PL216143B1

PL216143B1 - process for the preparation of dilauroilfluorescein

Info

Publication number: PL216143B1
Application number: PL394420A
Authority: PL
Inventors: Lucjan Szuster; Łucja Wyrębska; Tomasz Górecki; Bogusław Królikowski
Original assignee: Inst Inżynierii Materiałow Polimerowych I Barwnikow
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2014-03-31
Also published as: PL394420A1

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania dilauroilofluoresceiny (DLF) umożliwiający uzyskanie produktu o wysokiej czystości, wymaganej dla składników testów medycznych w obszarze szybkiej diagnostyki.The subject of the invention is a method for the production of dilauroylfluorescein (DLF) that allows to obtain a high purity product required for medical test components in the field of rapid diagnostics.

DLF jest bezbarwną substancją, która ulega hydrolizie pod wpływem enzymów z grupy hydrolaz (esterazy, proteazy). W wyniku tej reakcji powstaje fluoresceina - związek barwny, fluoryzujący, wykazujący maksimum pochłaniania światła przy długości fali λ=490 nm i emisji światła przy λ=514 nm. Szybkość uwalniania fluoresceiny jest wprost proporcjonalna do stężenia esteraz w próbie, a więc również do ilości i żywotności drobnoustrojów wytwarzających te enzymy.DLF is a colorless substance that is hydrolyzed by enzymes from the group of hydrolases (esterases, proteases). As a result of this reaction, fluorescein is formed - a colored, fluorescing compound, showing maximum light absorption at λ = 490 nm and light emission at λ = 514 nm. The rate of fluorescein release is directly proportional to the concentration of esterases in the test, and thus also to the amount and viability of the microorganisms producing these enzymes.

DLF stosowana jest głównie w diagnostyce medycznej, przy przewlekłych zapaleniach trzustki. Chorobę tą diagnozuje się przy pomocy tzw. testu PLT (Pancreolauryl test). Jest to nieinwazyjny test trzustkowy, bardzo czuły i dający pewne wyniki diagnozowanego schorzenia. Enzymy trzustki hydrolizują DLF do fluoresceiny i na tej podstawie przeprowadza się pomiar jej fluorescencji w moczu, a w konsekwencji zdolność trzustki do hydrolizy estrów.DLF is mainly used in medical diagnostics in chronic pancreatitis. This disease is diagnosed using the so-called PLT test (Pancreolauryl test). It is a non-invasive pancreatic test, very sensitive and gives certain results for the diagnosed disease. Pancreatic enzymes hydrolyze DLF to fluorescein and on this basis its fluorescence in urine is measured and, consequently, the ability of the pancreas to hydrolyze esters.

Z opisu zgłoszeniowego WO 92/01478 znane jest użycie DLF w teście służącym do diagnozowania niedoczynności trzustki. Pacjentowi podaje się doustnie emulsję typu olej w wodzie. Fazę rozproszoną stanowi olejek kokosowy z rozpuszczoną uprzednio substancją czynną. Prawidłowość czynności trzustki określa się na podstawie spektrofotometrycznego pomiaru stężenia wolnej fluoresceiny w moczu pacjenta.It is known from WO 92/01478 to use DLF in an assay for the diagnosis of pancreatic insufficiency. The patient is orally administered an oil-in-water emulsion. The dispersed phase is coconut oil with previously dissolved active substance. The normal functioning of the pancreas is determined by spectrophotometric measurement of the concentration of free fluorescein in the patient's urine.

Z artykułu zamieszczonego w czasopiśmie Dyes and Pigments 72 (2007) s. 322 + 326 znana jest, nie ujawniająca stechiometrii reagentów, metoda otrzymywania czystej DLF, polegająca na reakcji estryfikacji fluoresceiny chlorkiem lauroilu w temperaturze 70°C w środowisku chloroformu, wobec pirydyny jako katalizatora. Po całkowitym przereagowaniu roztwór poreakcyjny jest następnie zatężany, a czysty produkt wydziela się za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (eluent: octan etylu/eter naftowy 10:1), Rf = 0,80. Wydajność reakcji 81%.The article published in the journal Dyes and Pigments 72 (2007) p. 322 + 326 discloses a method of obtaining pure DLF, which does not reveal the stoichiometry of the reagents, consisting in the esterification of fluorescein with lauroyl chloride at a temperature of 70 ° C in the environment of chloroform, in the presence of pyridine as a catalyst . After complete reaction, the reaction solution is then concentrated, and the pure product is isolated by column chromatography over silica gel (eluent: ethyl acetate / petroleum ether 10: 1), Rf = 0.80. The reaction yield was 81%.

