PL215097B1 - Czasteczka DNA, zawierajacy ja rekombinowany wektor ekspresyjny DNA, organizm zywiciela transformowany taka czasteczka lub wektorem oraz polipeptyd kodowany przez sekwencje takiej czasteczki DNA o wlasciwosciach glównego alergenu pylku Phl p 4 z Phleum pratense - Google Patents
Czasteczka DNA, zawierajacy ja rekombinowany wektor ekspresyjny DNA, organizm zywiciela transformowany taka czasteczka lub wektorem oraz polipeptyd kodowany przez sekwencje takiej czasteczki DNA o wlasciwosciach glównego alergenu pylku Phl p 4 z Phleum pratenseInfo
- Publication number
- PL215097B1 PL215097B1 PL372423A PL37242303A PL215097B1 PL 215097 B1 PL215097 B1 PL 215097B1 PL 372423 A PL372423 A PL 372423A PL 37242303 A PL37242303 A PL 37242303A PL 215097 B1 PL215097 B1 PL 215097B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- phl
- seq
- gly
- ala
- dna
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
- A61K39/36—Allergens from pollen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Wynalazek dotyczy dostarczenia sekwencji genetycznej głównego alergenu pyłku traw Phl p 4. Wynalazek dotyczy także fragmentów, nowych kombinacji sekwencji częściowych i mutantów punktowych o działaniu hipoalergicznym. Rekombinowane cząsteczki DNA i pochodzące od nich polipeptydy, fragmenty czy też nowe kombinacje i warianty sekwencji częściowych mogą zostać wykorzystywane w terapii chorób alergicznych wywoływanych przez pyłki. Białka wytworzone metodą rekombinacji mogą być zastosowane w diagnostyce in vitro i in vivo alergii na pyłki.
STAN TECHNIKI
Alergie typu I mają duże znaczenie światowe. Aż 20% populacji państw uprzemysłowionych cierpi na schorzenia o podłożu alergicznym takie jak zapalenie nosa, zapalenie spojówek, czy też dychawica oskrzelowa. Alergie te wywoływane są przez znajdujące się w powietrzu alergeny (aeroalergeny), które pochodzą z różnych źródeł takich jak pyłki roślin, kleszcze, koty lub psy. Z kolei aż u około 40% alergików należących do opisywanego typu I występuje specyficzna reaktywność IgE z alergenami pyłków traw (Freidhoff et al., J. Allergy Clin. Immunol. 78, 1190-2001).
Do substancji wywołujących alergie I typu należą białka, glikoproteiny oraz polipeptydy. Po przeniknięciu błony śluzowej alergeny takie u osób uwrażliwionych reagują z cząsteczkami IgE znajdującymi się na powierzchni komórek tucznych. Jeśli dwie cząsteczki IgE łączą się ze sobą przez alergen, dochodzi do uwolnienia mediatorów (np. histamin i prostaglandyn) oraz cytokin przez komórkę efektorową, a tym samym do odpowiednich symptomów klinicznych.
W zależności od względnej częstotliwości reakcji poszczególnych cząsteczek alergenów z przeciwciałami IgE alergików, wyróżniamy alergeny główne i alergeny poboczne (drugorzędowe).
W przypadku tymotki łąkowej (Phleum pratense) jako alergeny główne zidentyfikowano dotychczas: Phl p 1 (Petersen et al., 1993, J. Allergy C (in. Immunol. 92: 789-796), Phl p 5 (Matthiesen i Lowenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54), Phl p 2/3 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3), 299-304), Phl p 4 (Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294, Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) oraz Phl p 13 (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402).
Phl p 4 opisywana jest jako zasadowa glikoproteina o masie cząsteczkowej od 50 do 60 kDa (Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268). Cząsteczka Phl p 4 jest oporna na działanie trypsyny (Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) i 70-88% alergików uczulonych na pyłki traw posiada przeciwciała IgE przeciwko niej skierowane (Valenta et al., 1993, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294; Rossi et al., 2001, Allergy 56:1180-1185; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy 33:43-51). Opisano homologiczne cząsteczki ze spokrewnionych gatunków traw (Su et al., 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 449-455; Jaggi et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348; Jaggi et al., 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 83: 845-852; Leduc-Brodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:1065-1072; 14 -17); takie homologiczne cząsteczki traw (łac.: Poaceae) tworzą grupę alergenów 4, których molekuły wykazują wysoką immunologiczną reaktywność krzyżową między sobą jak również z monoklonalnymi przeciwciałami myszy oraz z ludzkimi przeciwciałami IgE (Fahlbusch et al., 1993 Clin. Exp. Allergy 23:51-60; Leduc-Brodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072; Su et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 97:210; Fahlbusch et al. 1998, Clin. Exp. Allergy 28:799-807; Gavrovic-Jankulovic et al., 2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10 (6): 361-367; Stumvoll et al. 2002, Biol. Chem. 383: 1383-1396; Grote et al., 2002, Biol. Chem. 383:1441-1445; Andersson und Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130: 87-107; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy, 33 (1): 43-51).
W przeciwieństwie do wyżej wymienionych alergenów głównych Phleum pratense (Phl p 1, Phl p 2/3, Phl 5a i 5b, Phl p 6 i Phl p 13), struktura pierwszorzędowa Phl p 4 nie jest jeszcze jasna. Pełna sekwencja cząsteczek grupy 4 z innych gatunków traw również jest jeszcze niedostępna.
Ustalenie N-terminalnej sekwencji aminokwasowej nie zakończyło się do tej pory sukcesem. Jednak przyczyny tego nie są znane. Fischer et al. (J. Allergy Clin. Immunol., 1996; 98: 189-198) wysuwają przypuszczenie o zablokowaniu N-końca, udało im się jednakże oczyścić peptyd wewnętrzny po rozcięciu endopeptydazą i ustalić jego sekwencję: IVALPXGMLK (SEQ ID Nr 7).
Peptyd ten wykazuje homologię z sekwencjami peptydowymi alergenów krostawca -Amb a1 i Amb a2 jak również podobieństwo do sekwencji białek kukurydzy (Zm58.2), pomidora (lat 59, lat 56)
PL 215 097 B1 i tytoniu (G10) (Fischer et al., 1996; J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198). Dla fragmentów peptydowych zasadowych alergenów grupy 4 w przypadku życicy trwałej (Lolium perenne) ustalono następujące sekwencje: FLEPVLGLIFPAGV (SEQ ID Nr 8) oraz GLIEFPAGV (SEQ ID Nr 9) (Jaggi et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348).
W wyniku enzymatycznego rozcięcia uzyskano peptydy alergenów grupy 4 z Dactylus glomerata i poddano je sekwencjonowaniu:
DIYNYMEPYVSK (P15, SEQ ID Nr 10),
VDPTDYFGNEQ (P17, SEQ ID Nr 11),
ARTAWVDSGAQLGELSY (P20, SEQ ID Nr 12) oraz GVLFNIQYVNYWFAP (P22, SEQ ID Nr 13) (Leduc-Brodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:1065-1072).
Poprzez proteolizę otrzymano także peptydy alergenów grupy 4 subtropikalnego gatunku psiozęba palczastego (Cynodon dactylon) i poddano je sekwencjonowaniu:
KTVKPLYIITP (S, SEQ ID Nr 14),
KQVERDFLTSLTKDIPQLYLKS (V49L, SEQ ID Nr 15),
TVKPLYIITPITAAMI (T33S, SEQ ID Nr 16),
LRKYGTAADNVIDAKVVDAQGRLL (T35L, SEQ ID Nr 17),
KWQTVAPALPDPNM (Ρ2, SEQ ID Nr 18),
VTWIESVPYIPMGDK (V26L, SEQ ID Nr 19),
GTVRDLLXRTSNIKAFGKY (L25L, SEQ ID Nr 20),
TSNIKAFGKYKSDYVLEPIPKKS (T22L, SEQ ID Nr 21),
YRDLDLGVNQVVG (P3, SEQ ID Nr 22),
SATPPTHRSGVLFNI (V20L, SEQ ID Nr 23), oraz AAAALPTQVTRDIYAFMTPYVSKNPRQAYVNYRDLD (V14L, SEQ ID Nr 24) (Liaw et al., 2001, Biochem. Biophys. Research Communication 280:738-743).
Jednakże opisane powyżej sekwencje peptydowe Phl p 4 i alergenów grupy 4 nie wystarczają do odtworzenia pełnej struktury pierwszo rzędowej alergenów grupy 4.
Celem wynalazku jest zatem dostarczenie pełnej sekwencji DNA Phl p 4 jak również odpowiadających mu rekombinantów DNA, na bazie których alergen Phl p 4, mógłby zostać wyrażony jako białko i znaleźć znaczące zastosowanie farmakologiczne, jako takie lub w formie zmodyfikowanej.
WYKAZ FIGUR RYSUNKU fig. 1: Wewnętrzna sekwencja DNA (SEQ ID Nr 25) genu Phl p 4. Amplimery otrzymane z genomowego DNA zostały sklonowane i zsekwencjonowane z wykorzystaniem zdegenerowanych starterów nr 30 (sensowny) i nr 37 (antysensowny) - oba zaznaczono kursywą. Przedstawiona sekwencja jest zgodna w przypadku 6 klonów. Specyficzny starter sensowny nr 82 zaprojektowany na podstawie tej sekwencji jest podkreślony.
fig. 2: Koniec 3' sekwencji kwasu nukleinowego (SEQ ID Nr 26) genu Phl p 4. W wyniku reakcji amplifikacji na matrycy cDNA Phleum pratense techniką 3'-RACE PCR odcinka flankowanego specyficznym starterem nr 82 (zaznaczony kursywą) i starterem zakotwiczającym otrzymano amplimery i zsekwencjonowano je. Przedstawiona sekwencja jest zgodna w przypadku 3 procedur sekwencjonowania i obejmuje koniec 3' genu Phl p 4 do kodonu stop (podwójnie podkreślone). Zakresy sekwencji wykorzystanych do konstrukcji startera antysensownego nr 85 i nr 86 są podkreślone.
fig. 3: Lokalizacja peptydu Phl p 4 w przypuszczalnej sekwencji aminokwasów alergenu Phl p 4 (SEQ ID Nr 2).
Sekwencje aminokwasowe peptydów P1 - P6 (SEQ ID Nr 27-32) otrzymanych przy okazji procesu sekwencjonowania aminokwasów oczyszczonego i pofragmentowanego alergenu Phl p 4 można jednoznacznie przyporządkować odpowiadającym im sekwencjom nukleotydowym genu Phl p 4.
fig. 4: Określenie identyczności rekombinowanego Phl p 4 (rPhl p 4) techniką Western Blot z wykorzystaniem specyficznych przeciwciał monoklonalnych 5H1 (Biot A) i 3C4 (Blot B).
Ścieżka 1: Ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających fragment 1-200 rPhl p 4.
Ścieżka 2: Ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających fragment 185-500 rPhl p 4.
Ścieżka 3: Ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających rPhl p 4
Ścieżka 4: oczyszczony nPhl p 4 z Phleum pratense.
PL 215 097 B1 (p: rozerwane lub zdegradowane fragmenty C-terminalnego odcinka rPhl p 4 bądź całej cząsteczki rPhl p 4.
fig. 5: Określenie techniką Western Blot reaktywności rekombinowanego Phl p 4 (rPhl p 4) z IgE pochodzącymi z surowicy alergików uczulonych na pyłki traw.
