PL219695B1 - Microfluidic system for the cultivation of three-dimensional cellular structures and examining the cytotoxicity of chemical compounds - Google Patents
Microfluidic system for the cultivation of three-dimensional cellular structures and examining the cytotoxicity of chemical compoundsInfo
- Publication number
- PL219695B1 PL219695B1 PL399357A PL39935712A PL219695B1 PL 219695 B1 PL219695 B1 PL 219695B1 PL 399357 A PL399357 A PL 399357A PL 39935712 A PL39935712 A PL 39935712A PL 219695 B1 PL219695 B1 PL 219695B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- culture
- microcells
- spheroids
- well plate
- module
- Prior art date
Links
Description
Przedmiotem wynalazku jest system mikroprzepływowy do hodowli trójwymiarowych struktur komórkowych i badania cytotoksyczności związków chemicznych.The subject of the invention is a microfluidic system for the cultivation of three-dimensional cell structures and the study of the cytotoxicity of chemical compounds.
Hodowle komórkowe in vitro są popularnym narzędziem dla badań podstawowych oraz testów toksykologicznych czy farmakologicznych. Szczególne znaczenie dla wdrażania nowych leków mają systemy HTS (High Throughput Screening) umożliwiające szybką i powtarzalną analizę wielu próbek jednocześnie. Większość rozwiązań dążących do automatyzacji oznaczeń bazuje na wykorzystaniu płytek wielodołkowych (96-cio, 384-ro lub 1536-cio dołkowych), co wiąże się z rozbudowanym zapleczem aparaturowym. Poszukuje się wysokosprawnych metod umożliwiających otrzymywanie wyników pozwalających przewidzieć działanie związku na żywy organizm. Metody takie doprowadziłyby do zmniejszenia liczby zwierząt wykorzystywanych w badaniach.In vitro cell cultures are a popular tool for basic research as well as toxicological and pharmacological tests. Of particular importance for the implementation of new drugs are HTS (High Throughput Screening) systems that enable fast and repeatable analysis of many samples simultaneously. Most of the solutions aiming at the automation of determinations are based on the use of multi-well plates (96, 384 or 1,536 wells), which is associated with an extensive equipment base. They are looking for highly efficient methods that would allow to obtain results that would predict the action of a compound on a living organism. Such methods would reduce the number of animals used in research.
Modelem komórkowym najczęściej wykorzystywanym w systemach HTS jest monowarstwa komórek adherentnych. Jest to model wygodny w użyciu i stosunkowo prosty do analizy, jednak niewystarczający z punktu widzenia poszukiwania metod alternatywnych do testów na zwierzętach. Komórki wyizolowane z organizmu i hodowane w postaci monowarstwy na dnie naczynia hodowlanego tracą funkcje specyficzne dla danej tkanki. Otoczenie komórek w środowiskach in vivo oraz in vitro jest rozbieżne ze względu na brak bezpośrednich połączeń międzykomórkowych, różnice w topologii macierzy międzykomórkowej oraz brak sygnalingu parakrynnego i endokrynnego. W efekcie obserwuje znaczące rozbieżności w fizjologii komórek in vitro i in vivo - od budowy cytoszkieletu po zmiany w ekspresji genów.The cellular model most commonly used in HTS systems is the adherent cell monolayer. It is a model that is easy to use and relatively simple to analyze, but not sufficient from the point of view of alternatives to animal testing. Cells isolated from the body and grown as a monolayer at the bottom of the culture vessel lose tissue-specific functions. The cellular environment in in vivo and in vitro environments is divergent due to the lack of direct intercellular connections, differences in the matrix topology and the lack of paracrine and endocrine signaling. As a result, he observes significant divergences in cell physiology in vitro and in vivo - from the structure of the cytoskeleton to changes in gene expression.
Znany jest z publikacji Ziółkowska K. i in., marzec 2010, Sensors and Actuators B: Chemical, 145(1), 533-542 mikroukład do hodowli komórkowej. W szklanej płytce znajduje się macierz mikrokomór hodowlanych w układzie liniowym, przeznaczonych do prowadzenia hodowli komórek. Mikrokanały, korzystnie meandryczne, utworzone w płytce polimerowej, tworzą generator gradientu stężeń, zawierający dwa kanały wlotowe służące do wprowadzenia dwóch stężeń badanych substancji i kanały wylotowe połączone z mikrokomorami hodowlanymi i łączące mikrokomory hodowlane ze sobą wzdłuż mikroukładu. Od strony dwóch kanałów wlotowych znajdują się trzy mikrokanały, każdy następny etap generatora gradientu stężeń utworzony przez mikrokanały zawiera o jeden mikrokanał więcej. W ostatnim etapie generatora stężeń utworzonym przez mikrokanały znajduje się taka ilość mikrokanałów, która odpowiada ilości linii mikrokomór hodowlanych. W trakcie przepływu substancji przez generator gradientu stężeń następuje wymieszanie badanych substancji i tworzenie różnych stężeń. Pozwala to na otrzymanie macierzy mikrokomór z tyloma stężeniami badanej substancji w jednym kroku ile jest linii mikrokomór hodowlanych. Ponadto mikrosystem zawiera wywiercony w płytce polimerowej otwór do wprowadzenia komórek do mikroukładu oraz pożywek hodowlanych. Mikrokomory mają płaskie dno i uzyskane w nich hodowle komórkowe mają postać monowarstwy.It is known from the publication of Ziółkowska K. et al., March 2010, Sensors and Actuators B: Chemical, 145 (1), 533-542 microcircuit for cell culture. The glass plate contains an array of linear culture microcells intended for cell culture. Microchannels, preferably meandering, formed in the polymer wafer form a concentration gradient generator containing two inlet channels for introducing two concentrations of test substances and outlet channels connected to the rearing microchamber and connecting the rearing microchamber to each other along the microcircuit. There are three microchannels on the side of the two inlet channels, each successive stage of the concentration gradient generator formed by the microchannels contains one more microchannel. In the last stage of the concentration generator formed by the microchannels, there is an amount of microchannels that corresponds to the number of microchannel lines. As the substances flow through the concentration gradient generator, the test substances are mixed and formed at different concentrations. This allows to obtain a matrix of microcells with as many concentrations of the test substance in one step as there are lines of culture microcells. In addition, the microsystem includes a hole drilled in the polymer wafer for introducing cells into the microcircuit and culture media. The microchamber has a flat bottom and the cell cultures obtained therein are in the form of a monolayer.
