PL222995B1 - Sposób wytwarzania preparatu diagnostycznego do detekcji bakterii z gatunku Salmonella sp. - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania preparatu diagnostycznego do detekcji bakterii z gatunku Salmonella sp., wykorzystującego zjawisko wzbudzenia plazmonów przez światło.

Z międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO2006091630 znany jest sposób wytwarzania sensorów z receptorami w postaci przeciwciał specyficznie oddziałujących z analitem - komórką bakteryjną immobilizowaną na powierzchni złóż magnetycznych. Procedura analityczna wykorzystująca opisany w zgłoszeniu czujnik składa się z 2 etapów: z inkubacji złoża magnetycznego z analitem w celu jego koncentracji oraz z detekcji analitu w oparciu o reakcje chemiczne katalizowane pod wpływem jego obecności.

W zgłoszeniu patentowym nr WO0208763 opisany został sposób wytwarzania sensora amperometrycznego, którego specyficzność uzależniona jest od użytego przeciwciała, a procedura analityczna polega na pomiarach amperometrycznych przy użyciu szeregu elektrod.

W zgłoszeniu patentowym WO2011056936 opisana jest metoda wytwarzania czujników oparta na nanostrukturach z zastosowaniem pomiarów konduktometrycznych. Zaproponowane rozwiązanie pozwala na wykrywanie różnych analitów z bardzo wysokim limitem detekcji.

Z opisu patentowego WO2005017122 znana jest metoda wytwarzania sensora ze zjawiskiem zlokalizowanego rezonansu plazmonów. W zgłoszeniu tym opisano metodę wytwarzania sensorów z immobilizowanymi na powierzchni złota receptorami (przeciwciałami). Detekcja analitu jest rejestrowana za pomocą sprzętu spektroskopowego w postaci analizy przesunięć widm.

Ze zgłoszenia patentowego WO2010029175 znany jest czujnik kolorymetryczny wykorzystujący zjawisko aglutynacji nanocząstek opłaszczonych receptorem specyficznym względem wykrywanego analitu. Zmiana barwy układu kolorymetrycznego spowodowana jest aglomeracją nanocząstek wokół wykrywanego analitu za pomocą interakcji analit - nanocząstki opłaszczone receptorem.

Istotą wynalazku jest sposób wytwarzania preparatu diagnostycznego do detekcji bakterii z gatunku Salmonella sp., który polega na tym, że w pierwszym etapie otrzymuje się koloidalne złoto w procesie redukcji chlorku złota III w ilości 5-20 mg rozpuszczonego w 95 ml wody dejonizowanej z dodatkiem 5 ml 1% cytrynianu trisodowego, po czym w drugim etapie do otrzymanego roztworu koloidalnego złota o objętości 590 pl lub jej krotności zawierającej złoto w ilości 20-80 pg dodaje się przeciwciało specyficzne względem komórek bakteryjnych Salmonella sp. w ilości 1-1,5 pg zawieszone w 10 pl wody dejonizowanej, a następnie dodaje się analizowaną próbkę, po czym dodaje się czynnik wywołujący reakcję barwną.

Korzystnie syntezę nanocząstek koloidalnego złota prowadzi się w temperaturze 75-100°C.

Korzystnie jako czynnik wywołujący reakcję barwną stosuje się chlorek sodu lub chlorek potasu w ilości 10-20 pl 2M roztworu.

Korzystnie czynnik wywołujący reakcję barwną jest odizolowany od roztworu wywołującego detekcję.

Zaletą sposobu wytwarzania preparatu diagnostycznego do detekcji bakterii z gatunku Salmonella sp., według wynalazku jest to, że opracowane rozwiązanie nie wymaga procesów immobilizacji przeciwciał na powierzchni układu nanocząstek. Do wytworzenia funkcjonalnego preparatu diagnostycznego wystarcza zmieszanie roztworu koloidalnego złota z roztworem przeciwciała dającym końcowe stężenie przeciwciał na poziomie 10-30 pg/ml.

