PL217383B1

PL217383B1 - New phosphatidylcholine and process for the preparation thereof

Info

Publication number: PL217383B1
Application number: PL398019A
Authority: PL
Inventors: Natalia Niezgoga; Paweł Mituła; Czesław Wawrzeńczyk
Original assignee: Univ Przyrodniczy We Wrocławiu
Priority date: 2012-02-06
Filing date: 2012-02-06
Publication date: 2014-07-31
Also published as: PL398019A1

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest nowa fosfatydylocholina, o wzorze przedstawionym na rysunku, oraz sposób jej otrzymywania.The subject of the invention is a novel phosphatidylcholine of the formula shown in the drawing and a method of its preparation.

Związek ten może znaleźć zastosowanie, jako składnik suplementów diety o właściwościach wspomagających odchudzanie, a także jako prolek wspomagający terapię antynowotworową.This compound can be used as a component of dietary supplements with slimming properties, as well as a pro-drug supporting anti-cancer therapy.

Fosfatydylocholina z izomerem sprzężonego kwasu linolowego jest połączeniem dwóch funkcjonalnych komponentów, jakim jest cholina oraz sprzężony kwas linolowy. Sprzężony kwas linolowy jest grupą izomerów kwasu oktadekadienowego. Z uwagi na możliwość wystąpienia wiązania podwójnego w konfiguracji Z lub E oraz jego pozycji wyróżnić można wiele izomerów, z których w największej ilości w pożywieniu występuje izomer 9Z,11E oraz izomer 7E,9Z (M. P. Yurawecz i inni, Lipids, 1998, 33, s.803; Y. Park i inni, Small Ruminant Res., 2001, 68, s.88). Przemysłowo otrzymywany sprzężony kwas linolowy jest przeważnie równomolową mieszaniną izomerów 9Z,11E oraz 10E,12Z z kilkuprocentowym udziałem izomerów 9Z,11Z; 10Z,12Z; 9E,11E i 10E,12E (M. J. T. Reaney i inni, U. S. Pat. No. 6420577).Phosphatidylcholine with the conjugated linoleic acid isomer is a combination of two functional components, which is choline and conjugated linoleic acid. Conjugated linoleic acid is a group of octadecadienoic acid isomers. Due to the possibility of a double bond in the Z or E configuration and its position, many isomers can be distinguished, of which the 9Z, 11E isomer and the 7E, 9Z isomer are the most abundant in food (MP Yurawecz et al., Lipids, 1998, 33, pp. 803; Y. Park et al., Small Ruminant Res., 2001, 68, p. 88). The industrially obtained conjugated linoleic acid is usually an equimolar mixture of 9Z, 11E and 10E, 12Z isomers with a few percent of 9Z, 11Z isomers; 10Z, 12Z; 9E, 11E and 10E, 12E (M. J. T. Reaney et al., U. S. Pat. No. 6,420,577).

W wyniku prowadzonych badań biologicznych in vitro oraz in vivo wykazano ich właściwości immunomodulacyjne (C. C. Miller i inni, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1994, 198, s. 1107), przeciwnowotworowe (C. Liew i inni, Carcinogenesis, 1995, 16, s.3037), przeciwmiażdżycowe (Κ. N. Lee, Atherosclerosis, 1994, 108, s. 19), regulujące przyrost tkanki tłuszczowej i mięśniowej u zwierząt (Y. Park, Lipids, 1999, 34, s.235) i ludzi (Y. D. Halvorsen i inni, Obesity Res., 2000, 8, s.121). Podczas większości z tych badań stosowano mieszaninę izomerów sprzężonego kwasu linolowego. Wyższą cytotoksyczność wykazano jednak względem komórek nowotworowych raka wątroby (M. Yamasaki i inni, Cancer Letters, 2002, 188, s. 171), raka piersi (D. L. Amaru i inni, Lipids, 2009, s.449), raka okrężnicy (F. Beppu i inni, J. Nutr. Biochem., 2006, 18, s.830) i raka prostaty (J. D. Palombo i inni. Cancer Lett., 2002, 177, s.163) izomeru 10E,12Z niż izomeru 9Z,11E CLA - drugiego z głównych izomerów występujących w przemysłowo otrzymywanych preparatach sprzężonego kwasu linolowego.As a result of in vitro and in vivo biological studies, their immunomodulatory properties have been demonstrated (CC Miller et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1994, 198, p. 1107), antitumor (C. Liew et al., Carcinogenesis, 1995, 16, p. 3037), antiatherosclerotic (Κ. N. Lee, Atherosclerosis, 1994, 108, p. 19), regulating the growth of adipose and muscle tissue in animals (Y. Park, Lipids, 1999, 34, p. 235) and people (YD Halvorsen et al., Obesity Res., 2000, 8, p. 121). Most of these studies used a mixture of conjugated linoleic acid isomers. However, higher cytotoxicity has been shown to cancer cells of liver cancer (M. Yamasaki et al., Cancer Letters, 2002, 188, p. 171), breast cancer (DL Amaru et al., Lipids, 2009, p. 449), colon cancer (F. Beppu et al., J. Nutr. Biochem., 2006, 18, p. 830) and prostate cancer (JD Palombo et al. Cancer Lett., 2002, 177, p. 163) of the 10E, 12Z isomer rather than the 9Z, 11E CLA isomer - the second of the main isomers occurring in industrially obtained preparations of conjugated linoleic acid.