Wyniki najnowszych badań na temat różnic między środowiskami in vivo a in vitro są przesłanką do poszukiwania nowych modeli in vitro. Obiecujące jest stosowanie w badaniach trójwymiarowych struktur komórkowych - sferoidów. Komórki adherentne hodowane w naczyniach o odpowiednim, hydrofobowym charakterze powierzchni, zamiast monowarstwy tworzą kuliste agregaty zwane sferoidami. Trójwymiarowa struktura, obecność macierzy międzykomórkowej, przestrzenne połączenia międzykomórkowe oraz warstwowa budowa tkanki powodująca opory dyfuzyjne sprawiają, że steroidy są modelem in vitro znacznie przybliżającym warunki in vivo. Jest to model szczególnie atrakcyjny dla badań nad nowotworami, gdyż wykazano, że sferoidy zbudowane z komórek nowotworowych wykazują szereg cech identycznych z guzami in vivo. Jednak brak wygodnych i powtarzalnych metod hodowli sferoidów w znacznym stopniu ogranicza ich szerokie wykorzystanie w badaniach. Istnieje potrzeba poszukiwania nowych metod, pozwalających na włączenie sferoidów do badań nad lekami przeciwnowotworowymi.The results of the latest studies on the differences between in vivo and in vitro environments are the basis for the search for new in vitro models. The use of three-dimensional cell structures - spheroids - is promising. Adherent cells grown in vessels with an appropriate, hydrophobic surface character, instead of a monolayer, form spherical aggregates called spheroids. The three-dimensional structure, the presence of the intercellular matrix, spatial intercellular connections and the layered structure of the tissue causing diffusion resistance make steroids an in vitro model that significantly approximates in vivo conditions. This model is particularly attractive for cancer research as it has been shown that spheroids composed of neoplastic cells exhibit a number of features identical to tumors in vivo. However, the lack of convenient and reproducible methods of culturing spheroids significantly limits their wide use in research. There is a need to search for new methods allowing the inclusion of spheroids in research on anti-cancer drugs.
Dotychczas opisano w literaturze kilka rozwiązań dotyczących hodowli sferoidów w układach mikroprzepływowych, jednak żadne z nich nie było kompatybilne z metodami analizy instrumentalnej. W ogromnej większości są to układy wymagające wieloetapowego wytwarzania, skomplikowanej obsługi oraz żmudnych metod detekcji (manualna obróbka obrazu mikroskopowego). Układy mikroprzepływowe do hodowli sferoidów złożone są z dwóch polimerowych płytek z których jedna, lub obie zawierają mikrostrukturę. Układy takie zawierają matrycę komór hodowlanych odpowiadających wielkościom pojedynczych sferoidów (poniżej 200 μm), z doprowadzeniem medium do każdej komory w postaci pojedynczego, wąskiego mikrokanału. Takie rozwiązanie powoduje wysokie wartości stresuSo far, several solutions for the cultivation of spheroids in microfluidic systems have been described in the literature, but none of them was compatible with the methods of instrumental analysis. The vast majority of these are systems that require multi-stage production, complicated handling and tedious detection methods (manual processing of the microscopic image). Microfluidic systems for spheroid culture are composed of two polymer plates, one or both of which contain a microstructure. Such systems contain a matrix of culture chambers corresponding to the size of individual spheroids (less than 200 µm), with the medium feeding to each chamber in the form of a single, narrow microchannel. This solution causes high stress values
PL 219 695 B1 hydrodynamicznego działającego na pojedynczy sferoid. W przypadku układów zawierających mikrostrukturę w obu warstwach polimeru, precyzja dopasowania wzorów znacznie wpływa na funkcjonalność, a im dokładniejsze dopasowanie jest konieczne, tym koszt urządzenia wyższy. Ze względów technologicznych komory hodowlane są odseparowane od siebie i położone na dość znacznej powierzchni, dlatego też żadne z opisanych w literaturze rozwiązań nie było kompatybilne z metodami analizy instrumentalnej (czytnikami płytek wielodołkowych). Znane jest również rozwiązanie zawierające wiele nisz hodowlanych w jednej mikrokomorze, jednak są to nisze małe, mieszczące do kilkunastu komórek, co nie w pełni odzwierciedla warunki in vivo. Jako alternatywa, opublikowany został system kompatybilny z czytnikami płytek wielodołkowych wykorzystujący hodowlę sferoidów w wiszącej kropli, jednak ten sposób hodowli w znaczący sposób ogranicza możliwość wymiany medium hodowlanego (dostarczanie związków pokarmowych, odprowadzanie produktów metabolizmu), przez co zgodność otrzymanych wyników może być poddana w wątpliwość.A single spheroid. In the case of systems containing microstructure in both polymer layers, the precision of pattern matching significantly affects the functionality, and the more accurate the fit is necessary, the higher the cost of the device. Due to technological reasons, the breeding chambers are separated from each other and located on a fairly large surface, therefore none of the solutions described in the literature was compatible with the methods of instrumental analysis (multi-well plate readers). There is also a known solution containing many breeding niches in one microcell, but these are small niches, accommodating up to a dozen cells, which does not fully reflect the in vivo conditions. As an alternative, a system compatible with multi-well plate readers has been published, using the culture of spheroids in a hanging drop, but this method of culture significantly reduces the possibility of replacing the culture medium (supplying nutrients, draining metabolic products), so the compliance of the obtained results may be questioned .