Podstawą działania preparatu diagnostycznego jest wykorzystanie protekcyjnych właściwości białka (przeciwciała) przed procesem aglomeracji nanocząstek stymulowanego zmianą siły jonowej roztworu. Przeciwciało wiąże się z analitem obecnym w roztworze, tym samym dochodzi do lokalnych zaburzeń rozkładu białka w roztworze analitu, które sprzyja aglomeracji nanocząstek, co w efekcie powoduje zmianę barwy roztworu.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach wykonania.

P r z y k ł a d 1

a) Przygotowanie złota koloidalnego.

Do kolby Erlenmayera zawierającej 95 ml wody dodaje się chlorku złota III w ilości 5 mg. Kolbę z zawartością umieszcza się na mieszadle magnetycznym i ogrzewa do temperatury 75°C. Następnie do mieszaniny dodaje się 5 ml 1% roztworu cytrynianu trisodowego i nadal ogrzewa, aż do momentu otrzymania barwy czerwonego wina.

b) Przygotowanie układu diagnostycznego.

Do przezroczystego naczynia dodaje się 590 pl roztworu złota koloidalnego oraz 1 pg

PL 222 995 B1 przeciwciała anty Salmonella sp. zawieszonego w 10 μΙ wody, a następnie miesza się zawartość. Do szklanej kruchej rurki dodaje się 2M roztworu chlorku sodu w ilości 10 μΙ. Rurkę zatapia się i umieszcza w plastikowym naczyniu z wcześniej przygotowaną mieszaniną.

c) Procedura testowa:

Do przygotowanego układu diagnostycznego dodaje się 100 μl roztworu analizowanej próbki. Mieszaninę poddaje się 10 minutowej inkubacji. Następnie przygotowaną szklaną rurkę uszkadza się mechanicznie w taki sposób, by nastąpiło uwolnienie jej zawartości. Po 3 minutach obserwuje się barwę układu detekcyjnego.

d) Analiza wyniku:

Wynik pozytywny - zmiana barwy z czerwonej na fioletowo niebieską Wynik negatywny - brak zmian barwy.

P r z y k ł a d 2

a) Przygotowanie złota koloidalnego.

Do kolby Erlenmayera zawierającej 95 ml wody dodaje się chlorku złota III w ilości 5 mg. Kolbę z zawartością umieszcza się na mieszadle magnetycznym i ogrzewa do temperatury 85°C. Następnie do mieszaniny dodaje się 5 ml 1% roztworu cytrynianu trisodowego i nadal ogrzewa, aż do momentu otrzymania barwy czerwonego wina.

b) Przygotowanie układu diagnostycznego.

Do przezroczystego naczynia dodaje się 590 μl roztworu złota koloidalnego oraz 1,5 μg przeciwciała anty Salmonella sp. zawieszonego w 10 μl wody, a następnie miesza się zawartość. Do szklanej kruchej rurki dodaje się 2M roztworu chlorku sodu w ilości 20 μΗ Rurkę zatapia się i umieszcza w plastikowym naczyniu z wcześniej przygotowaną mieszaniną.

c) Procedura testowa:

Do przygotowanego układu diagnostycznego dodaje się 100 μl roztworu analizowanej próbki. Mieszaninę inkubuje się przez 10 minut. Następnie dodaje się do roztworu detekcyjnego zawarty w pipetce roztwór chlorku sodu. Po 3 minutach obserwuje się barwę układu detekcyjnego.

d) Analiza wyniku:

Wynik pozytywny - zmiana barwy z czerwonej na fioletowo niebieską Wynik negatywny - brak zmian barwy.

P r z y k ł a d 3

a) Przygotowanie złota koloidalnego.