Ekstrakty stransformowanych komórek E. coli, w których ekspresji ulegał cały gen Phl p 4 lub tylko N-terminalny fragment 1-200 bądź C-terminalny fragment 185-500, zostały rozdzielone metodą
SDS-PAGE i przeniesione na błonę nitrocelulozową. Naniesione na błonę peptydy inkubowano z surowicą alergików uczulonych na pyłki traw typu A, B lub C, a następnie połączone IgE z właściwymi im alergenami reagowały ze stosowanymi w tej metodzie skoniugowanymi z alkaliczną fosfatazą przeciwciałami anty-ludzka-lgE, co umożliwiło kolorymetryczną detekcję związanych IgE.
Ścieżka 1: Ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających fragment
1-200 rPhl p 4.
Ścieżka 2: Ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających fragment
185-500 rPhl p 4.
Ścieżka 3: Ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających rPhl p 4.
Ścieżka 4: oczyszczony nPhl p 4 z Phleum pratense.
Powyżej i poniżej stosowane określenia sekwencji nukleotydowych bądź aminokwasowych „SEQ ID Nr” opierają się na nazewnictwie zawartym w dołączonym protokole sekwencji.
ISTOTA WYNALAZKU
Wynalazek po raz pierwszy ujawnia sekwencję genu głównego alergenu pyłku traw Phl p 4, o trzech odkrytych dominujących sekwencjach (SEQ ID Nr 1, 3 i 5) wynikających z polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (ang. single nucleotide polymorphisms - SNPs).
Istotą wynalazku jest zatem cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej wyselekcjonowanej z grupy zawierającej sekwencje SEQ ID Nr 1, SEQ ID Nr 3 oraz SEQ ID Nr 5; względnie cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej genu kodującego alergen główny Phl p 4 z Phleum pratense.
Wynalazek dotyczy rekombinowanej cząsteczki DNA odpowiadającej sekwencjom SEQ ID Nr 1, 3 lub 5, przy czym sekwencja nukleotydowa w pozycji 1-69 pochodzi z sekwencji aminokwasowej N-końca Phl p 4. Zostały wykorzystane przy tym kodony często występujące u E.coli. Od pozycji 70 sekwencja DNA odpowiada takim sekwencjom, które zostały zidentyfikowane w DNA genomowym i cDNA Phleum pratense.
Zatem istotą wynalazku jest cząsteczka DNA zawierająca lub mająca sekwencję nukleotydową zgodną z sekwencjami SEQ ID Nr 1, SEQ ID Nr 3 względnie SEQ ID Nr 5, rozpoczynającą się w pozycji 70, która koduje polipeptyd o właściwościach alergenu głównego Phl p 4 z Phleum pratense.
Polipeptydy według wynalazku mogą być stosowane do produkcji preparatów leczniczych do diagnozy i/lub terapii alergii, które wywoływane są przez grupę 4 alergenów Poaceae jak również w zapobieganiu takim alergiom.
Polipeptydy takie lub białka według wynalazku, które mają oddziaływanie alergenne na organizm ludzki zawarte są w ziarnkach pyłku Phleum pratense. Ziarnka pyłku innych gatunków należących do rodziny Poaceae jak np. między innymi Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus zawierają homologiczne cząsteczki alergenów (alergeny grupy 4). Homologia tych cząsteczek została udowodniona przez ich krzyżową reaktywność immunologiczną zarówno z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi jak i ludzkimi przeciwciałami IgE.
Z tego względu wynalazek dotyczy również sekwencji homologicznych do sekwencji DNA Phl p 4 bądź odpowiadającej jej cząsteczki DNA alergenów grupy 4 z innych gatunków Poaceae jak na przykład Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus, Triticum aestivum oraz Hordeum vulgare, które przez istniejącą homologię sekwencji, hybrydyzują z DNA Phl p 4 w warunkach rygorystycznych, bądź wykazują krzyżową reaktywność immunologiczną względem Phl p 4.
Istotą wynalazku jest więc zatem cząsteczka DNA, która ulega hybrydyzacji z opisaną powyżej cząsteczką DNA według wynalazku w warunkach rygorystycznych i pochodzi z sekwencji DNA gatunków Poaceae.
Istotą wynalazku jest również cząsteczka DNA kodująca polipeptyd, charakteryzująca się tym, że polipeptyd ten jest wybrany z grupy obejmującej:
- polipeptyd mający sekwencję wybraną z grupy obejmującej SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 i SEQ ID Nr: 6,
PL 215 097 B1
- polipeptyd mający sekwencję aminokwasową SEQ ID Nr: 2 ze zmianami aminokwasowymi określonymi przez następujące klony 1 do 11:
klon 1: L54, I57, V62, S76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, L227, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, klon 2: L54, I57, V62, T76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287,
P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, klon 3: P141, K282, L287, P299, L347, E351, klon 4: G289, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, klon 5: L347, E351, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, klon 6: N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258,
I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, klon 7: K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, klon 8: Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299,
E351, klon 9: M231, T246, A251, C263, G289, L307, L309, E334, klon 10: Q219, K221, I231, S235, T237, M238, V242, V246, K248, A258, I264, K270, K282,
L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, N358, V362, S384, wstawienie GA pomiędzy pozycje 407 a 408, N452, Y456, A457, K460, E472, klon 11: wstawienie GA pomiędzy pozycje 407 a 408.
Wynalazek dotyczy także fragmentów, nowych kombinacji sekwencji częściowych i mutantów punktowych o działaniu hipoalergicznym.
Istotą wynalazku jest zatem również cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji częściowej lub kombinacji sekwencji częściowych według wynalazku zdefiniowanych powyżej kodująca immunomodulacyjny fragment Phl p 4 reaktywny z limfocytami T wybrana spośród:
- fragmentu 1-200, z aminokwasami 1-200 Phl p 4, oraz
- fragmentu 185-500, z aminokwasami 185-500 Phl p 4.
Wynalazek dotyczy również alergenów grupy 13, które charakteryzują się podobną masą cząsteczkową do alergenów grupy 4, co wykazano techniką SDS-PAGE oraz są trudne do rozdziałem technikami biochemicznymi (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332, Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). Za pomocą białka i sekwencji DNA według wynalazku, którą ujawniono po raz pierwszy, można jednak jednoznacznie wykazać zasadnicze różnice w sekwencji aminokwasowej pomiędzy grupami 4 i 13.
Bazując na przedstawionej sekwencji DNA rPhl p 4 sekwencje częściowe kodujące peptydy posiadające od 50 do 350 aminokwasów zostały wklonowane w wektory ekspresyjne. Sekwencje częściowe pokrywają kolejno pełną sekwencję rPhl p 4, przy czym mamy do czynienia z zachodzeniem na siebie co najmniej 12 aminokwasów. Funkcjonalne peptydy odpowiadają fragmentom Phl p 4. Fragmenty te - pojedyncze lub połączone w różnych kombinacjach - nie reagują z przeciwciałami IgE alergików lub reakcja zachodzi na niskim poziomie, co pozwala zaklasyfikować je jako hipoalergiczne. W przeciwieństwie do tego mieszanina tych fragmentów jest zdolna w takim samym stopniu jak cała cząsteczka rekombinowanego lub naturalnego Phl p 4 do stymulacji limfocytów T alergików uczulonych na pyłki traw Phl p 4.
Na rysunku fig. 4 przedstawiono jako przykład charakterystykę dwóch takich fragmentów Phl p 4, odpowiadających aminokwasom 1-200 i 185-500, poprzez ich wiązanie z Phl p 4-specyficznymi mysimi przeciwciałami monoklonalnymi. Fragment C-terminalny 185-500 reaguje tylko z przeciwciałem monoklonalnym 5H1, podczas gdy fragment N-terminalny 1-200 reaguje wyraźnie tylko z przeciwciałem monoklonalnym 3C4. Z rysunku fig. 5 jasno wynika, iż fragment 185-500 reaguje słabiej z IgE pochodzącymi z surowicy alergików B i C, jest zatem mniej alergenny niż fragment 1-200, który wykazuje zredukowaną IgE-reaktywność (właściwości hipoalergiczne) względem surowicy pacjenta C.
Zatem wynalazek dotyczy również opisanej powyżej i poniżej cząsteczki DNA kodującej fragment 1-200, z aminokwasami 1-200 Phl p 4, jak również cząsteczki DNA kodującej fragment 285-500 z aminokwasami 285-500 Phl p 4.
PL 215 097 B1
Triplety kodujące cysteinę zostały w wyniku mutagenezy ukierunkowanej tak zmienione, że kodują inne aminokwasy, a korzystnie serynę. Zostały wyprodukowane zarówno warianty, w których zamianie uległy pojedyncze reszty cystein jak również takie, w których zamienione zostały różne kombinacje dwóch reszt cysteinowych względnie wszystkich pięciu cystein. Funkcjonalne białka tych mutantów punktowych pod względem cysteiny wykazują silnie zredukowaną, względnie brak reaktywności z przeciwciałami IgE alergików, są jednakże zdolne do reakcji z limfocytami T tych pacjentów.
Zatem istotą wynalazku jest także opisana powyżej i poniżej cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej według wynalazku, w której, w szczególności wskutek ukierunkowanej mutagenezy, rzeczona sekwencja nukleotydowa została specyficznie zmodyfikowana przez zastąpienie jednej, wielu lub wszystkich cystein odpowiedniego polipeptydu przez inny aminokwas.
Dzięki znajomości sekwencji DNA naturalnie występujących alergenów jest obecnie możliwe wytworzenie tych alergenów w postaci rekombinowanych białek, które mogą znaleźć zastosowanie w diagnostyce i terapii chorób alergicznych (Scheiner and Kraft, 1995, Allergy 50: 384-391).
Klasycznym sposobem postępowania w efektywnym leczeniu alergii jest specyficzna immunoterapia lub obniżenie wrażliwości (hiposensybilizacja) (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102(4): 558-562). Pacjentom podaje się wówczas podskórnie zastrzyki z naturalnych ekstraktów alergenów zwiększając dozowanie. Przy tej metodzie istnieje jednak niebezpieczeństwo wywołania reakcji alergicznych a nawet szoku anafilaktycznego. Celem zminimalizowania tego ryzyka stosuje się innowacyjne preparaty w postaci alergoidów. Są to chemicznie zmodyfikowane ekstrakty alergenów, które charakteryzują się znacznie zredukowaną reaktywnością z IgE, ale taką samą jak w naturalnych ekstraktach reaktywnością z komórkami T (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382).
Jeszcze większą optymalizację terapii umożliwiłoby zastosowanie alergenów wyprodukowanych z wykorzystaniem procesu rekombinacji. Zdefiniowane, w danym wypadku dostosowane do indywidualnego stopnia uczulenia pacjenta koktajle wytworzonych na drodze rekombinacji alergenów o wysokiej czystości mogłyby zastąpić ekstrakty z naturalnych źródeł alergenów, gdyż w ekstraktach takich oprócz różnych alergenów znajduje się duża liczba nie oddziałujących alergennie, jednakże posiadających właściwości immunogenne białek towarzyszących.
Zastosowanie celowo zmutowanych rekombinowanych alergenów ze specyficzną delecją epitopów IgE nie wpływającą ujemnie na niezbędne w terapii epitopy rozpoznawane przez komórki T, otwiera realistyczne perspektywy bezpiecznej hiposensybilizacji produktami ekspresji. (Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162: 2406-2414).
Inną możliwością terapeutycznego wpływania na zaburzoną równowagę komórek TH u alergików jest immunoterapeutyczne szczepienie DNA. Polega ono na zastosowaniu funkcjonalnego DNA kodującego odpowiednie alergeny. Pierwszych dowodów na specyficzny dla alergenu wpływ na odpowiedź immunologiczną dostarczyły badania przeprowadzone na gryzoniach polegające na iniekcji DNA kodującego alergeny (Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544).
