PL223208B1 - Sposób przygotowania immunoczujnika oraz jego zastosowanie do wykrywania wirusa grypy - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowania immunoczujnika do wykrywania wirusa grypy, gdzie czyste złote elektrody płucze się etanolem i umieszcza się w 10 mM etanolowym roztworze 1,6-heksanoditiolu (HDT) na 20 h w temperaturze pokojowej. Następnie elektrody płucze się kolejno etanolem i wodą dejonizowaną oraz odwraca się dołem do góry i nakrapla 10 µl roztworu złota koloidalnego (GCP) na 18 h w +4°C, w kolejnym etapie elektrody płucze się 0.1 M buforem PBS (145 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.4 mM NaH2PO4, 1.6 mM Na2HPO4) i nakrapla się 10 µl roztworu przeciwciał anty-M o stężeniu 28 µg/ml w 0.1 M buforze PBS na 20 h w +4°C. W ostatnim etapie na powierzchnie elektrod nakrapla się 10 µl roztworu 0.5% (w/v) BSA w 0.1 M PBS na 2 h w +4°C, tak przygotowane elektrody płucze się buforem PBS i przechowuje w temperaturze +4°C do momentu użycia (nie dłużej niż jeden dzień). Ponadto ujawniono zastosowanie immunoczujnika do wykrywania w roztworze białka M oraz wirusa grypy.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowania immunoczujnika oraz jego zastosowanie do wykrywania ilości białka M w roztworze, oraz do wykrywania wirusa grypy.

Wynalazek dotyczy sposobów otrzymywania immunoczujników, zwłaszcza do wykrywania wirusa grypy.

Znane są i opisane w literaturze sposoby otrzymywania immunoczujników, zwłaszcza do wykrywania wirusa grypy.

Z publikacji p.t. ”A nanobeads amplified QCM immunosensor for the detection of avian influenza wirus” H5N1, Dujuan Li, Jianping Wang, Ronghui Wang, Yanbin Li, Daad Abi-Ghanem, Luc Berghman, Billy Hargis, Huaguang Lu (Biosensors and Bioelectronics 26 (2011) 4146-4154), znany jest immunosesnor do wykrywania wirusa grypy podtypu H5N1, gdzie analiza wyników polega na pomiarze zmiany częstotliwości drgania kryształów kwarcu.

W innej publikacji p.t. „Detection of avian influenza virus using an interferometric biosensor” Jie Xu & David Suarez & David S. Gottfried (Anal Bioanal Chem (2007) 389:1193-1199) ujawniono immunosesnor do wykrywania wirusa grypy podtypu H7N2, który dokonuje analizy wyników na podstawie pomiaru zmian refrakcyjnych. Pomiar odbywa się tu w sposób optyczny.

Z kolejnej publikacji p.t. „Immuno-interferometric sensor for the detection of influenza A nucleoproteih, Leslie R. Farris & Nan Wu & Wenhui Wang & Lisa-Jo A. Clarizia & Xingwei Wang & Melisenda J. McDonald (Anal Bioanal Chem (2010) 396:667-674) ujawniono immunosesnor do wykrywania wirusa grypy typu A, gdzie wykrywa się białka NP (nukleokapsydu). Analiza wyników polega według tego sposobu na pomiarze zmian interferometrycznych - załamania się fali.

Obecnie wyróżnia trzy typy wirusa grypy: A, B i C. Wirus grypy A występuje m.in. u ludzi, świń, koni czy ptaków, natomiast wirusy typu B i C - tylko u ludzi. Szczepy mogące wywołać epidemie czy pandemie to A i B, a typ C powoduje jedynie lokalne zachorowania.

Wirusy grypy A są szeroko rozpowszechnione wśród różnych populacji ptaków na całym świ ecie - zarówno dzikich jak i domowych czy nawet ozdobnych [Esterday et al., 1998]. Jednak wirus patogenny dla jednego gatunku może powodować bezobjawowe przejście choroby w innych organ izmach [Webster, 1997].

