PL222250B1 - Bioczujnik elektrochemiczny ze stabilną warstwą detekcyjną, (54) sposób wytwarzania bioczujnika elektrochemicznego ze stabilną warstwą detekcyjną oraz zastosowanie bioczujnika - Google Patents

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 222250 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 394798 (51) Int.Cl.

G01N 31/00 (2006.01) G01N 27/327 (2006.01) G01N 33/532 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 06.05.2011

Bioczujnik elektrochemiczny ze stabilną warstwą detekcyjną, (54) sposób wytwarzania bioczujnika elektrochemicznego ze stabilną warstwą detekcyjną oraz zastosowanie bioczujnika (43) Zgłoszenie ogłoszono:

19.11.2012 BUP 24/12 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

29.07.2016 WUP 07/16 (73) Uprawniony z patentu:

INSTYTUT ROZRODU ZWIERZĄT I BADAŃ ŻYWNOŚCI POLSKIEJ AKADEMII NAUK, Olsztyn, PL

INSTYTUT BIOCHEMII I BIOFIZYKI POLSKIEJ AKADEMII NAUK, Warszawa, PL (72) Twórca(y) wynalazku:

JERZY RADECKI, Olsztyn, PL

HANNA RADECKA, Olsztyn, PL

IWONA GRABOWSKA, Olsztyn, PL

AGATA JARGIŁO, Gdańsk, PL

AGNIESZKA SIRKO, Warszawa, PL

ANNA GÓRA-SOCHACKA, Warszawa, PL

ALEKSANDRA WYSŁOUCH-CIESZYŃSKA,

Warszawa, PL

MICHAŁ DADLEZ, Warszawa, PL WIM DEHAEN, Heverlee, BE (74) Pełnomocnik:

rzecz. pat. Zbigniew Kamiński

PL 222 250 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest bioczujnik elektrochemiczny ze stabilną warstwą detekcyjną, sposób modyfikacji elektrod złotych w celu uzyskania bioczujnika, sposób wytwarzaniu bioczujnika elektrochemicznego ze stabilną warstwą detekcyjną oraz zastosowanie bioczujnika. Bardziej szczegółowo rozwiązanie dotyczy molekularnego złączu redoks-aktywnego pomiędzy redoks aktywnym centrum i białkiem, skonstruowane w oparciu o kompleksy pochodnych dipirometenu z jonami Cu(II) oraz Ni(II) osadzonych na powierzchni złota pełniących rolę transduktora oraz, złącza molekularnego do kowalencyjnego wiązania cząsteczek białek posiadających etykietę histydynową. Celem wynalazku jest konstrukcja elektrochemicznego bioczujnika opartego o redox aktywną warstwę przeznaczonego do obserwowania oddziaływań pomiędzy unieruchomionymi cząsteczkami histagowanych białek na powierzchni elektrod złotych a specyficznymi cząsteczkami obecnymi w roztworze wodnym. Oddziaływania te prowadzą do zmian konformacyjnych białek osadzonych na powierzchni elektrody. W konsekwencji następuje zmiana dostępności centrów redox-aktywnych dla jonów towarzyszących, co powoduje generowanie sygnału analitycznego.

Kluczowym problemem związanym z rozwojem bioczujników z udziałem białek jest ich właściwe unieruchamianie na powierzchni z zachowaniem ich struktury, organizacji i orientacji. To zapewnia zachowanie funkcji biologicznych unieruchamianych cząsteczek.

Bardzo liczną grupę białek uzyskiwanych metodami inżynierii genetycznej stanowią białka wyposażone w łańcuch składający się z 6-10 cząsteczek histydyn (His_6-10-Tag). Posiadają one zdolność do wytworzenia wiązań z centrum metalu (Ni²⁺ lub Cu²⁺) zchelatowanego przy pomocy kwasu nitrylotrioctowego (NTA) lub kwasu iminodioctowego (IDA). Ta właściwość stanowi podstawę kontrolowanego i zorientowanego unieruchamiania cząsteczek białek posiadających His6-10-Tag na powierzchniach stałych bioczujników [1, 9, 10]. Z dotychczasowych danych literaturowych wynika , że czas uzyskiwania kompleksu NTA-Cu(II) na powierzchni elektrod złotych wynosił 90 min, natomiast jego stabilność wynosiła tylko 2 h [1]. Do unieruchamiania cząsteczek białek posiadających His-tag zastosowano również lipidy zmodyfikowane jonami Ni(II). Najdłuższy osiągnięty czas dysocjacji kompleksu (lipid 35% Ni(II)-his-tag-białko) wynosił 4 h [6]. Kinetykę wiązania histagowanych białek oraz kinetykę dysocjacji powstałego kompleksu oznaczano przy pomocy powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR) [3, 6, 7]. Elektrody zmodyfikowane kompleksem NTA-Cu(II) oraz NTA-Ni(II) zostały zastosowane do unieruchamiania lakazy posiadającej His6-10-Tag. Nie zaobserwowano bezpośredniego transferu elektronów pomiędzy centrami miedziowymi lakazy a powierzchnią elektrody złotej [1]. Kompleksy NTA-Cu(II) oraz NTA-Ni (II) mogą być unieruchamiane nie tylko na powierzchni elektrod złotych [1], ale także na powierzchni elektrod węglowych uprzednio zmodyfikowanych grupami COOH [2] oraz na powierzchni szkła [3], czy silikonu [10].