Według innego sposobu opisanego w czasopiśmie Revista de Chimie 61 (2010) s. 372 + 376 reakcję estryfikacji fluoresceiny chlorkiem Iauroilu prowadzi się w środowisku pirydyny. Do mieszaniny zawierającej 16,6 g (0,05 mola) fluoresceiny i 75 ml pirydyny wkrapla się 24,06 g (0,11 mola) chlorku lauroilu, po czym mieszaninę reakcyjną utrzymuje w temperaturze 115 + 125°C w ciągu 24 godzin. Po stwierdzeniu zakończenia reakcji i wystudzeniu do temperatury pokojowej oleistą masę poreakcyjną wylewa się na wodę i koryguje pH do wartości 3 za pomocą kwasu solnego. Otrzymana żelowata pasta jest przemywana wodą do zaniku zapachu pirydyny. Produkt oczyszcza się poprzez rozpuszczenie pasty w octanie etylu i wytrącenie eterem naftowym. Osad jest filtrowany, suszony, a następnie rozpuszczany w toluenie do stężenia około 25% i w tej postaci może być stosowany jako znacznik produktów petrochemicznych. Wydajność reakcji 80%.According to another method described in the journal Revista de Chimie 61 (2010) pp. 372 + 376, the esterification reaction of fluorescein with lauroyl chloride is carried out in a pyridine medium. 24.06 g (0.11 mol) of lauroyl chloride are added dropwise to a mixture containing 16.6 g (0.05 mol) of fluorescein and 75 ml of pyridine, and the reaction mixture is kept at 115 + 125 ° C for 24 hours. After confirming the completion of the reaction and cooling to room temperature, the oily reaction mass is poured over water and the pH is adjusted to 3 with hydrochloric acid. The resulting gel-like paste is washed with water until the pyridine odor disappears. The product is purified by dissolving the paste in ethyl acetate and precipitating with petroleum ether. The sludge is filtered, dried and then dissolved in toluene to a concentration of about 25% and in this form it can be used as a tracer for petrochemical products. The reaction yield was 80%.

W scharakteryzowanych metodach otrzymywania DLF sposób jej wydzielania o wysokiej czystości jest uciążliwy, pracochłonny i trudny do realizacji w warunkach przemysłowych.In the characterized methods of obtaining DLF, the method of its high purity separation is burdensome, laborious and difficult to implement in industrial conditions.

Opisane w dostępnych źródłach publikacyjnych metody syntezy DLF z racji pracochłonnych warunków wydzielania nie mają znaczenia praktycznego.The methods of DLF synthesis described in available publication sources have no practical significance due to the labor-intensive conditions of isolation.

