PL217827B1 - Gen kodujący białko heterologiczne hemaglutyniny wirusa grypy ptaków, (54) sposób otrzymywania tych genów, szczep bakterii mlekowych, jego zastosowanie, oraz kompozycja immunogenna i szczepionka ptasiej grypy - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest gen kodujący heterologiczne białko hemaglutyniny wirusa grypy ptaków (HA), o sekwencji przedstawionej na rysunku fig. 1 (HA 1-568), oraz jego pochodne fig. 2 (HA 17-568), fig. 3 (HA17-522), fig. 4 (HA1-568His), fig. 5 (HA17-568His), jak też gen interleukiny kurzej drugiej o sekwencji przedstawionej na rysunku fig. 6 (chIL-2), sposób mikrobiologicznego wytwarzania tych genów oraz kodowanych przez nie białek heterologicznych, bakterie mlekowe z rodzaju Lactococcus, Lactobacillus lub Bifidobacterium, zawierające te geny, zastosowanie wytwarzanych białek, kompozycja immunogenna oraz skuteczny preparat szczepionkowy. Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja nukleotydowa regionu promotorowego genu ptcB, o długości obejmującej region -10 i -35, przedstawiona na fig. 7, do stosowania w optymalizacji produkcji białek heterologicznych, według wynalazku.

WPROWADZENIE

Grypa ptaków to choroba zakaźna występująca powszechnie u ptaków. Jej czynnikiem etiologicznym jest wirus z rodziny Orthomyxoviridae, który powoduje zachorowania o charakterze epidemicznym lub pandemicznym. Głównym źródłem zagrożenia dla zdrowia ludzi i zwierząt (drobiu) są ptaki wolnożyjące (głównie ptaki wodne), będące bezobjawowymi nosicielami wirusa ptasiej grypy. Najbardziej prawdopodobnym źródłem zakażenia drobiu domowego jest bezpośredni lub pośredni kontakt (woda do picia) z takim ptactwem. Rezerwuar zwierzęcy wirusów grypy oraz powtarzające się od 1997 r. przypadki zakażeń człowieka przez wirusy ptasie, wskazują, że istnieje realna groźba pandemii. Najgroźniejszym obecnie szczepem wirusa jest szczep H5N1. W przypadku zakażenia ludzi choroba ma znacznie cięższy przebieg w porównaniu z „klasyczną” grypą ludzką. W wielu przypadkach zakażenia zaobserwowano następujące objawy: gorączka, ból gardła, kaszel, wirusowe zapalenie płuc, w wyniku którego dochodzi do ostrej niewydolności oddechowej. Nie stwierdzono przechodzenia wirusa z człowieka na człowieka - chociaż takiego zagrożenia nie można wykluczyć ponieważ wirus ma zdolność do tzw. mutacji. Biorąc pod uwagę bardzo duże straty ekonomiczne powodowane ewentualnym wybuchem choroby (śmiertelność w przypadku drobiu może sięgać nawet 100%), pojawia się konieczność podjęcia działań mających na celu ochronę zdrowia ludzi i zwierząt, związaną z zagrożeniem wysoce zjadliwą grypą ptaków oraz ograniczenie ryzyka szerzenia się choroby. Dostępne leki przeciwwirusowe są dość drogie. By uchroniły przed zachorowaniem, należałoby przyjmować je przez długi czas. Nadal jednak nie ma pewności, czy byłyby skuteczne w przypadku zmutowanego wirusa. Najczęściej stosowane w leczeniu grypy farmaceutyki to Tamiflu (OseItamivir) oraz Relenza (Zanamivir), są to inhibitory neuraminidazy wirusa A i B, które hamują uwalnianie replikowanych wirusów grypy z zakażonych komórek. Ogranicza to progresję choroby i zmniejsza ryzyko powikłań pogrypowych. Ich stosowanie jest jednak obarczone pewnym ryzykiem ostrzeżenia o możliwych skutkach ubocznych stosowania tych leków.

Za najbardziej skuteczną metodę walki z grypą ptaków uważa się szczepienia profilaktyczne ptaków. Szczepienie ptactwa może ograniczyć przenoszenie się wirusa na zdrowe ptaki w stadzie i zapobiec epidemii choroby. Takie rozwiązanie miałoby też korzyści ekonomiczne. Dzięki szczepionkom nie trzeba byłoby wybijać całych stad, w których znaleziono pojedyncze chore osobniki. Ograniczenie przenoszenia się wirusa wśród zwierząt zminimalizowałoby także zagrożenie pandemią ptasiej grypy wśród ludzi. Obecnie trwają intensywne prace nad stworzeniem szczepionki przeciwko ptasiej grypie. Naukowcy poznali dotychczas 15 typów hemaglutyniny i 9 neuraminidazy, część z nich występuje w różnych zestawieniach w ludzkich szczepach grypy. Kombinacje tych białek są składnikami szczepionek przeciwko grypie. Wprowadzenie do organizmu białka antygenowego powoduje wytworzenie pewnej odporności na tę konkretną substancję. Pomimo ogromnych wysiłków naukowców nie udało się w pełni zapanować nad grypą przez szczepienia ochronne, tak jak w przypadku innych chorób wywoływanych przez RNAwirusy (np. wścieklizna, choroba HeinegoMedina, różyczka). Ciągłe zmiany antygenowe wirusa grypy powodują, że trudno stworzyć skuteczną szczepionkę. Zmiana nawet jednego aminokwasu w wyniku punktowej mutacji, może powodować destrukcję wiązania pomiędzy antygenem wirusowym a przeciwciałem. Szczepionki przeciw grypie muszą więc być systematycznie modyfikowane. W związku z tym intensywnie poszukuje się elastycznych systemów pozwalających na łatwe wprowadzanie genów wirusowych i ich nowych wariantów oraz wydajną, relatywnie szybką i korzystną ekonomicznie produkcję antygenów.