Kolejnym sposobem unieruchamiania białek posiadających His6-10-Tag są kompleksy kwasu iminodioctowego: IDA-Cu(II) oraz IDA-Ni(II) [2, 8]. W obu przypadkach nie zaobserwowano przy pomocy metod elektrochemicznych obecności jonów Cu(II) oraz Ni(II) ponieważ były one ulokowane zbyt daleko od powierzchni elektrod [2]. Kompleksowanie jonów Cu(II) oraz Ni(II) na powierzchni elektrod zmodyfikowanych NTA lub IDA przeprowadzano w obecności roztworów wodnych soli CuCl2 oraz NiCl2 stosując pH w zakresie 7.4 [1, 2, 10]. W tych warunkach sole te ulegają hydrolizie, co obniża wydajność kompleksowania. Stosowano również roztwór CuSO4 5H2O w etanolu [8].

Bardzo często stosowaną metodą do unieruchamiania białek jest wytworzenie wiązania amidowego pomiędzy zaktywowaną przy pomocy EDC/NHS grupą COOH umieszczoną na powierzchni stałej a grupą aminową obecną w cząsteczce białka [3]. Ta metoda obarczona jest następującymi niedogodnościami: nie zapewnia ściśle określonej orientacji cząsteczki białka, jest wieloetapowa i czasochłonna [4, 5].

Szereg opracowanych metod unieruchamiania cząsteczek białek z udziałem wytworzenia wiązań chemicznych wymaga ich specyficznej modyfikacji [5]. Niestety, często ten etap wiąże się ze zmniejszeniem lub utratą ich aktywności biologicznych.

W dotychczasowych doniesieniach naukowych, systemy NTA-Ni(II), IDA-Cu(II) zostały zastosowane do zorientowanego unieruchamiania histagowanych białek na szeregu powierzchniach stałych. Proces immobilizacji białek, a także ich dysocjacje kontrolowano najczęściej przy pomocy techniki SPR. Oddziaływania unieruchomionych białek ze specyficznymi cząsteczkami obserwowano również najczęściej techniką SPR, a także metodą fluorescencji.

PL 222 250 B1

Z amerykańskiego opisu patentowego US 6306584 (opubl. 2001-10-23) znane jest elektroniczne wykrywanie cząsteczek biologicznych na powierzchni. Opisana została technika unieruchamiania cząstek biologicznych. Unieruchomione na powierzchni biologiczne cząsteczki mogą być użyte w technikach detekcji transferu elektronów, w których cząsteczka biologiczna obecna w roztworze (wiązana) doprowadzana jest blisko do biologicznej cząsteczki unieruchomionej na powierzchni. Tworzy się wówczas potencjał elektryczny pomiędzy dwoma rodzajami oddziaływujących ze sobą cząsteczek biologicznych, a transfer elektronów determinowany jest ich rodzajem/gatunkiem. Inna technika dotyczy unieruchamiania cząstek biologicznych takich jak białko, DNA, itp. na powierzchni za pomocą samodzielnie organizującej się monowarstwy, wpływając na cząstkę biologiczną np. poprzez wiązanie biologiczne, wywołujące zmianę konformacji przy udziale prionu, itp., jednocześnie wywołujące zmianę właściwości elektrycznych w cząsteczce takich jak zmiany impedancji związanej z obwodem elektrycznym wykierowanym przez cząsteczkę biologiczną. Takie techniki ułatwiają wytworzenie szeregu kombinatorycznych detekcji związków analizowanych.

Z opisów patentowych US 6809196 (opubl. 2002-04-11), US 6472148 (opubl. 2002-10-29), US 6197515 (opubl. 2001-03-06) i US 5620850 (opubl. 1997-04-15) znane jest molekularne rozpoznanie na powierzchniach pochodnych z samodzielnie organizującymi się monowarstwami. Przedmiot odpowiedni do zastosowania jako bioczujnik zawiera cząsteczkę o formule X-R-Ch przyłączoną do powierzchni przedmiotu jako część samodzielnie organizującej się monowarstwy. X jest funkcjonalną grupą przylegającą do powierzchni, R to grupa przestrzenna, Ch to czynnik chelatujący. Jon metalu może być koordynowany przez czynnik chelatujący, a poliamino kwasowo-związany biologicznie partner z grupy cząsteczek biologicznych jest skoordynowany z jonem metalu. Metoda według wynalazku dostarcza również przedmiot do kontaktu z medium zawierającym, bądź mogącym zawierać grupę cząsteczek biologicznych pozwalających cząsteczce biologicznej na wiązanie z partnerem. Przedmiot ten jest pomocny w szczególności jako czip powierzchniowego rezonansu plazmonów.

