Изобретение относится к области органической химии и медицины, а именно к нитропроизводным флуоресцеина, которые могут быть использованы в синтезе различных флуоресцентных соединений, таких как 5-изотиоцианат флуоресцеина (ФИТЦ), флуоресцеин лизикол (CFL), 5-[4,6-дихлортриазинил] аминофлуоресцеина (5-DATF), применяемых в медицине для диагностики и лечения заболеваний,The invention relates to the field of organic chemistry and medicine, namely to fluorescein nitro derivatives that can be used in the synthesis of various fluorescent compounds, such as fluorescein 5-isothiocyanate (FITC), fluorescein lysicol (CFL), 5- [4,6-dichlorotriazinyl] aminofluorescein (5-DATF) used in medicine for the diagnosis and treatment of diseases,

Известно, что производные флуоресцеина активно используются в медицине для диагностики и лечения заболеваний. Например, флуоресцеин лизикол используется в исследованиях фармакокинетики и в диагностике цирроза печени, гепатита, вирусных заболеваний, неалкогольного стеатогепатита у человека и неалкогольной жировой болезни печени [Mills С.О. et al. Cholyl-lysylfluorescein: synthesis, biliary excretion in vivo and during single-pass perfusion of isolated perfused rat liver // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. - 1991. - V. 1115. - №2. - P. 151-156.], для лечения атеросклероза [US 2007116754, A61K 49/00, , 2007]. Флуоресцеин-5-изотиоцианат имеет широкий спектр биологических применений, включая использование в качестве флуоресцентного маркирующего агента для белков, в качестве флуоресцентного реагента для отслеживания белка и в качестве реагента в технике флуоресцентных антител для быстрой идентификации патогенов [US 0220787, C07D 493/10, .2012]. Например, известно применение ФИТЦ для диагностики in vivo рака предстательной железы [RU 2450832, A61K 49/14, 2012]. 5-[4,6-Дихлортриазинил] аминофлуоресцеина (DATF) обладает высокой реакционной способностью в отношении белков. В отличие от других реакционноспособных флуоресцеинов, 5-DTAF не только реагирует с аминогруппами, но также реагирует с тиольными группами и даже непосредственно реагирует с гидроксигруппами, такими как полисахариды и другие спирты в водном растворе при рН выше 9. Из-за его высокой реакционной способности, 5-DTAF также используется для маркировки углеводов, а также биологически значимых молекул in vivo [GB 2081257, C07D 405/04, 1982].It is known that fluorescein derivatives are actively used in medicine for the diagnosis and treatment of diseases. For example, fluorescein lysicol is used in pharmacokinetics studies and in the diagnosis of liver cirrhosis, hepatitis, viral diseases, non-alcoholic steatohepatitis in humans and non-alcoholic fatty liver disease [Mills S.O. et al. Cholyl-lysylfluorescein: synthesis, biliary excretion in vivo and during single-pass perfusion of isolated perfused rat liver // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -General Subjects. - 1991. - V. 1115. - No. 2. - P. 151-156.], For the treatment of atherosclerosis [US 2007116754, A61K 49/00,, 2007]. Fluorescein-5-isothiocyanate has a wide range of biological applications, including use as a fluorescent marking agent for proteins, as a fluorescent reagent for protein tracking, and as a reagent in the technique of fluorescent antibodies for the rapid identification of pathogens [US 0220787, C07D 493/10,. 2012]. For example, the use of FITC for the diagnosis of in vivo prostate cancer is known [RU 2450832, A61K 49/14, 2012]. 5- [4,6-Dichlorotriazinyl] aminofluorescein (DATF) has a high protein reactivity. Unlike other reactive fluoresceins, 5-DTAF not only reacts with amino groups, but also reacts with thiol groups and even directly reacts with hydroxy groups, such as polysaccharides and other alcohols in an aqueous solution at pH above 9. Due to its high reactivity , 5-DTAF is also used to label carbohydrates as well as biologically significant molecules in vivo [GB 2081257, C07D 405/04, 1982].

