PL220375B1 - Sposób wytwarzania polihydroksyalkanolanów (PHA) z metanu przez konsorcjum bakteryjne zasiedlające skały przywęglowe - Google Patents

Sposób wytwarzania polihydroksyalkanolanów (PHA) z metanu przez konsorcjum bakteryjne zasiedlające skały przywęglowe

Info

Publication number
PL220375B1
PL220375B1 PL401711A PL40171112A PL220375B1 PL 220375 B1 PL220375 B1 PL 220375B1 PL 401711 A PL401711 A PL 401711A PL 40171112 A PL40171112 A PL 40171112A PL 220375 B1 PL220375 B1 PL 220375B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
bacteria
pha
phb
consortium
methanol
Prior art date
Application number
PL401711A
Other languages
English (en)
Other versions
PL401711A1 (pl
Inventor
Zofia Stępniewska
Agnieszka Kuźniar
Anna Pytlak
Original Assignee
Katolicki Univ Lubelski Jana Pawła Ii
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Katolicki Univ Lubelski Jana Pawła Ii filed Critical Katolicki Univ Lubelski Jana Pawła Ii
Priority to PL401711A priority Critical patent/PL220375B1/pl
Publication of PL401711A1 publication Critical patent/PL401711A1/pl
Publication of PL220375B1 publication Critical patent/PL220375B1/pl