Wprowadzenie kwasu 10E,12Z-oktadekadienowego do struktury fosfatydylocholiny jako cząsteczki o amfifilowym charakterze, posiadającej zdolności do łatwego przenikania przez błony biologiczne, może skutkować zwiększeniem przyswajalności sprzężonego kwasu linolowego oraz możliwością wykorzystania nowej fosfatydylocholiny w charakterze proleku.The introduction of 10E, 12Z-octadecadienoic acid to the structure of phosphatidylcholine as a molecule of an amphiphilic nature, having the ability to easily penetrate biological membranes, may result in an increase in the bioavailability of conjugated linoleic acid and the possibility of using the new phosphatidylcholine as a prodrug.

Istotą wynalazku jest nowa fosfatydylocholina z izomerem kwasu 10E,12Z-oktadekadienowego w pozycjach sn-1 i sn-2, o wzorze przedstawionym na rysunku.The essence of the invention is a new phosphatidylcholine with the 10E, 12Z-octadecadienoic acid isomer in sn-1 and sn-2 positions, with the formula shown in the drawing.

Sposób według wynalazku polega na tym, że izomer kwasu 10E,12Z-oktadekadienowego, korzystnie o czystości ponad 96%, poddaje się reakcji estryfikacji z kompleksem sn-glicero-3-fosfocholiny i chlorku kadmu, przy użyciu czynnika sprzęgającego jakim jest Ν,Ν'-dicykloheksylokarbodiimid oraz w obecności 4-dimetyloaminopirydyny, w środowisku bezwodnego chlorku metylenu.The method according to the invention consists in that the 10E, 12Z-octadecadienoic acid isomer, preferably with a purity of more than 96%, is esterified with a complex of sn-glycero-3-phosphocholine and cadmium chloride using a coupling agent such as Ν, Ν ' -dicyclohexylcarbodiimide and in the presence of 4-dimethylaminopyridine, in anhydrous methylene chloride.

Sposób, według wynalazku, objaśniony jest bliżej w przykładzie wykonania.The method according to the invention is explained in more detail in an embodiment.

P r z y k ł a d.P r z k ł a d.

Do osuszonego poprzez wielokrotne odparowanie mieszaniny benzen:chlorek metylenu (1:1, v/v) izomeru kwasu 10E,12Z-oktadekadienowego, o czystości (wg GC) 97%, i zawartości izomerów 9Z,11E; Z,Z i E,E odpowiednio 2,3%; 0,2% i 0,5% (1, 638 g, 5,84 mmol) otrzymanego zgodnie z opisaną metodą (N. Niezgoda i inni, Przemysł Chemiczny, 2011, 90, s. 957) umieszczonego w 100 mL kolbie okrągłodennej dodaje się kompleks chlorku kadmu z sn-glicero-3-fosfocholiną (GPCxCdCl2) w ilości 825 mg (1,46 mmol) oraz 4-dimetyloaminopirydynę (356 mg, 2,92 mmol) w 58 mL chlorku metylenu (CH2Cl2).For the benzene: methylene chloride (1: 1, v / v) isomer of the 10E, 12Z-octadecadienoic acid isomer, dried by repeated evaporation, 97% purity (according to GC), and the content of 9Z, 11E isomers; Z, Z and E, E 2.3%, respectively; 0.2% and 0.5% (1.638 g, 5.84 mmol) obtained according to the method described (N. Niezgoda et al., Przemysł Chemiczny, 2011, 90, p. 957) placed in a 100 mL round-bottom flask are added cadmium chloride complex with sn-glycero-3-phosphocholine (GPCxCdCl2) is 825 mg (1.46 mmol) and 4-dimethylaminopyridine (356 mg, 2.92 mmol) in 58 mL methylene chloride (CH2Cl2).