System mikroprzepływowy do hodowli trójwymiarowych struktur komórkowych i badania cytotoksyczności związków chemicznych składa się z modułu mikroprzepływowego oraz płytki pozycjonującej, przy czym moduł mikroprzepływowy składa się z dwóch warstw wykonanych z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) - warstwy górnej z wykonanymi portami wlotowymi i portem wylotowym i warstwy dolnej. W warstwie dolnej wykonana jest część hodowlana oraz system mikrokanałów doprowadzających medium hodowlane/roztwór badanego związku. W części hodowlanej znajdują się mikrokomory a w każdej mikrokomorze znajdują się półsferyczne mikrodołki hodowlane. Mikrokomory ułożone są w serie a ilość serii odpowiada ilości wylotów generatora gradientu stężeń mikrokanałów. Korzystnie mikrokomory mają średnice 3 mm i głębokość 50 μm i ułożone są w matrycę 4x4: cztery serie po cztery mikrokomory. Korzystnie w każdej mikrokomorze znajduje się dwadzieścia półsferyczych mikrodołków hodowlanych o średnicach 200 μm i głębokościach 150 μm. Wielkość mikrokomór oraz ich wzajemne położenie są identyczne z wielkością i położeniem grupy dołków standardowej płytki 384-dołkowej natomiast płytka pozycjonująca moduł mikroprzepływowy w spektrofluorymetrycznym czytniku płytek wielodołkowych posiada wgłębienia pozycjonujące ściśle dopasowane do kształtu modułu mikroprzepływowego i ma wymiary zewnętrzne zgodne ze standardową płytką 384-dołkową.The microflow system for the cultivation of three-dimensional cell structures and the study of the cytotoxicity of chemical compounds consists of a microfluidic module and a positioning plate, the microflow module consists of two layers made of poly (dimethylsiloxane) (PDMS) - the upper layer with inlet and outlet ports and bottom layer. In the lower layer there is a breeding part and a system of microchannels supplying the culture medium / test compound solution. There are microcells in the breeding part and in each microcell there are hemispherical culture microwells. The microcells are arranged in series and the number of series corresponds to the number of outlets of the generator of the microchannel concentration gradient. Preferably, the microcells have a diameter of 3 mm and a depth of 50 µm and are arranged in a 4x4 matrix: four series of four microcells. Preferably, each microcell there are twenty hemispherical culture microwells of 200 µm diameter and 150 µm depth. The size of the microcells and their relative position are identical to the size and position of the well group of a standard 384-well plate, while the microfluidic module positioning plate in the spectrofluorimetric multi-well plate reader has positioning recesses that closely match the shape of the microfluidic module and has external dimensions compatible with a standard 384-well plate.
Medium oraz badane związki doprowadzane są do mikrokomór systemem mikrokanałów tworzących generator gradientu stężeń. Za pomocą dwóch portów wlotowych doprowadzane są dwa roztwory o różnych stężeniach, które mieszane są w precyzyjny sposób w systemie mikrokanałów, dzięki czemu w czterech kanałach wylotowych znajdują się roztwory o ściśle zdefiniowanych stężeniach pośrednich. Do każdej z serii czterech mikrokomór doprowadzony jest roztwór związku o innym stężeniu, dzięki czemu możliwe jest badanie działania różnych stężeń związku w jednym eksperymencie. Porty wlotowe i wylotowe służą do montażu wężyków doprowadzających płyny.The medium and the tested compounds are supplied to the microcells by a system of microchannels that create a concentration gradient generator. Two solutions of different concentrations are supplied via the two inlet ports, which are precisely mixed in a microchannel system, thanks to which the four outlet channels contain solutions with precisely defined intermediate concentrations. Each of the series of four microcells is fed with a solution of the compound at a different concentration, which makes it possible to test the effect of different concentrations of the compound in one experiment. The inlet and outlet ports are used to install fluid supply hoses.
Drugim elementem systemu będącego przedmiotem wynalazku jest płytka pozycjonująca moduł mikroprzepływowy w spektrofluorymetrycznym czytniku płytek wielodołkowych. Mikrokomory hodowlane modułu mikroprzepływowego położone są w miejscach odpowiadających położeniu dołków standardowej płytki 384-dołkowej, do której przystosowanych jest większość urządzeń sczytujących. Moduł mikroprzepływowy ma precyzyjnie określone wymiary, kształt i pozycję mikrokomór względem brzegu. Wgłębienia pozycjonujące w płytce pozycjonującej są ściśle dopasowane do kształtu modułu mikroprzepływowego. Ich położenie i wymiary zostały wytworzone z dużą dokładnością za pomocą techniki mikrofrezowania w materiale polimerowym. Płytka pozycjonująca ma wymiary zgodne ze standardową płytką wielodołkową. Montaż modułu mikroprzepływowego we wgłębieniu pozycjonującym prowadzi do uzyskania pozycji mikrokomór analogicznej z pozycją dołków w płytce 384-dołkowej.The second element of the inventive system is the microfluidic module positioning plate in the spectrofluorimetric multi-well plate reader. The culture microcells of the microflow module are located in places corresponding to the well positions of a standard 384-well plate, to which most reading devices are adapted. The microflow module has precisely defined dimensions, shape and position of the microcells in relation to the edge. The positioning recesses in the positioning plate are closely matched to the shape of the microfluidic module. Their position and dimensions were produced with high accuracy using the micro-milling technique in a polymer material. The positioning plate is sized to match a standard multi-well plate. Mounting the microfluidic module in the positioning cavity results in a position of the microcells analogous to that of the wells in a 384-well plate.