Publikacja WO03021247 (opubl. 2003-03-13) ujawnia biosensor. Przedmiotowy wynalazek dotyczy biosensora, w szczególności bioelektrycznego czujnika zawierającego makrocząsteczki unieruchamiane na powierzchni elektrody w taki sposób, że potencjał redox kofaktora, który jest miejscowospecyficznie związany z makrocząsteczką i jest umiejscowiony pomiędzy makrocząsteczką a powierzchnią elektrody. Oddziaływanie z ligandem powoduje zmiany konformacyjne wywołujące zmianę geometrii oddziaływania pomiędzy aktywnym elektrochemicznie kofaktorem a powierzchnią elektrody. To skutkuje zmianą w elektronicznym sprzężeniu pomiędzy kofaktorem i elektrodą.

Z publikacji W09966322 (opubl. 1999-12-23) znany jest czujnik do wykrywania wybranych analitów. Obecność bądź stężenie analitu jest oznaczane za pomocą pomiaru indukowanych zmian siły elektromotorycznej, natężenia prądu lub innej właściwości elektrycznej będącej podstawowym elementem podczas ekspozycji analitu na czujnik. Jedna klasa przykładów wykonania przedstawia przedmiotowe urządzenie z unieruchomionymi naturalnymi bądź syntetycznymi makrocząsteczkami unieruchomionymi wystarczająco blisko elektrycznie przewodzącego podstawowego elementu, tak aby ubezpieczyć dowolną zmianę w ruchu i/lub polach elektrostatycznych makrocząstek podczas interakcji z góry ustalonym analitem indukując zmiany siły elektromotorycznej w podstawowym elemencie.

Z publikacji WO 9741425 (opubl. 1997-11-06) znane jest urządzenie - bioczujnik i metoda. Opisany został bioczujnik do detekcji wiązania pomiędzy ligandem i receptorem. Bioczujnik zawiera substrat - elektrodę pokrytą monowarstwą wytworzoną przez związki posiadające długie łańcuchy węglowodorowe charakteryzującą się wysoką stałą dielektryczną, posiadającą dodatkowo ligandy przyłączone do wyeksponowanej powierzchni monowarstwy. Wiązanie receptora do ligandu przymocowanego do monowarstwy oraz wynikające z tego oddziaływania zaburzenia struktury monowarstwy, powodują zmianę przepływu elektronów za pośrednictwem jonu poprzez monowarstwę. W jednym z przykładów wykonania, monowarstwa posiada heterodimer typu zwój-zwój osadzonego tamże, którego jedna podjednostka związana jest z substratem, druga podjednostka, zaś przytrzymuje ligand na powierzchni monowarstwy.

Z opisów US 20060194343 (opubl. 2006-08-31) i US 7759114 (opubl. 2010-0720) znane są czipy czujnika. Opisana została metoda selektywnego orientowania cząstek na powierzchni ciała stałego. Metoda ta obejmuje następujące etapy: (a) dołączenie cząsteczki łączącej do powierzchni ciała stałego, cząsteczka łącząca zawiera grupę główną, która jest zdolna do wiązania z ciałem stałym, oraz grupy końcowej, która jest zdolna do chelatowania jonu metalu, (b) następnie traktowanie ciała stałego roztworem zawierającym jony metalu; (c) związanie jonu metalu chelatującego Taga do czą4

PL 222 250 B1 steczki tworząc otagowane cząsteczki oraz (d) przechwytywania otagowanych cząsteczek na ciele stałym poprzez łączenie ich z otagowanymi cząsteczkami do wytwarzania monowarstwy cząsteczek na powierzchni ciała stałego, gdzie większość cząsteczek znajduje się w tej samej orientacji w odniesieniu do powierzchni. Wynalazek dostarcza również bioczujnikowe czipy wytworzone metodą opisaną powyżej.