Następnie dodaje się N,N'-dicykloheksylokarbodiimidu (1,265 g, 6,13 mmol) rozpuszczonego w 14 mL bezwodnego CH2Cl2. Otrzymaną mieszaninę reakcyjną w postaci zawiesiny, miesza się intensywnie przez 72 h w temperaturze pokojowej i atmosferze azotu w szczelnie zamkniętej kolbie, zabezpieczonej przed dostępem światła. Po tym czasie mieszaninę reakcyjną odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem na lejku Shotta. Do przesączu dodaje się formę H⁺ żywicy jonowymiennej (DOWEX 50W X8) i miesza przez 30 minut. Żywicę jonowymienną odsącza się a rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem.Then N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (1.265 g, 6.13 mmol) dissolved in 14 mL of anhydrous CH2Cl2 is added. The resulting reaction mixture, in the form of a suspension, is stirred vigorously for 72 h at room temperature and nitrogen atmosphere in a sealed flask protected against light. At this time, the reaction mixture was filtered under vacuum in a Shott funnel. ^{A H +} form ion exchange resin (DOWEX 50W X8) is added to the filtrate and stirred for 30 minutes. The ion exchange resin is filtered off and the solvent is evaporated off under reduced pressure.

Otrzymany surowy produkt oczyszcza się za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Jako eluent stosuje się mieszaninę chloroform:metanol:woda, w stosunku 65:25:4 (v/v/v). Otrzymuje się 851 mg (1,09 mmol) fosfatydylocholiny z resztą kwasu 10E,12Z-oktadekadienowego w pozycji sn-1 i sn-2 (TLC: Rf= 0,41; eluent CHCl3:CH3OH:H2O 65:25:4 (v/v/v))The obtained crude product was purified by silica gel column chromatography. A mixture of chloroform: methanol: water in the ratio 65: 25: 4 (v / v / v) is used as the eluent. 851 mg (1.09 mmol) of phosphatidylcholine are obtained with the remainder of the 10E, 12Z-octadecadienoic acid in the sn-1 and sn-2 positions (TLC: Rf = 0.41; eluent CHCl3: CH3OH: H2O 65: 25: 4 (v / v / v))

PL 217 383 B1PL 217 383 B1

Wydajność otrzymanego produktu wynosi 75% wydajności teoretycznej. Czystość potwierdzona przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) wyniosła >95% (Rt = 6,97 min). Warunki analizy: kolumna Betasil Diol-100; eluent: H2O z 1% kwasu mrówkowego i 1% trietyloaminy (A), heksan (B), 2-propanol (C) o przepływie 1,5 mL/min; temperatura 298 K; program (0 min - 3/57/5 (%A/%B/%C), 4 min - 10/40/50, 9 min - 10/40/50), 9,1 min - 3/40/57, 19 min-3/40/57).The yield of the obtained product is 75% of theory. The purity was confirmed by high performance liquid chromatography (HPLC) to be> 95% (Rt = 6.97 min). Analysis conditions: Betasil Diol-100 column; eluent: H2O with 1% formic acid and 1% triethylamine (A), hexane (B), 2-propanol (C) at 1.5 mL / min; temperature 298 K; program (0 min - 3/57/5 (% A /% B /% C), 4 min - 10/40/50, 9 min - 10/40/50), 9.1 min - 3/40/57 , 19 min-3/40/57).

Dane spektroskopowe otrzymanego związku są następujące:The spectroscopic data of the obtained compound are as follows:

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 0,89 (t; J=6,9 Hz; 6H; 2x CH3-18); 1,21-1,44 (m; 32H; 2x CH2-(4 -8) i 2x CH2-(15-17)); 1,49-1,66 (m; 4H; 2x CH2-3); 2,00-2,20 (m; 8H; 2x CH2-9 i 2x CH2-14); 2,21-2,34 (m; 4H; 2x CH2-2); 2,28 (dd; J=14,4; 7,0 Hz; 4H; 2x CH2-2); 3,36 (s; 9H; N(CH3)3); 3,74-3,84 (m; 2H; ¹ H NMR (300 MHz, CDCl 3) δ: 0.89 (t; J = 6.9 Hz; 6H; 2x CH3-18); 1.21-1.44 (m; 32H; 2x CH2- (4-8) and 2x CH2- (15-17)); 1.49-1.66 (m; 4H; 2x CH2-3); 2.00-2.20 (m; 8H; 2x CH2-9 and 2x CH2-14); 2.21-2.34 (m; 4H; 2x CH2-2); 2.28 (dd; J = 14.4; 7.0 Hz; 4H; 2x CH2-2); 3.36 (s; 9H; N (CH3) 3); 3.74-3.84 (m; 2H;