Производные флуоресцеина, в частности 5-изотиоцианат флуоресцеин (ФИТЦ), флуоресцеин лизикол, могут быть получены из 5-аминофлуоресцеина, синтезированного известным методом из 5-нитрофлуоресцеина. Последний, в свою очередь, получают по нижеописанной схеме реакцией 4-нитрофталевой кислоты с резорцином, катализируемой ортофосфорной кислотой [Coons А.Н., Kaplan М.Н. Localization of antigen in tissue cells: II. Improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody // Journal of Experimental Medicine. - 1950. - T. 91. - №. 1. - C. 1-13.; Глушко В.H., Блохина Л.И., Садовская Н.Ю. Исследования по получению флуоресцеин-5-изотиоцианата-флуоресцентного наномаркера для создания биосенсоров // Российский химический журнал. - 2014. - Т. 58. - №. 1. - С. 40-45.], или метансульфоновой кислотой [US 0220787 А1, C07D 493/10, 2012].Derivatives of fluorescein, in particular 5-isothiocyanate fluorescein (FITC), fluorescein lysicol, can be obtained from 5-aminofluorescein synthesized by a known method from 5-nitrofluorescein. The latter, in turn, is obtained according to the scheme described below by the reaction of 4-nitrophthalic acid with resorcinol catalyzed by phosphoric acid [Coons AN, Kaplan MN Localization of antigen in tissue cells: II. Improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody // Journal of Experimental Medicine. - 1950. - T. 91. - No. 1. - C. 1-13 .; Glushko V.N., Blokhina L.I., Sadovskaya N.Yu. Studies on the production of fluorescein-5-isothiocyanate-fluorescent nanomarker for the creation of biosensors // Russian Chemical Journal. - 2014. - T. 58. - No. 1. - S. 40-45.], Or methanesulfonic acid [US 0220787 A1, C07D 493/10, 2012].

В результате получается смесь изомеров 5- и 6-нитрофлуоресцеина, которую разделяют с помощью уксусного ангидрида,The result is a mixture of isomers of 5- and 6-nitrofluorescein, which is separated using acetic anhydride,

Получение 5-аминофлуоресцеина осуществляют либо сначала омылением полученных ацетатов 5-нитрофлуоресцеина спиртовой щелочью с последующим восстановлением полученного 5-нитрофлуоресцеина в растворе спиртовой щелочи гидразин-гидратом на никелевом катализаторе до получения 5-аминофлуоресцеина [Coons А.Н., Kaplan М.Н. Localization of antigen in tissue cells: II. Improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody // Journal of Experimental Medicine. - 1950. - T. 91. - №. 1. - C. 1-13.], либо кипячением в водном растворе сульфида натрия [Глушко В.Н., Блохина Л.И., Садовская Н.Ю. Исследования по получению флуоресцеин-5-изотиоцианата-флуоресцентного наномаркера для создания биосенсоров // Российский химический журнал. - 2014. - Т. 58. - №. 1. - С. 40-45.]. Восстановление нитрогруппы и омыление ацетатов во втором случае происходит в одну стадию. Ниже приводится схема реакций, характеризующая протекание данного процесса синтеза 5-аминофлуоресцеина:The preparation of 5-aminofluorescein is carried out either by first saponification of the obtained 5-nitrofluorescein acetates with alcohol alkali, followed by reduction of the obtained 5-nitrofluorescein in a solution of alcohol alkali with hydrazine hydrate on a nickel catalyst to obtain 5-aminofluorescein [Coons A.N., Kaplan M.N. Localization of antigen in tissue cells: II. Improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody // Journal of Experimental Medicine. - 1950. - T. 91. - No. 1. - C. 1-13.], Or by boiling in an aqueous solution of sodium sulfide [Glushko VN, Blokhina LI, Sadovskaya N.Yu. Studies on the production of fluorescein-5-isothiocyanate-fluorescent nanomarker for the creation of biosensors // Russian Chemical Journal. - 2014. - T. 58. - No. 1. - S. 40-45.]. The restoration of the nitro group and the saponification of acetates in the second case occurs in one stage. Below is a reaction scheme characterizing the course of this process of synthesis of 5-aminofluorescein:

