PL224643B1 - Preparat do rozrzedzalnika nasienia knura i sposób otrzymywania preparatu do rozrzedzalnika nasienia knura - Google Patents
Preparat do rozrzedzalnika nasienia knura i sposób otrzymywania preparatu do rozrzedzalnika nasienia knuraInfo
- Publication number
- PL224643B1 PL224643B1 PL408431A PL40843114A PL224643B1 PL 224643 B1 PL224643 B1 PL 224643B1 PL 408431 A PL408431 A PL 408431A PL 40843114 A PL40843114 A PL 40843114A PL 224643 B1 PL224643 B1 PL 224643B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cat
- preparation
- hours
- lecithin
- mmol
- Prior art date
Links
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 title claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 9
- 238000009472 formulation Methods 0.000 title description 4
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims description 24
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims description 24
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 claims description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 17
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Natural products C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 9
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 claims description 7
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 6
- -1 dextran aldehyde Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 6
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 claims description 6
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 claims description 6
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 5
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 4
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000036571 hydration Effects 0.000 claims description 4
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 claims description 4
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 4
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical class [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 claims 1
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 20
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 20
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 9
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 6
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 6
- 241000872931 Myoporum sandwicense Species 0.000 description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 5
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 4
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 3
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 208000010444 Acidosis Diseases 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N Lincomycin Natural products CN1CC(CCC)CC1C(=O)NC(C(C)O)C1C(O)C(O)C(O)C(SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 230000007950 acidosis Effects 0.000 description 1
- 208000026545 acidosis disease Diseases 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000013000 chemical inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 229960005287 lincomycin Drugs 0.000 description 1
- OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N lincomycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000003137 locomotive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 230000005787 mitochondrial ATP synthesis coupled electron transport Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- DVBIMNUZCMCPRL-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;pentahydrate Chemical class O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O DVBIMNUZCMCPRL-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest preparat do rozrzedzalnika nasienia knura i sposób otrzymywania preparatu do rozrzedzalnika nasienia knura. Preparat przeznaczony jest do stosowania w rozrzedzalniku do przechowywania nasienia knura w stanie niezamrożonym.
Dwa główne czynniki wpływają na funkcjonowanie komórek plemników po ejakulacji nasienia i w trakcie ich przechowywania in vitro: temperatura, w której nasienie jest pobierane i przechowywane po rozcieńczeniu oraz parametry fizykochemiczne rozrzedzalnika.
Nasienie knura różni się w kilku aspektach od nasienia innych zwierząt domowych: jest produkowane w dużych ilościach i jest bardzo wrażliwe na udary chłodowe lub nagłe chłodzenie natyc hmiast po pobraniu. Szybkie schłodzenie plemników z temperatury ciała do temperatury bliskiej temperaturze zamarzania nieodwracalnie zmniejsza zdolności zapładniające plemników. W takich warunkach plemniki tracą integralność błon i ruchliwość z nieodwracalnym obniżeniem metabolizmu, jak również dochodzi do uszkodzenia ich DNA. Szybkie chłodzenie powoduje także uwalnianie enzymów wewnątrzkomórkowych.