Podjęcie badań mających na celu opracowanie sposobu wytwarzania białek HA, jej wariantów oraz białka kurzego IL-2 w bakteriach mlekowych wiązało się z kilkoma przesłankami: (i) dotychczasowe

PL 217 827 B1 pozytywne wyniki stosowania bakterii mlekowych, jako producentów czynników immunomodulacyjnych (cytokin i antygenów), w tym także, jako szczepionek (ii) wykazanie potencjału indukującego odpowiedź immunologiczną białka hemaglutyniny (HA) oraz immunomodulacyjnych właściwości białka kurzej interleukiny 2 (IL-2) (iii) duże straty ekonomiczne w przemyśle drobiarskim związane z upadkami ptaków i eradykacją wirusa (iv) konieczność podjęcia skutecznych działań zapobiegających rozprzestrzenianiu wirusa i jak dotychczas brak skutecznej szczepionki.

AKTUALNY STAN WIEDZY

Hemaglutynina jest głównym białkiem wirusa grypy zdolnym do indukcji wytwarzania przeciwciał przez zainfekowanego gospodarza. Klonowane sekwencje w obrębie których zawarte są sekwencje nukleotydowe genu HA (fragment podkreślony) przedstawiono na rysunkach fig. 1-5.

Wiadomo, że niezależnie od serotypu zakażającego wirusa, neutralizujące przeciwciała antyHA wiążą się zawsze do tego samego epitopu w obrębie fragmentu odpowiedzialnego za fuzję. Większość badań nad szczepionkami wskazuje, że najbardziej immunogenne (dające najwyższe miano przeciwciał) są te, które zawierają całą hemaglutyninę. Inni uważają, że przyszłość należy do szczepionek o zoptymalizowanych epitopach. Hemaglutynina wykazuje następujące właściwości biologiczne: powoduje zlepianie erytrocytów, umożliwia łączenie się wirusa z czerwonymi krwinkami gospodarza, umożliwia adsorbcję wirusa do receptora komórkowego, odpowiada za połączenie wirusa z komórką poprzez fuzję osłonki wirusa z błoną komórkową, warunkuje integrację osłonki wirusowej z błoną komórkową gospodarza, powoduje wniknięcie wirionu do cytoplazmy komórki gospodarza i uwolnienie jego zawartości, co ułatwia penetrację zakażonej komórki, umożliwia uwolnienie dojrzałych wirionów z zakażonej komórki na drodze pączkowania; jest potrzebna do dalszego rozprzestrzeniania się wirusa w zakażonym organizmie; zapobiega aglutynacji wirusów w wyniku działania ich własnej hemaglutyniny poprzez eliminację kwasu sialowego z części węglowodanowej syntetyzowanych glikoprotein wirusowych HA i NA.

Kurza interleukina 2 (IL-2) jest immunostymulatorem, czyli substancją wzmagającą czynności miejscowego lub ogólnoustrojowego układu odpornościowego. Klonowaną sekwencję w obrębie której zawarta jest sekwencja nukleotydowa genu chIL-2 (fragment podkreślony) przedstawiono na rysunkach fig. 6.

Interleukina 2 jest glikoproteiną wytwarzaną przez limfocyty T pod wpływem mitogenów nieswoistych i swoistych. Indukuje proliferację limfocytów T pomocniczych i supresorowych oraz cytotoksycznych. Wzmaga czynność limfocytów NK. Dzięki takim właściwościom może być wykorzystywana w przypadku szczepionek jako naturalny adiuwant.

Nieoczekiwanie okazało się, że wykorzystanie bakterii fermentacji mlekowej, jako fabryk biologicznych produkujących białka heterologiczne według wynalazku jest bardzo atrakcyjne naukowo i aplikacyjnie. Takie podejście prezentuje wiele korzystnych cech medyczno-farmakologicznych. Wśród tych ostatnich duże nadzieje wiąże się z możliwością wykorzystania bakterii mlekowych jako wektorów szczepionkowych, tj. w produkcji szczepionek doustnych. Poszerzaniu zakresu aplikacji biotechnologicznych bakterii mlekowych sprzyjają dwa fakty. Po pierwsze, nadany tym bakteriom status GRAS, czyli bakterii niechorobotwórczych, bezpiecznych dla zdrowia ludzi i zwierząt. Po drugie, bardzo rozwinięte, intensywne i szeroko zakrojone badania naukowe nad bakteriami mlekowymi. Genomika, genomika funkcjonalna oraz metagenomika z wykorzystaniem globalnych analiz ekspresji genów, to obszary badawcze ostatnio rozwijane w pracach nad tymi bakteriami. Naturalne właściwości niektórych szczepów bakterii mlekowych mogą wpływać immunomodulacyjnie na organizm ludzi i zwierząt. Pojawiają się także prace wskazujące na możliwość stosowania bakterii mlekowych wytwarzających heterologiczne białka antygenowe lub zaangażowane w odpowiedź immunologiczną organizmu (np.: ureaza z Helicobacter pylori, LcrV - białko antygenowe odpowiedzi na niskie stężenie wapnia z Yersinia pseudotuberculosis, antygen EP7 wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 czy interleukiny ludzkie IL10 i IL12 ), jako szczepionek doustnych.

Okazało się, że możliwe jest opracowanie systemu do ekspresji genów, kodujących białka heterologiczne według wynalazku, w komórkach bakterii fermentacji mlekowej z rodzaju Lactococcus, Lactobacillus oraz Bifidobacterium i użycie ich jako bakteryjnych producentów, a następnie skutecznych immunomodulatorów w celu stworzenia preparatu o potencjalnym szczepionkowym zastosowaniu.

