PL224367B1

PL224367B1 - Farmaceutyczny zestaw na bazie gammaglobuliny ludzkiej normalnej

Info

Publication number: PL224367B1
Application number: PL396728A
Authority: PL
Inventors: Ewa Byszewska-Szpocińska; Elżbieta Jakubowska
Original assignee: Narodowe Centrum Badań Jądrowych Ośrodek Radioizotopów Polatom
Priority date: 2011-10-24
Filing date: 2011-10-24
Publication date: 2016-12-30
Also published as: PL396728A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest farmaceutyczny zestaw na bazie gammaglobuliny ludzkiej normalnej do wytwarzania preparatu radiofarmaceutycznego przeznaczonego do obrazowania stanów zapalnych u człowieka.

Gammaglobulina ludzka jest dużą cząsteczką białka o masie 150000 daltonów i stanowi obok innych klas gammaglobulin istotny składnik układu immunologicznego człowieka. Należy do grupy białek o znanej sekwencji aminokwasów.

Gammaglobulina inaczej immunoglobulina G (IgG) jest pozyskiwana z osocza krwi człowieka i charakteryzuje się obecnością dwóch łańcuchów aminokwasowych ciężkich i dwóch lekkich, połączonych mostkami dwusiarczkowymi, które stabilizują strukturę przestrzenną cząsteczki oraz gwarantują prawidłowe pofałdowanie. Te specyficzne cechy warunkują zachowanie własności immunogennych wykazujących specyficzną aktywność biologiczną, wykorzystywaną do wytwarzania preparatów farmaceutycznych na bazie gammaglobuliny. Gammaglobulina gromadzi się niespecyficznie w obszarach objętych stanem zapalnym różnych tkanek na zasadzie zwiększonego ukrwienia i zwiększonej przepuszczalności naczyń krwionośnych, co daje możliwość wczesnej nieinwazyjnej lokalizacji stanu zapalnego nieznanego pochodzenia i włączenia odpowiedniej terapii.

Preparat gammaglobuliny ludzkiej jest stosowany do wytwarzania radiofarmaceutyków umożliwiających obrazowanie stanów zapalnych różnego pochodzenia np. bakteryjnych, grzybiczych, pierwotniakowych, jak również stanów zapalnych powstających wokół implantów protez naczyniowych i kostno-stawowych.

Znany jest z polskiego patentu Nr 197725 farmaceutyczny zestaw na bazie gammaglobuliny do wytwarzania preparatu radiofarmaceutycznego przeznaczonego do obrazowania stanów zapalnych u człowieka. Zestaw składa się z dwóch szczelnych pojemników. W jednym z pojemników znajduje się sucha kompozycja zawierająca pochodną gammaglobuliny w postaci koniugatu gammaglobuliny z HYNIC w ilości od 7 mg do 12 mg, gdzie HYNIC oznacza kwas 6-hydrazynopirydyno-3-karboksylowy, chlorek cyny w ilości od 15 mg do 35 mg, koligand EDTA w ilości od 0,3 mg do 0,5 mg oraz 0,1 M bufor fosforanowy o objętości co najwyżej 1 ml. Z kolei w drugim pojemniku znajduje się stabilizator w postaci roztworu soli kationu dwuwartościowego, korzystnie chlorku magnezu w ilości od 0,2 mg do 0,7 mg w 0,1 M buforze fosforanowym o objętości co najwyżej 1 ml.

Z kolei z polskiego patentu Nr 205509 znany jest farmaceutyczny zestaw peptydowy do radioaktywnego znakowania, sposób jego otrzymywania oraz sposób otrzymywania środka radiofarmaceutycznego z zestawu peptydowego. Zestaw składa się z dwóch suchych kompozycji w oddzielnych, szczelnie zamkniętych pojemnikach. Jeden pojemnik zawiera stabilny analog somatostatyny - HYNIC-TOK lub HYNIC-TATE, czynnik redukujący SnCl₂, ligand uzupełniający Trycynę, alkohol - mannitol, stanowiąc pierwszą kompozycję. Drugi pojemnik zawiera liofilizat roztworu EDDA w buforze fosforanowym, stanowiąc drugą kompozycję. Środek radiofarmaceutyczny otrzymany z tego zestawu peptydowego jest przeznaczony zwłaszcza do wykrywania nowotworów pochodzenia neuroendokrynologicznego.

Ponadto z chińskiego zgłoszenia patentowego CN 101863924 znany jest kompleksowy związek kwasowy znakowany technetem, stosowany jako radiofarmaceutyk o ogólnym wzorze 99mTc(ETYNIC-NOON-FA) (Trycyna) (L), gdzie L stanowi fosforan trifenylu sodu lub kwas trójsiarczkowofosforowy trifenylu sodu.