Aby przedłużyć żywotność plemników w warunkach in vitro niezbędne jest zmniejszenie ich aktywności metabolicznej przy pomocy chemicznych inhibitorów bądź przez obniżenie temperatury. W obu przypadkach konieczne jest rozcieńczenie nasienia. Wymagania dotyczące składu przeznaczonego do tego celu rozrzedzalnika zostały opracowane w latach 90-tych. Wykazano również, że dla uzyskania pozytywnych efektów przechowywania należy poddać kontroli: pH, siłę jonową, rodzaj jonów i ciśnienie osmotyczne medium. Również często dodawane są substancje bakteriostatyczne. W świeżym ejakulacie nasienia knura pH waha się w granicach 7,2-7,5. Poniżej tego pH ruchliwość i metabolizm plemników ulegają stopniowemu zmniejszeniu. Wysokie stężenie glukozy w większości rozcieńczalników nasienia knurów powoduje zmniejszenie wewnątrzkomórkowego pH poniżej 6,0. Ta wewnątrzkomórkowa kwasica pozwala komórkom przetrwać kilka dni przechowywania w temperaturze otoczenia. Aby zapobiec rozwojowi mikroflory w przechowywanym nasieniu, rozcieńczalniki uzupełniane są antybiotykami: gentamycyną, neomycyną, penicyliną, streptomycyną, linkomycyną, spektynomycyną. Nowsze rozcieńczalniki oparte są na obojnaczo-jonowych buforach organicznych, zwłaszcza TES i HEPES, które wychwytują metale ciężkie i kontrolują pH. Do krótkoterminowego przechowywania nasienia knurów, poniżej 3 dni, powszechnie używany jest prosty rozrzedzalnik BTS (Beltsville Thawing Solution), natomiast do przechowywania długoterminowego, od 5 do 7 dni, stosowane są rozrzedzalniki złożone, zawierające między innymi HEPES i BSA, takie jak Androhep Plus czy Bio'dil. W publikacji Funahashi H. i Sano T. (2005) Select antioxidants improve the function of extended boar semen stored at 10°C. Theriogenology 63; 1605-1616 opisano doświadczenie, w którym do rozrzedzalnika, w którym przechowywano plemniki knura w temperaturze 10°C, przez co najmniej 14 dni, dodawano glutation lub cysteinę o stężeniu 5 mmol/l i stwierdzono poprawę żywotności i integralności funkcjonalnej plemników. Odsetek plemników zdolnych do ruchu postępowego nie różnił się pomiędzy dniem 0 (tuż po pobraniu; 90,8 ± 2,0%) a 21 dniem przechowywania (76,7 ± 4,6%), ale uległ znacznemu obniżeniu w 29 dniu (52,5 ± 6,6%). W badaniu in vitro wykazano, że plemniki przechowywane w obecności cysteiny były zdolne do zapłodnienia nawet po 29 dniach. W publikacji Roca J., Rodriguez M.J., Gil M.A., Carvajal G., Garcia E.M., Cuello C., Vazquez J.M., Martinez E.A. (2005) Survival and in vitro fertility of boar spermatozoa frozen in the presence of Superoxide Dismutase and/or Catalase. Journal of Andrology Vol. 26(1); 15-24 przedstawiono możliwość zastosowania enzymów antyoksydacyjnych - katalazy (CAT) i dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) w celu ograniczenia strat w czasie przechowywania plemników knura. Nasienie było poddawane mrożeniu w ciekłym azocie. Dodanie SOD w ilości 150 i 300 lU/ml do rozrzedzalnika z plemnikami powodowało istotny wzrost całkowitej ruchliwości plemników w porównaniu z grupą kontrolną. Dodanie SOD do rozrzedzalnika podnosiło również odsetek żywotnych plemników z nienaruszonym akrosomem, w próbach po rozmrożeniu. Badania wykazały znacznie niższy poziom reaktywnych form tlenu (RFT) w rozmr ożonych plemnikach, które zostały zamrożone z dodatkiem SOD, niż w grupie kontrolnej. Dodanie CAT w ilościach 200 i 400 lU/ml do rozrzedzalnika poddanego zamrażaniu spowodowało istotny wzrost całkowitej ruchliwości plemników i szybkości ruchu postępowego w porównaniu z grupą kontrolną. Dodanie CAT do rozrzedzalnika dało po rozmrożeniu znacznie wyższy odsetek plemników z nienaruszonym akrosomem. Próbki plemników poddawane mrożeniu z dodatkiem CAT wykazywały znacznie niższy poziom RFT po rozmrożeniu w porównaniu z próbą kontrolną. Również, dodanie do rozrzedzalnika mieszaniny SOD i CAT poprawiło odsetek plemników ruchliwych i szybkość ich ruchu postępowego
PL 224 643 B1 oraz, po rozmrożeniu, znacznie wyższy odsetek plemników z nienaruszonym akrosomem w porównaniu do próby kontrolnej. Badania wykazywały znacznie niższy poziom RFT w próbach po rozmrożeniu, zawierających SOD i CAT, niż w grupie kontrolnej.