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polihydroksyalkanolanów z metanu przez konsorcjum bakteryjne zasiedlające skały przywęglowe.
Polihydroksyalkanolany są syntetyzowane i akumulowane w komórkach bakterii i niektórych roślin (Verlinden R.A.J., Hill D.J., Kenward M.A., Williams C.D., Radecka I. (2007) Bacterial synthesis of biodegradable polyhydroxyalkanoates. Journal of Applied Microbiology 102(6); 437-1449) jako materiał zapasowy, stanowiący wewnętrzne źródło węgla i energii, umożliwiający im przetrwanie w niekorzystnych warunkach środowiska (Yilmaz M., Soran H., Yavuz B. (2005) Determination of poly-e-hydroxybutyrate (PHB) production by some Bacillus spp. World Journal of Microbiol Biotechnology 21(4): 565-566). Istnieją hipotezy mówiące o tym, że pełnią one także rolę regulatora wewnątrzkomórkowego potencjału oksydoredukcyjnego (Senior P. J., Dawes E. A. (1971) Poly-hydroxybutyrate biosynthesis and the regulation of glucose metabolism in Azotobacter beijerinckii. Journal of Biochemistry 125: 55-66). PHA syntetyzowane są komórkach bakteryjnych, szczególnie intensywnie w warunkach stresu, wywołanego niedostatkiem dostępnego N, P lub O, przy jednoczesnym braku ograniczenia ze strony substratu węglowego. Potwierdzono, iż przy zachowaniu tych warunków PHA mogą stanowić nawet 90% suchej masy komórek bakterii i do 40% masy komórek roślinnych (Verlinden R.A.J., Hill D.J., Kenward M.A., Williams C.D., Radecka I. (2007) Bacterial synthesis of biodegradable polyhydroxyalkanoates. Journal of Applied Microbiology 102(6): 437-1449).
Znanych jest szereg PHA syntetyzowanych przez mikroorganizmy. Tworzą one zarówno homojak i hetero polimery o długości od 600 do 35 000 cząsteczek, wśród których najczęściej występującym i o największym znaczeniu przemysłowym jest homopolimer kwasu hydroksylomasłowego (z ang. polyhydroksybutyric acid - PHB), charakteryzujący się wysoce krystaliczną strukturą (do 80%) i stosunkowo niską temperaturą wrzenia, wynoszącą 179°C (Hrabak O. (1992) Industrial production of Poly-β-hydroxybutyrate. FEMS Microbial Reviews, 103: 251-256). Strukturę i przykłady występujących w PHA monomerów przedstawiono na rys. 1.
R-wodór poli(3-hydroksypropionian)
R-metyl poli(3-hydroksymaślan)
R-etyl poli(3-hydroksywalerian)
R-pentyl poli(3-hydroksyoctan)
Rys. 1. Struktura wybranych monomerów PHA, występujących w komórkach bakteryjnych (za Lee S. Y., 1996, Bacterial Polyhydroxyalkanoates. Biotechnology and Bioengineering 49: 1-14).
PHA są nierozpuszczalne w wodzie a zatem gromadzone wewnątrz komórek w postaci zwartych ziaren. Korzyścią wynikającą z gromadzenia tych polimerów jest fakt, iż w tej formie nie wpływają na wewnątrzkomórkowy potencjał osmotyczny. Zakumulowane PHA są zabezpieczone przed wydaleniem z komórki, ich utrzymanie nie wymaga wysokich nakładów energii a jednocześnie stanowią łatwo dostępne źródło węgla. Dlatego też akumulacja PHA jest powszechnie występującą strategią przetrwania, wykorzystywaną m.in. przez Alcaligenes spp.. Bacillus spp., Azotobacter spp., Pseudomonas spp. i in. (Verlinden R.A.J., Hill D.J., Kenward M.A., Williams C.D., Radecka I. (2007) Bacterial synthesis of biodegradable polyhydroxyalkanoates. Journal of Applied Microbiology 102(6): 437-1449).
Polihydroksyalkanolany, a szczególnie polihydroksymaślan są polimerami w pełni biokompatybilnymi i biodegradowalnymi, nie wykazującymi właściwości toksycznych ani nie ulegającymi rozkładowi do związków szkodliwych (Chen G-Q., Wu Q. (2005) The application of polyhydroxyalkanoates as tissue engineering materials. Biomaterials 26: 6565-6578). Z tego względu od lat prowadzone są badania nad ich zastosowaniem w medycynie np. do produkcji narzędzi czy też tymczasowych protez, wykorzystywanych w chirurgii (rozpuszczalnych nici, połączeń naczyń krwionośnych i kości) (Chen G-Q., Wu Q. (2005) The application of polyhydroxyalkanoates as tissue engineering materials. Biomaterials 26: 6565-6578), czy też systemów służących do długoterminowego i ciągłego dawkowania leków.
Postulowane jest także wykorzystanie PHA w rolnictwie (do systemów spowolnionego uwalniania nawozów i pestycydów). Doskonałe właściwości termoplastyczne powodują, że PHA mogą być wykorzystywane do produkcji opakowań, jako domieszka do tradycyjnych (petrochemicznych) polimePL 220 375 B1 rów w celu przyspieszenia ich rozkładu w środowisku (Bonartsev A. P., Myshkina V. L. Nikolaeva D. A., Purina E. K., Makhina T. A, Livshits V. A., Boskhomdzhiev A. P., Ivanov E. A., lordanskii A. L., Bonartseva G. A. (2007) Biosynthesis, biodegradation, and application of poly(3-hydroxybutyrate) and its copolymers - natural polyesters produced by diazotrophic bacteria. Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology, Mendez-Vilas A., (Ed.),
295-307).
Produkcja PHA w oparciu o mikroorganizmy zazwyczaj opiera się na dwuetapowej fermentacji, której pierwszy etap prowadzony jest w warunkach zbilansowanego podłoża w celu wytworzenia jak największej ilości biomasy. W drugim etapie, podczas którego zachodzi synteza PHB, bakterie hodowane są na pożywce charakteryzującej się najczęściej ograniczoną dostępnością N (Verlinden i wsp., 2007). Powszechne zastosowanie PHA blokowane jest wysoką ceną tej substancji. Wysoki koszt procesu produkcji PHA wynika z charakteru dostarczanego mikroorganizmom źródła C, które stanowią najczęściej cukry, tłuszcze lub kwasy organiczne (Verlinden i wsp., 2007). Korzystną alternatywę w tym względzie mogą stanowić bakterie metanotroficzne, które zarówno do budowy biomasy jak i syntezy PHB wykorzystują CH4.