Zgodnie z wynalazkiem farmaceutyczny zestaw na bazie gammaglobuliny ludzkiej normalnej składa się z dwóch suchych kompozycji umieszczonych w dwóch szczelnych pojemnikach. Jeden pojemnik zawiera pochodną gammaglobuliny w postaci koniugatu gammaglobuliny ludzkiej normalnej z HYNIC w ilości od 1,9 mg do 2,1 mg, gdzie HYNIC oznacza kwas 6-hydrazynopirydyno-3-karboksylowy oraz 0,02M bufor cytrynianowy o pH w zakresie 5,5 do 5,8 o zawartości 0,59 mg cytrynianu sodu dwuwodnego i 1,02 mg kwasu cytrynowego jednowodnego o objętości co najwyżej 0,5 ml.

Z kolei w drugim pojemniku znajduje się ligand uzupełniający w postaci trycyny w ilości od 0,2 mg do 0,25 mg, gdzie trycyna oznacza N-[tris(hydroksymetylo)-metylo]glicynę, czynnik redukujący w postaci dwuwodnego chlorku cyny w ilości od 0,008 mg do 0,015 mg oraz zbuforowany roztwór soli fizjologicznej pozbawionej wapnia i magnezu, o objętości co najwyżej 1 ml.

Farmaceutyczny zestaw według wynalazku wykonany w dwóch szczelnych pojemnikach, dzięki umieszczeniu w jednym pojemniku pochodnej gammaglobuliny w środowisku kwaśnym, a koliganda stabilizującego wiązanie z technetem i reduktora w drugim pojemniku w środowisku obojętnym, jest

PL 224 367 B1 trwały podczas przechowywania, łatwy do wykorzystania, a po wyznakowaniu technetem-99m gwarantuje wymaganą jakość radiofarmaceutyku w czasie badania diagnostycznego.

Ponadto zastosowanie trycyny w ilości 0,250 mg jako środka umożliwiającego trwałe związanie cząsteczki radionuklidu technetu-99m z koniugatem gammaglobuliny, pozwala na wyeliminowanie dodatkowych stabilizatorów i zmniejszenie masy substancji pomocniczych w zestawie.

Istotną zaletą zestawu według wynalazku jest niewielka masa pochodnej gammaglobuliny, co szczególnie korzystnie wpływa na zmniejszenie reakcji organizmu na wprowadzenie obcego białka i powstawanie przeciwciał.

Z kolei środek farmaceutyczny wykonany z zestawu według wynalazku charakteryzuje się dużą przydatnością do wykrywania i lokalizacji stanu zapalnego.

Wynalazek jest bliżej wyjaśniony w przykładzie wykonania, który przedstawia farmaceutyczny zestaw na bazie gammaglobuliny ludzkiej normalnej.

P r z y k ł a d

Farmaceutyczny zestaw składa się z dwóch suchych kompozycji umieszczonych w oddzielnych, szczelnie zamkniętych pojemnikach.

W jednym pojemniku znajduje się pierwsza kompozycja stanowiąca pochodną gammaglobuliny w postaci koniugatu gammaglobuliny ludzkiej normalnej z HYNIC w ilości 2 mg, gdzie HYNIC oznacza kwas 6-hydrazynopirydyno-3-karboksylowy oraz 0,02 M bufor cytrynianowy o pH 5,5 i objętości 0,1 ml, o zawartości 0,59 mg cytrynianu sodu dwuwodnego i 1,02 mg kwasu cytrynowego jedno wodnego o objętości co najwyżej 0,5 ml. Z kolei w drugim pojemniku znajduje się ligand uzupełniający w postaci trycyny w ilości 0,2 mg, gdzie trycyna oznacza N-[tris(hydroksymetylo)-metylo]glicynę, czynnik redukujący w postaci dwuwodnego chlorku cyny w ilości 0,0117 mg oraz zbuforowany roztwór soli fizjologicznej pozbawionej wapnia i magnezu, o objętości 1 ml.

Dla otrzymania pierwszej suchej kompozycji sporządza się roztwór gammaglobuliny ludzkiej normalnej z HYNIC o stężeniu 20 mg/ml w 30 ml buforu cytrynianiowego o pH 5,5, rozcieńczając wyjściowy roztwór koniugatu zawierający 600 mg gammaglobuliny z HYNIC objętości 12-15 ml, otrzymany po oczyszczeniu przez dializę.

Bufor otrzymuje się z 176,4 mg cytrynianu sodu dwuwodnego i 306 mg kwasu cytrynowego jednowodnego.