Gen kodujący heterologiczne białko hemaglutyniny wirusa grypy ptaków (HA), wybrany z grupy obejmującej geny o sekwencjach przedstawionych na rysunku fig. 1 (HA 1-568), fig. 2 (HA 17-568), fig. 3 (HA17-522), fig. 4 (HA1-568His), fig. 5 (HA17-568His), kodujące odpowiednie białka heterologiczne

PL 217 827 B1 o sekwencjach aminokwasowych przedstawionych na rysunku fig. 1a (HA 1-568), fig. 2a (HA 17-568), fig. 3a (HA17-522), fig. 4a (HA1-568His), fig. 5a (HA17-568His).

Gen kodujący heterologiczne białko interleukiny kurzej drugiej o sekwencji przedstawionej na rysunku fig. 6 (chIL-2), kodujący białko interleukiny kurzej drugiej o sekwencji przedstawionej na rysunku fig. 6a (chlL- 2).

Sposób wytwarzania poszczególnych genów kodujących wybrane warianty heterologicznego białka hemaglutyniny wirusa grypy ptaków (HA) przedstawione na rysunku fig. 1 (HA 1-568), fig. 2 (HA 17-568), fig. 3 (HA17-522), fig. 4 (HA1-568His), fig. 5 (HA17-568His), kodujące białka o sekwencjach aminokwasowych przedstawionych odpowiednio na fig. 1a (HA 1-568), fig. 2a (HA 17-568), fig. 3a (HA17-522), fig. 4a (HA1-568His), fig. 5a (HA17-568His), według wynalazku, polega na ich syntezie metodą PCR na bazie wyjściowej matrycy (cząsteczka cDNA), z wykorzystaniem dla każdego genu 2 komplementarnych starterów (Tabela 1), których sekwencje nukleotydowe zostały zaprojektowane tak, aby odpowiadały kodonom preferencyjnie występującym u bakterii z rodzaju Lactococcus, Lactobacillus oraz Bifidobacterium przy czym, dodatkowo do sekwencji nukleotydowej starterów forward dla każdego genu wprowadzono sekwencję, odpowiadającą kodonowi START translacji (ATG), tuż przed sekwencją kodującą pierwszy aminokwas oryginalnych sekwencji peptydowych. Jednocześnie końce 5' starterów forward zawierają dodatkową sekwencję, typową dla RBS (ang. ribosome-binding site, miejsce wiązania rybosomu) Lactococcus lactis, rozpoznawaną przez maszynerię translacyjną, a także sekwencję 'spacer' (łącznik) zlokalizowaną między regionem RBS (ang. ribosome-binding site, miejsce wiązania rybosomu), a kodonem start.

W sposobie według wynalazku, korzystnie, końce 5' starterów niosą dodatkowo sekwencje rozpoznawane przez specyficzne endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie BamHI (forward) oraz XhoI (reverse) dla genów HA.

Sposób wytwarzania genu kodującego białko interleukiny kurzej drugiej chIL-2 o wzorze przedstawionym na rysunku fig. 6, według wynalazku, polega na jego syntezie metodą PCR na bazie wyjściowej matrycy (cząsteczka cDNA), z wykorzystaniem 2 komplementarnych starterów (Tabela 1), których sekwencje nukleotydowe zostały zaprojektowane tak, aby odpowiadały kodonom preferencyjnie występującym u bakterii z rodzaju Lactococcus, Lactobacillus oraz Bifidobacterium przy czym, dodatkowo do sekwencji nukleotydowej starterów forward wprowadzono sekwencję, odpowiadającą kodonowi START translacji (ATG), tuż przed sekwencją kodującą pierwszy aminokwas oryginalnych sekwencji peptydowych. Jednocześnie koniec 5' starterów forward zawiera dodatkową sekwencję, typową dla RBS (ang. ribosome-binding site, miejsce wiązania rybosomów) Lactococcus lactis, rozpoznawaną przez maszynerię translacyjną, a także sekwencję 'spacer' (łącznik) zlokalizowaną między regionem RBS (ang. ribosome-binding site, miejsce wiązania rybosomów), a kodonem start. W sposobie według wynalazku, korzystnie, końce 5' starterów niosą dodatkowo sekwencje rozpoznawane przez specyficzne endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie BoxI (forward) oraz AgeI i BoxI (reverse) dla genu chIL-2.

W wyniku PCR z użyciem tak zaprojektowanych starterów według wynalazku, otrzymuje się fragmenty DNA o sekwencjach przedstawionych na rysunku fig. 1, 2, 3, 4, 5, 6, w obrębie których zawarte są sekwencje genów kodujące badane białka heterologiczne (fragmenty podkreślone).

Przedmiotem wynalazku jest również szczep bakterii z rodzaju Lactococcus, Lactobacillus lub Bifidobacterium, korzystnie z gatunku Lactococcus lactis, zawierający plazmid wybrany z grupy plazmidów kodujących poszczególne geny wirusowej hemaglutyniny o sekwencjach przedstawionych na fig. 1 (HA 1-568), fig. 2 (HA 17-568), fig. 3 (HA17-522), fig. 4 (HA1-568His), fig. 5 (HA17-568His) i/lub opcjonalnie gen interleukiny kurzej drugiej o sekwencji przedstawionej na rysunku fig. 6 (chIL-2), kodujące odpowiednie białka heterologiczne o sekwencjach aminokwasowych przedstawionych na rysunku fig. 1a (HA 1-568), fig. 2a (HA 17-568), fig. 3a (HA17-522), fig. 4a (HA1-568His), fig. 5a (HA17-568His), oraz białko interleukiny kurzej drugiej o sekwencji przedstawionej na rysunku fig. 6a (chIL-2).