Z publikacji US 20100270543 (opubl. 2010-10-28) znane jest elektroniczne urządzenie oparte na biocząsteczkach. Wynalazek dotyczy elektronicznego rozwiązania opartego na biocząsteczkach, w którym biocząsteczka z potencjałem redox jest bezpośrednio unieruchomiona na substracie. Przedmiotowe rozwiązanie umożliwia doskonałe wykazanie zdolności bio-pamięci urządzenia do białek, w którym preferuje się użycie substratu, na którym rekombinowane białka z wprowadzoną cysteiną są efektywnie unieruchamiane i wytwarzana jest samodzielnie organizująca się monowarstwa (SAM). Potencjał redox jest regulowany za pomocą wewnętrznego potencjału redox białka, które zależy od przyłożonego napięcia. Rozwiązanie dostarcza również nową metodę, w której trzy potencjały zastosowane są na czterech etapach. Rozwiązanie posiada również cechy otrzymywania warstwy białkowej w dogodny sposób oraz indukcji transferu elektronów za pomocą podstawowych elektrochemicznych lub elektronicznych operacji. Metoda przedmiotowego rozwiązania jest nowa w takim sensie, iż mechanizm indukowany wewnętrznym transferem elektronów poprzez naturalnie występujące biocząsteczki jest użyty do opracowania urządzenia służącego do przechowywania informacji.

Ze zgłoszenia patentowego numer EP 1293779 (opubl. 2003-03-19) znana jest powierzchnia bioczujnika. Rozwiązanie to dostarcza powierzchnię bioczujnika zawierającą powierzchnię metaliczną lub membranę metaliczną traktowaną związkiem łącznikowym zdolnym do wiązania fizjologicznie aktywnej substancji, mierzący czip do bioczujnika posiadający fizjologicznie aktywną substancję unieruchomioną na powierzchni bioczujnika, metodą otrzymywania wyżej wspomnianych oraz metodę pomiaru wykorzystującą wyżej wspomniane. Przedmiotowe rozwiązanie dostarcza również metodę unieruchamiania fizjologicznie aktywnej substancji na powierzchni metalu w prostym procesie z wysoką wydajnością, podczas gdy większość cząstek podtrzymuje swoją aktywność i nie odłącza się.

Pomimo istniejących do tej pory rozwiązań istnieje ciągła potrzeba stworzenia rozwiązania umożliwiającego obserwowanie oddziaływań pomiędzy unieruchomionymi cząsteczkami histagowanych białek na powierzchni elektrod złotych a specyficznymi cząsteczkami obecnymi w roztworze wodnym.

Celem niniejszego wynalazku jest rozwiązanie podstawowego problemu związanego z właściwym i trwałym unieruchamianiem białek na powierzchni z zachowaniem struktury, organizacji i orientacji, zapewniającym zachowanie funkcji biologicznych unieruchamianych cząsteczek, a tym samym dostarczenie takiego rozwiązania, które umożliwiałoby obserwowanie oddziaływań pomiędzy unieruchomionymi cząsteczkami histagowanych białek na powierzchni elektrod złotych a specyficznymi cząsteczkami obecnymi w roztworze wodnym. Bardziej szczegółowo celem wynalazku jest konstrukcja elektrochemicznego bioczujnika opartego o redox aktywną warstwę, przeznaczonego do obserwowania oddziaływań pomiędzy unieruchomionymi cząsteczkami histagowanych białek na powierzchni elektrod złotych a specyficznymi cząsteczkami obecnymi w roztworze wodnym. Oddziaływania te prowadzą do zmian konformacyjnych białek osadzonych na powierzchni elektrody. Do obserwowania powyższych oddziaływań zastosowano metody elektrochemiczne takie jak cykliczna woltamperometria oraz woltamperometria fali prostokątnej. Oddziaływanie pomiędzy białkiem unieruchomionym na powierzchni elektrody a specyficznym związkiem obecnym w roztworze wodnym powoduje zmiany właściwości elektrochemicznych kompleksu pochodnych dipirometenu z Cu(II) lub Ni(II) obecnych na powierzchni elektrod złotych. W konsekwencji następuje zmiana dostępności centrów redox-aktywnych dla jonów towarzyszących, co powoduje generowanie sygnału analitycznego.

Nieoczekiwanie udało się rozwiązać istniejące problemy uzyskując przedmiotowy wynalazek, w którym zastosowano po raz pierwszy do unieruchamiania histagowanych białek kompleksy dipirometen-Cu(II) albo dipirometen-Ni(II), które to kompleksy charakteryzują się dużą trwałością, przez co oddziaływanie pomiędzy białkiem unieruchomionym na powierzchni elektrody, a specyficznym związkiem obecnym w roztworze wodnym powoduje zmiany właściwości elektrochemicznych centrum redoksowego, jonu Cu(II) lub jonów Ni(II) obecnych na powierzchni elektrod złotych.

Przedmiotem wynalazku jest bioczujnik elektrochemiczny ze stabilną warstwą detekcyjną w postaci złącza molekularnego, w którym warstwa detekcyjna czujnika obejmuje złote elektrody pokryte warstwą zawierającą kompleks dipirometen-Ni(II) albo kompleks dipirometen-Cu(II) w połączeniu z N-acetylocysteaminą oraz na warstwie detekcyjnej zawiera unieruchomione cząsteczki białka posiadające histydynowy łańcuch.