Основным недостатком рассмотренных выше способов синтеза 5-аминофлуоресцеина является использование в них на стадии разделения смеси изомеров 5-и 6-нитрофлуоресцеинов уксусного ангидрида, который является прекурсором в производстве героина и других наркотиков опиоидной группы. В связи с этим уксусный ангидрид введен в утвержденные в ряде государств, в том числе и в Российской Федерации, перечни наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, подлежащих контролю [В России он внесен в Постановление Правительства РФ от 30 июня 1998 г. N 681 "Об утверждении перечня наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, подлежащих контролю в Российской Федерации" (с изменениями и дополнениями)].The main disadvantage of the above methods for the synthesis of 5-aminofluorescein is the use of acetic anhydride, which is a precursor in the production of heroin and other drugs of the opioid group, at the stage of separation of the mixture of isomers of 5 and 6-nitrofluoresceins. In this regard, acetic anhydride is included in the lists of narcotic drugs, psychotropic substances and their precursors subject to control that have been approved in a number of states, including the Russian Federation [In Russia, it was included in Decree of the Government of the Russian Federation of June 30, 1998 N 681 “On approval of the list of narcotic drugs, psychotropic substances and their precursors subject to control in the Russian Federation” (with amendments and additions)].

Так, например, в способе, выбранном нами в качестве прототипа [Глушко В.Н., Блохина Л.И., Садовская Н.Ю. Исследования по получению флуоресцеин-5-изотиоцианата-флуоресцентного наномаркера для создания биосенсоров // Российский химический журнал. - 2014. - Т. 58. - №. 1. - С. 40-45.], 5-аминофлуоресцеин реакцией 4-нитрофталевой кислоты с резорцином взятых в мольном соотношении 1:2, протекающей в среде ортофосфорной кислоты, взятой в соотношении к массе 4-нитрофталевой кислоты как 1:2,5 (концентрация ортофосфорной кислоты - 70%, что соответствует уд. весу 1,52) при температуре 135°С до образования смеси изомеров 5- и 6-нитрофлуоресцеинов и ее выделением. Для разделения смеси 5- и 6-нитрофлуоресцеин диацетатов, используют уксусный ангидрид. 5-нитрофлуоресцеин диацетат восстанавливают, подвергая кипячению в водном растворе сульфида натрия, взятого в мольном соотношении 1:3,3 к 5-нитрофлуоресцеин диацетату и выделяют 5-аминофлуоресцеин.So, for example, in the method chosen by us as a prototype [Glushko V.N., Blokhina L.I., Sadovskaya N.Yu. Studies on the production of fluorescein-5-isothiocyanate-fluorescent nanomarker for the creation of biosensors // Russian Chemical Journal. - 2014. - T. 58. - No. 1. - P. 40-45.], 5-aminofluorescein by the reaction of 4-nitrophthalic acid with resorcinol taken in a molar ratio of 1: 2, proceeding in phosphoric acid medium, taken in the ratio to the mass of 4-nitrophthalic acid as 1: 2.5 (the concentration of phosphoric acid is 70%, which corresponds to a specific gravity of 1.52) at a temperature of 135 ° C until a mixture of 5- and 6-nitrofluoresceins isomers is formed and is isolated. Acetic anhydride is used to separate the mixture of 5- and 6-nitrofluorescein diacetates. 5-nitrofluorescein diacetate is reduced by boiling in an aqueous solution of sodium sulfide taken in a molar ratio of 1: 3.3 to 5-nitrofluorescein diacetate and 5-aminofluorescein is isolated.

Целью предлагаемого изобретения является получение 5-аминофлуоресцеина и 6-аминофлуоресцеина доступным способом, который обеспечивал бы получение продукта, который по своему качеству отвечал бы всем требованиям, предъявляемым к реактивам для медицины.The aim of the invention is to obtain 5-aminofluorescein and 6-aminofluorescein in an affordable manner that would ensure the receipt of a product that in quality would meet all the requirements for reagents for medicine.