Z polskiego opisu patentowego 196570 znany jest rozcieńczalnik do nasienia knura zawierający glukozę, cytrynian sodu, EDTA i KCI, który w jednym litrze destylowanej wody zawiera 27,66 g glukozy, 8,16 g cytrynianu sodu, 2,45 g EDTA, 1,23 g NaHCO3, 1,04 g poliwinylopirolidonu, 0,77 g KCI i 0,20 g gentamycyny. Z opisu patentowego PL 202158 znany jest sposób konserwacji nasienia knura, które jest wykorzystywane do badania uszkodzeń chromatyny (DNA) polegający na tym, że dawkę nasienia rozcieńcza się w stosunku 1:1 rozrzedzalnikiem z dodatkiem glicerolu, zaś całość zamyka się w naczyniu mrożeniowym i zamraża. Z polskiego zgłoszenia patentowego P.391452 znany jest sposób konserwacji nasienia knura do badań laboratoryjnych polegający na tym, że do próbki nasienia dodaje się glikol propylenowy w ilości co najmniej 1%, miesza się i zamraża. Ze zgłoszenia patentowego RU 237003 znane jest podłoże do przechowywania nasienia knurów w stanie ochłodzonym, zawierające glukozę, odwodnioną sól disodową kwasu NNNN-etylenodiamino-tetraoctowego, tripodstawiony pięciowodny cytrynian sodowy, siarczan amonu, węglan sodowy, alkohol etylowy i wodę destylowaną.
Preparat do rozrzedzalnika nasienia knura, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że stanowi go kapsułka lipidowo-enzymowa ALEC-LCCD4, w której składniki lipidowe - cholesterol (Chol) i lecytyna (Lec) są połączone w stosunku molowym nie mniejszym niż 2:3, a enzymy antyoksydacyjne - katalaza (CAT), i dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), są połączone kowalencyjnie, za pomocą aldehydu dekstranu (AD), w stosunku molowym nie mniejszym niż 1:1, na jeden monomer katalazy przypada nie mniej niż 1 monomer dysmutazy ponadtlenkowej.
Sposób otrzymywania preparatu do rozrzedzalnika nasienia knura, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że aldehyd dekstranu (AD), otrzymany z dekstranu (D), który utlenia się nadmiarem NaIO4 w czasie 20 minut, w temperaturze 30°C, miesza się w stosunku molowym > 3:20 z katalazą (CAT), rozpuszczoną w 30 mmol/l buforze węglanowym o pH 9,0 i inkubuje 24 godziny w temperaturze 4°C. Zmodyfikowaną kowalencyjnie katalazę CAT-AD miesza się w stosunku molowym > 1:4 z dysmutazą ponadtlenkową (SOD) rozpuszczoną w buforze węglanowym o stężeniu 30 mmol/l i pH 9,0 i pozostawia do inkubacji na 24 godziny w temperaturze 4°C. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się NaBH4 o stężeniu 1 g/l, pozostawia na 24 godziny, po czym dializuje wobec wody destylowanej przez 16 godzin. Otrzymany koniugat katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej (CAT-AD-SOD) zamyka się w liposomy lecytynowo-cholesterolowe (Lec/Chol), w których stosunek molowy cholesterolu do lecytyny wynosi co najmniej 2:3, otrzymując preparat lipidowo-enzymowy (ALEC-LCCD4) w postaci kapsułki. Koniugat CAT-AD-SOD zamyka się w liposomy lecytynowo-cholesterolowe poddając hydratacji suchy film lipidowy, który 6-krotnie zamraża się i rozmraża w temperaturach -196°C i +40°C i kalibruje przy pomocy ekstrudera ręcznego z membranowym filtrem poliwęglanowym o średnicy porów 400 nm. Otrzymany preparat oczyszcza się na kolumnie wypełnionej Sephadex'em G50 zrównoważonej buforem fosforanowym o stężeniu 50 mmol/l i pH 7,4, w temperaturze pokojowej.
Antyoksydacyjna kapsułka lipidowo-enzymowa ALEC/LCCD4 według wynalazku może być stosowana z każdym rodzajem rozrzedzalnika do przechowywania nasienia knura dostępnym na rynku. Wzbogacenie standardowo stosowanego rozrzedzalnika liposomami z koniugatem katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej (CAT-AD-SOD) zabezpiecza plemniki przed szkodliwym działaniem reaktywnych form tlenu (RFT). Zastosowanie preparatu umożliwia przechowywanie nasienia przez 12 dni zabezpieczając plemniki przed uszkodzeniem ich aparatu ruchu, nie ograniczając jednocześnie aktywności enzymów mitochondrialnego systemu transportu elektronów.
Rozwiązanie według wynalazku przedstawione jest na przykładach wykonania.