Cząsteczka DNA według wynalazku lub odpowiadający jej wektor ekspresyjny mogą stanowić środki lecznicze.
Odpowiednie białka wytworzone z wykorzystaniem technik rekombinacji mogą być zastosowane w terapii jak również w in vitro- i in vivo- diagnostyce alergii na pyłki.
W celu wytworzenia rekombinowanego alergenu klonowany odcinek kwasu nukleinowego jest wbudowywany w wektor ekspresyjny i konstrukcja ta ulega ekspresji w organizmie gospodarza. Rekombinowany alergen po biochemicznym oczyszczeniu można wykryć odpowiednią metodą z wykorzystaniem przeciwciał IgE.
Istotą wynalazku jest zatem także rekombinowany wektor ekspresyjny DNA zawierający opisaną powyżej lub poniżej cząsteczkę DNA według wynalazku funkcjonalnie połączony z ekspresyjną sekwencją kontrolną oraz organizm żywiciela transformowany wymienioną cząsteczką DNA lub wymienionym wektorem ekspresyjnym.
Cząsteczka DNA według wynalazku lub wektor ekspresyjny według wynalazku mogą być zastosowane do produkcji środka leczniczego wykorzystywanego w immunoterapeutycznym szczepieniu DNA pacjentów cierpiących na alergie, które wywołane są alergenami grupy 4 Poaceae i/lub w zapobieganiu takim alergiom.
Jak już wspomniano, wynalazek może znaleźć zastosowanie w specyficznej immunoterapii jako główny składnik preparatu zawierającego rekombinowany alergen lub kwas nukleinowy. Pojawia się tu więcej możliwości. Z jednej strony składnikiem preparatu może być białko o niezmienionej strukturze
PL 215 097 B1 pierwszorzędowej. Z drugiej strony dla uniknięcia niepożądanych skutków ubocznych w terapii może być według wynalazku wykorzystywana hipoalergiczna forma alergoidu powstałego z pełnej cząsteczki w wyniku specyficznej delecji epitopów IgE, bądź przez wytworzenie pojedynczych fragmentów kodujących epitopy rozpoznawane przez komórki T. W końcu preparatem leczniczym może być sam w sobie kwas nukleinowy, który jeżeli wklonowany w eukariotyczny wektor ekspresyjny, daje preparat, który przy podaniu bezpośrednim zmieniałby stan immunologiczny w sensie terapeutycznym.
Ponadto istotą wynalazku są polipeptydy otrzymane sposobami rekombinacyjnymi, które są kodowane przez jedną lub większą liczbę opisanych sekwencji DNA, a szczególnie pod kątem ich właściwości leczniczych.
Chodzi tu szczególnie o polipeptydy o sekwencji zgodnej z sekwencjami SEQ ID Nr 2, SEQ ID Nr 4 lub SEQ ID Nr 6, gdzie pozycję aminokwasów 1-33 ustalono przez N-końcowe sekwencjonowanie aminokwasów wyizolowanego naturalnego alergenu Phl p 4. Sekwencje w pozycji 24-500 wywodzą się z sekwencji DNA według SEQ ID Nr 1, 3 oraz 5. Różne aminokwasy w pozycjach 6, 7, 8 i 9 ustalono na podstawie N-końcowego sekwencjonowania białek z różnych preparatów naturalnego Phl p 4 (Tabela 1).
Polipeptydy tego typu mogą być otrzymywane z wykorzystaniem hodowli organizmu żywiciela zdefiniowanego w zastrz. 11 i izolowania odpowiedniego polipeptydu z hodowli.
W procesie wykrywania sekwencji DNA i sekwencji białek Phl p 4 postępowano następująco:
Naturalny alergen Phl p 4 oczyszczano i izolowano według opisanych sposobów (Fahlbusch et al. 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807, Suck et al. 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). W celu dokładnego oczyszczenia i pozbycia się śladów alergenów grupy 13 postępowano zgodnie ze sposobem opisanym przez Suck et al. (2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). Analizę reszty N-terminalnej sekwencji aminokwasowej wyizolowanego z Phleum pratense Phl p 4 ustalono sposobem Edmana. Zamieszczone w Tabeli 1 sekwencje N-terminalne (P1a-f) zostały ustalone na podstawie różnych wsadów Phl p 4. Jako sekwencję zgodną dla pierwszych 15 pozycji ustalono następującą sekwencję: YFPP'P'AAKEDFLGXL (SEQ ID Nr 33). Nie udało się ustalić pozycji 14, prawdopodobnie jest ona podstawiona przez cysteinę. Różne aminokwasy w pozycjach 6, 7, 8 i 9 o różnych wsadach świadczą o występowaniu izoform. Pozycje 4 i 5 są podstawione hydroksyproliną (P'), co ustalono jednoznacznie na podstawie specyficznej analizy preparatów p1-a i -b.
Przez poddanie zdenaturowanych SDS Phl p 4 działaniu endopeptydazy Glu-C (Promega, Heidelberg, Niemcy) otrzymano różne peptydy. Ustalono sekwencję aminokwasową dwóch peptydów (P2 i P3) przedstawionych w Tabeli 1. Po rozszczepieniu endopeptydazą Lys-C (Roche, Mannheim, Niemcy) dwa peptydy (P4 i P5) zostały oczyszczone i zsekwencjonowane (Tabela 1). Z zastosowaniem rozszczepienia CNBr wyizolowano i ustalono sekwencję kolejnego peptydu (P6) (Tabela 1).
Podstawą konstrukcji zdegenerowanych starterów była N-terminalna sekwencja aminokwasowa oraz sekwencje wewnętrznych peptydów 2 i 6. Amplimery z genomowego DNA Phleum pratense otrzymano z wykorzystaniem startera sensownego nr 30 i startera antysensownego nr 37 (Tabela 2). Klony uzyskane z tych amplimerów poddano sekwencjonowaniu (Figura 1) i wykorzystano do konstrukcji specyficznych starterów sensownych nr 82 (Tabela 2). Za pomocą cDNA otrzymanego z reprezentatywnej populacji mRNA z pyłku Phleum pratense oraz z wykorzystaniem specyficznego startera sensownego nr 82 według wynalazku oraz startera zakotwiczającego AUAP (Life Technologies, Karlsruhe, Niemcy), przeprowadzono reakcję PCR (ang. polymerase chain reaction - łańcuchowa reakcja polimerazy) w warunkach rygorystycznych. Otrzymany amplimer wielkości ok. 450 kb został zsekwencjonowany i zidentyfikowano dzięki temu brakującą sekwencję genu Phl p 4 przy końcu 3' (fig. 2). W oparciu o tą C-terminalną sekwencję Phl p 4 określoną według wynalazku skonstruowano specyficzne startery antysensowne nr 85 i nr 86 (Tabela 2). W oparciu o N-terminalną sekwencję aminokwasową peptydu P1-a Phl p 4 (Tabela 1) skonstruowano zdegenerowany starter sensowny nr 29 pochodzący z DNA kodującego pozycję aminokwasów 24-33 (LYAKSSPAYP (SEQ ID Nr 34)).
Z użyciem starterów nr 29 i nr 86 przeprowadzono reakcję PCR na matrycy genomowego DNA Phleum pratense. Otrzymany produkt PCR posłużył jako matryca kolejnej reakcji PCR (zagnieżdżonej [ang. nested] PCR) z użyciem starterów nr 29 i nr 85. Amplimery te poddano insercji do wektora pGEM T-easy (Promega, Heidelberg, Niemcy), sklonowano i zsekwencjonowano. Sekwencja ta ma swój początek w pozycji 24 licząc od N-końca względnie w pozycji 70 sekwencji DNA zgodnej z sekwencjami SEQ ID Nr 1, 3 lub 5 i sięga w kierunku startera nr 85 (pozycja 1402 w SEQ ID Nr 1, 3 lub 5), który zlokalizowany jest w już określonym C-terminalnym odcinku genu Phl p 4. Na podstawie otrzymanych danych z sekwencjonowania aminokwasów pierwszych 33 pozycji i z ustalonej, na pod8
PL 215 097 B1 stawie zamplifikowanych klonów z użyciem starterów nr 29/nr 85 oraz nr 82/starter zakotwiczający przypuszczalnej sekwencji aminokwasowej 477 pozycji, może zostać skonstruowana pełna sekwencja cząsteczki Phl p 4. Oba klony zachodzą na siebie w 197 pozycjach ich sekwencji nukleotydowych. Peptyd kodowany przez klon nr 29/nr 85 zachodzi na 10 pozycji aminokwasowych ustalonych poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie aminokwasów sekwencji N-terminalnej (pozycje 1-33) Phl p 4, przy czym obie zastosowane metody wskazują na obecność tych samych aminokwasów.
Sekwencja aminokwasowa Phl p 4 bazująca na bezpośrednio ustalonych aminokwasach N-terminalnych i przypuszczalnej sekwencji aminokwasowej odpowiada sekwencjom przedstawionym w protokole sekwencji pod symbolami SEQ ID Nr 2, 4 oraz 6.
Produkty reakcji PCR przygotowano ze specyficznego startera sensownego nr 88 (Tabela 2) oraz specyficznego startera antysensownego nr 86, z wykorzystaniem zarówno genomowego jak i cDNA Phleum pratense i poddano sekwencjonowaniu.
Umożliwia to wykluczenie błędów reakcji PCR oraz odkrycie genetycznych zmienności (polimorfizmy pojedynczego nukleotydu).
Wykryte polimorfizmy pojedynczego nukleotydu dla sekwencji DNA o symbolu SEQ ID Nr 1 przedstawiono w Tabeli 3. Niektóre z polimorfizmów pojedynczego nukleotydu powodują zamianę aminokwasów. Są one przedstawione w tabeli 4. Zsekwencjonowano następnie klony DNA, których występowanie warunkowało obecność odmiennych aminokwasów w stosunku do dominujących sekwencji o symbolach SEQ ID Nr 2, 4 i 6 (Tabela 5).
Ta zmienność aminokwasów warunkuje występowanie izoform cząsteczki Phl p 4. Istnienie takich izoform zaobserwowano na podstawie heterogennego izoelektrycznego zachowania naturalnego Phl p 4. Wśród wszystkich dotąd poznanych alergenów pyłku można wyróżnić omawiane izoformy. Fakt, że odcinek DNA flankowany starterami nr 29 i nr 86 faktycznie koduje białko identyczne z naturalnym alergenem Phl p 4, może być udowodniony między innymi tym, że w zgodnej z wynalazkiem wydedukowanej sekwencji aminokwasów rekombinowanej cząsteczki Phl p 4 znaleziono (fig. 3) homologiczne sekwencje peptydowe do zidentyfikowanych wewnętrznych peptydów P3, P4 i P5 (Tabela 1) naturalnego Phl p 4. Z opisanej sekwencji aminokwasowej Phl p 4 wynika, że jest on zasadową cząsteczką zbudowaną z 500 aminokwasów o punkcie izoelektrycznym wynoszącym 8,99 (SEQ ID Nr 2), 8,80 (SEQ ID Nr 4) lub 9,17 (SEQ ID Nr 6). Ilościowe zestawienie aminokwasów przedstawiono w Tabeli 6. Obliczona masa cząsteczkowa rekombinowanego Phl p 4 wynosi 55.762 (SEQ ID Nr 2), 55.734 (SEQ ID Nr 4) bądź 55.624 (SEQ ID Nr 6) Daltonów. Ta wyliczona masa cząsteczkowa zgadza się bardzo dobrze z masą cząsteczkową naturalnego Phl p 4 wynoszącą 55 kDA, ustaloną metodą SDS-PAGE (Fahlbusch et al., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807 i Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402).