Materiał, z którego wykonany jest moduł mikroprzepływowy (PDMS) promuje agregację komórek i tworzenie sferoidów. W przypadku wyjątkowo wymagających typów komórek, dopuszcza się chemiczną modyfikację powierzchni PDMS. Wielkość mikrodołków jest dobrana tak, aby zapewnić formowanie pojedynczych sferoidów komórek ludzkich w każdym dołku. Komórki wprowadzone do mikrodołka opadają na półsferyczne dno i agregują w centralnym jego miejscu, co prowadzi do otrzymania pojedynczych sferoidów w każdym mikrodołku. Wielkością otrzymanych sferoidów można sterować poprzez dobór odpowiedniej gęstości zawiesiny komórkowej. Ponadto moduł umożliwia wymywanie komórek niezagregowanych w mikrodołkach, co zapewnia precyzyjną kontrolę ilości i umiejscowienia materiału biologicznego. Stosunkowo duża średnica mikrokomór powoduje redukcję prędkości liniowej płynu przepływającego w części hodowlanej, co wpływa bezpośrednio na obniżenie stresu hydrodynamicznego działającego na komórki. Dzięki temu możliwa jest wielotygodniowa hodowla stabilnych sferoidów.The material of the microfluidic module (PDMS) promotes cell aggregation and the formation of spheroids. In the case of extremely demanding cell types, chemical modification of the PDMS surface is allowed. The size of the microwells is selected to ensure the formation of individual human cell spheroids in each well. Cells introduced into the microwell drop to the hemispherical bottom and aggregate at its center, resulting in single spheroids in each microwell. The size of the obtained spheroids can be controlled by selecting the appropriate density of the cell suspension. In addition, the module allows for the elution of non-aggregated cells in microwells, which ensures precise control of the amount and location of biological material. The relatively large diameter of the microcells reduces the linear velocity of the fluid flowing in the culture part, which directly reduces the hydrodynamic stress acting on the cells. Thanks to this, it is possible to cultivate stable spheroids for many weeks.
PL 219 695 B1PL 219 695 B1
System będący przedmiotem wynalazku jest rozwiązaniem spełniającym wymagania stawiane nowoczesnym modelom in vitro: zapewnia wzrost komórek w postaci struktur trójwymiarowych (sferoidów), umożliwia ścisłą kontrolę nad warunkami hodowli, obserwację pojedynczych sferoidów oraz system detekcji kompatybilny z układami HTS.The system that is the subject of the invention is a solution that meets the requirements set for modern in vitro models: it provides cell growth in the form of three-dimensional structures (spheroids), enables strict control of the culture conditions, observation of individual spheroids and a detection system compatible with HTS systems.
System będący przedmiotem wynalazku może służyć do monitorowania wzrostu sferoidów. Jest to cecha unikatowa proponowanego systemu, gdyż brak jest obecnie instrumentalnych metod przystosowanych do monitorowania wzrostu trójwymiarowych struktur komórkowych. Do określania aktywności metabolicznej hodowanych komórek może posłużyć np. odczynnik alamarBlue®, który jest fluorescencyjnym wskaźnikiem zmian potencjału utleniająco-redukującego medium hodowlanego. Aktywność metaboliczna komórek prowadzi do redukcji odczynnika, a w efekcie do powstania fluorescencyjnego produktu reakcji. Moduł mikroprzepływowy zawierający hodowlę komórkową należy wypełnić roztworem odczynnika i po okresie inkubacji umieścić w płytce pozycjonującej, a następnie w spektrofluorymetrycznym czytniku płytek wielodołkowych. Sygnał intensywności fluorescencji pochodzący z każdej mikrokomory jest wprostproporcjonalny do ilości oraz stopnia proliferacji komórek w sferoidach zawartych w mikrodołkach danej mikrokomory. Przepływowy charakter systemu umożliwia wymycie odczynnika wskaźnikowego i dalsze prowadzenie hodowli. W trakcie wielotygodniowej hodowli sferoidów w module mikroprzepływowym, istnieje możliwość wielokrotnego powtórzenia opisanego wyżej doświadczenia.The system according to the invention can serve to monitor the growth of spheroids. This is a unique feature of the proposed system, as there are currently no instrumental methods adapted to monitoring the growth of three-dimensional cell structures. To determine the metabolic activity of the cultured cells, for example, the alamarBlue® reagent can be used, which is a fluorescent indicator of changes in the oxidation-reduction potential of the culture medium. The metabolic activity of the cells leads to a reduction of the reagent and, consequently, to the formation of a fluorescent reaction product. The microfluidic module containing the cell culture should be filled with a reagent solution and, after the incubation period, placed in the positioning plate, and then in the spectrofluorimetric multi-well plate reader. The fluorescence intensity signal from each microchamber is directly proportional to the amount and degree of cell proliferation in the spheroids contained in the microwells of the microchamber. The flow-through nature of the system allows the indicator reagent to be washed out and the culture to continue. During the multi-week cultivation of spheroids in the microfluidic module, it is possible to repeat the above-described experiment several times.