P r z y k ł a d 1
Przygotowano aldehyd dekstranu (AD) w ten sposób, że 5 ml dekstranu (D) o stężeniu 0,3 mmol/l utleniano przy pomocy NaIO4 o stężeniu 0,1 mol/l (0,107 g w 5 ml) w czasie 20 minut w temperaturze 30°C, po czym, w celu usunięcia nadmiaru NaIO4, dodano 0,279 ml glikolu etylenowego o stężeniu 1 mol/l i inkubowano 20 minut w temperaturze 30°C. Otrzymany AD, w ilości 0,050 ml 15 μmol/l, mieszano z 1 ml 5 μmol/l katalazy rozpuszczonej w 30 mmol/l buforze węglanowym o pH 9,0 i inkubowano 24 godziny w temperaturze 4°C.
Po zakończeniu inkubacji roztwór reakcyjny, zawierający 1 ml CAT-AD o stężeniu 5 μmol/l, mieszano z 0,350 ml SOD o stężeniu 57,9 μmol/l rozpuszczonej w buforze węglanowym o stężeniu 30 mmol/l i pH 9,0 i pozostawiano do inkubacji na 24 godziny w temperaturze 4°C. Następnie, do mieszaniny
PL 224 643 B1 reakcyjnej dodawano NaBH4 o stężeniu 1 mg/ml, pozostawiano na 24 godziny, po czym dializowano wobec wody destylowanej przez 16 godzin. Otrzymany koniugat CAT-AD-SOD oczyszczano w temperaturze pokojowej na sicie molekularnym (Sephacryl HR300, bufor fosforanowy o stężeniu 50 mmol/l, pH 7,4) i zamykano w liposomy lecytynowo-cholesterolowe przy stosunku Lec/Chol wynoszącym 6:4, mol/mol. Otrzymany preparat enzymowy oczyszczano na sicie molekularnym (Sephadex G50, bufor fosforanowy o stężeniu 50 mmol/l, pH 7,4). Skład koniugatów określano na podstawie ich masy molekularnej w oparciu o algorytm umożliwiający badanie krzywych elucji z uwzględnieniem współczynn ików kalibracji kolumny.
Liposomy otrzymywano z lecytyny i cholesterolu, zmieszanych w stosunku molowym 3:2, w wyniku hydratacji suchego filmu lipidowego poddawanego 6-krotnemu procesowi zamrażania i rozmrażania w temperaturach -196°C i +40°C i kalibracji przy pomocy ekstrudera ręcznego z membranowym filtrem poliwęglanowym o średnicy porów 400 nm. Preparat oczyszczano metodą sączenia molekularnego i stosowano jako dodatek do rozrzedzalnika nasienia knura przechowywanego w stanie niezamrożonym w ilości, która odpowiadała aktywnościom enzymatycznym katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej wynoszącym 200/150 UCAT/USOD na 1 ml nasienia zawieszonego w rozrzedzalniku. Do badań używano rozrzedzalnika Bio'dil (Francja).
P r z y k ł a d 2
Przygotowano aldehyd dekstranu (AD) w ten sposób, że 13 ml dekstranu (D) o stężeniu 0,3 mmol/l utleniano przy pomocy NaIO4 o stężeniu 0,1 mol/l (0,278 g w 13 ml) w czasie 20 minut w temperaturze 30°C, po czym, w celu usunięcia nadmiaru NaIO4, dodawano 0,725 ml glikolu etylenowego o stężeniu 1 mol/l i inkubowano 20 minut w temperaturze 30°C. Otrzymany AD, w ilości 0,130 ml 15 gmol/l, mieszano z 2,6 ml 5 gmol/l katalazy rozpuszczonej w 30 mmol/l buforze węglanowym o pH 9,0 i inkubowano 24 godziny w temperaturze 4°C.