PL 222 250 B1

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania bioczujnika elektrochemicznego ze stabilną warstwą detekcyjną, w którym modyfikacja obejmuje: a) immobilizację mieszanej warstwy N-acetylocysteaminy oraz tiolowych pochodnych dipirometenu bezpośrednio na złotej elektrodzie oraz kompleksowanie jonów metali Cu⁺² lub Ni⁺² przez dipirometen w obecności N-acetylo-cysteaminy w celu wytworzenia złącza molekularnego; b) immobilizację cząsteczek białka posiadającego histydynowy łańcuch za pomocą etykietki oligohistydynowej do powierzchni zmodyfikowanych złączami molekularnymi określonymi w punkcie (a).

Korzystnie, do skompleksowania jonów Cu (II) lub Ni(II) na powierzchni warstwy mieszanej unieruchomionej na powierzchni elektrod złotych składającej się z dipirometenu i N-acetylo-cysteaminy stosuje się roztwór octanu Cu(II) lub octanu Ni(II) w mieszaninie metanolu i chloroformu.

W korzystnym rozwiązaniu sposobu według wynalazku w etapie a) oczyszczone mechanicznie i elektrochemicznie elektrody płucze się kolejno etanolem i chloroformem, następnie zanurza się w roztworze dipirometenu i N-acetylocysteaminy w stosunku molowym zawartym w przedziale 1:100 w chloroformie na co najmniej 18 godzin w temperaturze 4°C, po czym elektrody płucze się chloroformem oraz mieszaniną chloroform-metanol i zanurza w roztworze octanu miedzi (II) od 1,0 x 10^-4 do

1,0 x 10^-3 M w mieszaninie chloroform-metanol, w stosunku objętościowym 1:1 na co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej, roztwory modyfikujące umieszcza się w probówkach, po umieszczeniu elektrod w roztworach modyfikujących probówki zabezpiecza się w celu ochrony przed wyparowaniem rozpuszczalnika, a po modyfikacji elektrody płucze się w kolejności chloroformem, metanolem i wodą, a następnie przechowuje do momentu użycia.

Korzystnie w etapie b) na opłukaną buforem i osuszoną azotem powierzchnię elektrod nakrapla się roztwór histagowanego białka w buforze o stężeniu od 10 μΜ do 50 μΜ na okres co najmniej 24 godziny w temperaturze 4°C pod przykryciem, a po modyfikacji elektrody płucze się, a następnie kondycjonuje w buforze przez 16 godzin.

Korzystnie w etapie c) na powierzchnie elektrod przygotowanych w punkcie b) nakrapla się roztwór zawierający wybrany ligand w buforze dostosowanym do wybranego ligandu, po czym elektrody zabezpiecza się przed odparowaniem wody, gdzie czas inkubacji wynosi od 30 do 60 min., elektrody płucze się buforem dostosowanym do wybranego ligandu i umieszcza w celce elektrochemicznej.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania bioczujnika elektrochemicznego ze stabilną warstwą detekcyjną z kompleksem metalu przejściowego z dipirometenem, w którym cząsteczkę histagowanego białka w buforze o stężeniu od 10 μΜ do 50 μM nakrapla się na opłukaną buforem i osuszoną azotem powierzchnię elektrod przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 4°C pod przykryciem, a po modyfikacji elektrody płucze się, a następnie kondycjonuje w buforze przez 16 godzin, tak, że cząsteczka białka jest immobilizowana za pomocą etykietki oligohistydynowej do powierzchni zmodyfikowanych złączami molekularnymi.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie bioczujnika do pomiarów oddziaływań pomiędzy unieruchomionymi cząsteczkami histagowanych białek na powierzchni elektrod złotych a specyficznymi cząsteczkami obecnymi w roztworze wodnym.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie bioczujnika według wynalazku do wykrywania specyficznych cząsteczek za pomocą cząsteczek białek posiadających histydynowy łańcuch immobilizowanych na powierzchni elektrod zmodyfikowanych kompleksem metalu przejściowego z pochodnymi dipirometenu.

Wynalazek został przedstawiony na rysunku, na którym:

figura 1 przedstawia przykładową krzywą woltamperometryczną. Pierwszą krzywą zarejestrowano dla elektrody zmodyfikowanej warstwą elektroaktywną (dipirometen /N-acetylocysteamina/Cu) z unieruchomionym na jej powierzchni białkiem HA/Nde. Kolejne krzywe zostały zarejestrowane po dodatku analitu w postaci przeciwciała Mab 6-9-1 o stężeniach kolejno 0.0075; 0.015; 0.03; 0.06 i 0.12 mg/ml.

Warunki pomiaru: 0,1 M KCl, szybkość skanowania 100 mVs/1;

figura 2 przedstawia przykładową krzywą woltamperometryczną. Pierwszą krzywą zarejestrowano dla elektrody zmodyfikowanej warstwą elektroaktywną (dipirometen /N-acetylocysteamina/Cu) z unieruchomioną na jej powierzchni domeną V białka RAGE. Kolejne krzywe zostały zarejestrowane po dodatku analitu w postaci A-beta peptydu o stężeniach kolejno 1nM; 10 nM; 100 nM; 1000 nM.