Zdolność do syntezy PHA, a szczególności PHB rozpowszechniona jest szczególnie wśród bakterii metanotroficznych typu II (Methylosinus spp. Methylocystis spp.), wykorzystujących do asymilacji C szlak serynowy. Znane są doniesienia na temat biosyntezy PHA przez czyste kultury bakterii metanotroficznych (Hang i wsp., 2008 Methylosinus trichosporium IMV3011; Xin J., Zhang Y., Dong J., Song H., Xia C. (2011) An experimental study on molecular weight of poly-3-hydroxybutyrate (PHB) accumulated in Methylosinus trichosporium IMV 3011. African Journal of Biotechnology 10 (36): 7078-7087) czy też konsorcjum wyizolowane z osadów aktywnych (Pieja A.J., Rostkowski K.H., Criddle C.S. (2011) Distribution and selection of poly-3-hydroxybutyrate production capacity in methanotrophic proteobacteria. Microbial Ecology 62(3):564-73).
Nieoczekiwanie okazało się, że możliwa jest produkcja PHA z metanu przy udziale konsorcjum bakterii matanotroficznych występujących w skałach przywęglowych.
Istota sposobu według wynalazku polega na tym, że skałę przywęglową najpierw rozdrabnia się do 0 < 2 i poddaje preinkubacji w temperaturze od 10 do 30°C przy wilgotności wynoszącej 25-200% całkowitej pojemności wodnej, w atmosferze zawierającej 1-50% CH4 v/v. Następnie skałą inokuluje się pożywkę NMS (Whittenbury R, Phillips K, Wilkinson J. Enrichment isolation and some properties of methane - utilizing bacteria. Journal of General Microbiology 1970; 61:205-218), zawierającą od 0,1 3 do 1 g/dm N-NO3 i inkubuje w temperaturze od 20 do 30°C, w atmosferze zawierającej 1-50% CH4 v/v, stale mieszając aż do osiągnięcia przez hodowlę stacjonarnej fazy wzrostu. Następnie bakterie oddziela się od podłoża i izoluje PHA metodą opisaną przez Zhang i wsp. (Zhang Y.X., Xin J.Y., Chen L.L., Song H., Xia C.G. (2008). Biosynthesis of poly-3-hydroxybutyrate with a high molecular weight by methanotroph from methane and methanol. Journal of Natural Gas Chemistry 17:103-109).
Większość metod izolacji PHA, w tym te stosowane wobec bakterii metanotroficznych bazuje na dwu strategiach. Pierwsza zakłada trawienie komórek przy pomocy surfaktantów i wysoce reaktywnych substancji jak np. podchloryn sodu, co prowadzi do uwolnienia niepodlegających rozkładowi w tych warunkach ziaren PHA. Druga strategia zakłada ekstrakcję PHA przy pomocy organicznych rozpuszczalników np. chloroformu. Zaletą tej metody jest wysoka czystość uzyskiwanej substancji natomiast wadą wysoki koszt środowiskowy, wynikający z dużej ilości i szkodliwości generowanych odpadów. Metodę tę stosowano z powodzeniem do odzyskiwania PHA syntetyzowanego przez Methylosinus trichosporium IMV3011 (Zhang Y.X., Xin J.Y., Chen L.L., Song H., Xia C.G. (2008) Biosynthesis of poly-3-hydroxybutyrate with a high molecular weight by methanotroph from methane and methanol. Journal of Natural Gas Chemistry 17:103-109).
P r z y k ł a d I.
Skałę przywęglową, rozdrobnioną do 0 < 2 mm, poddano preinkubacji w temperaturze 30°C, przy pełnej pojemności wodnej, w powietrzu zawierającym 10% v/v CH4 w. Po stwierdzeniu ubytku CH4 w atmosferze inkubacji, świadczącym o namnożeniu się bakterii metanotroficznych preinkubowaną skałą inokulowano 20 ml pożywki mineralnej NMS o składzie według Whittenbury i wsp. (1970), zmo-3 dyfikowanej poprzez zmniejszenie stężenia NO3- do 0,1 g/dm3. Namnażanie bakterii prowadzono w temperaturze 30°C, w atmosferze zawierającej 10% v/v CH4, przy 200 obr/min przez 6 dni. Następnie hodowlę odwirowano przez 10 minut przy 20 000 x g. Izolację PHB prowadzono metodą zaproponowaną przez Zhang i wsp. (2008). Uzyskany po wirowaniu osad komórek zawieszono w 10 ml 80% roztworu metanolu w wodzie i inkubowano przez 1,5 godz. w temp. 50°C. Po upływie tego czasu, lizaty
PL 220 375 B1 zawierające zdezintegrowane komórki oraz granule PHB odwirowano przy 20 000 x g przez 10 min. Ekstrakcję PHB z osadu prowadzono z wykorzystaniem 2 ml wrzącego chloroformu (temp. 70°C) przez 90 min. Rozpuszczony w chloroformie PHB filtrowano a następnie wytrącano z roztworu poprzez dodanie metanolu w proporcji objętościowej 1CH3Cl:5CH3OH. W celu uzyskania pełnej precypitacji próbki inkubowano przez 20 min. w temp. pokojowej a następnie wirowano przez 30 minut przy 20 000 x g. Po odwirowaniu PHB płukano dwukrotnie metanolem a następnie suszono w temp. 60°C.
Oznaczenie ilości uzyskanego PHB prowadzono spektrofotometrycznie, przy 235 nm, po uprzednim utlenieniu PHB do kwasu krotonowego przy pomocy stężonego H2SO4, metodą opisaną wcześniej przez Law i Slepecky. (Law J. Slepecky, R. A. (1961) Assay of poly-β-hydroxybutyric acid. Journal of Bacteriology 82: 52-55.) (rys. 2).
P r z y k ł a d II.
3
Jak wyżej, z tą różnicą, że hodowle bakterii prowadzone były na pożywce zawierającej 0,5 g/dm3 NO3- (rys. 2).
P r z y k ł a d III.
[140] Jak wyżej, z tą różnicą, że hodowle bakterii prowadzone były na pożywce zawierającej 1 g/dm3 NO3- (rys. 2).