Po zakończeniu inkubacji roztwór reakcyjny, zawierający 2,6 ml CAT-AD o stężeniu 5 gmol/l, mieszano z 0,91 ml SOD o stężeniu 57,9 gmol/l rozpuszczonej w buforze węglanowym o stężeniu 30 mmol/l i pH 9,0 i pozostawiano do inkubacji na 24 godziny w temperaturze 4°C. Następnie, do mieszaniny reakcyjnej dodawano NaBH4 o stężeniu 1 mg/ml, pozostawiano na 24 godziny, po czym dializowano wobec wody destylowanej przez 16 godzin. Otrzymany koniugat CAT-AD-SOD oczyszczano w temperaturze pokojowej na sicie molekularnym (Sephacryl HR300, bufor fosforanowy o stężeniu 50 mmol/l, pH 7,4) i zamykano w liposomy lecytynowo-cholesterolowe przy stosunku Lec/Chol wynoszącym 6:4, mol/mol. Otrzymany preparat enzymatyczny oczyszczano na sicie molekularnym (Sephadex G50, bufor fosforanowy o stężeniu 50 mmol/l, pH 7,4). Skład koniugatów określano na podstawie ich masy molekularnej w oparciu o algorytm umożliwiający badanie krzywych elucji z uwzględnieniem współczynnika kalibracji kolumny.
Liposomy otrzymywano z lecytyny i cholesterolu, zmieszanych w stosunku molowym 3:2, w wyniku hydratacji suchego filmu lipidowego poddawanego 6-krotnemu procesowi zamrażania i rozmrażania w temperaturach -196°C i +40°C i kalibracji przy pomocy ekstrudera ręcznego z membranowym filtrem poliwęglanowym o średnicy porów 400 nm. Preparat oczyszczano metodą sączenia molekularnego i stosowano jako dodatek do rozrzedzalnika nasienia knura przechowywanego w stanie niezamrożonym w ilości, która odpowiadała aktywnościom enzymatycznym katalazy i dysmutazy ponadtlenkowej wynoszącym 200/150 UCAT/USOD na 1 ml nasienia zawieszonego w rozrzedzalniku. Do badań używano rozrzedzalnika Bio'dil (Francja).
Claims (4)
1. Preparat do rozrzedzalnika nasienia knura, znamienny tym, że stanowi go kapsułka lipidowo-enzymowa ALEC-LCCD4, w której składniki lipidowe - cholesterol i lecytyna są połączone w stosunku molowym nie mniejszym niż 2:3, a enzymy antyoksydacyjne - katalaza, i dysmutaza ponadtlenkowa są połączone kowalencyjnie, za pomocą aldehydu dekstranu w stosunku molowym nie mniejszym niż 1:1, z zachowaniem aktywności katalitycznych.
2. Sposób otrzymywania preparatu do rozrzedzalnika nasienia knura, znamienny tym, że aldehyd dekstranu (AD), otrzymany z dekstranu (D), który utlenia się nadmiarem NaIO4 w czasie 20 minut, w temperaturze 30°C, miesza się w stosunku molowym > 3:20 z katalazą, CAT, rozpuszczoną w 30 mmol/l buforze węglanowym o pH 9,0 i inkubuje 24 godziny w temperaturze 4°C, po czym zmodyfikowaną kowalencyjnie katalazę CAT-AD miesza się w stosunku molowym > 1:4 z dysmutazą ponadPL 224 643 B1 tlenkową (SOD) rozpuszczoną w buforze węglanowym o stężeniu 30 mmol/l i pH 9,0 i pozostawia do inkubacji na 24 godziny w temperaturze 4°C, następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się NaBH4 o stężeniu 1 g/l, pozostawia na 24 godziny, po czym dializuje wobec wody destylowanej przez 16 g odzin, a otrzymany koniugat CAT-AD-SOD zamyka się w liposomy lecytynowo-cholesterolowe (Lec/Chol), otrzymując preparat lipidowo-enzymowy ALEC-LCCD4 w postaci kapsułki.
3. Sposób otrzymywania według zastrz. 2, znamienny tym, że koniugat CAT-AD-SOD zamyka się w liposomy lecytynowo-cholesterolowe, Lec/Chol, w których stosunek cholesterolu do lecytyny jest nie mniejszy niż 2:3, poddając hydratacji suchy film lipidowy, który 6-krotnie zamraża się i rozmraża w temperaturach -196°C i +40°C i kalibruje przy pomocy ekstrudera ręcznego z membranowym filtrem poliwęglanowym o średnicy porów 400 nm i oczyszcza metodą sączenia molekularnego.