System będący przedmiotem wynalazku może posłużyć również do oceny aktywności leków przeciwnowotworowych. W tym celu w module mikroprzepływowym prowadzi się hodowlę komórek nowotworowych w postaci sferoidów. W odpowiednio dobranym momencie hodowli (sugeruje się by była to faza logarytmicznego wzrostu komórek) podaje się lek w taki sposób, że jednym portem wlotowym wprowadzane jest medium hodowlane, natomiast drugim roztwór leku w medium hodowlanym o stężeniu CMAX. Po przeprowadzeniu strumieni przez generator gradientu stężeń, do poszczególnych serii mikrokomór wprowadzane są roztwory o kolejnych stężeniach: o CMAX (czyste medium hodowlane - kontrola), 0,33 CMAX, 0,67 CMAX oraz CMAX. Po określonym czasie inkubacji z lekiem przeprowadza się test żywotności komórek analogicznie do sposobu opisanego powyżej. Możliwe jest również wykorzystanie innych testów żywotności opartych na detekcji spektrofluorymetrycznej.The system, which is the subject of the invention, can also be used to evaluate the activity of anti-cancer drugs. For this purpose, neoplastic cells are cultured in the form of spheroids in the microfluidic module. At an appropriately selected moment of culture (it is suggested that it should be the phase of logarithmic cell growth), the drug is administered in such a way that the culture medium is introduced through one inlet port, and the drug solution in the culture medium with a concentration of C MAX is introduced through the other port. After the streams are passed through the concentration gradient generator, solutions with successive concentrations are introduced into each series of microcells: o C MAX (pure culture medium - control), 0.33 C MAX , 0.67 C MAX and C MAX . After a specified incubation time with the drug, a cell viability test is performed in analogy to the method described above. It is also possible to use other viability tests based on spectrofluorimetric detection.
Przepływowy charakter systemu umożliwia wymycie leku oraz odczynnika wskaźnikowego i dalsze prowadzenie hodowli. W trakcie wielotygodniowej hodowli sferoidów w module mikroprzepływowym, istnieje możliwość wprowadzania powtórnych dawek leku, jak również powtarzanie testów żywotności. Prowadzi to do unikatowej możliwości testowania powtórzonych dawek leku w warunkach in vitro, jak również określania cytotoksyczności opóźnionej.The flow-through nature of the system allows the drug and indicator reagent to be washed out and the cultivation to continue. During the multi-week cultivation of spheroids in the microflow module, it is possible to introduce repeated doses of the drug, as well as repeat the viability tests. This leads to the unique possibility of testing repeated doses of a drug in vitro as well as determining delayed cytotoxicity.
Przedmiot wynalazku przedstawiono na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia rzut ukośny modułu mikroprzepływowego do hodowli pojedynczych sferoidów z zachowaniem proporcji rzeczywistych, Fig. 2 przedstawia schematyczny przekrój przez układ mikroprzepływowy w proporcjach nierzeczywistych, Fig. 3 przedstawia rzut ukośny przykładu płytki pozycjonującej moduł mikroprzepływowy w czytniku płytek wielodołkowych, Fig. 4 przedstawia przykładowe pozycjonowania modułów mikroprzepływowych w czytniku płytek wielodołkowych (linią przerywaną zaznaczono pola, w których zachodzi detekcja za pomocą czytnika płytek 384-dołkowych).The subject of the invention is shown in the drawing, in which Fig. 1 shows an oblique view of the microfluidic module for the cultivation of single spheroids with real proportions, Fig. 2 shows a schematic cross-section through a microfluidic system in unreal proportions, in a multi-well plate reader, Fig. 4 shows an example of the positioning of microfluidic modules in the multi-well plate reader (the dotted lines indicate the fields that are detected with the 384-well plate reader).
P r z y k ł a d 1. Moduł mikroprzepływowy 10 do hodowli trójwymiarowych struktur komórkowych składa się z części hodowlanej 2a oraz systemu mikrokanałów 4 doprowadzających medium hodowlane/roztwór badanego związku. Elementy modułu wytworzone są z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS). Moduł mikroprzepływowy 10 składa się z dwóch warstw: warstwy dolnej 8 zawierającej wklęsły, trójwymiarowy wzór mikrostruktury oraz warstwy uszczelniającej 7 zawierającej otwory wlotowe 5 i wylotowe 6. Część hodowlana 2a jest skonstruowana tak, aby zapewnić wielodniową hodowlę trójwymiarowych agregatów komórkowych. W części hodowlanej 2a znajdują się mikrokomory 2 średnicy 3 mm i głębokości 50 μm ułożone w matrycę 4x4: cztery serie po cztery mikrokomory. W każdej m ikrokomorze 2 znajduje się dwadzieścia półsferyczych mikrodołków hodowlanych 1 o średnicach 200 μm i głębokościach 150 μm. W sumie układ zawiera 320 mikrodołków 1 (po 20 w każdej mikrokomorze) do hodowli pojedynczych sferoidów. Wielkość mikrokomór 2 oraz ich wzajemne położenie są identyczne z wielkością i położeniem grupy 16 (4x4) dołków standardowej płytki 384-dołkowej . Medium oraz badane związki doprowadzane są do mikrokomór 2 systemem mikrokonałów 4 tworzących generator gradientu stężeń. Na końcu każdego mikrokanału znajduje się kanał wylotowy 3 łączący mikrokanały 4 z mikrokomorami 2. Za pomocą dwóch portów wlotowych 5 doprowadzane są dwa roztwory o różnych stężeniach, które mieszane są w precyzyjny sposób w mikrokanałach 4, dziękiExample 1. The microflow module 10 for the cultivation of three-dimensional cell structures consists of a culture part 2a and a microchannel system 4 feeding the culture medium / test compound solution. The components of the module are made of poly (dimethylsiloxane) (PDMS). The microflow module 10 consists of two layers: a bottom layer 8 containing a concave three-dimensional microstructure pattern, and a sealing layer 7 containing inlet 5 and outlet openings 6. The growing part 2a is constructed to ensure multi-day cultivation of three-dimensional cell aggregates. In