PL 222 250 B1

Warunki pomiaru: 0.1M KCl, szybkość skanowania 100 mV/s.

W celu lepszego zrozumienia rozwiązania poniżej przedstawiono przykładowe rozwiązania wynalazku.

Przykłady

Celem wynalazku jest obserwowanie oddziaływań pomiędzy unieruchomionymi cząsteczkami histagowanych białek na powierzchni elektrod złotych a specyficznymi cząsteczkami obecnymi w roztworze wodnym. Do obserwowania powyższych oddziaływań zastosowano metody elektrochemiczne takie jak cykliczna woltamperometria oraz woltamperometria fali prostokątnej. Oddziaływanie pomiędzy białkiem unieruchomionym na powierzchni elektrody a specyficznym związkiem obecnym w roztworze wodnym powoduje zmiany właściwości elektrochemicznych centrów redoksowych kompleksów dipirometenu - Cu(Il) i dipirometenu - Ni(II) obecnych na powierzchni elektrod złotych.

W badaniach zastosowano po raz pierwszy do unieruchamiania histagowanych białek kompleksy dipirometen - Cu(II) i dipirometen - Ni(II). Powyższe kompleksy dipirometen - Cu(II) - histagowane białko i dipirometen - Ni(II) - histagowane białko charakteryzowały się dużą trwałością (3 doby-dłuższy okres nie był badany).

Do skompleksowania jonów Cu(II) lub Ni(II) na powierzchni dipirometenu zastosowanao roztwór octanu Cu(II) [11] lub octanu Ni(II) w mieszaninie metanolu i chloroformu. Warunki te zdecydowanie poprawiają wydajność reakcji kompleksowania w porównaniu z roztworami wodnymi soli Cu(II) i Ni(II).

Modyfikacja elektrod złotych (1) Immobilizacja mieszanej warstwy tiolowych pochodnych dipirometenu bezpośrednio +2 +2 na złotej elektrodzie oraz kompleksowanie jonów metali Cu⁺² lub Ni⁺² przez dipirometen.

Oczyszczone mechanicznie i elektrochemicznie elektrody opłukano kolejno etanolem i chloroformem, a następnie zanurzano w roztworze dipirometenu i N-acetylocysteaminy (w stosunku molowym 1:100) w chloroformie na 18 h w temperaturze 4°C. Następnie elektrody opłukano chloroformem oraz mieszaniną chloroform-metanol i zanurzono w 1.0 x 10^-3 M roztworze octanu miedzi (II) w mieszaninie chloroform-metanol (w stosunku objętościowym 1:1) na 3 h w temperaturze pokojowej. Roztwory modyfikujące umieszczono w szklanych probówkach o średnicy 8 mm z zaokrąglonym dnem. Po umieszczeniu elektrod w roztworach modyfikujących probówki zabezpieczono taśmą teflonową i parafilmem w celu ochrony przed wyparowaniem rozpuszczalnika. Po modyfikacji elektrody opłukano w kolejności chloroformem, metanolem i wodą, a następnie przechowywano je w 0.1 M roztworze chlorku potasu aż do momentu użycia.

(2) Immobilizacja cząsteczek białka za pomocą etykietki oligohistydynowej do zmodyfikowanych powierzchni redoksowo aktywnych poprzez tworzenie złączy molekularnych.

Na opłukaną uprzednio buforem i osuszoną azotem powierzchnię elektrod nakraplano po 10 μΐ roztworu histagowanego białka w buforze o stężeniu od 10 μΜ do 50 μΜ na okres 24 h w temperaturze 4°C pod przykryciem. Po modyfikacji elektrody opłukano, a następnie kondycjonowano w odpowiednim buforze: w buforze 100 mM TRIS, 300 mM NaCl pH=8.0 w przypadku elektrody z unieruchomionym białkiem HA/Nde lub w buforze o składzie: 50 mM TRIS, 500 mM NaCl pH 7.4 w przypadku elektrody z unieruchomioną domeną V białka RAGE. Czas kondycjonowania wynosił 16 h.

(3) Badanie oddziaływań pomiędzy cząsteczkami białek unieruchomionych na powierzchni elektrod a specyficznym ligandem znajdującym się w roztworze wodnym

Na powierzchni elektrod przygotowanych w punkcie (2) nakraplano po 10 μl roztworu zawierającego odpowiedni ligand:

przeciwciało Mab 6-9-1 w buforze PBS o składzie 0.1M PBS pH 7.4 (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM KH2PO4, 1.8 mM Na2HPO4) lub A- beta peptyd w buforze o składzie 50 mM TRIS, 300 mM NaCl, pH=7.4. Elektrody zabezpieczano przed odparowaniem wody przy pomocy parafilmu. Czas inkubacji wynosił 30 min.