Najważniejszym rezerwuarem wszystkich szczepów wirusa jest ptactwo dzikie, wodne, wędrowne, u których infekcje wirusowe przechodzą bezobjawowo. Stanowią one główne źródło zakażenia ptactwa domowego jak i innych zwierząt [Webster, 2002; Esterday et al., 1998]. Podejrzewa się, że wszystkie szczepy infekujące ssaki, w tym ludzi, pochodzą od szczepów wirusów ptasich i w drodze adaptacji i mutacji uzyskały zdolność infekowania innych organizmów [Webster, 2002].

Zakażenia ptaków dzikich następują najczęściej bezobjawowo na drodze kontaktu bezpośredniego z innym chorym zwierzęciem lub poprzez kontakt z materiałem zawierającym wirusa np. odchodami [Webster, 2002].

Wirus ptasiej grypy bytuje w środowisku, a jego przetrwanie przedłużają otaczające go cząstki organiczne np. kał. Infekcyjność wirusa zawartego w kale w temperaturze 4°C wynosi około 30-35 dni, w temperaturze 20°C nawet 7 dni. Jeden gram odchodów zawierający ponad miliard kopii wirusowego RNA jest w stanie zakazić około 1 miliona ptaków.

Na szczęście stosowane środki dezynfekcyjne niszczą wirusa ze 100% skutecznością [ECHCPD, 2003]. Zakażenia wśród ludzi następują na ogół drogą kropelkową [WHO, 2008a].

Różnorodność serotypów wirusa wiąże się z różną wirulencją poszczególnych szczepów. Możliwy jest jednak podział na wirusy o wysokiej zjadliwości (HPAl - Highly Pathogenic Avian Influenza), oraz wirusy o niskiej zjadliwości (LPAI - Low Pathogenic Avian Influenza). Do pierwszej grupy zalicza się wirusy o serotypie H5 i H7, których pojawienie się w stadzie prowadzi najczęściej do 100% śmiertelności. Do LPAI zalicza się wszystkie pozostałe podtypy wirusa. Obecność wirusa tego typu w organizmie nie objawia się lub objawia w niewielkim stopniu.

To czy dany szczep jest silnie zjadliwy czy nie, jest uzależnione od łatwości cięcia proteolitycznego hemaglutyniny podczas infekcji na etapie endosomalnym. Wirusy stają się zjadliwe w wyniku mutacji. Tak stało się np. z wirusem H7N1, który ze słabo zjadliwego zmutował w wysoko złośliwy. Pierwszy raz zidentyfikowano ten wirus jako wysoce patogenny na fermach włoskich w latach 1999-2000 [ECHCPD, 2003].

Objawy kliniczne u ptaków są różne w zależności od typu wirusa oraz gatunku zwierzęcia. Infekcje wirusem o wysokiej zjadliwości HPAI charakteryzuje się ostrym i ciężkim przebiegiem, obj aPL 223 208 B1 wami ze strony układu oddechowego, pokarmowego oraz nerwowego. Śmiertelność jest bardzo wysoka i często osiąga 100% [Subbarao et al., 1998].

Wirusy o niskiej zjadliwości (LPAI) powodują łagodne objawy ze strony układu oddechowego, czasami wpływają na obniżenie nieśności jaj, a wielokrotnie ptactwo nie wykazuje żadnych symptomów chorobowych [Alexander, 1993].

U ludzi objawy kliniczne grypy to wysoka gorączka oraz objawy ze strony dróg oddechowych. Infekcje wirusowe często połączone są z zapaleniami tchawicy i oskrzeli. Pierwsze symptomy widoczne są już po 1-4 dniach od wniknięcia wirusa [WHO, 2008a].

Każdego roku grypa dotyka około 5-15 % populacji ludzkiej i powoduje od 250 do 500 tys. zgonów w wyniku powikłań zwłaszcza u dzieci i osób starszych. Dwa najważniejsze szczepy krążące w populacji ludzkiej to H3N2 i H1N1 [WHO, 2008a]. W Polsce w 2005 roku na grypę zachorowało ponad 730 tys. osób [GUS, 2007].

Wirusa scharakteryzowanego jako H5N1 po raz pierwszy wyizolowano w 1997 roku w Hong Kongu od 3-letniego chłopca, wykazującego silne objawy ze strony układu oddechowego. Niestety zmiany te w konsekwencji doprowadziły do śmierci. [Subbarao et al, 1998]. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) oraz Komisji Europejskiej ds. Zdrowia, do czerwca 2008 roku na grypę wywołaną wirusem HPAI zachorowało 401 osób, z czego zmarło 247 (śmiertelność 62%). Wykaz przypadków zachorowania na grypę typu H5N1 przedstawiono w tabeli 3 [WHO, 2008b; EC, 2008].