the rearing part 2a there are 2 microchamber 2 diameter 3 mm and a depth of 50 μm arranged in a 4x4 matrix: four series of four micro-chambers. In each microcell 2 there are twenty hemispherical culture microwells 1 with diameters of 200 μm and depths of 150 μm. In total, the system includes 320 microwells 1 (20 in each microcell) for the cultivation of individual spheroids. The size of the microcells 2 and their relative positions are identical to the size and position of a group of 16 (4x4) wells of a standard 384-well plate. The medium and the tested compounds are supplied to the microcells 2 by the system of microconvals 4 creating a concentration gradient generator. At the end of each microchannel there is an outlet channel 3 connecting the microchannels 4 with the microchamber 2. Two solutions of different concentrations are fed through the two inlet ports 5, which are mixed precisely in the microchannels 4 thanks to
PL 219 695 B1 czemu w czterech kanałach wylotowych 3 znajdują się roztwory o ściśle zdefiniowanych stężeniach pośrednich. Do każdej z serii czterech mikrokomór 2 doprowadzony jest roztwór związku o innym stężeniu, dzięki czemu możliwe jest badanie działania różnych stężeń związku w jednym eksperymencie. Porty wlotowe 5 i wylotowe 6 służą do montażu wężyków doprowadzających płyny.Thus, in the four outlet channels 3 there are solutions with strictly defined intermediate concentrations. Each of the series of four microcells 2 is supplied with a solution of the compound at a different concentration, which makes it possible to test the effect of different concentrations of the compound in one experiment. The inlet 5 and outlet 6 ports are used for mounting fluid hoses.
Materiał, z którego wykonany jest układ (PDMS) promuje agregację komórek i tworzenie sferoidów. W przypadku wyjątkowo wymagających typów komórek, dopuszcza się chemiczną modyfikację powierzchni PDMS. Wielkość mikrodołków 1 jest dobrana tak, aby zapewnić formowanie pojedynczych sferoidów komórek ludzkich w każdym dołku. Komórki wprowadzone do mikrodołka 1 opadają na półsferyczne dno i agregują w centralnym jego miejscu, co prowadzi do otrzymania pojedynczych sferoidów 9 w każdym mikrodołku 1. Wielkością otrzymanych sferoidów można sterować poprzez dobór odpowiedniej gęstości zawiesiny komórkowej. Ponadto wynalazek umożliwia wymywanie komórek niezagregowanych w mikrodołkach 1, co zapewnia precyzyjną kontrolę ilości umiejscowienia materiału biologicznego. Stosunkowo duża średnica mikrokomór 2 powoduje redukcję prędkości liniowej płynu przepływającego w części hodowlanej, co wpływa bezpośrednio na obniżenie stresu hydrodynamicznego działającego na komórki. Dzięki temu możliwa jest wielotygodniowa hodowla stabilnych sferoidów.The material of the system (PDMS) promotes cell aggregation and the formation of spheroids. In the case of extremely demanding cell types, chemical modification of the PDMS surface is allowed. The size of the microwells 1 is selected to ensure the formation of individual human cell spheroids in each well. Cells introduced into microwell 1 sink to the hemispherical bottom and aggregate in its central place, resulting in single spheroids 9 in each microwell 1. The size of the spheroids obtained can be controlled by selecting the appropriate density of the cell suspension. In addition, the invention allows for the elution of disaggregated cells in the microwells 1, which ensures a precise control of the amount of biological material localization. The relatively large diameter of the microcells 2 reduces the linear velocity of the fluid flowing in the culture part, which directly reduces the hydrodynamic stress acting on the cells. Thanks to this, it is possible to cultivate stable spheroids for many weeks.
Istotnym elementem systemu będącego przedmiotem wynalazku jest sposób pozycjonowania modułu mikroprzepływowego w spektrofluorymetrycznym czytniku płytek wielodołkowych. Urządzenia kompatybilne z czytnikami płytek wielodołkowych wpisują się w powszechne dążenia do opracowywania systemów HTS (High Throughput Screening). Mikrokomory hodowlane 2 modułu mikroprzepływowego 10 położone są w miejscach odpowiadających położeniu dołków standardowej płytki 384-dołkowej, do której przystosowanych jest większość urządzeń sczytujących. Moduł mikroprzepływowy 10 ma precyzyjnie określone wymiary, kształt i pozycję mikrokomór 2 względem brzegu. Wgłębienia pozycjonujące 11a i 11b wykonane w płytce pozycjonującej 11 są ściśle dopasowane do kształtu modułu mikroprzepływowego 10. Ich położenie i wymiary zostały wytworzone z dużą dokładnością za pomocą techniki mikrofrezowania w materiale polimerowym. Płytka pozycjonująca 11 ma wymiary zgodne ze standardową płytką wielodołkową. Montaż modułu mikroprzepływowego 10 we wgłębieniu pozycjonującym 11a prowadzi do uzyskania pozycji mikrokomór 4 analogicznej z pozycją dołków w płytce 384-dołkowej.An important element of the inventive system is the method of positioning the microfluidic module in a spectrofluorimetric multi-well plate reader. Devices compatible with multi-well plate readers are in line with the common efforts to develop HTS (High Throughput Screening) systems. The culture microchamber 2 of the microfluidic module 10 are located at the locations of the wells of a standard 384-well plate, to which most reading devices are adapted. The microfluidic module 10 has precisely defined dimensions, shape and position of the microcells 2 with respect to the edge. The positioning recesses 11a and 11b made in the positioning plate 11 are closely matched to the shape of the microfluidic module 10. Their position and dimensions have been produced with high accuracy by the technique of micro-milling in a polymer material. The positioning plate 11 is dimensioned according to a standard multi-well plate. Mounting the microflow module 10 in the positioning cavity 11a results in a position of the microcells 4 analogous to the position of the wells in a 384-well plate.