Предлагаемый способ получения состоит в следующем: 5- и 6-аминофлуоресцеины получают реакцией 4-нитрофталевой кислоты с резорцином взятых в мольном соотношении 1:2, протекающей в среде ортофосфорной кислоты, взятой в соотношении к массе 4-нитрофталевой кислоты как 1:2,5 (уд. вес ортофосфорной кислоты - 1,75 г/мл) при температуре 135°С до образования смеси изомеров 5- и 6-нитрофлуоресцеинов и ее выделением и разделением через образование 5- и 6-нитрофлуоресцеин дипропионатов, с последующим восстановлением каждого из них до образования соответствующих аминопроизводных отличающийся тем, что для разделения смеси изомеров нитрофлуоресцеина (5- и 6-) используют пропионовый ангидрид в количестве 1:8, который смешивают со смесью изомеров, кипятят полученную смесь в течение 2,5 часов, охлаждают, фильтруют и выпавший осадок 5-нитрофлуоресцеин дипропионата промывают этиловым спиртом, высушивают и подвергают кипячению в водном растворе сульфида натрия, взятого в мольном соотношении 1:3,3 к 5-нитрофлуоресцеин дипропионату и выделяют 5-аминофлуоресцеин, а отделенный после фильтрации маточный раствор содержащий 6-нитрофлуоресцеин дипропионат, обрабатывают дистиллированной водой до получения маслянистого осадка, его закристаллизовывают растиранием, кристаллический осадок отделяют фильтрованием и промывают этанолом, сушат и перекристаллизовывают из бензола после чего полученный 6-нитрофлуоресцеин дипропионат также подвергают кипячению в водном растворе сульфида натрия, взятого в мольном соотношении 1:3,3 к 6-нитрофлуоресцеин дипропионату и выделяют 6-аминофлуоресцеинThe proposed production method consists in the following: 5- and 6-aminofluoresceins are obtained by the reaction of 4-nitrophthalic acid with resorcinol taken in a molar ratio of 1: 2, proceeding in an orthophosphoric acid medium, taken in the ratio to the mass of 4-nitrophthalic acid as 1: 2.5 (specific weight of phosphoric acid - 1.75 g / ml) at a temperature of 135 ° C until a mixture of 5- and 6-nitrofluoresceins isomers is formed and it is isolated and separated through the formation of 5- and 6-nitrofluorescein dipropionates, followed by reduction of each of them to the formation of the corresponding amino derivatives, characterized in that to separate the mixture of nitrofluorescein isomers (5- and 6-) propionic anhydride is used in an amount of 1: 8, which is mixed with the mixture of isomers, the resulting mixture is boiled for 2.5 hours, cooled, filtered and precipitated the precipitate of 5-nitrofluorescein dipropionate is washed with ethyl alcohol, dried and subjected to boiling in an aqueous solution of sodium sulfide, taken in a molar ratio of 1: 3.3 to 5-nitro fluorescein dipropionate and 5-aminofluorescein is isolated, and the mother liquor containing 6-nitrofluorescein dipropionate separated after filtration is treated with distilled water to obtain an oily precipitate, it is crystallized by trituration, the crystalline precipitate is filtered off and washed with ethanol, dried and recrystallized from benzene 6 nitrofluorescein dipropionate is also boiled in an aqueous solution of sodium sulfide taken in a molar ratio of 1: 3.3 to 6-nitrofluorescein dipropionate and 6-aminofluorescein is isolated

Предлагаемый способ получения 5-нитрофлуоресцеина (предшественника 5-аминофлуоресцеина) реакцией 4-нитрофталевой кислоты с резорцином отличается тем, что для получения смеси 5-, 6-нитрофлуоресцеинов используют более концентрированную ортофосфорную кислоту, а для разделения смеси изомеров нитрофлуоресцеина (5- и 6-) используют пропионовый ангидрид.The proposed method for producing 5-nitrofluorescein (a precursor of 5-aminofluorescein) by the reaction of 4-nitrophthalic acid with resorcinol is characterized in that more concentrated orthophosphoric acid is used to obtain a mixture of 5-, 6-nitrofluoresceins, and nitrofluorescein isomers (5- and 6- ) use propionic anhydride.

Пропионовый ангидрид - гомолог уксусного ангидрида, не является прекурсором в производстве героина и других наркотиков опиоидной группы, является сырьем, доступным для массового производства.Propionic anhydride - a homologue of acetic anhydride, is not a precursor in the production of heroin and other drugs of the opioid group, is a raw material available for mass production.