Szczep z rodzaju Lactococcus, Lactobacillus lub Bifidobacterium, szczególnie Lactococcus lactis IL1403, Lactococcus Iactis IBB477, Lactococcus Iactis IBB360 zawierający gen kodujący wybrane białko heterologiczne, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na rysunku (fig. 1 - 6) i sekwencji aminokwasowej kodowanego białka heterologicznego (fig. 1a - 6a).

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja immunogenna do indukowania w ptasim gospodarzu odpowiedzi immunologicznej przeciwko wirusowi ptasiej grypy (HA), która obejmuje co najmniej jeden szczep bakterii z rodzaju Lactococcus, Lactobacillus lub Bifidobacterium, korzystnie z gatunku Lactococcus Iactis, zawierający plazmid wybrany z grupy plazmidów kodujących poszczególne

PL 217 827 B1 geny wirusowej hemaglutyniny o sekwencjach przedstawionych na fig. 1 (HA 1-568), fig. 2 (HA 17-568), fig. 3 (HA17-522), fig. 4 (HA1-568His), fig. 5 (HA17-568His), oraz opcjonalnie gen interleukiny kurzej drugiej o sekwencji przedstawionej na rysunku fig. 6 (chIL-2), kodujące odpowiednie białka heterologiczne o sekwencjach aminokwasowych przedstawionych na rysunku fig. 1a (HA 1-568), fig. 2a (HA 17-568), fig. 3a (HA17-522), fig. 4a (HA1-568His), fig. 5a (HA17-568His), oraz białko interleukiny kurzej drugiej o sekwencji przedstawionej na rysunku fig. 6a (chIL-2).

W wyniku realizacji wynalazku okazało się, że możliwe jest:

a) wytwarzanie syntetycznych genów kodujących wybrane białka heterologiczne metodą PCR;

b) klonowanie, w komórkach wybranych szczepów gramdodatnich bakterii mlekowych z rodzaju

Lactococcus, rodzaju Lactobacillus oraz Bifidobacterium otrzymanych genów rekombinowanych z odpowiednimi wektorami do klonowania oraz uzyskanie ekspresji tych genów;

c) optymalizacja biosyntezy białek heterologicznych według wynalazku w bakteriach mlekowych;

d) optymalizacja sposobów ich uwalniania z komórek gram dodatnich bakterii mlekowych z rodzaju Lactococcus, Lactobacillus i Bifidobacterium.

Sposób wytwarzania genów kodujących wybrane białka heterologiczne polega, według wynalazku, na ich syntezie metodą PCR na bazie wyjściowej matrycy (cząsteczka cDNA), wykorzystując dla każdego genu 2 komplementarne startery (Tabela 1), których sekwencje nukleotydowe zostały zaprojektowane tak, aby odpowiadały kodonom preferencyjnie występującym w bakterii z rodzaju Lactococcus, Lactobacillus i Bifidobacterium, korzystnie z gatunku Lactococcus Iactis. Dodatkowo do sekwencji nukleotydowej starterów forward dla każdego peptydu wprowadzono sekwencję, odpowiadającą kodonowi START translacji (ATG), tuż przed sekwencją kodującą pierwszy aminokwas oryginalnych sekwencji peptydowych. Jednocześnie końce 5' starterów forward zawierają dodatkową sekwencję, typową dla RBS (ang. ribosome-binding site, miejsce wiązania rybosomu) Lactococcus Iactis, rozpoznawaną przez maszynerię translacyjną oraz sekwencje 'spacer' (łącznik) zlokalizowaną między regionem RBS, a kodonem start. Końce 5' starterów niosą dodatkowo sekwencje rozpoznawane przez specyficzne endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie BamHI (forward) oraz XhoI (reverse) dla genów HA i BoxI (forward) oraz AgeI i BoxI (reverse) dla genu chIL-2. Końce 5' starterów reverse posiadają dodatkowo dwukrotnie powtórzoną sekwencję odpowiadającą kodowi STOP translacji (TAA), a dwa z nich tzw. sekwencję His-tag (6xHis). W wyniku reakcji PCR używając tak zaprojektowanych starterów według wynalazku, otrzymuje się fragmenty DNA o sekwencjach nukleotydowych przedstawionych na fig. 1-6, w obrębie których zawarte są sekwencje genów kodujących badane białka heterologiczne (fragmenty podkreślone).

Zastosowanie genów wytworzonych sposobem według wynalazku, transformowanych szczepów Lactococcus Iactis, Lactobacillus lub Bifidobacterium, szczególnie Lactococcus Iactis IL1403, Lactococcus Iactis IBB477, Lactococcus Iactis IBB360 jako składników szczepionki przeciw ptasiej grypie.

Efektem zastosowania wytworzonych według wynalazku transformowanych szczepów z rodzaju Lactococcus, Lactobacillus lub Bifidobacterium, preferencyjnie Lactococcus Iactis IL1403, Lactococcus Iactis IBB477 oraz Lactococcus Iactis IBB360, jest uzyskanie szczepionki przeciw ptasiej grypie.