Użytkowanie modułu rozpoczyna się od sterylizacji poprzez ekspozycję na promieniowanie UV oraz przepływ 70% wodnego roztworu alkoholu etylowego. Tak przygotowany system wypełnia się medium hodowlanym, a następnie zawiesiną ludzkich komórek określonego typu (lub mieszaniną komórek różnych typów w celu stworzenia kokultury lub multikultury). Uszczelniony moduł umieszcza się w inkubatorze CO2 do hodowli komórkowych. Poli(dimetylosiloksan), z którego zbudowany jest moduł, zapewnia wymianę gazową z atmosferą inkubatora, dzięki czemu możliwa jest efektywna hodowla. Ze względu na hydrofobowy charakter powierzchni poli(dimetylosiloksanu) uniemożliwiona jest adhezja komórek i w ciągu pierwszych kilkunastu godzin hodowli następuje agregacja komórek w mikrodołkach, a następnie tworzenie sferoidów. Przepływ medium zastosowany po 24 godzinach od wprowadzenia komórek, wymywa niezagregowane komórki z wężyków i mikrokanałów, pozostawiając trójwymiarowe agregaty jedynie w mikrodołkach hodowlanych.The use of the module begins with sterilization through exposure to UV radiation and the flow of 70% aqueous solution of ethyl alcohol. The system prepared in this way is filled with the culture medium and then with a suspension of human cells of a certain type (or a mixture of cells of different types to create a co-culture or multiculture). The sealed module is placed in a CO 2 incubator for cell culture. The poly (dimethylsiloxane) of which the module is made ensures gas exchange with the atmosphere of the incubator, thanks to which effective cultivation is possible. Due to the hydrophobic nature of the poly (dimethylsiloxane) surface, cell adhesion is prevented, and during the first several hours of cultivation, cells aggregate in microwells, followed by the formation of spheroids. The medium flow applied 24 hours after the introduction of the cells washes disaggregated cells from the tubing and microchannels, leaving the three-dimensional aggregates only in the culture microwells.
Hodowlę sferoidów prowadzi się przy okresowej wymianie medium w układzie. Reżim wymiany medium oraz jego skład należy dobrać stosownie do typu hodowanych komórek. System będący przedmiotem wynalazku może służyć do monitorowania wzrostu sferoidów. Do określania aktywności ® metabolicznej hodowanych komórek może posłużyć np. odczynnik alamarBlue®, który jest fluorescencyjnym wskaźnikiem zmian potencjału utleniająco-redukującego medium hodowlanego. Aktywność metaboliczna komórek prowadzi do redukcji odczynnika, a w efekcie do powstania fluorescencyjnego produktu reakcji. Moduł mikroprzepływowy zawierający hodowlę komórkową należy wypełnić roztworem odczynnika i po okresie inkubacji umieścić w płytce pozycjonującej, a następnie w spektrofluorymetrycznym czytniku płytek wielodołkowych. Sygnał intensywności fluorescencji pochodzący z każdej mikrokomory jest wprostproporcjonalny do ilości oraz stopnia proliferacji komórek w sferoidach zawartych w mikrodołkach danej mikrokomory. Przepływowy charakter systemu umożliwia wymycie odczynnika wskaźnikowego i dalsze prowadzenie hodowli. W trakcie wielotygodniowej hodowli sferoidów w module mikroprzepływowym, istnieje możliwość wielokrotnego powtórzenia opisanego wyżej doświadczenia.The culture of spheroids is carried out with periodic replacement of the medium in the system. The medium exchange regime and its composition should be selected according to the type of cultured cells. The system according to the invention can serve to monitor the growth of spheroids. For the determination of the metabolic activity ® of the cultured cells, for example, the alamarBlue ® reagent can be used, which is a fluorescent indicator of changes in the oxidation-reduction potential of the culture medium. The metabolic activity of the cells leads to a reduction of the reagent and, consequently, to the formation of a fluorescent reaction product. The microfluidic module containing the cell culture should be filled with a reagent solution and, after the incubation period, placed in the positioning plate, and then in the spectrofluorimetric multi-well plate reader. The fluorescence intensity signal from each microchamber is directly proportional to the amount and degree of cell proliferation in the spheroids contained in the microwells of the microchamber. The flow-through nature of the system allows the indicator reagent to be washed out and the cultivation to continue. During the multi-week cultivation of spheroids in the microfluidic module, it is possible to repeat the above-described experiment several times.