Ниже изобретение иллюстрируется следующим примером:The invention is illustrated below by the following example:

ПримерExample

1. Получение смеси 5-, 6-нитрофлуоресцеинов:1. Obtaining a mixture of 5-, 6-nitrofluoresceins:

В трехгорлую круглодонную колбу емкостью 1 л, снабженную термометром, механической мешалкой, обратным холодильником загружают 220 г (2 моль) резорцина, 211 г (1 моль) 4-нитрофталевой кислоты и 300 мл ортофосфорной кислоты (90%, уд. вес. 1,75 г/мл). Нагревают до 135°С и выдерживают при этой температуре 3,5 часа. Реакционную массу охлаждают до 100°С и выливают в 1 л дистиллированной воды нагретой до 80°С. Реакционную колбу споласкивают 0,5 л горячей дистиллированной воды и присоединяют к основной массе. Перемешивают 1 час, осадок отфильтровывают, переносят в колбу емкостью 2 л, приливают 1 л дистиллированной воды, кипятят 1 час и отфильтровывают горячим. Сушат при 110°С в вакуумном шкафу до постоянной массы. Получают 312 г смеси 5- и 6-нитрофлуоресцеиновов. Выход 90%.220 g (2 mol) of resorcinol, 211 g (1 mol) of 4-nitrophthalic acid and 300 ml of orthophosphoric acid (90%, specific gravity 1, are charged into a 1-liter three-neck round-bottom flask equipped with a thermometer, a mechanical stirrer, and reflux condenser). 75 g / ml). Heated to 135 ° C and maintained at this temperature for 3.5 hours. The reaction mass is cooled to 100 ° C and poured into 1 liter of distilled water heated to 80 ° C. The reaction flask is rinsed with 0.5 l of hot distilled water and attached to the bulk. It is stirred for 1 hour, the precipitate is filtered off, transferred to a 2 L flask, 1 liter of distilled water is added, boiled for 1 hour and filtered off hot. Dried at 110 ° C in a vacuum oven to constant weight. 312 g of a mixture of 5- and 6-nitrofluoresceins are obtained. Yield 90%.

2. Получение смеси 5-, 6-нитрофлуоресцеин диацетатов и ее разделение на изомеры2. Obtaining a mixture of 5-, 6-nitrofluorescein diacetates and its separation into isomers

422 г (1,12 моль) смеси 5-, 6-нитрофлуоресцеинов и 1162 г (1145 мл, 8,94 моль) пропионового ангидрида помещают в трехгорлую колбу емкостью 2,0 л, нагревают до кипения и кипятят в течение 2,5 часов. Затем реакционную смесь переливают в стакан емкостью 2,0 л, выпавший осадок при охлаждении отфильтровывают, промывают 350 мл этилового спирта. После высушивания получают 137 г (0,28 моль) 5-нитрофлуоресцеин дипропионата. Выход: 25%.422 g (1.12 mol) of a mixture of 5-, 6-nitrofluoresceins and 1162 g (1145 ml, 8.94 mol) of propionic anhydride are placed in a 2.0-liter three-necked flask, heated to boiling and boiled for 2.5 hours . Then the reaction mixture was poured into a 2.0 L beaker, the precipitate formed was filtered off with cooling, and washed with 350 ml of ethyl alcohol. After drying, 137 g (0.28 mol) of 5-nitrofluorescein dipropionate are obtained. Yield: 25%.

Т_пл.=215-218°С. ТСХ (тонкослойная хроматография) (Толуол/AcOEt 7:1): Rf - 0.64. 1Н-ЯМР (DMSO d6, σ): 8.70 (d 1Н); 8.62 (dd, 1H); 7.75 (d, 1H); 7.30 (d, 2H), 7.05-6.52 (m, 4H); 2.62 (q, 4H (CH₂)) 1.29 (t, 6H (CH₃)).T _pl. = 215-218 ° C. TLC (thin layer chromatography) (Toluene / AcOEt 7: 1): Rf 0.64. 1 H NMR (DMSO d6, σ): 8.70 (d 1H); 8.62 (dd, 1H); 7.75 (d, 1H); 7.30 (d, 2H); 7.05-6.52 (m, 4H); 2.62 (q, 4H (CH ₂ )) 1.29 (t, 6H (CH ₃ )).

