym obwodzie zewnętrznym i zamkniętym obwodem wewnętrznym, zgodnie z fig. 5.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że monitorowanie prowadzi się w układzie z krążącym medium w niezależnych zamknięto-otwartych obwodach, zwłaszcza zamkniętym obwodzie zewnętrznym i otwartym obwodzie wewnętrznym, zgodnie z fig. 6.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że monitorowanie prowadzi się w sposób ręczny lub automatyczny.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pomiar prowadzi się jako pomiar wartości ciśnienia transmembranowego przez ten sam ustalony dla wszystkich kolejnych pomiarów czas mierzony od momentu zblokowania przepływu płynu wzdłuż osi kapilar, za wyjściem bioreaktora.

11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pomiar prowadzi się jako pomiar czasu osiągnięcia ustalonej dla wszystkich kolejnych pomiarów takiej samej wartości ciśnienia transmembranowego.

12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podczas kolejnych pomiarów wykonywanych w czasie prowadzenia hodowli dobiera się wartość przepływu Q_p tak, aby ustabilizowana wartość ciśnienia transmembranowego osiągnęła za każdym razem taką samą ustaloną wcześniej wartość wzorcową.

13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podczas kolejnych pomiarów mierzona jest ustabilizowana wartość ciśnienia transmembranowego dla takiej samej ustalonej wcześniej wartości przepływu Qp.

14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podczas kolejnych pomiarów po ustabilizowaniu się wartości ciśnienia transmembranowego mierzona jest wartość współczynnika ultrafiltracji (obliczana zgodnie ze wzorem 2).

UFC =

Qp

S*PTM (2) gdzie:

Q_p - objętość zwłaszcza medium hodowlanego przepływającego w jednostce czasu w kierunku poprzecznym do powierzchni membrany zmierzona po ustabilizowaniu się ciśnienia transmembranowego PTM

S - powierzchnia membrany.