Sposób wytwarzania dilauroilofluoresceiny według wynalazku polegający na ogrzewaniu fluoresceiny i chlorku lauroilu w środowisku chloroformu wobec pirydyny charakteryzuje się tym, że do 350 - 450 części wagowych, korzystnie 400 części wagowych chloroformu dodaje się 12 - 20 części wagowych, korzystnie 16 części wagowych pirydyny i 60 - 70 części wagowych, korzystnie około 66 części wagowych fluoresceiny. Do tak sporządzonej zawiesiny powoli wkrapla się 88 - 135 części wagowych, korzystnie około 109 części wagowych chlorku lauroilu. Następnie tak otrzymaną masę reakcyjną ogrzewa się do temperatury wrzenia i prowadzi się reakcję korzystnie w czasie nie krótszym niż 8 godzin do całkowitego przereagowania fluoresceiny. Tak otrzymaną masę poreakcyjną zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem poprzez oddestylowanie chloroformu. Nieoczekiwanie okazało się, że na tym etapie procesu możliwe jest wytrącenie czystej dilauroilofluoresceiny za pomocą alkoholu etylowego. Do pozostałości po oddestylowaniu chloroformu wprowadza się 320 - 480 części wagowych, korzystnie 400 części wagowych alkoholu etylowego, zawiesinę miesza się w czasie 0,5 - 1,5 godziny, korzystnie przez około 1 godzinę, następnie filtruje się. Tak otrzymany osad przemywa się w 120 - 200 części wagowych, korzystnie w 160 części wagowych etanolu i ponownie sporządza się zawiesinę w 150 - 250 części wagowych, korzystnie 200 części wagowych etanolu. Po dokładnym wymieszaniuThe method for producing dilauroylfluorescein according to the invention, which consists in heating fluorescein and lauroyl chloride in a chloroform medium against pyridine, is characterized in that to 350 - 450 parts by weight, preferably 400 parts by weight of chloroform, 12 - 20 parts by weight, preferably 16 parts by weight, of pyridine and 60 parts by weight are added to chloroform. 70 parts by weight, preferably about 66 parts by weight, of fluorescein. To the thus prepared suspension, 88-135 parts by weight, preferably about 109 parts by weight, of lauroyl chloride are slowly added dropwise. The reaction mass thus obtained is then heated to reflux temperature and the reaction is carried out preferably for not less than 8 hours until the fluorescein is completely converted. The reaction mass thus obtained was concentrated under reduced pressure by distilling off the chloroform. It has surprisingly been found that at this stage of the process it is possible to precipitate pure dilauroylfluorescein with ethyl alcohol. 320-480 parts by weight, preferably 400 parts by weight, of ethyl alcohol are introduced into the residue after distilling off the chloroform, the suspension is stirred for 0.5-1.5 hours, preferably for about 1 hour, and then filtered. The precipitate thus obtained is washed in 120-200 parts by weight, preferably in 160 parts by weight, of ethanol and resuspended in 150-250 parts by weight, preferably 200 parts by weight, of ethanol. After thorough mixing

PL 216 143 B1 osad filtruje się i ponownie przemywa się w 30 - 50 części wagowych, korzystnie 40 części wagowych etanolu, po czym suszy się korzystnie w temperaturze 35°C.The precipitate is filtered and washed again in 30-50 parts by weight, preferably 40 parts by weight, of ethanol and then dried preferably at 35 ° C.

Metoda otrzymywania DLF według wynalazku jest znacznie prostsza niż te znane dotychczas, mniej czasochłonna i nie wymaga specjalistycznej aparatury, a uzyskany produkt charakteryzuje się wysoką czystością.The method of obtaining DLF according to the invention is much simpler than those known so far, less time-consuming and does not require specialized equipment, and the obtained product is characterized by high purity.

Stwierdzono, że metoda jest bezpieczna, a proces syntezy powtarzalny i pozwala na uzyskanie produktu o wysokich parametrach jakościowych. Opracowany sposób według wynalazku umożliwia niezawodność technologiczną i właściwą mu efektywność.It was found that the method is safe and the synthesis process is repeatable and allows to obtain a product with high quality parameters. The developed method according to the invention enables technological reliability and the corresponding efficiency.

Wynalazek zobrazowano na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat reakcji wytwarzanej dilauroilofluoresceiny (DLF) tym sposobem, przy czym:The invention is illustrated in the drawing, in which Fig. 1 shows the reaction scheme of the prepared dilauroylfluorescein (DLF) by this method, in which:

A - oznacza fluoresceinę,A - means fluorescein,

B - oznacza chlorek lauroilu,B - is lauroyl chloride,

C - oznacza dilauroilofluoresceinę, zaś fig. 2 przedstawia widmo masowe struktury otrzymanej DLF.C - is dilauroylfluorescein and Fig. 2 shows the mass spectrum of the obtained DLF structure.

Przedmiot wynalazku ilustruje przedstawiony poniżej przykład, nie ograniczając jego zakresu.The following example illustrates the subject matter of the invention without limiting its scope.