Wirus grypy infekuje rocznie od 300 do 900 milionów ludzi na świecie. Większość przypadków nie wymaga specjalistycznego leczenia, gdyż choroba zostaje zwalczona przez układ odpornościowy gospodarza. Jednak, co roku zdarzają się powikłania związane z wirusem grypy i liczne zgony. Na największe zagrożenie narażone są osoby w wieku starszym i dzieci, a także osoby z osłabionym układem odpornościowym [WHO, 2008a].

Jak do tej pory nie stworzono w pełni skutecznego leku przeciw wirusowi grypy. Opracowane zostały dwa typy leków hamujących rozwój wirusa w organizmie. Pierwsza grupa stanowi inhibitory kanału jonowego M2. Są to przede wszystkim amantadyna, metylowa pochodna rimantydyny oraz rzadziej stosowana rybawiryna. Leki te stosowane są nie tylko w celach leczniczych, ale także w prof ilaktyce. Niestety wirus bardzo szybko mutuje i staje się niewrażliwy na leki tej generacji. Szacuje się, że 80% izolowanych wirusów jest już kompletnie nie podatna na działanie tego leku [Beigel, 2008].

Do drugiej grupy zalicza się leki będące kompetycyjnymi inhibitorami neuraminidazy. Przykładem są zanamivir (Relenaza) oraz oseltamivir (Tamiflu) [McKimm-Breschkin et al, 2001]. Są to leki nowej generacji rekomendowane przez Komitet Doradztwa ds. Szczepień (ACIP). Leki te są skuteczne zarówno w walce z wirusem grypy typu A jak i typu B, jednak podane muszą zostać do 48 godzin po stwierdzeniu infekcji tym patogenem [de Clercq, 2006], Skuteczność tych leków została wielokrotnie potwierdzona m. innymi poprzez stosowanie ich w walce z wirusem H7N7 w Chinach i Belgii oraz w walce z mutantem wirusa H5N1 zakażającym ludzi w Chinach w marcu 2003 roku [Brydak, 2004].

Najskuteczniejszym sposobem walki z wirusem i powikłaniami wywoływanymi przez niego są szczepienia ochronne. Niestety ze względu na dużą zmienność wirusa konieczne jest coroczne szczepienie się preparatem przeciw wirusowi aktywnemu w danym sezonie. Wiąże się to z koniecznością produkcji nowej szczepionki każdego roku. Czas potrzebny na wyprodukowanie działającego preparatu to około 6 miesięcy, a zdolności produkcyjne szacowane są na około 250 milionów dawek rocznie, przy zapotrzebowaniu około 2-3-krotnie większym. Obecnie stosuje się dwa rodzaje szczepionek: inaktywowane oraz atenuowane.

Wyzwaniem jest stworzenie aktywnej szczepionki rekombinowanej, której produkcja będzie znacznie szybsza i mniej pracochłonna [Kamble, et al., 2003]. W Polsce szczepienia przeciw grypie figurują w kalendarzu szczepień od 1994 roku, ale jako zalecane, a nie obowiązkowe [Gerdil, 2003].

Przeciwciała ochronne, czyli antyhemaglutynina i antyneuraminidaza są wytwarzane w organizmie pacjenta już po 7 dniach od przyjęcia szczepionki. Czas utrzymywania się ich szacuje się na około 12 miesięcy [Brydak, 2004].

Przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowania immunoczujnika do wykrywania wirusa grypy, w którym istotnym jest że - czyste złote elektrody płucze się etanolem i umieszcza się w 10 mM etanolowym roztworze 1,6-heksanoditiolu (HDT) na 20 h w temperaturze pokojowej, - następnie elektrody płucze się kolejno etanolem i wodą dejonizowaną, oraz odwraca się dołem do góry i nakrapla 10 μι roztworu złota koloidalnego (GCP) na 18 h w +4°C, - w kolejnym charakterystycznym etapie elektrody płucze się 0.1 M buforem PBS (145 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.4 mM NaH₂PO₄, 1.6 mM Na₂HPO₄) i nakrapla się 10 μl roztworu przeciwciał anty-M o stężeniu 28 μg/ml w 0.1 M buforze PBS

PL 223 208 B1 na 20 h w +4°C i w ostatnim charakterystycznym etapie na powierzchnię elektrod nakrapla się 10 μΙ roztworu 0.5% (w/v) BSA w 0.1 M PBS na 2 h w +4°C, po czym tak przygotowane elektrody płucze się buforem PBS i przechowuje w temperaturze około b+4°C do momentu użycia. Istotnym jest że bufor PBS ma pH utrzymywane w przedziale od 5.2 do 5.7, lecz najkorzystniej 5.5.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie immunoczujnika do wykrywania ilości białka M w którym istotne jest, że na powierzchnię elektrod nakrapla się 10 μl roztworu białka M na czas około 30 min w temperaturze pokojowej, po czym elektrody płucze się buforem PBS i umieszcza się w celce elektrochemicznej i wykonuje pomiar elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej, który prowadzi się w obecności jonów żelazocyjanków (Fe(CN)₆ ^3-/4-) jako znacznika redoksaktywnego i na koniec obserwuje się wzrost oporu przeniesienia elektronu wraz ze wzrostem stężenia białka M, przy czym istotne jest, że immunoczujnik stosuje się do wykrywania mianowanego roztworu białka M wirusa ludzkiej grypy rozcieńczonego 0.1 M roztworem buforu PBS pH 5.5

Immunoczujnik według wynalazku stosuje się zwłaszcza w badaniach diagnostycznych do w ykrywania wirusa grypy, korzystnie wszystkich jej podtypów.

Immunoczujnik będący przedmiotem wynalazku: - wykrywa wszystkie podtypy grypy dzięki zastosowaniu przeciwciała anty-M1, - posiada prostą konstrukcję, - wykazuje dużą czułość przy jednoczesnym względnie krótkim czasie analizy (30 minut), - wykrywa białko M1 wirusa grypy którego jest najwięcej i jest ono łatwiej dostępne niż np. nukleokapsyd (białko NP) którego jest około 3 razy mniej na każdego wirusa.

Immunoczujnik opisany w wynalazku można stosować również w wymazach gardłowych pacjentów oraz do wykrywania każdego podtypu grypy.

Wynalazek jest szczegółowo opisany na przykładach wykonania, nie stanowiące jego ogran iczenia i zilustrowany na rysunkach, na których dla przykładu pierwszego fig. 1 przedstawia cykliczne woltamogramy zarejestrowane dla kolejnych etapów wytwarzania immunoczujnika, gdzie a - czysta elektroda złota, b - 1,6-heksanoditiol, c - GCP, d - przeciwciało anti-M, e - BSA, przy zachowaniu warunków pomiarowych 1 mM Fe(CN)6^3-/ Fe(CN)6^4- w 0.1 M roztworze PBS pH 5.5, szybkości skanowania 100 mV/s, fig. 2 przedstawia widma impedancyjne zarejestrowane dla kolejnych etapów wytwarzania immunoczujnika, gdzie a - czysta elektroda złota, b - 1,6-heksanoditiol, c - GCP, d - przeciwciało anti-M, e - BSA, przy zachowaniu warunków pomiarowych 1 mM Fe(CN)6^3-/ Fe(CN)6^4- w 0.1 M roztworze PBS pH 5.5, i potencjału 0.17 V, fig. 3 krzywe impedancyjne uzyskane dla elektrody złotej modyfikowanej, gdzie BSA/przeciwciało anty-M/złoto koloidalne/1,6-heksanoditiol/Au (a) w 0.1 M buforze PBS pH 5.5; (b) 10 pg/ml; (c) 20 pg/ml; (d) 40 p/ml; (e) 60 pg/ml; (f) 80 pg/ml; (g) 100 pg/ml mianowanego roztworu białka M wirusa ludzkiej grypy, przy zachowaniu warunków pomiarowych ImM Fe(CN)6^3-/ Fe(CN)6^4- w 0.1 M roztworze PBS pH 6.0, potencjał 0.17V, fig. 4. wykresy zależności (R₁-R₀)/Ro od stężenia C [pg/ml] mianowanego roztworu białka M wirusa ludzkiej grypy w 0.1 M PBS pH 5.5., gdzie R₁, jest wartością oporu przeniesienia elektronu przez podwójną warstwę po immobilizacji cząsteczek białka M i R₀ jest wartością oporu przeniesienia elektronu przez podwójną warstwę przed immobilizacją cząsteczek białka i dla przykładu drugiego fig. 5 chromatogram potwierdzenia uniwersalności przeciwciał wykrywających różne szczepy wirusa grypy, gdzie M mass marker PageRuler, C - negative control, 1 = A/H5N2 (Weybridge), 2 = A/H5N2 /MW74/10 (Puławy), 3 = A/H1N1v/32u/10, oraz 4 = A/H1N1v/47u/10.