Szczepionka przeciw ptasiej grypie, według wynalazku zawiera wybrany transformowany szczep bakterii z rodzaju Lactococcus, Lactobacillus lub Bifidobacterium, zawierający plazmid wybrany z grupy plazmidów kodujących poszczególne geny wirusowej hemaglutyniny o sekwencjach przedstawionych na fig. 1 (HA 1-568), fig. 2 (HA 17-568), fig. 3 (HA17-522), fig. 4 (HA1-568His), fig. 5 (HA17-568His), oraz opcjonalnie gen interleukiny kurzej drugiej o sekwencji przedstawionej na rysunku fig. 6 (chIL-2), kodujące odpowiednie białka heterologiczne o sekwencjach aminokwasowych przedstawionych na rysunku fig. 1a (HA 1-568), fig. 2a (HA17-568), fig. 3a (HA17-522), fig. 4a (HA1-568His), fig. 5a (HA17-568His), oraz białko interleukiny kurzej drugiej o sekwencji przedstawionej na rysunku fig. 6a (chIL-2).

Sposób klonowania genów według wynalazku.

Sposób klonowania otrzymanych genów dla wybranych białek heterologicznych w szczepach bakterii mlekowych polega, według wynalazku, na poddaniu ich podwójnemu trawieniu enzymami restrykcyjnymi, preferencyjnie BamHI i XhoI w przypadku HA i BoxI w przypadku chIL-2, a następnie połączeniu z wektorem plazmidowym zdolnym do replikacji w komórkach bakterii mlekowych, korzystnie z rodzaju Lactococcus, zwłaszcza pIL253, trawionym uprzednio tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. Postępowanie to ma na celu uzyskanie plazmidów rekombinowanych, w których kierunek/orientacja wklonowanych produktów PCR (wstawek) byłaby zgodna z kierunkiem transkrypcji kierowanej z wewnętrznego promotora obecnego w wektorze. Zrekombinowane DNA wprowadza się

PL 217 827 B1 metodą elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które inkubuje się w znany sposób. Z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy gen, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność wstawek, zawierających odpowiednie geny. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych genów z ich sekwencjami wyjściowymi potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.

Szczepy bakterii mlekowych

W sposobie według wynalazku, korzystnie jako gramdodatnie szczepy bakterii mlekowych, do których wprowadza się rekombinowane DNA, stosuje się korzystnie szczepy z rodzaju Lactococcus, np. Lactococcus Iactis IL1403, Lactococcus Iactis IBB477 oraz Lactococcus lactis IBB360, o różnym stopniu przeżywalności w przewodzie pokarmowym ssaków oraz inne rodzaje bakterii mlekowych, preferencyjnie Lactobacillus oraz Bifidobacterium.

Sposób badania ekspresji genów według wynalazku

W sposobie według wynalazku, korzystnie prowadzi się ekspresję syntetycznych genów wybranych białek heterologicznych w komórkach szczepów bakterii mlekowych, zwłaszcza z rodzaju Lactococcus, hodując komórki na znanym podłożu specyficznym dla bakterii mlekowych, preferencyjnie na pożywce M17 lub podłożu zdefiniowanym typu CDM (z ang. chemically defined medium), z dodatkiem cukru, korzystnie glukozy lub celobiozy, w stężeniu nie mniejszym niż 0,5% lub też na mleku czy też innym odpowiednim podłożu, w temperaturze w granicach 20°-30°C, preferencyjnie 30°C, do OD powyżej 0,6. Tak otrzymany materiał bakteryjny, wykorzystywany jest odpowiednio do analiz ekspresji badanych genów.

Sposób badania ekspresji genów według wynalazku na poziomie transkrypcji

Sposób badania ekspresji genów wybranych białek heterologicznych na poziomie transkrypcji, według wynalazku, przeprowadza się wykorzystując metodę odwrotnej transkrypcji (RT-PCR). Z bakteryjnych szczepów niosących rekombinowane plazmidy izolowane jest w znany sposób całkowite RNA, które po odpowiedniej obróbce znanymi metodami poddawane jest reakcji odwrotnej transkrypcji przy użyciu starterów (reverse) komplementarnych do końca 3' genu, korzystnie starterów reverse podanych w TABELI 2. Tak otrzymane cDNA poddawane jest następnie reakcji amplifikacji techniką klasycznego PCR, wykorzystując dwie pary starterów (forward i reverse), korzystnie o sekwencjach podanych w TABELI 1. W wyniku przeprowadzonych badań otrzymywane są specyficzne produkty dla każdego z analizowanych genów, o wielkości odpowiadającej długości amplifikowanego regionu.

Sposób badania ekspresji genów według wynalazku na poziomie translacji.

Sposób badania ekspresji genów wybranych białek heterologicznych na poziomie translacji, według wynalazku, przeprowadza się znanymi metodami immunologicznymi, preferencyjnie metodą dot-blot, western-blot, wykorzystując ekstrakty białkowe otrzymane opisanymi metodami z odpowiednich rekombinowanych komórek bakteryjnych i zawieszone w buforze o pH lekko zasadowym, preferencyjnie buforze PBS, pH 7,4, oraz odpowiednie, specyficzne przeciwciała.

Optymalizacja biosyntezy białek heterologicznych według wynalazku w bakteriach mlekowych