Do kolby Erlenmayera zawierającej 95 ml wody dodaje się chlorku złota III w ilości 20 mg. Kolbę z zawartością umieszcza się na mieszadle magnetycznym i ogrzewa do temperatury 85°C. Następnie do mieszaniny dodaje się 5 ml 1% roztworu cytrynianu trisodowego i nadal ogrzewa, aż do momentu otrzymania barwy czerwonego wina.

b) Przygotowanie układu diagnostycznego.

Do przezroczystego naczynia dodaje się 590 μl roztworu złota koloidalnego oraz 1,0 μg przeciwciała anty Salmonella sp. zawieszonego w 10 μl wody, a następnie miesza się zawartość. Do szklanej kruchej rurki dodaje się 2M roztworu chlorku sodu w ilości 20 μΚ Rurkę zatapia się i umieszcza w plastikowym naczyniu z wcześniej przygotowaną mieszaniną.

c) Procedura testowa:

Do przygotowanego układu diagnostycznego dodaje się 100 μl roztworu analizowanej próbki. Mieszaninę inkubuje się przez 10 minut. Następnie szklaną rurkę uszkadza się mechanicznie w taki sposób, by nastąpiło uwolnienie jej zawartości. Po 3 minutach obserwuje się barwę układu detekcyjnego.

d) Analiza wyniku:

Wynik pozytywny - zmiana barwy z czerwonej na fioletowo niebieską Wynik negatywny - brak zmian barwy.

P r z y k ł a d 4

a) Przygotowanie złota koloidalnego.

Do kolby Erlenmayera zawierającej 95 ml wody dodaje się chlorku złota III w ilości

PL 222 995 B1 mg. Kolbę z zawartością umieszcza się na mieszadle magnetycznym i ogrzewa do temperatury 100°C. Następnie do mieszaniny dodaje się 5 ml 1% roztworu cytrynianu trisodowego i nadal ogrzewa, aż do momentu otrzymania barwy czerwonego wina.

b) Przygotowanie układu diagnostycznego.

Do przezroczystego naczynia dodaje się 590 μΙ roztworu złota koloidalnego oraz 1,25 μg przeciwciała anty Salmonella sp. zawieszonego w 10 μl wody, a następnie miesza się zawartość. Do szklanej kruchej rurki dodaje się 2M roztworu chlorku sodu w ilości 15 μΚ Rurkę zatapia się i umieszcza w plastikowym naczyniu z wcześniej przygotowaną mieszaniną.

c) Procedura testowa:

Do przygotowanego układu diagnostycznego dodaje się 100 μl roztworu analizowanej próbki. Mieszaninę inkubuje się przez 10 minut. Następnie dodaje się do roztworu detekcyjnego zawarty w pipetce roztwór chlorku sodu. Po 3 minutach obserwuje się barwę układu detekcyjnego.

d) Analiza wyniku:

Wynik pozytywny - zmiana barwy z czerwonej na fioletowo niebieską Wynik negatywny - brak zmian barwy.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania preparatu diagnostycznego do detekcji bakterii z gatunku Salmonella sp., znamienny tym, że w pierwszym etapie otrzymuje się koloidalne złoto w procesie redukcji chlorku złota III w ilości 5-20 mg w obecności 5 ml 1% cytrynianu trisodowego, po czym w drugim etapie do otrzymanego roztworu koloidalnego złota o objętości 590 μl lub jej krotności zawierającej złoto w ilości 20-80 μg dodaje się przeciwciało specyficzne względem komórek bakteryjnych Salmonella sp. w ilości 1-1,5 μg, a następnie dodaje się analizowaną próbkę, po czym dodaje się czynnik wywołujący reakcję barwną.
2. 2. Sposób według zastrz. 1 , znamienny tym, że syntezę nanocząstek koloidalnego złota prowadzi się w temperaturze 75-100°C.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako czynnik wywołujący reakcję barwną używa się chlorek sodu lub chlorek potasu w postaci roztworu lub ciała stałego w ilości 10-20 μl 2M roztworu.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że czynnik wywołujący reakcję barwną jest odizolowany od roztworu wywołującego detekcję.