P r z y k ł a d 1

Przygotowanie bioczujnika. Bezpośrednio przed modyfikacją elektrody złote oczyszcza sie m echanicznie przez polerowanie w wodnych zawiesinach tlenku glinu (aluminy) o średnicach odpowiednio 0.3 i 0.05 μm, po około 5 minut w każdej. W kolejnym etapie elektrody oczyszcza elektrochemicznie w 0.5 M roztworze wodorotlenku potasu, poprzez przemiatanie potencjałem w zakresie od - 1200 mV do -400 mV (względem Ag/AgCl jako elektrody odniesienia) z prędkością 100 mV/s, przy liczbie cykli odpowiednio 3, 50 i 5. Następnie elektrody wkłada się do 0.5 M roztworu kwasu siarkowego i przemiata się potencjałem w zakresie od - 300 mV do 1500 mV, z prędkością 100 mV/s, przy liczbie cykli: 3, 10 i 5 i na koniec powierzchnie elektrod odświeża się przez zanurzanie w roztworze KOH stosując co najmniej 10 cykli. Tak przygotowane czyste elektrody złote płuka się etanolem i umieszcza w 10 mM etanolowym roztworze 1,6-heksanoditiolu (HDT) na czas około 20 h w przetrzymując je temperaturze pokojowej. Naczynia technologiczne zawierające elektrody zanurzone w roztworze HDT uszczelnia się dodatkowo taśmą teflonową i para filmem, w celu uniknięcia parowania rozpuszczalnika. Po upływie czasu przetrzymywania, elektrody płuka sią kolejno etanolem i wodą dejonizowaną, po czym odwraca się je dołem do góry i nakrapla 10 μl roztworu złota koloidalnego

PL 223 208 B1 (GCP) i pozostawia na czas około 18 h w temperaturze +4°C. W kolejnym etapie elektrody płucze sią 0.1 M buforem PBS pH 5.5 (składającym się z 145 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 8.4 mM NaH₂PO₄, i 1.6 mM Na₂PO₄) i nakrapla się je 10 ąl roztworu przeciwciał anty-M o stężeniu 28 ąg/ml w 0.1 M, buforze PBS i pozostawia na czas około 20 h w temperaturze +4°C. W ostatnim etapie na powierzchnie elektrod nakrapla się 10 ąl roztworu 0.5% BSA w 0.1 M PBS, mającym liczbę kwasową około pH 5.5 na czas około 2 h w temperaturze +4°C, po upływie którego elektrody płucze się buforem PBS i przech owywuje w temperaturze +4°C do momentu użycia.

Poszczególne etapy przykładowego wykonania wynalazku charakteryzowano za pomocą metody woltamperometrii cyklicznej oraz elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej z zastosowaniem jonów żelazocyjanków (Fe(CN)₆ ^3-/4-) jako znacznika redoksaktywnego. Na rysunku fig. 1 i 2 przedstawiono przykładowe cykliczne woltamogramy oraz widma impedancyjne uzyskane dla kolejnych etapów modyfikacji.