P r z y k ł a dP r z k ł a d

Do zawiesiny 66,4 części wagowych fluoresceiny w 400 częściach wagowych chloroformu i 16 częściach wagowych pirydyny powoli wkroplono w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny 109,2 części wagowych chlorku lauroilu. Mieszaninę reakcyjną następnie ogrzewano w łagodnym wrzeniu w temperaturze 70°C mieszając w ciągu 11 godzin. Postęp reakcji kontrolowano metodą TLC w eluentach cykloheksan : aceton 8:6 (ocena stopnia przereagowania fluoresceiny) i octan etylu : eter naftowy 10:1 (ocena jakości DLF). Po zakończeniu masę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej (otoczenia) i przeprowadzono filtrację klarującą. Z przesączu w wyparce obrotowej oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem chloroform, a do oleistej pozostałości dodano 400 części wagowych etanolu i mieszano przez 1 godzinę. Wytworzony biały osad DLF odsączono i przemyto na filtrze 160 częściami wagowymi zimnego etanolu. Produkt zawieszono w 200 częściach wagowych zimnego etanolu, odfiltrowano, przemyto 40 częściami wagowymi alkoholu etylowego i suszono w suszarce próżniowej w temperaturze 35°C.To a suspension of 66.4 parts by weight of fluorescein in 400 parts by weight of chloroform and 16 parts by weight of pyridine, 109.2 parts by weight of lauroyl chloride was slowly added dropwise at room temperature over 1 hour. The reaction mixture was then heated to gentle reflux at 70 ° C with stirring for 11 hours. The progress of the reaction was monitored by TLC in the eluents: cyclohexane: acetone 8: 6 (evaluation of the degree of conversion of fluorescein) and ethyl acetate: petroleum ether 10: 1 (evaluation of DLF quality). Upon completion, the reaction mass was cooled to room temperature (ambient) and clarification filtration was performed. From the filtrate in a rotary evaporator, chloroform was distilled off under reduced pressure, and 400 parts by weight of ethanol were added to the oily residue and stirred for 1 hour. The resulting white DLF precipitate was filtered off and washed on the filter with 160 parts by weight of cold ethanol. The product was suspended in 200 parts by weight of cold ethanol, filtered, washed with 40 parts by weight of ethyl alcohol and dried in a vacuum oven at 35 ° C.

Otrzymany biały, krystaliczny proszek topi się w temp. 66 - 67°C, jest jednorodny chromatograficznie i nie fluoryzuje.The obtained white, crystalline powder melts at 66-67 ° C, is chromatographically homogeneous and does not fluoresce.

Wynalazek przedstawiono jako przykładowe możliwości realizacji, jednakże obejmuje on również wszelkie odmiany i modyfikacje mieszczące się w ramach zastrzeżenia patentowego.The invention is presented by way of example of its feasibility, however, it also covers all variations and modifications falling within the scope of the patent claim.

Claims

A method for the preparation of dilauroyl fluorescein by heating fluorescein and lauroyl chloride in a chloroform medium against pyridine, characterized in that to 350 - 450 parts by weight, preferably 400 parts by weight of chloroform, 12-20 parts by weight, preferably 16 parts by weight of pyridine and 60 - 70 parts by weight, are added. by weight, preferably about 66 parts by weight of fluorescein, then 88-135 parts by weight, preferably about 109 parts by weight, of lauroyl chloride are added dropwise to the thus prepared suspension, then the reaction mass thus obtained is heated to the boiling point in the range of 68-70 ° C and the reaction is carried out preferably within not less than 8 hours until the fluorescein reacts completely, then the reaction mass is concentrated under reduced pressure by distilling off the chloroform, and then 320 - 480 parts by weight, preferably 400 parts by weight, of ethyl alcohol are introduced, the suspension is stirred during 0.5 - 1.5 hours, preferably for about 1 1 hour, then it is filtered, the precipitate thus obtained is washed in 120-200 parts by weight, preferably in 160 parts by weight of ethanol, and resuspended in 150-250 parts by weight, preferably 200 parts by weight, of ethanol, then, after thorough mixing, the precipitate is filtered and again washed in 30-50 parts by weight, preferably 40 parts by weight, of ethanol and then dried preferably at 35 ° C.