Także dla alergenów grupy 4 spokrewnionych gatunków traw opublikowano masy cząsteczkowe wynoszące pomiędzy 50 a 60 kDa (Su et al., 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 449-455; Jaggi et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348; Jaggi et al., 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 83: 845-852; LeducBrodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072; 14 - 17).
Celem wyprodukowania rekombinowanego białka Phl p 4, sekwencja kodująca Phl p 4 zgodna z sekwencjami SEQ ID Nr 1, 3 i/lub 5 została wklonowana w wektor ekspresyjny (np. pProEx, pLCro, pSE 380). Dla poznanych w wyniku sekwencjonowania białek aminokwasów N-terminalnych zastosowano zoptymalizowane kodony E.coli.
Rekombinowany Phl p 4 poddano transformacji w bakteriach szczepu E.coli, ekspresji i oczyszczaniu przy zastosowaniu różnych technik rozdzielania, a otrzymane białko zostało poddane procesowi wtórnego składania.
Z tak uzyskanego białka rPhl p 4 otrzymuje się pojedyncze pasmo w elektroforezie SDS-PAGE, które wędruje w takim samym zakresie wartości mas cząsteczkowych jak naturalny Phl p 4. Reaktywność immunologiczna rPhl p 4 mogła zostać udowodniona poprzez reakcję z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi 5H1 i 3C4, które zostały wyindukowane w wyniku oddziaływania naturalnego Phl p 4 i reagują krzyżowo z homologicznymi białkami (grupa 4) Poaceae (fig. 4) (Fahlbusch et al., 1998, Clin. Exp. Allergy 28:799-807; Gavrovic-Jankulovic et al., 2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10 (6): 361-367). rPhl p 4 wchodzi w reakcję z przeciwciałami IgE alergików, które charakteryzują się udowodnioną reaktywnością IgE z naturalnym Phl p 4. Ta reaktywność wobec IgE, a poprzez to oddziaływanie jako alergen mogło zostać udowodnione zarówno w teście-Dot, metodą Western-Blot i techniką adsorpcji alergenów na polistyrenowych mikropłytkach. Detekcję metodą Western-Blot przedstawiono na rysunku fig. 5. W wyniku reakcji rPhl p 4 z leukocytami zasadochłonnymi alergików uczulonych na alergePL 215 097 B1 ny grupy 4 pyłku traw, leukocyty zasadochłonne pobudzane są do zwiększonej ekspresji markera aktywującego CD 203c. Taka aktywacja leukocytów zasadochłonnych przez rPhl p 4 świadczy wyraźnie o funkcjonalnej czynności tego białka jako alergenu. Taki alergen rPhl p 4 może zatem zostać wykorzystywany do wysoko specyficznej diagnostyki alergików uczulonych na pyłki traw. Diagnostyka ta może przebiegać w warunkach in vitro poprzez detekcję specyficznych przeciwciał (IgE, IgG1 - 4, IgA) i reakcje z komórkami efektorowymi (np. leukocytami zasadochłonnymi z krwi) upakowanymi IgE lub w warunkach in vivo poprzez test reakcji skórnej i narażenie na organ reakcji.
Reakcja rPhl p 4 z limfocytami T alergików uczulonych na pyłki traw może być dowiedziona przez specyficzną co do alergenu stymulację limfocytów T do proliferacji i syntezy cytokin dotyczącą komórek T ze świeżo spreparowanych limfocytów krwi jak również założonych linii komórkowych limfocytów T i klonów nPhl p 4-reaktywnych.
Immunomodulatorowa aktywność fragmentów hipoalergicznych, odpowiadających polipeptydom posiadającym epitopy limfocytów T, jak również hipoalergicznych mutantów punktowych (np. polimorfizmów cysteiny) jest potwierdzona ich reakcją z limfocytami T alergików uczulonych na pyłki traw.
Takie hipoalergiczne fragmenty bądź mutanty punktowe cysteiny mogą znaleźć zastosowanie w produkcji preparatów do obniżania wrażliwości (hiposensybilizacji) alergików, ponieważ reagują one z taką samą reaktywnością z limfocytami T, jednakże w związku z ich zmniejszoną lub brakiem reaktywności względem IgE, wywołują minimalne skutki uboczne spowodowane przez oddziaływanie z IgE.
W przypadku wklonowania odcinków kwasów nukleinowych kodujących hipoalergiczne warianty Phl p 4 lub kodujących niezmienione DNA Phl p 4 w ludzkie wektory ekspresyjne, konstrukcje takie mogą znaleźć zastosowanie w immunoterapii (szczepienie DNA).
Kompozycje farmaceutyczne zawierające co najmniej jedną cząsteczkę DNA według wynalazku lub co najmniej jeden z wektorów ekspresyjnych według wynalazku i opcjonalnie składniki aktywne i/lub pomocnicze mogą być zastosowane do immunoterapeutycznego szczepienia DNA pacjentów cierpiących na alergie wywołane alergenami grupy 4 Poaceae i/lub do zapobiegania takim alergiom.
Inna grupa tego rodzaju kompozycji farmaceutycznych może zawierać, zamiast DNA, co najmniej jeden z dotychczas opisanych polipeptydów nadających się do diagnozy i/lub terapii rzeczonych alergii.
Taka kompozycja farmaceutyczna zawiera jako aktywne składniki polipeptyd według wynalazku lub wektor ekspresyjny i/lub ich odpowiednią farmaceutycznie użyteczną pochodną, w tym ich mieszaniny w dowolnym stosunku. Składniki aktywne według wynalazku mogą być dostarczane do właściwej postaci dozowania razem z nośnikiem lub substancją pomocniczą o konsystencji stałej, płynnej i/lub półpłynnej i opcjonalnie w połączeniu z jednym lub kilkoma środkami czynnymi.
Jako substancje pomocnicze szczególnie nadają się do użycia immunostymulujące odcinki DNA lub oligonukleotydy bogate w motywy CpG.
Kompozycje te mogą znaleźć zastosowanie jako terapeutyki i preparaty diagnostyczne w medycynie i weterynarii. Rolę nośników mogą spełniać organiczne lub nieorganiczne substancje, które nadają się do stosowania pozajelitowego i które nie wpływają negatywnie na działanie składników aktywnych będących przedmiotem wynalazku. Do podawania pozajelitowego szczególnie właściwe są roztwory, najbardziej korzystne są roztwory oleiste lub wodne, korzystne są także zawiesiny, emulsje i implantaty. Składnik aktywny według wynalazku może także być liofilizowany, a otrzymany Iiofilizat wykorzystany np. do produkcji preparatów do iniekcji. Wymieniona kompozycja może być sterylizowana i/lub zawierać substancje pomocnicze takie jak substancje poślizgowe, konserwujące, stabilizujące i/lub substancje zwilżające, emulgatory, sole zmieniające ciśnienie osmotyczne, substancje buforowe i/lub wiele innych składników aktywnych.
Ponadto poprzez odpowiednią formulację składników aktywnych według wynalazku można otrzymać preparaty o powolnym uwalnianiu.
Wynalazek służy zatem także polepszeniu diagnostyki in vitro w ramach identyfikacji składnikowo-specyficznego spektrum wrażliwości na składniki wywołujące alergie. Wynalazek służy również do otrzymywania znacząco ulepszonych preparatów do specyficznej immunoterapii alergii wywołanych przez pyłki traw.
PL 215 097 B1
T a b e l a 1. Sekwencja aminokwasów peptydów Phl p 4
Preparat | Seria peptydu | SEQ ID Nr | Aminokwasy | ||||||
1 | 6 | 11 | 16 | 21 | 26 | 31 | |||
Cały | P1-a | 35 | YFPP'P' | AAKED | FLGXL | VKEIP | PRLLY | AKSSP | AYP |
Phl p 4 | P1-b | 36 | YFPP'P' | AAKED | FLGXL | VKE-P | PRLLY | AKSSP | |
P1-c | 37 | YFPXX | AAKED | FLGXL | |||||
P1-d | 38 | YFPXX | AKKED | FLGXL | |||||
P1-e | 39 | YFPXX | AAKDD | FLGXL | |||||
P1-f | 40 | YFPXX | LANED | F | |||||
Fragment | P2 | 41 | SATPF | XHRKG | VLFNI | QYV | |||
Glu-C | P3 | 42 | GLXYR | XLXPE | |||||
Fragment | P4 | 43 | KXMGD | DHFXA | VR | ||||
Lys-C | P5 | 44 | APEGA | VDI I | |||||
Fragment | P6 | 45 | MEPYV | SINPV | QAYAN | Y | |||
CNBr |
T a b e l a 2. Zdegenerowane oraz specyficzne sensowne (forward) i antysensowne (reverse) startery skonstruowane na bazie sekwencji peptydowych i sekwencji DNA Phl p 4
Starter Nr | Peptyd/DNA | Sensowny /Antysensowny | SEQ ID Nr | Sekwencja nukleotydowa |
29 | Phl p 4-P1 | S | 46 | YTN TAY GCN AAR WSN WSN CCN GCN TAY CC |
30 | Phl p 4-P2 | S | 47 | CAY MGN AAR GGN GTN YTN TTY AAY ATM C |
37 | Phl p 4-P6 | As | 48 | TAR TTN GCR TAN GCY TGN |
ACN GGR TT | ||||
82 | Phl p 4-DNA-NYW | S | 49 | ACT ACT GGT TCG CCC CGG GAG CC |
85 | Phl p 4-DNA-GLV | As | 50 | TGA AGT ATT TCT GGC CCC ACA CCA AAC C |
86 | Phl p 4-DNA-QRL | As | 51 | CCC TTG GTG ATG GCG AGC CTC TGG |
88 | Phl p 4-DNA-PSV | S | 52 | CTC AGT CCT GGG GCA GAC CAT CC |
Sekwencje nukleotydów starterów 82, 85, 86 oraz 88 przedstawiono zwyczajowym kodem 4-literowym. W przypadku starterów 29, 30 oraz 37 zastosowano kod DNA IUPAC-IUB; w tym przypadku litera „N” oznacza inozynę.