Przygotowany jak przykładowo opisano immunoczujnik zastosowano do wykrywania mianowanego roztworu białka M wirusa ludzkiej grypy rozcieńczonego 0.1 M roztworem buforu PBS przy lic zbie kwasowej pH 5.5 w zakresie stężeń 10:100pg/ml. Na powierzchnię elektrod nakrapla sie 10 ąl roztworu białka M na 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie elektrody opłukuje się buforem PBS i umieszcza się w celce elektrochemicznej. Pomiary elektrochemicznej spektroskopii impendacyjnej prowadza się w obecności jonów żelazocyjanków (Fe(CN)₆ ^3-/4-) jako znacznika redoksaktywnego. Na tak przygotowanym materiale prowadzi się obserwację wzrost oporu przeniesienia elektronu ze wzrostem stężenia białka M (fig. fig. 3 i 4).

P r z y k ł a d 2

Uzyskiwanie przeciwciał. Przeciwciała uzyskuje się poprzez immunizację myszy rekombinowanym białkiem M1 uzyskanym w systemie bakteryjnym. Następnie przeciwciała oczyszcza się na złożu z aktywowaną Sepharozą połączoną z białkiem M1, a otrzymaną surowicę rozcieńcza się w buforze PBS a następnie nanosi się na kolumnę ze złożem. Inkubowanie prowadzi się przez około 16 godzin w temperaturze +4°C. Po przeprowadzeniu inkubacji złoże płucze buforem PBS aż do całkowitego wypłukania niezwiązanych przeciwciało kolejno eluowuje się przeciwciała anty-Ml buforem elucyjnym (składającym się z 0,1M glicyny mającej pH 2,4) do naczynia technologicznego zawierającej 50uL 1M Tris o pH 9 w celu neutralizacji. Otrzymany wynik jest zilustrowany na rys. fig.5.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób przygotowania immunoczujnika do wykrywania wirusa grypy, znamienny tym, że czyste złote elektrody płucze się etanolem i umieszcza się w 10 mM etanolowym roztworze 1,6-heksanoditiolu (HDT) na czas około 20 h w temperaturze pokojowej, następnie elektrody płucze się kolejno etanolem i wodą dejonizowaną oraz odwraca się je dołem do góry i nakrapla 10 ąl roztworu złota koloidalnego (GCP) i pozostawia na czas około 18 h w temperaturze około 4°C, po upływie którego w kolejnym etapie elektrody płucze się 0.1 M buforem PBS (składającym się z 145 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.4 mM NaH₂PO₄, i 1.6 mM Na₂HPO₄) i nakrapla się 10 ąl roztworu przeciwciał anty-M o stężeniu 28 ąg/ml w 0.1 M buforze PBS i pozostawia na czas około 20 h w temperaturze 4°C, po upływie którego w ostatnim etapie na powierzchnie elektrod nakrapla się 10 ąl roztworu 0.5% (w/v) BSA w 0.1 M PBS i pozostawia się na czas do 2 h w temperaturze 4°C, i tak przygotowane elektrody płucze się buforem PBS i przechowuje w temperaturze nie wyższej jak 4°C do momentu użycia, nie dłużej jednak niż przez 24 h.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że liczba kwasowa pH buforu PBS jest utrzym ywana w przedziale od 5.2 do 5.7 i najkorzystniej wynosi około 5.5.
3. 3. Zastosowanie immunoczujnika do wykrywania ilości białka M w roztworze znamienne tym, że na powierzchnię elektrod nakrapla się 10 ąl roztworu białka M i pozostawia się na czas do 30 min w temperaturze pokojowej, następnie elektrody płucze się buforem PBS i umieszcza się w celce elektrochemicznej, w której pomiary elektrochemicznej spektroskopii impendancyjnej prowadzi się w obecności jonów żelazocyjanków (Fe(CN)6^3-/4-) jako znacznika redoks-aktywnego, i prowadzi się końcową obserwację wzrostu oporu przeniesienia elektronu ze wzrostem stężenia białka M.
4. 4. Zastosowanie immunoczujnika według zastrz. 3, znamienne tym, że immunoczujnik stosuje się do wykrywania mianowanego roztworu białka M wirusa ludzkiej grypy rozcieńczonego 0.1 M roztworem buforu PBS do poziom pH około 5.5.

   PL 223 208 B1
5. 5. Zastosowanie immunoczujnika według zastrz. 3, znamienne tym, że immunoczujnik sosuje się w badaniach diagnostycznych do wykrywania wirusa grypy, korzystnie wszystkich jej podtypów wirusa grypy.