P r z y k ł a d 2. System będący przedmiotem wynalazku może posłużyć również do oceny aktywności leków przeciwnowotworowych. W tym celu w module mikroprzepływowym prowadzi się ho6Example 2. The system, which is the subject of the invention, can also be used to evaluate the activity of anti-cancer drugs. For this, h 6 is run in the microfluidic module
PL 219 695 B1 dowlę komórek nowotworowych w postaci sferoidów. W odpowiednio dobranym momencie hodowli (sugeruje się by była to faza logarytmicznego wzrostu komórek) podaje się lek w taki sposób, że jednym portem wlotowym wprowadzane jest medium hodowlane, natomiast drugim roztwór leku w medium hodowlanym o stężeniu CMAX. Po przeprowadzeniu strumieni przez generator gradientu stężeń, do poszczególnych serii mikrokomór wprowadzane są roztwory o kolejnych stężeniach: 0 CMAX (czyste medium hodowlane - kontrola), 0,33 CMAX, 0,67 CMAX oraz CMAX. Po określonym czasie inkubacji z lekiem przeprowadza się test żywotności komórek analogicznie do sposobu opisanego w przykładzie 1. Możliwe jest również wykorzystanie innych testów żywotności opartych na detekcji spektrofluorymetrycznej. Przepływowy charakter systemu umożliwia wymycie leku oraz odczynnika wskaźnikowego i dalsze prowadzenie hodowli. W trakcie wielotygodniowej hodowli sferoidów w module mikroprzepływowym, istnieje możliwość wprowadzania powtórnych dawek leku, jak również powtarzanie testów żywotności. Prowadzi to do unikatowej możliwości testowania powtórzonych dawek leku w warunkach in vitro, jak również określania cytotoksyczności opóźnionej.A culture of neoplastic cells in the form of spheroids. At an appropriately selected moment of culture (it is suggested that it should be the phase of logarithmic cell growth), the drug is administered in such a way that the culture medium is introduced through one inlet port, and the drug solution in the culture medium with a concentration of C MAX is introduced through the other port. After passing the streams through the concentration gradient generator, solutions with successive concentrations are introduced into each series of microcells: 0 C MAX (pure culture medium - control), 0.33 C MAX , 0.67 C MAX and C MAX . After a specified incubation time with the drug, a cell viability test is performed analogously to the method described in Example 1. It is also possible to use other viability tests based on spectrofluorimetric detection. The flow-through nature of the system allows the drug and indicator reagent to be washed out and the cultivation to continue. During the multi-week cultivation of spheroids in the microflow module, it is possible to introduce repeated doses of the drug, as well as repeat the viability tests. This leads to the unique possibility of testing repeated doses of a drug in vitro as well as determining delayed cytotoxicity.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL399357A PL219695B1 (en) | 2012-05-29 | 2012-05-29 | Microfluidic system for the cultivation of three-dimensional cellular structures and examining the cytotoxicity of chemical compounds |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL399357A PL219695B1 (en) | 2012-05-29 | 2012-05-29 | Microfluidic system for the cultivation of three-dimensional cellular structures and examining the cytotoxicity of chemical compounds |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL399357A1 PL399357A1 (en) | 2013-12-09 |
| PL219695B1 true PL219695B1 (en) | 2015-06-30 |
Family
ID=49684160
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL399357A PL219695B1 (en) | 2012-05-29 | 2012-05-29 | Microfluidic system for the cultivation of three-dimensional cellular structures and examining the cytotoxicity of chemical compounds |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL219695B1 (en) |
-
2012
- 2012-05-29 PL PL399357A patent/PL219695B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL399357A1 (en) | 2013-12-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10179897B2 (en) | Cell culture and gradient migration assay methods and devices | |
| Kamei et al. | An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells | |
| Sivagnanam et al. | Exploring living multicellular organisms, organs, and tissues using microfluidic systems | |
| US20160340631A1 (en) | Layered microfluidic array | |
| CN106238112B (en) | A kind of micro-fluidic chip and its application in the identification and drug sensitive experiment of pathogen | |
| US20030077817A1 (en) | Microfermentor device and cell based screening method | |
| JP2017093467A (en) | Cell culture and gradient migration assay method and device | |
| US10144945B2 (en) | Layered microfluidic living cell array | |
| AU2012308096B2 (en) | Substance exposure apparatus | |
| AU2002303311A1 (en) | Microfermentor device and cell based screening method | |
| EP2529238A2 (en) | Hanging drop devices, systems and/or methods | |
| DK2680961T3 (en) | Process for monitoring a reaction and reaction system for carrying it out | |
| Lee et al. | Unified 2D and 3D cell-based high-throughput screening platform using a micropillar/microwell chip | |
| US20190161715A1 (en) | Layered microfluidic array | |
| US20140322701A1 (en) | Miniaturized, automated in-vitro tissue bioreactor | |
| PL219695B1 (en) | Microfluidic system for the cultivation of three-dimensional cellular structures and examining the cytotoxicity of chemical compounds | |
| CN106434346A (en) | Chip for sieving medicines under oxygen gradient and preparation method and application of chip | |
| PL237365B1 (en) | Microfluidal device for growing cell culture in a gradient of bioactive substance | |
| Bhanpattanakul et al. | Triangular microwell for single cell trapping and short-term culturing: Cellular study and analysis of Leukemia cell line. | |
| US11377634B2 (en) | 3D micro fabrication and screening | |
| WO2020226519A1 (en) | Magnetic microfluidic device for high-throughput screening | |
| CN115595266A (en) | Biochip and method for manufacturing the same | |
| Dorrigiv et al. | Pixelated microfluidics for drug screening on tumour spheroids and ex vivo microdissected primary tissue | |
| WO2023081354A1 (en) | Apparatus and methods for generating and analyzing three-dimensional cellular materials | |
| BR102021015397A2 (en) | MICROFLUID DEVICE WITH REVERSIBLE SEALING FOR DRUG SCREENING AND CELL BEHAVIOR |