PL 215 097 B1
T a b e l a 3. Wykryte polimorfizmy pojedynczych nukleotydów
Pozycja w sekwencji | Nukleotyd według SEQ ID Nr 1 | Wykryte SNP |
1 | 2 | 3 |
85 | T | A |
130 | C | A |
159 | G | A |
160 | A | C |
169 | G | A |
185 | C | T |
186 | C | A |
222 | G | C |
226 | G | A |
227 | G | C |
228 | T | C |
237 | C | T |
273 | C | T |
285 | C | T |
286 | C | T |
298 | G | A |
299 | A | C |
303 | C | T |
309 | C | G |
318 | T | C |
320 | G | A |
333 | C | G |
348 | G | C |
369 | C | G |
409 | C | T |
411 | C | T |
420 | T | C |
421 | A | C |
423 | A | C |
424 | G | A |
PL 215 097 B1 cd. tabeli 3
1 | 2 | 3 |
425 | T | C |
456 | C | G |
462 | C | A |
522 | G | C |
525 | C | G |
567 | G | A |
618 | C | T |
655 | A | C |
657 | G | A |
662 | G | A |
680 | C | T |
684 | G | C |
690 | C | A |
691 | G | A |
693 | G | A |
703 | C | T, A |
710 | A | C |
711 | G | A |
713 | C | T |
743 | G | A |
750 | G | A |
768 | C | T |
773 | A | C |
790 | G | A |
798 | G | C |
801 | G | A |
804 | C | G |
809 | C | A |
834 | G | C |
844 | C | A |
859 | A | T |
865 | A | G |
PL 215 097 B1 cd. tabeli 3
1 | 2 | 3 |
879 | G | C |
895 | G | C |
900 | G | C, A |
918 | G | A |
961 | A | G |
962 | A | C |
964 | A | C |
987 | G | C |
994 | A | T |
1020 | G | A |
1023 | G | C |
1036 | G | C |
1040 | C | T |
1041 | G | C |
1047 | C | A |
1051 | A | G |
1052 | G | A, C |
1053 | G | A, C, T |
1056 | G | C |
1069 | T | C |
1073 | G | A |
1084 | C | G |
1086 | G | C |
1090 | C | T |
1098 | G | C |
1151 | G | C |
1152 | G | C |
1155 | G | C |
1161 | G | C |
1185 | C | G |
1229 | G | C |
1233 | G | C |
PL 215 097 B1 cd. tabeli 3
1 | 2 | 3 |
1239 | A | C |
1240 | T | C |
1242 | G | C |
1257 | G | C |
1266 | C | T |
1269 | C | T |
1278 | A | C, G |
1305 | C | G |
1308 | C | T |
1311 | C | A |
1335 | G | C |
1350 | G | C |
1357 | T | A |
1359 | A | G |
1370 | G | C |
1377 | T | C |
1378 | T | A |
1379 | T | A |
1383 | G | C |
1398 | C | T |
1411 | T | C |
1414 | C | G |
1425 | C | A |
1428 | C | T |
1443 | G | C |
1449 | C | T |
1464 | G | A |
1485 | G | A |
1498 | A | C |
PL 215 097 B1
T a b e l a 4. Zamiany aminokwasów w konsekwencji polimorfizmów pojedynczych nukleotydów
Pozycja w sekwencji | Aminokwasy według SEQ ID Nr 2 | Wykryte zamiany |
1 | 2 | 3 |
6 | A | L |
7 | A | K |
8 | K | N |
9 | E | D |
29 | S | T |
54 | I | L |
57 | V | I |
62 | A | V |
76 | G | T, N, S |
100 | E | T |
107 | S | N |
137 | H | Y |
141 | T | P |
142 | V | A, T |
189 | T | K |
219 | K | Q |
221 | R | K |
227 | P | L |
231 | V | I |
235 | P | T, S |
237 | K | T |
238 | A | V |
248 | R | K |
258 | D | A |
264 | V | I |
270 | T | K |
282 | Q | K |
287 | M | L |
289 | S | G |
299 | A | P |
PL 215 097 B1 cd. tabeli 4
1 | 2 | 3 |
321 | N | A |
322 | I | L |
332 | T | S |
346 | E | Q |
347 | P | L |
351 | R | E, T |
357 | F | L |
358 | S | N |
362 | L | V |
364 | P | S |
384 | W | S |
410 | G | A |
419 | E | D |
456 | F | Y |
457 | S | A, N |
460 | L | K |
468 | K | M |
472 | Q | E |
498 | K | Q |
T a b e l a 5. Pozycje aminokwasów różniących się w poszczególnych klonach Phl p 4 w porównaniu z sekwencją SEQ ID Nr 2
Przykład | Pozycje różniące się* |
1 | 2 |
Klon 1 | L54, I57, V62, S76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, L227, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472 |
Klon 2 | L54, I57, V62, T76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472 |
Klon 3 | P141, K282, L287, P299, L347, E351 |
Klon 4 | G289, A410, D419, Y456, A 457, K460, E472 |
Klon 5 | L347, E351, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472 |
Klon 6 | N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460 |
Klon 7 | K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384 |
PL 215 097 B1 cd. tabeli 5
1 | 2 |
Klon 8 | Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, E351 |
Klon 9 | M231, T246, A251, C263, G289, L307, L309, E334 |
Klon 10 | Q219, K221, I231, S235, T237, M238, V242, V246, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, N358, V362, S384, wstawienie GA pomiędzy pozycję 407 a 408, N452, Y456, A457, K460, E472 |
Klon 11 | Wstawienie GA pomiędzy pozycję 407 a 408 |
*[Aminokwas według SEQ ID Nr 2 / pozycje w sekwencji / różniący się aminokwas]
T a b e l a 6. Skład aminokwasowy Phl p 4
Aminokwasy | Liczba | % masowy |
Z ładunkiem | 138/138/138 | 33.89/33.86/33.93 |
Kwasowe | 45/46/43 | 9.82/10.05/9.38 |
Zasadowe | 54/53/55 | 13.67/13.39/13.78 |
Polarne | 120/119/124 | 24.88/24.71/25.89 |
Hydrofobowe | 180/180/180 | 35.64/35.66/35.43 |
A AIa | 40/40/41 | 5.10/5.10/5.24 |
C Cys | 5/5/5 | 0.92/0.93/0.93 |
D Asp | 24/24/24 | 4.95/4.96/4.97 |
E Glu | 21/22/19 | 4.86/5.10/4.41 |
F Phe | 24/24/22 | 6.33/6.34/5.82 |
G Gly | 42/42/40 | 4.30/4.30/4.10 |
H His | 10/10/9 | 2.46/2.46/2.22 |
I Ile | 29/29/30 | 5.88/5.89/6.10 |
K Lys | 29/29/33 | 6.67/6.67/7.60 |
L Leu | 33/33/35 | 6.70/6.70/7.12 |
M Met | 11/11/10 | 2.59/2.59/2.36 |
N Asn | 22/22/23 | 4.50/4.50/4.72 |
P Pro* | 38/39/39 | 6.62/6.80/6.81 |
Q Gln | 15/15/15 | 3.45/3.45/3.46 |
R Arg | 25/24/22 | 7.00/6.73/6.18 |
S Ser | 32/32/33 | 5.00/5.00/5.17 |
T Thr | 22/21/22 | 3.99/3.81/4.00 |
V VaI | 41/41/40 | 7.29/7.29/7.13 |
W Trp | 13/13/12 | 4.34/4.34/4.02 |
Y Tyr | 24/24/26 | 7.02/7.03/7.63 |
* w tym hydroksyprolina
Wartości zostały podane dla trzech dominujących sekwencji w kolejności SEQ ID Nr 2/SEQ ID Nr 4/SEQ ID Nr 6.
PL 215 097 B1
Lista sekwencji <110> Merck Patent GmbH <120> Sekwencja DNA i otrzymywanie alergenu Phi p 4 pyłku traw metodami rekombinacji <130> P 02/101 <140> EP 02 013953.1 <141> 2002-06-25 <160> 52 <170> Patentln wersja 3.1 <210> 1 <211> 1503 <212> DNA <2-13> Phleusi pratense <220>
<221> sztuczna sekwencja DNA <222> ¢1),.(69} <223> sekwencja DNA pochodzącą z sekwencjonowanego białka <220>
<221> natywna sekwencja DNA <222> (70)..(1503} <223>
PL 215 097 B1
<220> | |
<221> | CDS |
<222> | (1)..(1503) |
<223> |
<400> 1
tac ttc Tyr Phe 1 | ccg ccg | ccg Pro 5 | gct gct aaa gaa gac ttc ctg ggt tgc ctg gtt | 48 | ||||||||||||
Pro | Pro | Ala | Ala Lys | GTo | Asp Phe 10 | Leu | Gly | Cys | Leu 15 | Val | ||||||
aaa | gaa | atc | ccg | ccg | cgt | ctg | ttg | tac | gcg | aaa | teg | teg | ccg | gcg | tat | 96 |
Lys | Glu | Ile | Pro | Ero | Arg | Leu | Leu | Tyr | Ala | Lys | Ser | Ser | Pro | Ala | Tyr | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
ccc | tea | gtc | ctg | ggg | cag | acc | atc | cgg | aac | teg | cgg | tgg | teg | teg | ccg | 144 |
Pro | Ser | Val | Leu | Gly | Gin | Thr | Ile | Arg | Asn | Ser | Arg | Trp | Ser | Ser | Pro | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
gac | aac | gtg | aag | ccg | atc | tac | atc | gtc | acc | ccc | acc | aac | gcc | tcc | cac | 192 |
Asp | Asn | Val | Lys | Pro | Ile | Tyr | Ile | Val | Thr | Pro | Thr | Asn | Ala | Ser | His | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
atc | cag | tcc | gcc | gtg | gtg | tgc | ggc | cgc | cgg | cac | ggt | gtc | cgc | atc | cgc | 240 |
Ile | Gin | Ser | Ala | Val | Val | Cys | Gly | Arg | Arg | His | Gly | Val | Arg | Ile | Arg | |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
gtg | cgc | agc | ggc | ggg | cac | gac | tac | gag | ggc | ctc | teg | tac | cgg | tcc | ctg | 288 |
Val | Arg | Ser | Gly | Gly | His | Asp | Tyr | Glu | Gly | Leu | Ser | Tyr | Arg | Ser | Leu | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
cag | ccc | gag | gag | ttc | gcc | gtc | gtc | gac | ctt | agc | aag | atg | cgg | gcc | gtg | 336 |
Gin | Pro | Glu | Glu | Fhe | Ala | Val | Val | Asp | Leu | Ser | Lys | Met | Arg | Ala | Val | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
tgg | gtg | gac | ggg | aag | gcc | cgc | acg | gcg | tgg | gtc | gac | tcc | ggc | gcg | cag | 384 |
Trp | Val | Asp | Gly | Lys | Ala | Arg | Thr | Ala | Trp | Val | Asp | Ser | Giy | Ala | Gin | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
ctc | ggc | gag | ctc | tac | tac | gcc | atc | cac | aag | gcg | agt | cca | gtg | ctg | gcg | 432 |
Leu | Gly | Glu | Leu | Tyr | Tyr | Ala | Ile | His | Lys | Ala | Ser | Pro | Val | Leu | Ala | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
ttc | ccg | gcc | ggc | gtg | tgc | ccg | acc | atc | ggc | gtg | ggc | ggc | aac | ttc | gcg | 480 |
Phe | Pro | Ala | Gly | Val | Cys | Pro | Thr | Ile | Gly | Val | Giy | Gly | Asn | Phe | Ala | |
145 | 15'0 | 155 | 160 | |||||||||||||
ggc | ggc | ggc | ttc | ggc | atg | ctg | ctg | cgc | aag | tac | ggc | atc | gcg | gcc | gag | 528 |
Gly | Gly | Gly | Phe | Gly | Met | Leu | Leu | Arg | Lys | Tyr | Gly | Ile | Ala | Ala | Glu | |
165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
aac | gtc | atc | gac | gtg | aag | ctc | gtc | gac | gcc | aac | ggc | acg | ctg | cac | gac | 576 |