4. Sposób otrzymywania według zastrz. 2, znamienny tym, że otrzymany preparat oczyszcza się na kolumnie wypełnionej Sephadex'em G50 i zrównoważonej buforem fosforanowym o stężeniu 50 mmol/l i pH 7,4 w temperaturze pokojowej.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL408431A PL224643B1 (pl) | 2014-06-03 | 2014-06-03 | Preparat do rozrzedzalnika nasienia knura i sposób otrzymywania preparatu do rozrzedzalnika nasienia knura |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL408431A PL224643B1 (pl) | 2014-06-03 | 2014-06-03 | Preparat do rozrzedzalnika nasienia knura i sposób otrzymywania preparatu do rozrzedzalnika nasienia knura |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL408431A1 PL408431A1 (pl) | 2015-12-07 |
| PL224643B1 true PL224643B1 (pl) | 2017-01-31 |
Family
ID=54776632
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL408431A PL224643B1 (pl) | 2014-06-03 | 2014-06-03 | Preparat do rozrzedzalnika nasienia knura i sposób otrzymywania preparatu do rozrzedzalnika nasienia knura |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL224643B1 (pl) |
-
2014
- 2014-06-03 PL PL408431A patent/PL224643B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL408431A1 (pl) | 2015-12-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kumar et al. | Strategies to minimize various stress-related freeze–thaw damages during conventional cryopreservation of mammalian spermatozoa | |
| JP2003520859A (ja) | 器官および組織保存および低体温血液置換のためのシステム | |
| WO2011008695A2 (en) | Materials and methods for flushing and cold/cryo preserving organs, tissues, and cells | |
| Abedin et al. | Zinc oxide and selenium nanoparticles can improve semen quality and heat shock protein expression in cryopreserved goat (Capra hircus) spermatozoa | |
| Ahmed et al. | Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) addition as an antioxidant in a cryo-diluent media improves microscopic parameters, and fertility potential, and alleviates oxidative stress parameters of buffalo spermatozoa | |
| Hozyen et al. | In vitro supplementation of nano selenium minimizes freeze-thaw induced damage to ram spermatozoa. | |
| CN106538510B (zh) | 番茄红素和芝麻酚配伍在家畜精液冷冻保存剂中的应用 | |
| JP2001247401A (ja) | 組織の冷却保存液 | |
| Wahjuningsih et al. | Extract of cincau (Mesona palustris B.) supplementation in semen extender improves boer goat sperm cryopreservation | |
| Zeitoun et al. | Spirulina supplementation to the semen extender influences the quality and antioxidant parameters of chilled or cryopreserved Arabian stallion spermatozoa | |
| US12471592B2 (en) | Cytoprotective compositions for short-term cells storage and transportation without cryopreservation and deep freezing | |
| EP2639298B1 (en) | The method for preparing human semen for in vitro fertilization or for artificial insemination | |
| PL224643B1 (pl) | Preparat do rozrzedzalnika nasienia knura i sposób otrzymywania preparatu do rozrzedzalnika nasienia knura | |
| Zubov et al. | Trolox antioxidant as a factor in stabilization of human cord blood nucleated cells during cryopreservation | |
| Kim et al. | Rapid freezing without cooling equilibration in canine sperm | |
| JP2014198673A (ja) | 動物胚の低温保存用の保存剤及び低温での動物胚の保存方法 | |
| RU2563117C1 (ru) | Комбинированный криопротектор "диметилсульфоксид/реополиглюкин" для криоконсервации стволовых клеток и способ их криоконсервации для клинического применения | |
| De Loecker et al. | Metabolic changes in rat skin during preservation and storage in glycerol buffer at− 196° C | |
| Dutta et al. | Effect of membrane stabilizers on semen quality and sperm membrane protein expression during cryopreservation of goat semen | |
| WO2023064216A1 (en) | Composition comprising glass forming agent(s) for use as cryoprotectants and methods of making and using the same | |
| Perumal et al. | Effect of superoxide dismutase on cryopreservation of Mithun semen | |
| Yang et al. | Enhanced metabolic function of human hepatocytes cryopreserved with low concentration Me2SO and polyol additives at–80 C | |
| KR20010036569A (ko) | mWAP/hGH이 도입된 한국재래산양 정자의 동결보존 방법 | |
| Behmanesh et al. | Cysteamine mitigates the deleterious impact of cryopreservation on sperm parameters | |
| Elsheshtawy | Cryoprotective Effects of Tris Taurine Cholesterol-Loaded-Cyclodextrins Extender on Buffalo Bull Spermatozoa |