PL225257B1 - Układ membranowy do miejscowej immobilizacji komórek oraz sposób jego wytwarzania - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest specjalnie modyfikowana powłoka polielektrolitowa oraz sposób modyfikowania powłoki przeznaczonej do immobilizacji komórek polegający na tym, że bezpośrednio na masę komórkową wprowadza się, roztwór polielektrolitu, wybranego z grupy obejmującej hydrożele zwłaszcza polisacharydy, korzystnie alginiany z inkorporowanym fulerenolem oraz proteiną A i rozpuszczone w soli fizjologicznej, a w strukturę tak utworzonej membrany wprowadza się roztwór polielektrolitu, obejmującego aminy II lub III rzędu zwłaszcza metyloaminy i etyloaminy, korzystnie zawierające 100% grup metylowych lub etylowych, z inkorporowanym fulerenolem, rozpuszczony w soli fizjologicznej.

Description

Przedmiotem wynalazku jest układ membranowy oparty o membrany polielektrolitowe, zwłaszcza mający bezpośredni kontakt z grupą immobilizowanych komórek do miejscowej immobilizacji k omórek eukariotycznych oraz sposób jej przygotowania.

Membrany polielektrolitowe dla celów biotechnologicznych są przedmiotem zainteresowania od lat 90-tych, przy czym dla zwiększenia użyteczności membran dla celów biotechnologicznych stosuje się membrany funkcjonalne, zawierające grupy zmieniające/modyfikujące ich właściwości w kierunku przewidywanych zastosowań.

Immobilizacja materiału biologicznego w membranie półprzepuszczalnej pozwalająca na umiejscowienie działania wytwarzanych przezeń produktów może znaleźć bezpośrednie zastosowanie biomedyczne.

Nieoczekiwanie okazało się, możliwe skonstruowanie układu membranowego według wynalazku, do immobilizacji komórek Eukariota, pozwalającego na unieruchomienie i izolację komórek, zapewniając ich funkcjonowanie i nie wydostawanie się na zewnątrz membrany, posiadającego potencjalne możliwości wykorzystania do wspomagania odbudowy tkanki dzięki zlokalizowaniu działania.

Podczas badań nad przydatnością różnego rodzaju membran do izolacji komórek, stwierdzono, że nie zapewniają one dostępu substancji odżywczych do materiału biologicznego lub stwarzają kłopoty z odizolowaniem od środowiska zewnętrznego, które w przypadku planowanych zastosowań stanowić może nie tylko układ immunologiczny biorcy, ale i środowisko bakteryjne (bakterii Gram (+) oraz Gram (-)), pomimo odpowiedniego punktu odcięcia teoretycznie gwarantującego izolację i funkcjonowanie materiału biologicznego.

Badano między innymi membrany z polilizyny (PLL) i sulfonianu polistyrenu (PSS) oraz z poliaminy i sulfonianu polistyrenu. Okazało się, że nadają się one do enkapsulacji komórek eukariotycznych, ale nie zapewniają spełnienia wyżej wymienionych warunków jeśli chodzi o izolację układu komórek z zagwarantowaniem odcięcia dostępu komórek bakteryjnych.

Z opisu patentowego PL212620 znana jest także membrana poliolefinowa, do izolacji mikroorganizmów, charakteryzująca się tym, że na podłożu z materiału poliolefinowego ma naniesioną co najmniej jedną biwarstwę, utworzoną kolejno z warstwy polielektrolitu, obejmującego aminokwasy alifatyczne, zwłaszcza białkowe, a następnie warstwy z polielektrolitu, wybranego z grupy obejmującej aminy II lub III rzędowe, jakkolwiek zapewniająca izolację mikroorganizmów, to zważywszy na jej formę - makrokapsuły, zwiększająca objętość ewentualnego wszczepu. W związku z przewidywanym działaniem układu dla celów lokalnego dostarczania produkowanego czynnika, korzystna byłaby minimalizacja objętości wszczepu bez pogorszenia jakości izolacji materiału biologicznego (tu: komórek eukariotycznych) od mikroorganizmów środowiska zewnętrznego. Można to uzyskać stosując przy wykonaniu układu membranowego metodę dopasowanego opłaszczania, nakładając membrany warstwa po warstwie.