Asn | Val | Ile | Asp | Val | Lys | Leu | Val | Asp | Ala | Asn | Gly | Thr | Leu | His | Asp | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
aag | aag | tcc | atg | ggc | gac | gac | cat | ttc | tgg | gcc | gtc | agg | ggc | ggc | ggg | 624 |
Lys | Lys | Ser | Met | Gly | Asp | Asp | His | Phe | Trp | Ala | Val | Arg | Gly | Gly | Gly | |
195 | 200 | 205 |
PL 215 097 B1
qqc aac age ttc | ggc Gly | atc gtg | gtc gcg | tgg aag gtg agg ctc ctg | ccg Pro | S72 | ||||||||||
Gly | Glu 210 | Ser Phe | Ile | Val 215 | Val | Ala | Trp | Lys | Val 220 | Arg | Leu | Leu | ||||
gtg | ccg | CCC | acg | gtg | acc | gtg | ttc | *3 JS /T CLdy | at c | ccc | aag | aag | gcg | age | gag | 720 |
Val | Ero | Pro | Thr | Val | Thr | Val | Ehe | Lys | I le | Pro | Lys | Lys | Ala | Ser | Glu | |
225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
ggc | gcc | gtg | gac | atc | atc | aac | agg | tgg | cag | gtg | gtc | gcg | ccg | cag | ctc | 768 |
Gly | Ala | Val | Asp | Ile | Ile | Asn | Arg | Trp | Gin | Val | Val | Ala | Pro | Gin | Leu | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
ccc | gac | gac | ctc | atg | atc | cgc | gtc | atc | gcg | cag | ggc | ccc | acg | gcc | acg | 816 |
Ero | Asp | Asp | Leu | Met | Ile | Arg | Val | Ile | Ala | Gin | Gly | Pro | Thr | Ala | Thr | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
ttc | gag | gcc | atg | tac | ctg | gg<= | acc | tgc | caa | acc | ctg | acg | ccg | atg | atg | 864 |
Ehe | Glu | Ala | Met | Tyr | Leu | Gly | Thr | Cys | Gin | Thr | Leu | Thr | Pro | Met | Met | |
275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
age | age | aag | ttc | ccc | gag | ctc | ggc | atg | aac | gcc | tcg | cac | tgc | aac | gag | 912 |
Ser | Ser | Lys | Phe | Pro | Glu | Leu | Gly | Met | Asn | Ala | Ser | His | Cys | Asn | Glu | |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
atg | tcg | tgg | atc | cag | tcc | atc | ccc | ttc | gtc | cac | ctc | ggc | cac | agg | gac | 960 |
Met | Ser | Trp | Ile | Gin | Ser | Ile | Pro | Phe | Val | His | Leu | Gly | His | Arg | Asp | |
305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
aac | atc | gag | gac | gac | ctc | ctc | aac | cgg | aac | aac | acc | ttc | aag | ccc | ttc | 1008 |
Asn | Ile | Glu | Asp | Asp, | Leu | Leu | Asn | Arg | Asn | Asn | Thr | Phe | Lys | Pro | Phe | |
325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
gcc | gaa | tac | aag | tcg | gac | tac | gtc | tac | gag | ccg | ttc | ccc | aag | gaa | gtg | 1056 |
Ala | Glu | Tyr | Lys | Ser | Asp | Tyr | Val | Tyr | Glu | Pro | Phe | Pro | Lys | Glu | Val | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
tgg | gag | cag | atc | ttc | age | acc | tgg | ctc | ctg | aag | ccc | ggc | gcg | ggg | atc | 1104 |
Trp | Glu | Gin | Ile | Phe | Ser | Thr | Trp | Leu | Leu | Lys | Pro | Gly | Ala | Gly | Ile | |
355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
atg | atc | ttc | gac | ccc | tac | ggc | gcc | acc | atc | age | gcc | acc | ccg | gag | tgg | 1152 |
Met | Ile | Phe | Asp | Pro | Tyr | Gly | Ala | Thr | Ile | Ser | Ala | Thr | Pro | Glu | Trp | |
370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
gcg | acg | ccg | ttc | cct | cac | cgc | aag | ggc | gtc | ctc | ttc | aac | atc | cag | tac | 1200 |
Ala | Thr | Pro | Phe | Pro | His | Arg | Lys | Gly | Val | Leu | Phe | Asn | Ile | Gin | Tyr | |
385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||||
gtc | aac | tac | tgg | ttc | gcc | ccg | gga | gcc | ggc | gcg | gcg | cca | ttg | tcg | tgg | 1248 |
Val | Asn | Tyr | Trp | Phe | Ala | Pro | Gly | Ala | Gly | Ala | Ala | Pro | Leu | Ser | Trp | |
405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
age | aag | gag | atc | tac | aac | tac | atg | gag | cca | tac | gtg | age | aag | aac | ccc | 1296 |
Ser | Lys | Glu | Ile | Tyr | Asn | Tyr | Met | Glu | Pro | Tyr | Val | Ser | Lys | Asn' | Pro | |
420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
agg | cag | gcc | tac | gcc | aac | tac | agg | gac | atc | gac | ctc | ggg | agg | aac | gag | 1344 |
Arg | Gin | Ala | Tyr | Ala | Asn | Tyr | Arg | Asp | Ile | Asp | Leu | Gly | Arg | Asn | Glu | |
435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
gtg | gtg | aac | gac | gtc | tcc | acc | ttc | age | age | ggt | ttg | gtg | tgg | ggc | cag | 1392 |
PL 215 097 B1
Val Val Asn Asp Val Ser 450 | Thr Phe 455 | Ser Ser | Gly | Leu 460 | Val | Trp | Gly | Gin | ||||||||
aaa | tac | ttc | aag | ggc | aat | ttc | cag | agg | ctc | gcc | atc | acc | aag | ggc | aag | 1440 |
Lys | Tyr | Phe | Lys | Gly | Asn | Phe | Gin | Arg | Leu | Ala | Ile | Thr | Lys | Gly | Lys | |
465 | 470 | 475 | 480 | |||||||||||||
gtg | gat | ccc | ctCCT | gac | ttc | agg | aac | gag | cag | age | atc | ccg | ccg | ctc | 14 88 | |
Yal | Asp | Pro | Thr | Asp | Tyr | Phe | Arg | Asn | Glu | Gin | Ser | Ile | Pro | Pro | Leu | |
485 | 490 | 495 |
atc aaa aag tac tga 1503
Ile Lys Lys Tyr
500
<210> | 2 |
<2H> | 500 |
<212> | PRT |
<213> | Phleum pratense |
<4 00> | 2 |
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Val 15 10 15
Lys | Glu | Ile | Pro 20 | Pro | Arg | Leu | Leu | Tyr 25 | Ala | Lys | Ser | Ser | Pro 30 | Ala | Tyr |
Pro | Ser | Yal | Leu | Gly | Gin | Thr | Ile | Arg | Asn | Ser | Arg | Trp | Ser | Ser | Pro |
40 45
Asp Asn Val Lys Pro Ile Tyr Ile Val Thr Pro Thr Asn Ala Ser His 50 55 60
Ile Gin Ser Ala Val Val Cys Gly Arg Arg His Gly Yal Arg Ile Arg 65 70 75 30
Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu 85 90 95
Gin Pro Glu Glu Phe Ala Val Val Asp Leu Ser Lys Met Arg Ala Val 100 105 110
Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gin 115 120 125
Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile His Lys Ala Ser Pro Yal Leu Ala 130 135 140 .
PL 215 097 B1
Phe 145 | Pro | Ala | Gly | Val | Cys 150 | Pro | Thr | Ile | Gly | Yal 155 | Gly Gly | Asn | Phe | Ala 150 | |
Gly | Gly | Gly | Phe | Gly 155 | Met | Leu | Leu | Arg | Lys 170 | Tyr | Gly | Ile | Ala | Ala 175 | Glu |
Asn | Val | Ile | Asp 180 | Val | Lys | Leu | Val | Asp 165 | Ala | Asn | Giy | Thr | Leu 190 | His | Asp |
Lys | Lys | Ser 195 | Met | Gly | Asp | Asp | His 200 | Phe | Trp | Ala | Val | Arg 205 | Gly | Gly | Gly |
Gly | Glu 210 | Ser | Phe | Gly | Ile | Val 215 | Val | Ala | Trp | Lys | Val 220 | Arg | Leu | Leu | Pro |
Yal 225 | Pro | Pro | Thr | Val | Thr 230 | Val | Phe | Lys | Ile | Pro 235 | Lys | Lys | Ala | Ser | Glu 240 |
Gly | Ala | Yal | Asp | Ile 245 | Ile | Asn | Arg | Trp | Gin 250 | Yal | Yal | Ala | Pro | Gin 255 | Leu |
Pro Asp Asp Leu | Met Ile Arg | Yal Ile Ala Gin Gly Pro Thr Ala Thr | |||||||||||||
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Phe | Glu | Ala | Met | Tyr | Leu | Gly | Thr | Cys | Gin | Thr | Leu | Thr | Pro | Met | Met |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Ser | Ser | Lys | Phe | Pro | Glu | Leu | Gly | Met | Asn | Ala | Ser | His | Cys | Asn | Glu |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Met | Ser | Trp | Ile | Gin | Ser | Ile | Pro | Phe | Yal | His | Leu | Gly | His | Arg | Asp |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Asn | Ile | Glu | Asp | Asp | Leu | Leu | Asn | Arg | Asn | Asn | Thr | Phe | Lys | Pro | Phe |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Ala | Glu | Tyr | Lys 340 | Ser | Asp | Tyr | Yal | Tyr 345 | Glu | Pro | Phe | Pro | Lys 350 | Glu | Yal |
Trp | Glu | Gin | Ile | Phe | Ser | Thr | Trp | Leu. | Leu | Lys | Pro | Gly | Ala | Gly | Ile |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Met | Ile | Phe | Asp | Pro | Tyr | Gly | Ala | Thr | Ile | Ser | Ala | Thr | Pro | Glu | Trp |
370 | 375 | 380 |
PL 215 097 B1
Ala 305 | Thr | Pro | Phe | Pro | His 330 | Arg | Lys | Gly | Val | Leu 395 | Phe | Asn | Ile | Gin | Tyr 400 |
Val | Asn | Tyr | Trp | Phe 405 | Ala | Pro | Gly | Ala· | Gly 410 | Ala | Ala | Pro | Leu | Ser 415 | Trp |
Ser | Lys | Glu | Ile 420 | Tyr | Asn | Tyr | Met | Glu 425 | Pro | Tyr | Val | Ser | Lys 430 | Asn | Pro |
Arg | Gin | Ala 435 | Tyr | Al 3 | Asn | Tyr | Arg 440 | Asp | Ile | Asp | Leu | dy 445 | Arg | Asn | Glu |
Val | Val 450 | Asn | Asp | Yal | Ser | Thr 455 | Phe | Ser | Ser | Gly | Leu 460 | Val | Trp | Gly | Gin |
Lys 465 | Tyr | Phe | Lys | Gly | Asn 470 | Phe | Gin | Arg | Leu | Ala 475 | Ile | Thr | Lys | Gly | Lys 480 |
Val | Asp | Pro | Thr | Asp 485 | Tyr | Phe | Arg | Asn. | Glu 490 | Gin | Ser | Ile | Pro | Pro 495 | Leu |
Ile Lys Lys Tyr 500 <210> 3 <211> 1503 <212> DNA <213> Phleum pratense <220>
<221> sztuczna sekwencja DNA <222> (1).,(69) <223> sekwencja DNA pochodzącą z sekwencjonowanego białka <220 <221> natywna sekwencja DNA <222> (70)..(1503) <223>
PL 215 097 B1
<220> | |
<221> | CDS |
<222> | (1)..(1503 |
<223> |
<400> 3