Otrzymany roztwór przesącza się przez sączek bakteriologiczny 0,22 μm rozdozowuje po 0,1 ml do pojemników. Rozdozowany materiał zamraża się do -70°C po czym zamrożone fiolki wstawia do liofilizatora i prowadzi proces liofilizacji utrzymując temperaturę suchego produktu poniżej 19°C. Pojemniki z gotową suchą kompozycją zamyka się szczelnie w atmosferze azotu.

Dla otrzymania drugiej kompozycji przygotowuje się roztwór 44 mg trycyny w 199 ml wyazotowanego buforu PBS, do którego dodaje się 4,4 mg chlorku cyny dwuwodnego, uprzednio rozpuszczonego w 1 ml 0,1 M kwasu solnego. Roztwór przesącza się przez sączek bakteriologiczny 0,22 μm i rozdozowuje po 1 ml do pojemników, zamraża do -70°C i prowadzi proces liofilizacji przez 24 godziny w warunkach jak dla pierwszej kompozycji.

Tak przygotowany zestaw suchych kompozycji stanowi produkt wyjściowy do otrzymania środka radiofarmaceutycznego do obrazowania stanów zapalnych u człowieka. Sposób otrzymywania środka radiofarmaceutycznego polega na tym, że do pojemnika zawierającego drugą kompozycję o składzie 0,2 mg trycyny i 0,0117 mg chlorku cyny wprowadza się 1 ml wody do iniekcji. Zawartość dokładnie rozpuszcza się i za pomocą jałowej strzykawki pobiera się 0,5 ml tak przygotowanego roztworu. Następnie roztwór ten wprowadza się do pojemnika zawierającego pierwszą kompozycję o składzie 2 mg koniugatu gammaglobuliny z HYNIC i po jej rozpuszczeniu do tego samego pojemnika wprowadza się 0,5 ml roztworu nadtechnecjanu sodu o radioaktywności 740 MBq. Roztwór inkubuje się w temperaturze 37°C przez okres 30 minut i schładza się do temperatury pokojowej. Czystość radiochemiczną otrzymanego środka farmaceutycznego bada się metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej HPLC i sączenia molekularnego.

Zestaw przechowywano w temperaturze 2-8°C przez okres dwunastu miesięcy. Po różnym czasie przechowywania wykonywano znakowanie tego zestawu technetem 99m, otrzymując środek radiofarmaceutyczny, dla którego w okresie dwunastu miesięcy przeprowadzano co trzy miesiące badania jakości metodą HPLC oceniając zawartości dimerów, polimerów i niskocząsteczkowych produktów rozpadu 99mTc-HYNIC-IgG oraz czystość radiochemiczną. Wyniki tych badań przedstawiono w tabeli Nr 1.

PL 224 367 B1

T a b e l a Nr 1.

Okres przechowywania miesiące	Zawartość dimerów 99mTc-HYNIC-IgG %	Zawartość produktów rozpadu 99mTc-HYNIC- -IgG %	Czystość radiochemiczna %	Uwagi
0	15,0	1,8	97,0	brak polimerów
3	16,5	1,9	97,0	brak polimerów
6	13,2	2,0	96,0	brak polimerów
9	18,1	1,9	96,3	brak polimerów

Powyższe dane wskazują, że środek radiofarmaceutyczny przygotowany z zestawu wykonanego według wynalazku, w którym substancja czynna umieszczona jest w środowisku kwaśnym, charakteryzuje się wysoką jakością, przejawiającą się w dużej trwałości i stabilności.

Dla środka farmaceutycznego wykonanego według wyżej opisanego sposobu, przeprowadzono badania stabilności w surowicy krwi ludzkiej in vitro. Jedną objętość środka farmaceutycznego zmieszano z trzema objętościami surowicy i inkubowano w temperaturze 37°C przez okres 3,5 godziny. Tożsamość głównego składnika - monomer i dimer, zawartość niezidentyfikowanych zanieczyszczeń niskocząsteczkowych oraz zawartość 99mTc nadtechnecjanu sodu oceniono metodą chromatografii HPLC z zastosowaniem kolumny BioSep SEC-S-2000, a zawartość głównego składnika metodą chromatografii żelowej na kolumnie PD-10. Czystość radiochemiczną obliczano stosując metodę HPLC i chromatografię żelową. Wyniki tych badań przedstawiono w tabeli Nr 2.

T a b e l a Nr 2.