Istotne było uzyskanie membrany, która pozwoli odizolować immobilizowane komórki eukariotyczne od komórek bakteryjnych a jednocześnie zapewni ukierunkowany wzrost tych komórek. Membrany polielektrolitowe, które jakkolwiek pozwalają na funkcjonowanie komórek eukariotycznych ok azały się nie spełniać w pełni oczekiwań w stosunku do ich ukierunkowanego wzrostu. Membrany polielektrolitowe, które pozwalają na izolację komórek bakteryjnych (prokariotycznych) również nie spełniają oczekiwań w stosunku do ukierunkowanego wzrostu komórek eukariotycznych.

Nieoczekiwanie okazało się, że sposobem według wynalazku można otrzymać układ membranowy, którego jedna warstwa nałożona jest bezpośrednio na grupę izolowanych komórek eukariotycznych, pozwalający na izolację komórek Eukariota od środowiska zewnętrznego, w szczególności m ikroorganizmów, jednocześnie nie ograniczające transportu substancji odżywczych przez membranę, pozwalające na ich ukierunkowany wzrost.

Układ membran polielektrolitowych, do immobilizacji komórek, według wynalazku charakteryzuje się tym, że zbudowany jest z suportu oraz co najmniej jednej biwarstwy składającej się z warstw dwóch rodzajów polielektrolitów, zwłaszcza z jednej warstwy nałożonej bezpośrednio na grupę izolowanych komórek oraz stanowiącą jednocześnie suport, na którym są one posadowione oraz drugiej warstwy, przy czym korzystnie druga warstwa oprócz komórek pokrywa suport - podłoże membranowe służące do zaadsorbowania/posadowienia na nim komórek o takim samym składzie jakościowym jak pierwsza warstwa, na którym korzystnie posadowione są komórki adherentne, korzystnie opłas zczone wcześniej 1 warstwą membrany, przy czym biwarstwa utworzona jest kolejno z warstwy poliaPL 225 257 B1 nionu, wybranego z grupy obejmującej hydrożele z grupy polisacharydów, zwłaszcza alginiany z inkorporowanym fulerenolem oraz proteiną A, a następnie warstwy polielektrolitu, wybranego z grupy obejmującej aminy II lub III rzędowe, korzystnie zawierającego grupy etylowe lub metylowe, z inkorporowanym fulerenolem.

Membrana do immobilizacji komórek, według wynalazku korzystnie, zawiera biwarstwę w której pierwsza warstwa polisacharydu, zwłaszcza alginianu, najkorzystniej ma grubość od 4 nm do 20 nm i jest inkorporowana fulerenolem oraz proteiną A, a druga warstwa polielektrolitu zwłaszcza polimeru aminy alifatycznej II lub III rzędu, korzystnie zawierającego grupy etylowe lub metylowe, najkorzystniej ma grubość od 4 nm do 20 nm i jest inkorporowana fulerenolem.

Sposób wytwarzania półprzepuszczalnych powłok, zwłaszcza bezpośrednio na materiale biologicznym do immobilizacji komórek, według wynalazku polega na tym, że bezpośrednio na masę k omórkową wprowadza się w znany sposób, zwłaszcza przez moczenie, roztwór hydrożelu, wybranego z grupy obejmującej polisacharydu, zwłaszcza alginiany, korzystnie rozpuszczone w roztworze NaCI, ewentualnie z dodatkiem fulerenolu w ilości od 0,03-0,5% objętościowych do 0,5% objętościowych i kompleksu z proteiną A w ilości od 0,03-0,5% objętościowych do 0,5% objętościowych, a następnie po odpłukaniu, w strukturę membrany wprowadza się w znany sposób, korzystnie przez moczenie, roztwór polimeru aminy alifatycznej II lub III rzędowej, wybranej z grupy obejmującej metyloaminy i/lub etyloaminy, korzystnie zawierające 100% grup metylowych lub etylowych, rozpuszczonego w roztworze NaCI, ewentualnie z dodatkiem fulerenolu w ilości od 0,03-0,5% objętościowych do 0,5% objętościowych.

W sposobie według wynalazku, korzystnie wprowadza się roztwór hydrożelu naturalnego polimeru polisacharydu, wybranego z grupy obejmującej polisacharydy, zwłaszcza alginiany, w roztworze NaCI, o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, korzystnie przy pH 7,0-7,6.