Optymalizacja biosyntezy wybranych białek heterologicznych w bakteriach mlekowych polega, według wynalazku, na zastąpieniu wewnętrznego konstytutywnego promotora na wektorze plazmidowym replikującym się w komórkach L. Iactis, korzystnie przez region promotorowy genu pochodzącego z genomu bakterii L. Iactis, preferencyjnie przez region promotorowy genu zaangażowanego w katabolizm cukrów u bakterii mlekowych z rodzaju Lactococcus, ptcB, który jest regulowany poprzez obecność różnych źródeł węgla, t.j. glukozy, celobiozy, galaktozy, salicyny, eskuliny. Ekspresja genów wybranych białek heterologicznych w komórkach bakterii mlekowych, korzystnie z rodzaju Lactococcus, według wynalazku, polega na hodowli komórek niosących rekombinowany wektor plazmidowy (ze sklonowanym sztucznym genem oraz odpowiednim regionem promotorowym, korzystnie promotorem genu ptcB o długości obejmującej region -10 i -35 sekwencji nukleotydowej, przedstawionej na fig. 7, z genomu bakterii szczepu Lactococcus Iactis IL1403,) na znanym podłożu specyficznym dla bakterii mlekowych, zwłaszcza mleku lub serwatce, preferencyjnie na podłożu zdefiniowanym typu CDM (z ang. chemically defined medium), z dodatkiem cukru, korzystnie glukozy lub celobiozy, o stężeniu > 0,5%, w temperaturze w granicach 20°-30°C, preferencyjnie 30°C, do OD powyżej 0,6. Żwirowaniu osadu bakteryjnego, zebraniu supernatantu i izolacji z tych dwóch ostatnich białek znanymi metodami.

Sekwencja regionu promotorowego genu ptcB

Sposób według wynalazku, korzystnie polega na wytworzeniu techniką PCR regionu promotorowego genu ptcS, podlegającego indukcji w obecności różnych cukrów jako źródła węgla, preferencyjnie

PL 217 827 B1 celobiozy, poprzez użycie jako matrycy chromosomalnego DNA szczepu L. Iactis IL1403 oraz pary starterów (forward i reverse) komplementarnych do końców 5' sekwencji regionu promotorowego chromosomalnego genu ptcB oraz zmodyfikowanych tak, aby na ich końcach 5' znajdowały się sekwencje rozpoznawane przez odpowiednie endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie VspI (dla startera forward) oraz NciI (dla startera reverse) (TABELA 3). W wyniku reakcji PCR używając tak zaprojektowanych starterów według wynalazku otrzymuje się fragment DNA o sekwencji przedstawionej wzorem fig. 7, w obrębie której zawarta jest sekwencja klonowanego regionu promotorowego o długości obejmującej region -10 i -35 (fragment podkreślony).

Następny etap polega na poddaniu takiego produktu PCR działaniu preferencyjnie wymienionymi enzymami i połączeniu go z rekombinowanymi wektorami niosącymi geny, kodujące wybrane białka heterologiczne, z których usunięto oryginalny region promotorowy (np. poprzez działanie tych samych restryktaz). Zrekombinowane DNA wprowadzane jest metodą elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które hoduje się w znany sposób. Z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy region promotorowy, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność oczekiwanego fragmentu DNA. Zgodność sekwencji nukleotydowej sklonowanego regionu promotorowego potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.

Zastosowanie wytworzonych według wynalazku transformowanych szczepów Lactococcus

Iactis

Efektem zastosowania wytworzonych według wynalazku transformowanych szczepów Lactococcus Iactis, preferencyjnie Lactococcus Iactis IL1403, Lactococcus Iactis IBB477 oraz Lactococcus Iactis IBB360 lub innych rodzajów bakterii mlekowych, preferencyjnie Lactobacillus oraz Bifidobacterium jako szczepionek, jest wywołanie odpowiedniego poziomu odpowiedzi immunologicznej u szczepionych ptaków, a co za tym idzie wytworzenie ochrony immunologicznej przed zakażeniem zjadliwym szczepem wirusa grypy ptaków H5N1. Najskuteczniejsze warianty mogą służyć do walki z wirusem grypy ptaków na poziomie działań profilaktycznych.

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku.

P r z y k ł a d I.

Geny hemaglutyniny (HA) wirusa grypy ptaków, jego poszczególne warianty i gen kurzej interleukiny 2 (chIL-2) otrzymano przez syntezę metodą PCR na wyjściowej matrycy jaką stanowiło odpowiednie cDNA. Dla każdego genu kodującego wybrany peptyd zastosowano 2 komplementarne startery przedstawione w TABELI 1. W wyniku przeprowadzonej reakcji amplifikacji otrzymano następujące, produkty PCR: HA1-568, HA17-568, HA17-522, HA1-568His, HA17-568His, chIL-2, kodujące odpowiednio sekwencje aminokwasowe: HA1-568 aa, HA17-568 aa, HA17-522 aa, HA1-568His aa, HA17-568His aa, chIL-2 aa. Produkty te poddawano działaniu odpowiednich enzymów restrykcyjnych. W przypadku genu HA i jego wariantów enzymami BamHI (forward) oraz XhoI (reverse) i BoxI dla genu chIL-2. Następnie rekombinowane je z wektorem plazmidowym Lactococcus Iactis, pIL253, trawionym uprzednio tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. W wyniku takiego postępowania uzyskano odpowiednie plazmidy rekombinowane, w których kierunek/orientacja wklonowanych produktów PCR (wstawek) była zgodna z kierunkiem transkrypcji kierowanej z wewnętrznego promotora obecnego w wektorze. Zrekombinowane DNA wprowadzano metodą elektroporacji do komórek wybranych szczepów bakteryjnych Lactococcus Iactis: IL1403, IBB360 i IBB477, które inkubowano w znany sposób. Obecność odpowiednich sekwencji genów potwierdzano metodą PCR. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych genów z ich sekwencjami wyjściowymi potwierdzono przy użyciu reakcji sekwencjonowania.

P r z y k ł a d II.

Dla sklonowanych genów: HA1-568, HA17-568, HA17-522, HA1-568His, HA17-568His, chIL-2 przeprowadzono analizę na poziomie transkrypcji wykorzystując metodę RT-PCR. Z bakteryjnych szczepów niosących rekombinowane plazmidy izolowano całkowite RNA, które po odpowiedniej obróbce poddawano odwrotnej transkrypcji przy użyciu starterów (reverse) komplementarnych do końca 3' genu (TABELA 2). Otrzymane cDNA poddawano standardowej reakcji amplifikacji wykorzystując pary starterów (forward i reverse), specyficzne dla klonowanych genów (TABELA 1). Dla wszystkich analizowanych konstruktów otrzymano na żelu agarozowym produkty amplifikacji o wielkości odpowiadającej długości badanego regionu.