CH2-e); 3,84-4,00 (m; 2H; CH₂-3'); 4,12 (dd, J=12,00; 7,4 Hz; 1H; jeden z CH₂-1'); 4,25-2,35 (m; 2H; CH2-a); 4,39 (dd; J=12,0; 2,8 Hz; 1H; jeden z CH₂-1'); 5,19 (m; 1H; CH-2'); 5,30 (dt; J=11,0; 7,5 Hz; 1H; =CH-13); 5,64 (dt; J=15,0; 7,5 Hz; 1H; =CH-10); 5,93 (m; 1H, =CH-12); 6,29 (dd, J=15,0; 11 Hz; 1H; =CH-11).CH2-e); 3.84-4.00 (m; 2H; CH ₂ -3 '); 4.12 (dd, J = 12.00; 7.4 Hz; 1H; one of CH ₂ -1 '); 4.25-2.35 (m; 2H; CH2-a); 4.39 (dd; J = 12.0; 2.8 Hz; 1H; one of CH ₂ -1 '); 5.19 (m; 1H; CH-2 '); 5.30 (dt; J = 11.0; 7.5 Hz; 1H; = CH-13); 5.64 (dt; J = 15.0; 7.5 Hz; 1H; = CH-10); 5.93 (m; 1H, = CH-12); 6.29 (dd, J = 15.0; 11Hz; 1H; = CH-11).

¹³C NMR (75 MHz, CDCl3) δ: 14,03 (2x C-18); 22,53 (2x C-17); 24,84 (C-3); 24,94 (C-3); 27,80 (2x C-14); 29,00 - 29,59 (2x C-4-7); 29,39 (2x C-8); 29,44 (2x C-15); 31,45 (2x C-16); 32,88 (2x C-9); 34,10 (C-2); 34,29 (C-2); 54,39 (-N(CHa)s); 59,31 (C-α); 62,99 (C-1'); 63,38 (C-3'); 66,36 (C-β); 70,48 (C-2'); 125,66 (2x C-11); 128,56 (2x C-12); 130,12 (2x C-13); 134,49 (C-10); 173,17 (C-1); 173,51 (C-1) ³¹P NMR (121 MHz, CDCl3) δ: -0,15. ¹³ C NMR (75 MHz, CDCl 3) δ: 14.03 (2x C-18); 22.53 (2x C-17); 24.84 (C-3); 24.94 (C-3); 27.80 (2x C-14); 29.00 - 29.59 (2x C-4-7); 29.39 (2x C-8); 29.44 (2x C-15); 31.45 (2x C-16); 32.88 (2x C-9); 34.10 (C-2); 34.29 (C-2); 54.39 (-N (CHa) s); 59.31 (C-α); 62.99 (C-1 '); 63.38 (C-3 '); 66.36 (C-β); 70.48 (C-2 '); 125.66 (2x C-11); 128.56 (2x C-12); 130.12 (2x C-13); 134.49 (C-10); 173.17 (C-1); 173.51 (C-1) ³¹ P NMR (121 MHz, CDCl3) δ: -0.15.

(') - oznacza sygnały pochodzące od części glicerolowej (α, β) - oznacza sygnały pochodzące od reszty choliny(') - means signals from the glycerol part (α, β) - means signals from the rest of the choline

Claims

Patent claims

1. New phosphatidylcholine with the 10E, 1 2Z-octadecadienoic acid isomer at the sn-1 and sn-2 positions, with the formula shown in the figure.

2. The method of obtaining a new phosphatidylcholine with the 1 OE, 1 2Z-octadecadienoic acid isomer in sn-1 and sn-2 positions, with the formula shown in the figure, characterized in that the 10E, 12Z-octadecadiene acid isomer is subjected to esterification reaction with the sn complex -glycero-3-phosphocholine and cadmium chloride, using the coupling agent which is Ν, Ν'-dicyclohexylcarbodiimide and in the presence of 4-dimethylaminopyridine, in anhydrous methylene chloride.

3. The method of obtaining a new phosphatidylcholine, according to claim 2. The process of claim 2, characterized in that 10E, 12Z-octadecadienoic acid with a purity greater than 96% is used.