tac ttc | ccg ccg ccg Pro Pro Pro 5 | gct gct aaa gaa gac ttc ctg ggt tgc ctg | gtt Val | 48 | |||||||||
Tyr 1 | Phe | Ala | Ala Lys | Glu | Asp 10 | Phe | Leu | Gly | Cys | Leu 15 | |||
aaa | gaa | atc ccg ccg | cgt | ctg.ttg | tac | gcg | aaa | teg | teg | ccg | gcg | tat | 96 |
Lys | Glu | Ile Pro Pro 20 | Arg | Leu Leu | Tyr 25, | Ala | Lys | Ser | Ser | Pro 30 | Ala | Tyr | |
ccc | tea | gtc ctg ggg | cag | acc atc | cgg | aac | teg | cgg | tgg | teg | teg | ccg | 144 |
Pro | Ser | Val Leu Gly 35 | Gin | Thr Ile 40 | Arg | Asn | Ser | Arg | Trp 45 | Ser | Ser | Pro | |
gac | aac | gtg aag ccg | atc | tac atc | gtc | acc | ccc | acc | aac | gcc | tcc | cac | 192 |
Asp | Asn 50 | Val Lys Pro | Ile | Tyr Ile 55 | Val | Thr | Pro | Thr 60 | Asn | Ala | Ser | His | |
atc | cag | tcc gcc gtg | gtg | tgc ggc | cgc | cgg | cac | ggt | gtc | cgc | atc | cgc | 240 |
Ile 65 | Gin | Ser Ala Val | Val 70 | Cys Gly | Arg | Arg | His 75 | Gly | Val | Arg | Ile | Arg 80 | |
gtg | cgc | age ggc ggg | cac | gac tac | gag | ggc | ctc | teg | tac | cgg | tcc | ctg | 288 |
Val | Arg | Ser Gly Gly 85 | His | Asp Tyr | Glu | Gly 90 | Leu | Ser | Tyr | Arg | Ser 95 | Leu | |
cag | ccc | gag gag ttc | gcc | gtc gtc | gac | ctt | age | aag | atg | cgg | gcc | gtg | 336 |
Gin | Pro | Glu Glu Phe 100 | Ala | Val Val | Asp 105 | Leu | Ser | Lys | Met | Arg 110 | Ala | Val | |
tgg | gtg | gac ggg aag | gcc | cgc acg | gcg | tgg | gtc | gac | tcc | ggc | gcg | cag | 384 |
Trp | Val | Asp Gly Lys 115 | Ala | Arg Thr 120 | Ala | Trp | Val | Asp | Ser 125 | Gly | Ala | Gin | |
ctc | ggc | gag ctc tac | tac | gcc atc | cac | aag | gcg | agt | aca | gtg | ctg | gcg | 432 |
Lsu | Gly 130 | Glu Leu Tyr | Tyr | Ala Ile 135 | His | Lys | Ala | Ser 14 0 | Thr | Val | Leu | Ala | |
ttc | ccg | gcc ggc gtg | tgc | ccg acc | atc | ggc | gtg | ggc | ggc | aac | ttc | gcg | 480 |
Phe 145 | Pro | Ala Gly Val | Cys 150 | Pro Thr | Ile | Gly | Val 155 | Gly | Gly | Asri | Phe | Ala 160 | |
ggc | ggc | ggc ttc ggc | atg | ctg ctg | cgc | aag | tac | ggc | atc | gcg | gcc | gag | 528 |
Gly | Gly | Gly Phe Gly 165 | Met | Leu Leu | Arg | Lys 170 | Tyr | Giy | Ile | Ala | Ala 175 | Glu | |
aac | gtc | atc gac gtg | aag | ctc gtc | gac | gcc | aac | ggc | acg | ctg | cac | gac | 576 |
Asn | Val | Ile Asp Val 180 | Lys | Leu Val | Asp 185 | Ala | Asn | Gly | Thr | Leu 190 | His | Asp | |
tcc atg ggc | gac | gac cat | ttc | tgg | gcc | gtc | agg | ggc | cpjc | ggg | 624 | ||
Lys | Lys | Ser Met Gly | Asp | Asp His | Phe | Trp | Ala | Val | Arg | Gly | Gly | Gly |
195 200 205
PL 215 097 B1
ggc Gly | gag age ttc ggc | atc Ile | gtg Val 215 | gtc gcg tgg aag gtg agg | ctc Leu | ctg Leu | ccg Pro | 672 | ||||||||
Glu 210 | Ser | Phe | Gly | Val | Ala | Trp | Lys | Val 220 | Arg | |||||||
gtg | ccg | ccc | acg | gtg | acc | ttc | aag | at c | ccc | £<3.CJ | «33.CJ | gcg | age | gag | 720 | |
Val | Pro | Pro | Thr | Val | Thr | Val | Phe | Lys | Ile | Pro | Lys | Lys | Ala | Ser | Glu | |
225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
ggc | gcc | gtg | gac | atc | atc | aac | agg | tgg | cag | gtg | gtc | gcg | ccg | cag | ctc | 768 |
Gly | Ala | Val | Asp | Ile | Ile | Tlsn | Arg | Trp | Gin | Val | Val | Al a | Pro | Gin | Leu | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
ccc | gac | gac | ctc | atg | atc | cgc | gtc | atc | gcg | cag | ggc | ccc | acg | gcc | acg | 816 |
Pro | Asp | Asp | Leu | Met | Ile | Arg | Val | Ile | Ala | Gin | Gly | Pro | Thr | Ala | Thr | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
ttc | gag | gcc | atg | tac | ctg | ggc | acc | tgc | caa | acc | ctg | acg | ccg | atg | atg | 864 |
Phe | Glu | Ala | Met | Tyr | Leu | Gly | Thr | cys | Gin | Thr | Leu | Thr | Pro | Met | Met | |
275 | 290 | 285 | ||||||||||||||
age | age | aag | ttc | ccg | gag | ctc | ggc | atg | aac | gcc | tcg | cac | tgc | aac | gag | 912 |
Ser | Ser | Lys | Phe | Pro | Glu | Leu | Gly | Met | Asn | Ala | Ser | His | Cys | Asn | Glu | |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
atg | tcg | tgg | atc | cag | tcc | atc | ccc | ttc | gtc | cac | ctc | ggc | cac | agg | gac | 960 |
Met | Ser | Trp | Ile | Gin | Ser | Ile | Pro | Phe | Val | His | Leu | Gly | His | Arg | Asp | |
305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
aac | atc | gag | gac | gac | ctc | ctc | aac | cgg | aac | aac | acc | ttc | aag | ccc | ttc | 1008 |
Asn | Ile | Glu | Asp | Asp | Leu | Leu | Asn | Arg | Asn | Asn | Thr | Phe | Lys | Pro | Phe | |
325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
gcc | gaa | tac | aag | tcg | gac | tac | gtc | tac | gag | ccg | ttc | ccc | aag | agg | gtg | 1056 |
Ala | Glu | Tyr | Lys | Ser | Asp | Tyr | Val | Tyr | Glu | Pro | Phe | Pro | Lys | Arg | Val | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
tgg | gag | cag | atc | ttc | age | acc | tgg | ctc | ctg | aag | ccc | ggc | gcg | ggg | atc | 1104 |
Trp | Glu | Gin | Ile | Phe | Ser | Thr | Trp | Leu | Leu | Lys | Pro | Gly | Ala | Gly | Ile | |
355 | 350 | 365 | ||||||||||||||
atg | atc | ttc | gac | ccc | tac | ggc | gcc | acc | atc | age | gcc | acc | ccg | gag | tgg | 1152 |
Met | Ile | Phe | Asp | Pro | Tyr | Gly | Ala | Thr | Ile | Ser | Ala | Thr | Pro | Glu | Trp | |
370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
gcg | acg | ccg | ttc | cct | cac | cgc | aag | ggc | gtc | ctc | ttc | 'aac | atc | cag | tac | 1200 |
Ala | Thr | Pro | Phe | Pro | His | Arg | Lys | Gly | Val | Leu | Phe | Asn | Ile | Gin | Tyr | |
385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||||
gtc | aac | tac | tgg | ttc | gcc | ccg | gga | gcc | ggc | gcg | gcg | cca | ttg | tcg | tgg | 1248 |
Val | Asn | Tyr | Trp | Phe | Ala | Pro | Gly | Ala | Gly | Ala | Ala | Pro | Leu | Ser | Trp | |
405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
age | aag | gag | atc | tac | aac | tac | atg | gag | cca | tac | gtg | age | aag | aac | ccc | 1296 |
Ser | Lys | Glu | Ile | Tyr | Asn | Tyr | Met | Glu | Pro | Tyr | Val | Ser | Lys | Asn | Pro | |
420· | 425 | 430 | ||||||||||||||
agg | cag | gcc | tac | gcc | aac | tac | agg | gac | atc | gac | ctc | ggg | agg | aac | gag | 1344 |
Arg | Gin | Ala | Tyr | Ala | Asn | Tyr | Arg Asp | Ile | Asp | Leu | Gly Arg | Asn | Glu | |||
435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
gtg | gtg | aac | gac | gtc | tcc | acc | ttc | age | age | ggt | ttg | gtg | tgg | ggc | cag | 1392 |
PL 215 097 B1
Val Yal Asn 450 | Asp | Vsl | Ser | Thr 455 | Phe | Ser | ||
aaa | tac | ttc | aag | <JCJC | aat | ttc | cag | agg |
Lys | Tyr | Phe | Lys | Gly | Asn | Phe | Gin | Arg |
465 | 470 | |||||||
gtg | gat | ccc | acc | gac | tac | ttc | agg | aac |
Val | Asp | Pro | Thr | Asp | Tyr | Phe | Arg | Asn |
485 | ||||||||
atc | aaa | aag | tac | tga | ||||
Ile | Lys | Lys | Tyr | |||||
500 |
Ser | Gly | Leu 460 | Vał | Trp | Gly | Gin | |
ctc | gcc | atc | acc | aag | ggc | aag | 1440 |
Leu | Ala 475 | Ile | Thr | Lys | Gly | Lys 460 | |
gag | cag | age | atc | ccg | ccg | ctc | 1488 |
Glu 490 | Gin | Ser | Ile | Pro | Pro 495 | Leu |
1503
<21Q> | 4 |
<211> | 500 |
<212> | PRT |
<213> | Phleum pratense |
<400> 4
Tyr 1 . | Phe | Pro | Pro | Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Yal | |||||||||||
5 | 10 | 15 | |||||||||||||
Lys | Glu | Ile | Pro | Pro | Arg | Leu | Leu | Tyr | Ala | Lys | Ser | Ser | Pro | Ala | Tyr |
20 | 25 | .30 | |||||||||||||
Pro | Ser | Yal | Leu | Gly | Gin | Thr | Ile | Arg | Asn | Ser | Arg | Trp | Ser | Ser | Pro |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Asp | Asn | Yal | Lys | Pro | Ile | Tyr | Ile | Yal | Thr | Pro | Thr | Asn | Ala | Ser | His |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Ile | Gin | Ser | Ala | Val | Yal | Cys | Gly | Arg | Arg | His | Gly | Val | Arg | Ile | Arg |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Val | Arg | Ser | Gly | Gly | Hi,s | Asp | Tyr | Glu | Gly | Leu | Ser | Tyr | Arg | Ser | Leu |
85 | SO | 95 | |||||||||||||
Gin | Pro | Glu | Glu | Phe | Ala | Yal | Yal | Asp | Leu | Ser | Lys | Met | Arg | Ala | Val |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Trp | Yal | Asp | Gly | Lys | Ala | Arg | Thr | Ala | Trp | Val | Asp | Ser | Gly | Ala | Gin |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Leu | Gly | Glu | Leu | Tyr | Tyr | Ala | Ile | His | Lys | Ala | Ser | Thr | Yal | Leu | Ala |
130 135 140
PL 215 097 B1
Phe Pro Ala 145 | Gly | Vał Cys Pro 150 | Thr Ile | Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala | |||||||||||
155 | 160 | ||||||||||||||
Gly | Gly | Gly | Phe | Gly | Met | Leu | Leu | Arg | Lys | Tyr | Gly | Ile | Ala | Ala | Glu |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Asn | Val | Ile | Asp | Val | Lys | Leu | Val | Asp | Ala | Asn | Gly | Thr | Leu | His | Asp |