Claims (1)

  1. Sposób wytwarzania PHA przy udziale konsorcjum bakterii metanotroficznych namnażanych na pożywce NMS, znamienny tym, że aktywną metanotroficznie skalę przywęglową rozdrobnioną do 0 < 2 mm poddaje się preinkubacji w temperaturze od 10 do 30°C, korzystnie 30°C, przy wilgotności wynoszącej
    25-200% pełnej pojemności wodnej w atmosferze zawierającej 1-50% CH4 v/v, następnie po namnożeniu 3 się bakterii metanotroficznych skałą inokuluje się ww. pożywkę NMS zawierającą od 0,1 do 1 g/dm N-NO3 i prowadzi hodowlę bakterii w temperaturze od 20 do 30°C w atmosferze zawierającej 1-50% CH4 v/v stale mieszając do osiągnięcia stacjonarnej fazy wzrostu, następnie wyhodowane bakterie oddziela się od podłoża i izoluje PHA dwuetapowo, w pierwszym etapie z komórek bakterii usuwa się lipidy i barwniki poprzez ekstrakcję 80% metanolem przez 1,5 godziny w temperaturze 50°C, a następnie PHB zawarty w masie bakteryjnej ekstrahuje się przy pomocy wrzącego chloroformu przez 1,5 godziny w temperaturze 70°C, po czym po odfiltrowaniu zanieczyszczeń PHB wytrąca się przy pomocy metanolu a następnie separuje i suszy w 60°C.
PL401711A 2012-11-22 2012-11-22 Sposób wytwarzania polihydroksyalkanolanów (PHA) z metanu przez konsorcjum bakteryjne zasiedlające skały przywęglowe PL220375B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL401711A PL220375B1 (pl) 2012-11-22 2012-11-22 Sposób wytwarzania polihydroksyalkanolanów (PHA) z metanu przez konsorcjum bakteryjne zasiedlające skały przywęglowe

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL401711A PL220375B1 (pl) 2012-11-22 2012-11-22 Sposób wytwarzania polihydroksyalkanolanów (PHA) z metanu przez konsorcjum bakteryjne zasiedlające skały przywęglowe