Czas inkubacji godz.	Tożsamość głównego składnika monomer Czas retencji min.	Tożsamość głównego składnika dimer Czas retencji min.	Zawartość głównego składnika monomer+dimer %	Zawartość zanieczyszczeń nisko-cząstecz- kowych %	Zawartość 99mTc nadtechnecjanu sodu %	Czystość radiochemiczna %
0	6,72	5,99	98,8	1,04	0	97,8
2,5	6,81	6,06	99,0	0,24	1,44	97,3
3,5	6,79	6,03	97,5	0,39	1,1	96,0

Na podstawie uzyskanych danych oraz poprzez porównanie z wynikami analiz produktu bezpośrednio po wyznakowaniu, nie inkubowanego w surowicy stwierdzono, że wyznakowany zestaw jest stabilny w surowicy ludzkiej do 3,5 godziny, odznaczając się wysoką czystością radiochemiczną powyżej 96%. W surowicy nie obserwuje się uwalniania izotopu technetu 99m z radiofarmaceutyku, rozpadu gammaglobuliny ani jej nadmiernej polimeryzacji.

Przeprowadzono również badania biodystrybucji narządowej środka farmaceutycznego otrzymanego z zestawu według wynalazku, u szczurów. U trzech szczurów wywołano stan zapalny uda i wykonano badania biodystrybucji narządowej po trzech i po dwudziestu czterech godzinach po podaniu radiofarmaceutyku. Wyniki gromadzenia radiofarmaceutyku u tych zwierząt, wyrażone jako procent radioaktywności w przeliczeniu na gram tkanki oraz na narząd, przedstawiono w tabeli Nr 3.

T a b e l a Nr 3.

Narząd	Biodystrybucja po 3 godzinach % na narząd	Biodystrybucja po 3 godzinach % na gram	Biodystrybucja po 24 godzinach % na narząd	Biodystrybucja po 24 godzinach % na gram
1	2	3	4	5
Krew		3,44 ± 0,01		1,41
Wątroba	18,39 ± 0,36	1,70 ± 0,17	16,23	1,53

PL 224 367 B1

Ciąg dalszy tabeli 3

1	2	3	4	5
Nerki	2,52 ± 0,35	1,19 ± 0,04	2,17	0,99
Noga zdrowa	1,76 ± 0,07	0,13 ± 0,02	2,58	0,17
Noga ze stanem zapalnym	8,04 ± 3,32	0,48 ± 0,17	11,62	0,71
Mocz	3,36 ± 0,1		6,52
Reszta	38,31 ± 1,20		46,67
Retencja	96.64 ± 0,10		93,48

Gromadzenie znacznika po 24 godzinach od podania środka farmaceutycznego, wykonanego z zestawu według wynalazku, u szczura z wywołanym stanem zapalnym uda, przedstawia scyntygram na fig. 1. Na podstawie powyższych danych stwierdzono, że znacznik wykazuje bardzo dobrą retencję w organizmie, powyżej 93% oraz bardzo wyraźne, zwłaszcza po 24 godzinach gromadzenie się w miejscu zapalenia. Ponadto przeprowadzono badanie gromadzenia znacznika otrzymanego z zestawu według wynalazku, u człowieka. Pacjentowi z podejrzeniem stanu zapalnego podano dożylnie preparat wyznakowany technetem-99m o aktywności 740 MBq i wykonano badanie scyntygraficzne SPECT/CT wybranej okolicy po 8 godzinach od podania. Gromadzenie znacznika przedstawia fig. 2.

Stwierdzono wyraźnie podwyższone gromadzenie znacznika w miejscu zakażonej przetoki skórnej lewego biodra. Stopień gromadzenia znacznika w ogniskach zapalnych jest wysoki w porównaniu z wychwytem w tkankach niezmienionych.

Claims

Farmaceutyczny zestaw na bazie gammaglobuliny ludzkiej normalnej składający się z dwóch suchych kompozycji umieszczonych w dwóch szczelnych pojemnikach, z których jeden zawiera pochodną gammaglobuliny w postaci koniugatu gammaglobuliny ludzkiej normalnej z HYNIC, gdzie HYNIC oznacza kwas 6-hydrazynopiiydyno-3-karboksylowy, znamienny tym, że w jednym pojemniku znajduje się sucha kompozycja zawierająca koniugat gammaglobuliny ludzkiej normalnej z HYNIC w ilości od 1,9 mg do 2,1 mg oraz 0,02 M bufor cytrynianowy o pH w zakresie 5,5 do 5,8 o zawartości 0,59 mg cytrynianu sodu dwuwodnego i 1,02 mg kwasu cytrynowego jednowodnego o objętości co najwyżej 0,5 ml, a w drugim pojemniku znajduje się ligand uzupełniający w postaci tricyny w ilości od 0,2 mg do 0,25 mg, gdzie tri cyna oznacza N-[tris(hydroksymetylo)-metylojglicynę, czynnik redukujący w postaci dwuwodnego chlorku cyny w ilości od 0,008 mg do 0,015 mg oraz zbuforowany roztwór soli fizjologicznej pozbawionej wapnia i magnezu o objętości co najwyżej 1 ml.