P r z y k ł a d III.

Badanie ekspresji genów kodujących białka: HA1-568 aa, HA17-568 aa, HA17-522 aa, HA1-568His aa, HA17-568His aa, chIL-2 aa polegało na hodowli komórek transformowanych szczepów na

PL 217 827 B1 podłożu zdefiniowanym typu CDM z dodatkiem glukozy lub celobiozy, w stężeniu 0,5%, w temperaturze 30°C do wartości OD powyżej 0,6. Z otrzymanej masy bakteryjnej oraz supernatantu izolowano białka, które zawieszano w buforze PBS o pH 7,4. Identyfikacji konkretnych białek heterologicznych dokonano przy pomocy kilkuetapowych reakcji typu dot-blot i western-blot z wykorzystaniem odpowiednich przeciwciał mono- i poliklonalnych. Pozytywny wynik reakcji uzyskano w przypadku wszystkich badanych wariantów.

P r z y k ł a d IV.

W celu zwiększenia wydajności produkcji analizowanych białek heterologicznych zastąpiono naturalny promotor występujący w wektorze plazmidowym pIL253 promotorem ptcB. Region promotorowy namnożono w reakcji PCR wykorzystując parę specyficznych starterów (Tabela 3). Otrzymany produkt PCR trawiono enzymami restrykcyjnymi VspI oraz NciI. Tak przygotowany region promotorowy wprowadzono do wektora pIL253, uprzednio trawionego tymi samymi enzymami restrykcyjnumi, w miejsce oryginalnego promotora plazmidowego. Transformanty analizowano techniką PCR, w celu potwierdzenia obecności oczekiwanego fragmentu DNA, a zgodność sekwencji nukleotydowej potwierdzono sekwencjonowaniem. W ten sposób otrzymano warianty szczepów, w których badane geny heterologiczne HA1-568, HA17-568, HA17-522, HA1-568His, HA17-568His, chIL-2 znajdowały się pod regulacją promotora ptcB, podlegającego indukcji w obecności różnych cukrów jako źródła węgla. Funkcjonalność promotora i poziom ekspresji badanych genów analizowano analogicznie jak w przykładach 2 i 3.

Materiały i metody

Szczepy bakteryjne, warunki hodowlane i stosowane plazmidy.

Szczepy bakteryjne i plazmidy stosowane w niniejszych badaniach przedstawiono w TABELI 4. Szczepy Lactococcus Iactis hodowano na podłożach M17 (Oxoid, Anglia) z dodatkiem 0,5% glukozy lub podłożu składanym CDM z dodatkiem glukozy lub cellobiozy (0,5%- 1%), w temperaturze 30°C. Gdy zachodziła potrzeba, w celach selekcyjnych, stosowano następujące antybiotyki: erytromycynę 5 pg/ml dla szczepów IL1403 i IBB360 L. Iactis oraz erytromycynę 5 pg/ml i tetracyklinę 2 pg/ml dla szczepu IBB 477.

TABELA 1

Nazwa startera	Sekwencja nukleotydowa
HA For	5’ CGGGATCCCG AAGGAGTATT TCTATGGAGA ATATAGTGC TTCTTT 3’
HA17 For	5’ CGGGATCCG AAGGAGTATT TCTATG CAGATTTGCATTGGTTACC 3’
HA Rev	5’ CCGCTCGAGTTAAATGCAAATTCT 3 ’
HA52 2 Rev	5’ CCGGCTCGAGTTATTATACTCCACTTATTTCCTC 3'
HA His Rev	5’CCGCTCGAGTTATTAATGATGATGATGATGATGAATGCAAATTCTGCGTTG 3 ’
ehlL-2 For	5’GC GACGAGCGTCAAAAGGAGGTATTTCTATGATGTGCAAATGA3’
chIL-2 Rev	5’CGGACGAGCGTCGCGACCGGTTTATTATTTTTGCAG3’

PL 217 827 B1

TABELA 2,

Nazwa startera reverse w reakcji RT-PCR	Sekwencja nukleotydowa
HA Rev	5’ CCGCTCGAGTTAAATGCAAATTCT3’
HA 522 Rev	5’ CCGGĆTCGAGTTATTATACTCCACTTATTTCCTC 3’
chIL-2 Rev	Ś’CGGACGAGĆGTCGCGACCGGTTTATTATTTTTGCAG3’

TABELA 3

Nazwa startera	Sekwencja nukleotydowa
ptcB For	5’GCGATTAATGTCGCCTAAAGGTTGC3 ’
ptcB Rev	5 ’ AA fCCCGGCGTTTT AT A ATTTAACGTTC3 ’

TABELA 4.