W sposobie według wynalazku, korzystnie, wprowadza się roztwór polisacharydu w roztworze NaCI 0,05-0,5 M, o stężeniu 0,05-0,2% objętościowych.

W sposobie według wynalazku, korzystnie, układ poddaje się kąpieli w roztworze polisacharydu pod ciśnieniem atmosferycznym, w temperaturze 20-37°C, w czasie do 10 minut. Do roztworu polimeru polisacharydu wprowadza się proteinę A oraz pochodną fulerenu z grupą hydroksylową we wskazanych wyżej ilościach.

W sposobie według wynalazku korzystnie poddaje się układ kąpieli w roztworze polimeru aminy II lub III rzędowej zawierającego grupy etylowe pod ciśnieniem atmosferycznym, w temperaturze 15-37°C, w czasie do 10 minut, a przygotowany układ ewentualnie płucze się w soli fizjologicznej.

W sposobie według wynalazku, korzystnie wprowadza się roztwór polimeru aminy II lub III rzędowej w roztworze NaO, o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, przy pH 7,0-7,6.

W sposobie według wynalazku, korzystnie wprowadza się roztwór polimeru aminy II lub III rzędowej w roztworze NaO 0,05-0,5 M, korzystnie o stężeniu 0,05-0,2% objętościowych.

Do roztworu polimeru alifatycznej aminy I lub II rzędowej wprowadza się pochodną fulerenu z grupą hydroksylową we wskazanych wyżej ilościach.

Sposób według wynalazku polega na utworzeniu, co najmniej jednej biwarstwy polielektrolitów na powierzchni materiału biologicznego - komórki. Polielektrolity przygotowuje się przez rozpuszczenie polimerów w roztworze NaCI o odpowiednim pH.

Układ poddaje się kąpieli w roztworze kolejno polisacharydu, a następnie polimeru aminy alifatycznej w odpowiednio dobranych warunkach ciśnieniowych, w odpowiedniej temperaturze i czasie tak, aby biwarstwa polielektrolitów została zaadsorbowana przez komórki. Procedurę można powtórzyć kilkakrotnie. Tak przygotowany układ płucze się jeszcze ewentualnie w soli fizjologicznej.

Najkorzystniejsza wersja sposobu polega na tym, że peletę odpowiednich komórek w probówce zalewa się roztworem polimeru polisacharydu - alginianu sodu zawierającego fulerenol o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych oraz proteinę A o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych w roztworze NaO na okres 5-6 minut w komorze ciśnieniowej przy odpowiednim ciśnieniu i w temperaturze od 20-37°C. Komórki pokryte pierwszą warstwą korzystnie posadawia się na suporcie polimerowym o takim samym składzie jakościowym jak warstwa pierwsza. Następnie, układ zanurza się w pojemniku z roztworem polimeru aminy alifatycznej II lub III rzędowej w roztworze NaCI, zawierającego grupy etylowe, fulerenol o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, korzystnie przy pH 7,0-7,6, na okres 5-10 minut, w komorze ciśnieniowej przy atmosferycznym ciśnieniu i w temperaturze od 15-37°C. Następnie układ poddaje się płukaniu w soli fizjologicznej. Procedurę korzystnie powtarza się.

PL 225 257 B1

W celu oceny przydatności membran do immobilizacji, poddawano je badaniu in vitro, sprawdzając stabilność membrany przy użyciu spektroskopii FTTR (Fourier Transformation Infrared), jakość enkapsulacji oraz funkcjonowanie enkapsulowanych w membranie komórek.

Badano także funkcjonowanie immobilizowanych w opracowanym układzie membran komórek. Enkapsulowano komórki jako źródło czynników wspomagających odbudowę tkanki ze szczególnym uwzględnieniem komórek adherentnych, co potwierdziło możliwość wykorzystania membrany we wspomaganiu odbudowy tkanki.

Ponadto, badano cytotoksyczność zastosowanych membran względem materiału komórkowego poprzez zbadanie żywotności komórek spektrofotometrycznie w teście MTT lub w cytometrze przepływowym. Nie stwierdzono istotnego wpływu materiału zastosowanego układu membran na funkcjonowanie komórek.