Następnie elektrody pluskano odpowiednim buforem: PBS o składzie 0.1M PBS pH 7.4 (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM KH2PO4, 1.8 mM Na2HPO4) w przypadku przeciwciała Mab 6-9-1 lub buforem o składzie 50 mM TRIS, 300 mM NaCl, pH=7.4 w przypadku A- beta peptydu.

Po opłukaniu elektrod odpowiednim buforem, płukano je roztworem 0.1 M KCl i umieszczano w celce elektrochemicznej. Pomiary elektrochemiczne prowadzono w obecności roztworu 0.1 M KCl. Powstawanie na powierzchni elektrody kompleksu białko-ligand powodowało zmianę właściwości warstwy redoksaktywnej. Obserwowano obniżenie natężenia prądu utlenienia i redukcji centrum redox-aktywnego oraz przesunięcie potencjału położenia maksimum natężenia piku w kierunku potencjału

PL 222 250 B1 ujemnego. Zmiany te były proporcjonalne do stężenia ligandu. Do ich obserwowania stosowano technikę woltamperometrii fali prostokątnej.

Przykładowe wyniki uzyskane dla badania oddziaływań pomiędzy białkiem HA/Nde unieruchomionym na elektrodzie, a przeciwciałem Mab 6-9-1 znajdującym się w roztworze przedstawiono na figurze 1 natomiast badania oddziaływań pomiędzy domeną V białka RAGE unieruchomioną na elektrodzie a A-beta peptydem znajdującym się w roztworze przedstawiono na figurze 2.

W obu przypadkach zaobserwowano charakterystyczne obniżenie natężenia prądu oraz przesunięcie potencjału w kierunku wartości ujemnych wraz ze wzrostem stężenia dodawanego analitu świadczące o występowaniu oddziaływania pomiędzy zimmobilizowanym białkiem HA/Nde i przeciwciałem Mab 6-9-1 (figura 1) lub domeną V białka RAGE i A-beta peptydem (fig. 2).

Literatura:

1. Veronique Ballad, Christelle Hureju, Angela Maria Cusano, Singli Liu, Thierry Tron, Benoit

Limoges, „Oriented immobilization of fully active monolayer of histidine - tagged recombinant laccase on modified gold electrodes”, Chemistry A European Journal, 2008, 14, 7186-7192.

2. Ronald Blankespoor, Benoit Limoges, Bernard Schollhron, Jean - Laurent Syssa-Magale, Dounia Yazidi, Dense monolayers of metal -chelating ligands covalently attached to carbon electrodes electrochemically and their usefull application in affinity binding of histidine - tagged proteins”, Langmuir 21, 3362-3375.

3. Suman Lata, Jacob Piehler, “Stable and functional immobilization of histidine - tagged proteins via multivalent chelator headgroups on a molecular poly(ethylene glycol) brush”, Anal. Chem., 2005,77, 1096-1105.

4. J.F. Cabrita, L. M. Abrantes, A.S. Viana, „N-hydroxysuccinimide-terminated self - assembled monolayers on gold for biomolecules immobilization”, Electrochimica Acta, 2005, 50, 2117-2124.

5. Julio A. Camarero “Recent developments in the site-specific immobilization of proteins onto solid supports. Review Article”, Biopolymers (Peptide Science), 2007, vol. 90, no 3, 450-458.

6. Craig D. Blanchette, Nicholas O. Fischer, Michele Corzett, Graham Benach, Paul D. Hoeprich, „Kinetic analysis of his-tagged protein binding to Nikel-chelating nanolipoptrotein particles”, BioconjugateChem., DOI: 10.1021/bc100129s

7. George B. Signal, Cynthia Bamdad, Alcide Barberis, Jack Strominger, Georg M. Whitesides, Anal. Chem. 1996, 68, 490-497.

8. Taewoon Cha, Athena Guo, Yongseok Jun, Duanquing Pei, Xiao-Yang Zhu, “Immobilization of oriented protein molecules on poly(ethylene4 glycol) coated Si (111)”, Proteomics, 2004, 4, 1965-1976.

9. Michael C. Pirrung, “His-tags lighten up and Iose their inhibitions”, PNASEary Editions, DOI: 10.1073/pnas. 1002011107.

10. Yi-Chi C Liu, Nathaliec Rieben, Lars Iversen, Brian S Sorensen, Jiwoong Park, Jesper Nygard, Karen L Martinez, “Specificc and revesible immobilization of histidine - tagged proteins on functionalized Silicon nanaowires” Nanotechnology, 2010, 21, 245105(7 pp).