Zastosowane szczepy /plazmidy Lactococcus	Nazwa
1.Szczep laboratoryjny, bezpfazmidowy	ILI403
2. Szczep autoiizujący	ΪΒΒ 360
3. Szczep adhezyjny	IBB 477
4. Plazmid bakteryjny Lactococcus	pJL253

Zastrzeżenia patentowe

Claims (13)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Gen kodujący białko heterologiczne hemaglutyniny wirusa grypy ptaków (HA), o sekwencji nukleotydowej wybranej z grupy obejmującej sekwencje HA 1-568, HA 17-568, HA17-522, HA1-568His, HA17-568His, kodujące odpowiednie białka o sekwencjach aminokwasowych HA 1-568, HA 17-568, HA17-522), HA1-568His, HA17-568His lub peptydy wykazujące 80% homologię do powyższych sekwencji białkowych.
2. 2. Gen interleukiny kurzej drugiej o sekwencji chIL-2, kodujący białko interleukiny kurzej drugiej o sekwencji chIL-2 lub innych peptydów wykazujących 80% homologię do powyższych sekwencji białkowych.
3. 3. Szczep Lactococcus Iactis, zwłaszcza Lactobacillus oraz Bifidobacterium, szczególnie Lactococcus lactis IL1403, Lactococcus Iactis IBB477, Lactococcus Iactis IBB360 zawierające geny kodujące wybrane białka heterologiczne, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej powyżej i kodujący odpowiednią sekwencję aminokwasową kodowanego białka heterologicznego.
4. 4. Sposób wytwarzania genu kodującego białko heterologiczne hemaglutyniny wirusa grypy ptaków (HA) i jego wariantów, HA 1-568, HA 17-568, HA17-522, HA1-568His, HA17-568His, znamienny tym, że prowadzi się syntezę tych genów metodą PCR na bazie wyjściowej matrycy - cząsteczki cDNA, z wykorzystaniem dla każdego genu 2 komplementarnych starterów, których sekwencje nukleotydowe zostały zaprojektowane tak, aby odpowiadały kodonom preferencyjnie występującym u bakterii z gatunku Lactococcus Iactis, rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium przy czym dodatkowo

   PL 217 827 B1 do sekwencji nukleotydowej starterów forward dla każdego genu wprowadzono sekwencję, odpowiadającą kodonowi START translacji (ATG), tuż przed sekwencją kodującą pierwszy aminokwas oryginalnych sekwencji peptydowych, a jednocześnie końce 5' starterów forward zawierają dodatkową sekwencję, typową dla RBS (ang. ribosome-binding site, miejsce wiązania rybosomu) Lactococcus Iactis, rozpoznawaną przez maszynerię translacyjną, a także sekwencję 'spacer' (łącznik) zlokalizowaną między regionem RBS, a kodonem start.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że końce 5' starterów niosą dodatkowo sekwencje rozpoznawane przez specyficzne endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie BamHI (forward) oraz XhoI (reverse) dla genów HA.
6. 6. Sposób wytwarzania genu kodującego białko interleukiny kurzej chIL-2 o sekwencji nukleotydowej chIL-2, znamienny tym, że prowadzi się syntezę metodą PCR na bazie wyjściowej matrycy (cząsteczka cDNA), z wykorzystaniem 2 komplementarnych starterów, których sekwencje nukleotydowe zostały zaprojektowane tak, aby odpowiadały kodonom preferencyjnie występującym u bakterii z gatunku Lactococcus Iactis, rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium, przy czym, dodatkowo do sekwencji nukleotydowej startera forward wprowadzono sekwencję, odpowiadającą kodonowi START translacji (ATG), tuż przed sekwencją kodującą pierwszy aminokwas oryginalnych sekwencji peptydowych. Jednocześnie końce 5' starterów forward zawierają dodatkową sekwencję, typową dla RBS Lactococcus Iactis, rozpoznawaną przez maszynerię translacyjną, a także sekwencję 'spacer' zlokalizowaną między regionem RBS, a kodonem start.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że końce 5' starterów niosą dodatkowo sekwencje rozpoznawane przez specyficzne endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie BoxI (forward) oraz AgeI i BoxI (reverse) dla genu chIL-2.
8. 8. Promotor ptcB o długości obejmującej region -10 i -35 sekwencji nukleotydowej.
9. 9. Sposób wytwarzania regionu promotorowego ptcB, znamienny tym, że prowadzi się syntezę metodą PCR, na matrycy chromosomalnego DNA szczepu L. Iactis IL1403 oraz pary starterów (forward i reverse) komplementarnych do końców 5' sekwencji regionu promotorowego chromosomalnego genu ptcB oraz zmodyfikowanych tak, aby na ich końcach 5' znajdowały się sekwencje rozpoznawane przez odpowiednie endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie VspI (dla startera forward) oraz NciI (dla startera reverse).
10. 10. Zastosowanie promotora ptcB o długości obejmującej region -10 i -35 sekwencji nukleotydowej, według zastrz. 8, do optymalizacji wytwarzania białek heterologicznych.
11. 11. Kompozycja immunogenna do indukowania w ptasim gospodarzu odpowiedzi immunologicznej przeciwko wirusowi ptasiej grypy (HA), znamienna tym, że obejmuje co najmniej jeden szczep bakterii z rodzaju Lactococcus, Lactobacillus lub Bifidobacterium, korzystnie z gatunku Lactococcus Iactis, zawierający plazmid wybrany z grupy plazmidów kodujących poszczególne geny wirusowej hemaglutyniny o sekwencjach HA 1-568, HA 17-568, HA17-522, HA1-568His, HA17-568His, kodujące odpowiednie białka heterologiczne o sekwencjach aminokwasowych HA 1-568, HA17-568, HA17-522, HA1-568His, HA17-568His, oraz opcjonalnie gen interleukiny kurzej drugiej o sekwencji chIL-2, kodujące białko interleukiny kurzej drugiej o sekwencji chIL-2.
12. 12. Zastosowanie genu według zastrz. 1 albo 2, do wytwarzania kompozycji immunogennej przeznaczonej do indukowania odpowiedzi immunologicznej u ptaków.
13. 13. Szczepionka przeciw ptasiej grypie, znamienna tym, że zawiera kompozycję według zastrz. 11 lub odpowiedni szczep bakterii mlekowych według zastrz. 3.