Sprawdzano również stabilność opracowanej membrany, wykorzystując widmo promieniowania podczerwonego (FTIR), nie stwierdzono zmian w składzie cząsteczkowym membran inkubowanych przez 1 miesiąc w środowisku symulującym fizjologiczne. Badano przepuszczalność membran wytworzonych sposobem według wynalazku i stwierdzono, że pozwalają one na transport wszelkich substancji odżywczych, niezbędnych do życia opłaszczonemu materiałowi biologicznemu, jednocześnie nie pozwalając na wydostawanie się na zewnątrz komórek.

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku, nie ograniczające jego zakresu.

P r z y k ł a d I. Masę komórkową zalewa się roztworem alginianu sodu z inkorporowanym fulerenolem i proteiną A o stężeniu odpowiednio 0,200 mg/ml oraz 0,1 mg/ml w roztworze NaCI 0,1M o stężeniu 0,05% obj., na 5 min., po czym płucze się w soli fizjologicznej w 20°C przez 3 minuty. Następnie, układ komórek z nałożoną powłoką poddaje się moczeniu w roztworze polietylenoiminy (100% grup etylowych) z inkorporowanym fulerenolem o stężeniu 0,200 mg/ml w roztworze NaCI 0,1M o stężeniu 0,05% obj., po czym układ umieszcza się w kąpieli z medium hodowlanego RPMI-1640 w 25°C na 4 minuty.

P r z y k ł a d II. Masę komórkową zalewa się roztworem alginianu sodu z inkorporowanym fulerenolem i proteiną A o stężeniu odpowiednio 0,200 mg/ml oraz 0,1 mg/ml w roztworze NaCI 0,1M o stężeniu 0,05% obj., na 5 min., po czym płucze się w soli fizjologicznej w 20°C przez 3 minuty. Komórki pokryte pierwszą warstwą zostają posadowione na suporcie o takim samym składzie jakościowym jak pierwsza warstwa. Następnie, układ poddaje się moczeniu w roztworze polietylenoiminy (100% grup etylowych) z inkorporowanym fulerenolem o stężeniu 0,200 mg/ml w roztworze NaCI 0,1M o stężeniu 0,05% obj., po czym układ umieszcza się w kąpieli z medium hodowlanego RPMI-1640 w 35°C na 5 minut.

P r z y k ł a d III. Masę komórkową zalewa się roztworem alginianu w roztworze NaCI 0,3M, o stężeniu 0,5% objętościowych, po czym wymoczone komórki umieszcza się w kąpieli z medium hodowlanego RPMI-1640 w 25°C na 4 minuty.

Następnie, komórki poddaje się moczeniu w roztworze polimetyloiminy (100% grup metylowych) w roztworze NaCI 0,01M, o stężeniu 0,4% obj., Następnie, układ poddaje się kąpieli w roztworze alg inianu z inkorporowanym fulerenolem oraz proteiną A w roztworze NaCI 0,1M, o stężeniu 0,5% objętościowych, po czym płucze się w soli fizjologicznej przez 3 minuty. Następnie, układ poddaje się m oczeniu w roztworze polimetyloiminy (100% grup metylowych) z inkorporowanym fulerenolem w roztworze NaCl 0,3M, o stężeniu 0,4% obj., po czym układ umieszcza się w kąpieli z medium hodowlanego RPMI-1640 w 25°C na 4 minuty.

P r z y k ł a d IV. Oceniano przydatność membrany do immobilizacji, poddając ją badaniu in vitro, sprawdzając stabilność membrany przy użyciu spektroskopii FTIR (Fourier Transformation Infrared). Wykorzystując widmo promieniowania podczerwonego (FTIR), nie stwierdzono zmian w składzie cząsteczkowym membran inkubowanych przez 1 miesiąc w środowisku symulującym fizjologiczne.

P r z y k ł a d V. Badano cytotoksyczność zastosowanych materiałów membran na komórki Eukariota poprzez badanie ich żywotności w cytometrze przepływowym. Nie stwierdzono w ciągu 48-godzinnej hodowli istotnej różnicy w żywotności komórek C3A hodowanych w obecności zastosowanego materiału oraz komórek hodowanych bez obecności badanego materiału - kontroli ujemnej. Różnice w uzyskanych wynikach udziału komórek żywych w populacji nie przekraczały 4%.