11. Iwona Szymańska, Magdalena Stobiecka, Czesława Orlewska, Taoufik Rohand, Dimitri Janssen, Wim Dehaen, Hanna Radecka, Electroactive dipyrromethene-Cu(II) self-assembled monolayers: complexation reaction on the surface of gold electrodes, Langmuir, 2008, 24, 11239-11245.

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Bioczujnik elektrochemiczny ze stabilną warstwą detekcyjną w postaci złącza molekularnego, znamienny tym, że warstwa detekcyjna czujnika obejmuje złote elektrody pokryte warstwą zawierającą kompleks dipirometen-Ni(II) albo kompleks dipirometen-Cu(II) w połączeniu z N-acetylocysteaminą oraz na warstwie detekcyjnej zawiera unieruchomione cząsteczki białka posiadające histydynowy łańcuch.
2. 2. Sposób wytwarzania bioczujnika elektrochemicznego ze stabilną warstwą detekcyjną, znamienny tym, że modyfikacja obejmuje: a) immobilizację mieszanej warstwy N-acetylocysteaminy oraz tiolowych pochodnych dipirometenu bezpośrednio na złotej elektrodzie oraz kompleksowanie jonów metali Cu⁺² lub Ni⁺² przez dipirometen w obecności N-acetylo-cysteaminy w celu wytworzenia złącza molekularnego; b) immobilizację cząsteczek białka posiadającego histydynowy łańcuch za pomocą

   PL 222 250 B1 etykietki oligohistydynowej do powierzchni zmodyfikowanych złączami molekularnymi określonymi w punkcie (a).
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że do skompleksowania jonów Cu(II) lub Ni(II) na powierzchni warstwy mieszanej unieruchomionej na powierzchni elektrod złotych składającej się z dipirometenu i N-acetylo-cysteaminy stosuje się roztwór octanu Cu(II) lub octanu Ni(II) w mieszaninie metanolu i chloroformu.
4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie a) oczyszczone mechanicznie i elektrochemicznie elektrody płucze się kolejno etanolem i chloroformem, następnie zanurza się w roztworze dipirometenu i N-acetylocysteaminy w stosunku molowym zawartym w przedziale 1:100 w chloroformie na co najmniej 18 godzin w temperaturze 4°C, po czym elektrody płucze się chloroformem oraz mieszaniną chloroform-metanol i zanurza w roztworze octanu miedzi (II) od 1.0 x 10^-4 do 1.0 x 10^-3 M w mieszaninie chloroform-metanol, w stosunku objętościowym 1:1 na co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej, roztwory modyfikujące umieszcza się w probówkach, po umieszczeniu elektrod w roztworach modyfikujących probówki zabezpiecza się w celu ochrony przed wyparowaniem rozpuszczalnika, a po modyfikacji elektrody płucze się w kolejności chloroformem, metanolem i wodą, a następnie przechowuje do momentu użycia.
5. 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie b) na opłukaną buforem i osuszoną azotem powierzchnię elektrod nakrapla się roztwór histagowanego białka w buforze o stężeniu od

   10 μΜ do 50 μΜ na okres co najmniej 24 godziny w temperaturze 4°C pod przykryciem, a po modyfikacji elektrody płucze się, a następnie kondycjonuje w buforze przez 16 godzin.
6. 6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie c) na powierzchnie elektrod przygotowanych w punkcie b) nakrapla się roztwór zawierający wybrany ligand w buforze dostosowanym do wybranego ligandu, po czym elektrody zabezpiecza się przed odparowaniem wody, gdzie czas inkubacji wynosi od 30 do 60 min., elektrody płucze się buforem dostosowanym do wybranego ligandu i umieszcza w celce elektrochemicznej.
7. 7. Sposób wytwarzania bioczujnika elektrochemicznego ze stabilną warstwą detekcyjną z kompleksem metalu przejściowego z dipirometenem, znamienny tym, że cząsteczkę histagowanego białka w buforze o stężeniu od 10 μΜ do 50 μM nakrapla się na opłukaną buforem i osuszoną azotem powierzchnię elektrod przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 4°C pod przykryciem, a po modyfikacji elektrody płucze się, a następnie kondycjonuje w buforze przez 16 godzin, tak, że cząsteczka białka jest immobilizowana za pomocą etykietki oligohistydynowej do powierzchni zmodyfikowanych złączami molekularnymi.
8. 8. Zastosowanie bioczujnika określonego w zastrz. 1, do pomiarów oddziaływań pomiędzy unieruchomionymi cząsteczkami histagowanych białek na powierzchni elektrod złotych a specyficznymi cząsteczkami obecnymi w roztworze wodnym.
9. 9. Zastosowanie bioczujnika określonego zastrz. 1 do wykrywania specyficznych cząsteczek za pomocą cząsteczek białek posiadających histydynowy łańcuch immobilizowanych na powierzchni elektrod zmodyfikowanych kompleksem metalu przejściowego z pochodnymi dipirometenu.