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL401711A1 PL401711A1 (pl) 2014-05-26
PL220375B1 true PL220375B1 (pl) 2015-10-30

Family

ID=50771868

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL401711A PL220375B1 (pl) 2012-11-22 2012-11-22 Sposób wytwarzania polihydroksyalkanolanów (PHA) z metanu przez konsorcjum bakteryjne zasiedlające skały przywęglowe

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL220375B1 (pl)

Also Published As

Publication number Publication date
PL401711A1 (pl) 2014-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Alsafadi et al. Utilizing the crop waste of date palm fruit to biosynthesize polyhydroxyalkanoate bioplastics with favorable properties
Pieja et al. Distribution and selection of poly-3-hydroxybutyrate production capacity in methanotrophic proteobacteria
Salgaonkar et al. Biosynthesis of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by Halogeometricum borinquense strain E3
Yamaguchi et al. Production of poly (3-hydroyxybutylate) by a novel alginolytic bacterium Hydrogenophaga sp. strain UMI-18 using alginate as a sole carbon source
Inoue et al. Polyhydroxyalkanoate production potential of heterotrophic bacteria in activated sludge
Ghoddosi et al. Effect of carbon sources for PHB production in bubble column bioreactor: Emphasis on improvement of methane uptake
Mandic et al. Biodegradation of poly (ε-caprolactone)(PCL) and medium chain length polyhydroxyalkanoate (mcl-PHA) using whole cells and cell free protein preparations of Pseudomonas and Streptomyces strains grown on waste cooking oil
Jung et al. Spontaneous liberation of intracellular polyhydroxybutyrate granules in Escherichia coli
Ng et al. Identification of a new polyhydroxyalkanoate (PHA) producer Aquitalea sp. USM4 (JCM 19919) and characterization of its PHA synthase
Di et al. Biodegradation of polyhydroxybutyrate by Pseudomonas sp. DSDY0501 and purification and characterization of polyhydroxybutyrate depolymerase
Esposito et al. Enhanced production of biobased, biodegradable, Poly (3-hydroxybutyrate) using an unexplored marine bacterium Pseudohalocynthiibacter aestuariivivens, isolated from highly polluted coastal environment
Tran et al. An efficient and eco-friendly approach for the sustainable recovery and properties characterization of polyhydroxyalkanoates produced by methanotrophs
Van Thuoc et al. Genome mining reveals the biosynthetic pathways of polyhydroxyalkanoate and ectoines of the halophilic strain Salinivibrio proteolyticus M318 isolated from fermented shrimp paste
Fang et al. A novel strategy for waste activated sludge treatment: Recovery of structural extracellular polymeric substances and fermentative production of volatile fatty acids
Jeyaseelan et al. Production of polyhydroxyalkanoate (PHA) using hydrolyzed grass and Syzygium cumini seed as low cost substrates
JP6274494B2 (ja) 微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法
Chang et al. Characterization of Ralstonia insidiosa C1 isolated from Alpine regions: Capability in polyhydroxyalkanoates degradation and production
Pu et al. Metabolic engineering of Salinivibrio sp. TGB10 for PHBV biosynthesis with a high 3-hydroxyvalerate fraction from starch and propionate
Jeon et al. Bioplastic (poly-3-hydroxybutyrate)-producing Massilia endophytica sp. nov., isolated from Cannabis sativa L.‘Cheungsam’
Amirul et al. Synthesis of biodegradable polyesters by Gram negative bacterium isolated from Malaysian environment
Tay et al. Polyhydroxyalkanoate (PHA) accumulating bacteria from the gut of higher termite Macrotermes carbonarius (Blattodea: Termitidae)
Koller et al. Physiological, kinetic, and process engineering aspects of polyhydroxyalkanoate biosynthesis by extremophiles
Das et al. Microbial and natural macromolecules: synthesis and applications
Chandrika et al. Bioremediation of coffee husk through polyhydroxyalkanoates (PHA) production for a greener environment
Xu et al. Extraction and characterization of PHB from Acidiphilium cryptum DX1-1