P r z y k ł a d VI. Badano funkcjonowanie immobilizowanych w opracowanym układzie membran komórek. Enkapsulowano komórki ze szczególnym uwzględnieniem komórek adherentnych. Stwierdzono zarówno przy użyciu testu MTT jak i przy użyciu cystometrii przepływowej że zachowują

PL 225 257 B1 żywotność. Stwierdzono również, że komórki podtrzymują produkcję białek w czasie 2 tygodniowej hodowli in vitro. Nie stwierdzono obecności komórek na zewnątrz układu membranowego - w środowisku hodowlanym po 2 tygodniach hodowli. Świadczy to o tym, że zastosowane membrany pozwalają na transport substancji odżywczych, niezbędnych do życia immobilizowanemu materiałowi biologicznemu, jednocześnie nie pozwalając na wydostawanie się na zewnątrz komórek.

Claims (9)

1. Układ membranowy do miejscowej immobilizacji komórek eukariotycznych, posiadający suport oraz co najmniej jedną biwarstwę, utworzoną z kolejno z jednej warstwy polielektrolitu obejmującej hydrożele polisacharydowe, zwłaszcza alginian sodu zawierający w swej strukturze inkorporowany fulerenol oraz proteinę A, znamienny tym, że pierwsza warstwa jest nałożona bezpośrednio na grupę izolowanych komórek posadowionych następnie na suporcie wykonanym z tego samego materiału pod względem składu oraz drugiej warstwy polimerowej z alifatycznych amin II lub III rzędowych zawierających grupy etylowe lub metylowe z inkorporowanym fulerenolem.

2. Układ według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera co najmniej jedną biwarstwę, w której warstwa polianionu polisacharydu, zwłaszcza alginianu sodu zawierająca fulerenol oraz proteinę A, ma grubość od 4 nm do 2 μm, a druga warstwa polielektrolitu zwłaszcza polimeru aminy alifatycznej II lub III rzędu, zawierającego grupy etylowe lub metylowe, z inkorporowanym fulerenolem, ma grubość od 4 nm do 2 μm.

3. Sposób wytwarzania układu membranowego do immobilizacji komórek eukariotycznych, znamienny tym, że na materiał biologiczny wprowadza się w znany sposób, korzystnie przez moczenie w roztworze hydrożelu polisacharydu zwłaszcza alginianu sodu, zawierający w swej strukturze fulerenol oraz proteinę A, rozpuszczone w roztworze NaCI, a następnie w strukturę membrany wprowadza się w znany sposób, korzystnie przez moczenie, roztwór polimeru aminy II lub III rzędowej metyloaminy i/lub etyloaminy, korzystnie zawierające 100% grup metylowych lub etylowych, z inkorporowanym fulerenolem, rozpuszczone w roztworze NaCl.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że do wprowadzania stosuje się roztwór alginianu sodu, zawierający fulerenol o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych oraz proteinę A o stężeniu 0,030,5% objętościowych w roztworze NaCI 0,05-0,5M, korzystnie o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, a roztwór polimeru amin alifatycznych w roztworze o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, zawierający fulerenol o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, korzystnie przy pH 7,0-7,6.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że do wprowadzania stosuje się roztwór alginianu sodu zawierający fulerenol o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych oraz proteinę A o stężeniu 0,030,5% objętościowych, w NaCI 0,05-0,5M, o stężeniu 0,05-0,2% objętościowych.

6. Sposób według zastrz. 3 albo 4 albo 5, znamienny tym, że materiał biologiczny poddaje się kąpieli w roztworze alginianu sodu zawierającego fulerenol oraz proteinę A pod ciśnieniem atmosferycznym, w temperaturze 20-37°C, w czasie do 10 minut, a przygotowany w ten sposób układ, ewentualnie, moczy się w soli fizjologicznej.

7. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że poddaje się układ kąpieli w roztworze polimeru alifatycznych amin II lub III rzędowych zawierającego grupy metylowe lub etylowe oraz fulerenom o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, pod ciśnieniem 0,09-0,1 MPa w temperaturze 20-37°C, w czasie 2 minut, a przygotowany w ten sposób układ, ewentualnie, moczy się w medium hodowlanym RPMI-1640.

8. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wprowadza się roztwór polimeru aminy alifatycznej II lub III rzędowej zawierający fulerenol w roztworze NaCI, o stężeniu 0,03-0,5% objętościowych, przy pH 7,0-7,6.

9. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wprowadza się roztwór polimeru aminy II lub III rzędowej zawierający fulerenol w roztworze NaCI 0,05-0,5M, o stężeniu 0,03-0,2% objętościowych.