Маточный раствор переливают в 2 л дистиллированной воды. Выпадает маслянистый осадок, который при растирании стеклянной палочкой закристаллизовывается. Осадок отфильтровывают, промывают 100 мл этилового спирта сушат и перекристаллизовывают из 700 мл бензола. После сушки получают 109,5 г 6-нитрофлуоресцеин дипропионата (0,224 моль) Выход: 20%. Т_пл.=191°С. ТСХ (тонкослойная хроматография) (Толуол/AcOEt; 7:1) Rf 0.51. 1Н-ЯМР (DMSO, d6): 8.70 (d 1Н); 8.40 (dd, 1H); 7.75 (d, 1H); 7.30 (d, 2H), 7.05-6.52 (m, 4H); 2.62 (q, 4H (CH₂)) 1.29 (t, 6H (CH₃)).The mother liquor is poured into 2 l of distilled water. An oily precipitate forms, which crystallizes upon grinding with a glass rod. The precipitate is filtered off, washed with 100 ml of ethyl alcohol, dried and recrystallized from 700 ml of benzene. After drying, 109.5 g of 6-nitrofluorescein dipropionate (0.224 mol) are obtained. Yield: 20%. T _pl. = 191 ° C. TLC (thin layer chromatography) (Toluene / AcOEt; 7: 1) Rf 0.51. 1 H NMR (DMSO, d6): 8.70 (d 1H); 8.40 (dd, 1H); 7.75 (d, 1H); 7.30 (d, 2H); 7.05-6.52 (m, 4H); 2.62 (q, 4H (CH ₂ )) 1.29 (t, 6H (CH ₃ )).

3. Восстановление нитрогруппы с одновременным омылением дипроионатов (на примере получения 5-аминофлуоресцеина:3. The restoration of the nitro group with the simultaneous saponification of diproionates (for example, obtaining 5-aminofluorescein:

В двухгорлую колбу, объемом 1000 мл, снабженную обратным холодильником, капельной воронкой, магнитной мешалкой помещают 50,6 г (0,11 моль) 5-нитрофлуоресцеин дипропината и 500 мл воды. К этому раствору прибавляют небольшими порциями раствор 87,2 г (0,363 моль) 9-водного сульфида натрия в 220 мл воды из капельной воронки. Суспензия 5-нитрофлуоресцеин диацетата полностью растворяется и цвет раствора из желто-коричневого становится темно красным. Кипятят раствор в течение 2-х часов, затем охлаждают до комнатной температуры. Отфильтровывают от выделившейся серы и подкисляют небольшим количеством уксусной кислоты (52 г, 50 мл)). Выпадает мелкий красный осадок. Осадок отфильтровывают, высушивают на фильтре, досушивают в вакуумном шкафу при 90°С до постоянной массы. Получено 26,7 г кирпично-красного осадка 5-аминофлуоресцеина. Выход: 70%. ¹Н ЯМР (DMSO d6, σ) 10.05 (s, 2Н); 7.00 - 6.80 (m, 3Н); 6.65 - 6.50 (m, 6Н); 5.70 (s, 2Н).In a two-necked flask with a volume of 1000 ml, equipped with a reflux condenser, a dropping funnel, a magnetic stirrer, 50.6 g (0.11 mol) of 5-nitrofluorescein dipropinate and 500 ml of water are placed. To this solution a solution of 87.2 g (0.363 mol) of 9-aqueous sodium sulfide in 220 ml of water from a dropping funnel is added in small portions. The suspension of 5-nitrofluorescein diacetate is completely dissolved and the color of the solution from tan becomes dark red. The solution is boiled for 2 hours, then cooled to room temperature. It is filtered off from the released sulfur and acidified with a small amount of acetic acid (52 g, 50 ml)). A fine red precipitate forms. The precipitate is filtered off, dried on the filter, and dried in a vacuum oven at 90 ° C to constant weight. 26.7 g of a brick-red precipitate of 5-aminofluorescein was obtained. Yield: 70%. ¹ H NMR (DMSO d6, σ) 10.05 (s, 2H); 7.00 - 6.80 (m, 3H); 6.65 - 6.50 (m, 6H); 5.70 (s, 2H).