180 | 185 | 190 | |||||||||||||
Lys | Lys | Ser | Met | Gly Asp | Asp | His | Phe | Trp | Ala | Val | Arg | Gly | Gły | Gly | |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Gly | Glu | Ser | Phe | Gly | Ile | Val | Val | Ala | Trp | Lys | Val | Arg | Leu | Leu | Pro |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Val | Pro | Pro | Thr | Val | Thr | Val | Phe | Lys | Ile | Pro | Lys | Lys | Ala | Ser | Glu |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Gly | Ala | Val | Asp | Ile | Ile | Asn | Arg | Trp | Gin | Val | Val | Ala | Pro | Gin | Leu |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Pro | Asp | Asp | Leu | Met | Ile | Arg | Val | Ile | Ala | Gin | Gly | Pro | Thr | Ala | Thr |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Phe | Glu | Ala | Met | Tyr | Leu | Gly | Thr | Cys | Gin | Thr | Leu | Thr | Pro | Met | Met |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Ser | Ser | Lys | Phe | Pro | Glu | Leu | Gly | Met | Asn | Ala | Ser | His | Cys | Asn | Glu |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Met | Ser | Trp | Ile | Gin | Ser | Ile | Pro | Phe | Val | His | Leu | Gly | His | Arg | Asp |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Asn | Ile | Glu | Asp | Asp | Leu | Leu | Asn | Arg | Asn | Asn | Thr | Phe | Lys | Pro | Phe |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Ala | Glu | Tyr | Lys | Ser | Asp | Tyr | Val | Tyr | Glu | Pro | Phe | Pro | Lys | Arg | Val |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Trp | Glu | Gin | Ile | Phe | Ser | Thr | Trp | Leu | Leu | Lys | Pro | Gly | Ala | Gly | Ile |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Met | Ile | Phe | Asp | Pro | Tyr | Gly | Ala | Thr | Ile | Ser | Ala | Thr | Pro | Glu | Trp |
370 | 375 | 380 |
PL 215 097 B1
Ala 385 | Thr Pro | Phe | Pro His 390 | Arg | Lys | Gly Yal Leu Phe Asn Ile Gin Tyr | |||||||||
395 | 400 | ||||||||||||||
Val | Asn | Tyr | Trp | Phe | Ala | Pro | Gly | Ala | Gly | Ala | Ala | Pro | Leu | Ser | Trp |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Ser | lys | Glu | Ile | Tyr | Asn | Tyr | Met | Glu | Pro | Tyr | Val | Ser | Lys | Asn | Pro |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Arg | Gin | Ala | Tyr | Ala | Asn | Tyr | Arg | Asp | Ile | Asp | Leu | Gly | Arg | Asn | Glu |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Val | Val | Asn | Asp | Val | Ser | Thr | Phe | Ser | Ser | Gly | Leu | Yal | Trp | Giy | Gin |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Lys | Tyr | Phe | Lys | Gly | Asn | Phe | Gin | Arg | Leu | Ala | Ile | Thr | Lys | Gly | Lys |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Yal | Asp | Pro | Thr | Asp | Tyr | Phe | Arg | Asn | Glu | Gin | Ser | Ile | Pro | Pro | Leu |
485 | 490 | 495 |
Ile Lys Lys Tyr 500 <210> 5 <211> 1503 <212> DNA <213> Phleum praten.se <220>
<221> sztuczna sekwencja DNA <222> (1)..(69) ' <223> sekwencja DNA pochodzącą z sekwencjonowanego białka <220>
<221> natywna sekwencja DNA <222> (70)..(1503) <223>
PL 215 097 B1
<220> | |
<221> | CDS |
<222> | {1)..(1503) |
<223> |
<400> 5
tac ttc ccg ccg | ccg Pro 5 | gct gct aaa gaa gac ttc ctg ggt tgc ctg gtt | 48 | |||||||||||||
Tyr 1 | Phe | Pro Pro | Ala Ala | Lys | Glu | Asp Phe 10 | Leu | Gly | Cys | Leu 15 | Val | |||||
aaa | gaa | atc | ccg | ccg | cgt | ctg | ttg | tac | gcg | aaa | teg | teg | ccg | gcg | tat | 96 |
Lys | Glu | Ile | Pro | Pro | Arg | Leu | Leu | Tyr | Ala | Lys | Ser | Ser | Pro | Ala | Tyr | |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
ccc | tea | gtc | ctg | ggg | cag | acc | atc | cgg | aac | teg | agg | tgg | teg | teg | ccg | 144 |
Pro | Ser | Val | Leu | Gly | Gin | Thr | Ile | Arg | Asn | Ser | Arg | Trp | Ser | Ser | Pro | |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
gac | aac | gtg | aag | ccg | ctc | tac | atc | atc | acc | ccc | acc | aac | gtc | tcc | cac | 192 |
Asp | Asn | Val | Lys | Pro | Leu | Tyr | Ile | Ile | Thr | Pro | Thr | Asn | Val | Ser | His | |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
atc | cag | tcc | gcc | gtg | gtg | tgc | ggc | cgc | cgc | cac | agc | gtc | cgc | atc | cgc | 240 |
Ile | Gin | Ser | Ala | Val | Val | Cys | Gly | Arg | Arg | His | Ser | Val | Arg | Ile | Arg | |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
gtg | cgc | agc | ggc | ggg | cac | gac | tac | gag | ggc | ctc | teg | tac | cgg | tct | ttg | 288 |
Val | Arg | Ser | Gly | Gly | His | Asp | Tyr | Glu | Gly | Leu | Ser | Tyr | Arg | Ser | Leu | |
85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
cag | ccc | gag | acg | ttc | gcc | gtc | gtc | gac | ctc | aac | aag | atg | cgg | gcg | gtg | 336 |
Gin | Pro | Glu | Thr | Phe | Ala | Val | Val | Asp | Leu | Asn | Lys | Met | Arg | Ala | Val | |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
tgg | gtg | gac | ggc | aag | gcc | cgc | acg | gcg | tgg | gtg | gac | tcc | ggc | gcg | cag | 384 |
Trp | Val | Asp | Gly | Lys | Ala | Arg | Thr | Ala | Trp | Val | Asp | Ser | Gly | Ala | Gin | |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
ctc | ggc | gag | ctc | tac | tac | gcc | atc | tat | aag | gcg | agc | ccc | acg | ctg | gcg | 432 |
Leu | Gly | Glu | Leu | Tyr | Tyr | Ala | Ile | Tyr | Lys | Ala | Ser | Pro | Thr | Leu | Ala | |
130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
ttc | ccg | gcc | ggc | gtg | tgc | ccg | acg | atc | gga | gtg | ggc | ggc | aac | ttc | gcg | 480 |
Phe | Pro | Ala | Gly | Val | Cys | Pro | Thr | Ile | Gly | Val | Gly Gly | Asn | Phe | Ala | ||
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
ggc | ggc | ggc | ttc | ggc | atg | ctg | ctg | cgc | aag | tac | ggc | atc | gcc | gcg | gag | 528 |
Gly | Gly | Gly | Phe | Gly | Met | Leu | Leu | Arg | Lys | Tyr | Gly | Ile | Ala | Ala | Glu | |
165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
aac | gtc | atc | gac | gtg | aag | ctc | gtc | gac | gcc | aac | ggc | aag | ctg | cac | gac | 576 |
Asn | Val | Ile | Asp | Val | Lys | Leu | Val | Asp | Ala | Asn | Gly | Lys | Leu | His | Asp | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
aag | aag | tcc | atg | ggc | gac | gac | cat | ttc | tgg | gcc | gtc | agg | ggc | ggc | ggg | 624 |
Lys | Lys | Ser | Met | Giy | Asp | Asp | His | Phe | Trp | Ala | Val | Arg | Giy | Gly | Gly | |
195 | 200 | 205 |
PL 215 097 B1
ggc gag age ttc ggc | atc gtg | gtc gcg tgg cag gtg aag ctc | ctg Leu | ccg Pro | 672 | |||||||||
Gly | Glu Ser Phe 210 | Gly | Ile | Val 215 | Val | Al ci | Trp | Gin | Val 220 | Lys | Leu | |||
gtg | ccg ccc acc | gtg | aca | ata | ttc | aag | atc | tcc | aag | aca | gtg | age | gag | 720 |
Val | Pro Pro Thr | Val | Thr | Ile | Phe | Lys | Ile | Ser | Lys | Thr | Val | Ser | Glu | |
225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||
ggc | gcc gtg gac | atc | atc | aac | aag | tgg | caa | gtg | gtc | gcg | ccg | cag | ctt: | 768 |
Gły | Ala Val Asp | Ile | Ile | Asn | Lys | Trp | Gin | Val | Val | Ala | Pro | Gin | jtau | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||
ccc | gcc gac ctc | atg | atc | cgc | atc | atc | gcg | cag | ggg | ccc | aag | gcc | acg | 816 |
Pro | Ala Asp Leu | Met | Ile | Arg | Ile | Ile | Ala | Gin | Gly | Pro | Lys | Ala | Thr | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||
ttc | gag gcc atg | tac | ctc | ggc | acc | tgc | aaa | acc | ctg | acg | ccg | ttg | atg | 864 |
Phe | Glu Ala Met | Tyr | Leu | Gly | Thr | cys | Lys | Thr | Leu | Thr | Pro | Leu | Met | |
275 | 280 | 285 | ||||||||||||
age | age aag ttc | ccg | gag | ctc | ggc | atg | aac | ccc | tcc | cac | tgc | aac | gag | 912 |
Ser | Ser Lys Phe | Pro | Glu | Leu | Gly | Met | Asn | Pro | Ser | His | Cys | Asn | Glu | |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||
atg | tea tgg atc | cag | tcc | atc | ccc | ttc | gtc | cac | ctc | ggc | cac | agg | gac | 960 |
Met | Ser Trp Ile | Giń | Ser | Ile | Pro | Phe | Val | His | Leu | Gly | His | Arg | Asp | |
305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||
gcc | ctc gag gac | gac | ctc | ctc | aac | cgg | aac | aac | tcc | ttc | aag | ccc | ttc | 1008 |
Ala | Leu Glu Asp | Asp | Leu | Leu | Asn | Arg | Asn | Asn | Ser | Phe | Lys | Pro | Phe | |
325 | 330 | 335 | ||||||||||||
gcc | gaa tac aag | tcc | gac | tac | gtc | tac | cag | ccc | ttc | ccc | aag | acc | gtc | 1056 |
Ala | Glu Tyr Lys | Ser | Asp | Tyr | Val | Tyr | Gin | Pro | Phe | Pro | Lys | Thr | Val | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||
tgg | gag cag atc | ctc | aac | acc | tgg | ctc | gtc | aag | ccc | ggc | gcc | ggg | atc | 1104 |
Trp | Glu Gin Ile | Leu | Asn | Thr | Trp | Leu | Val | Lys | Pro | Gly | Ala | Gly | Ile | |
355 | 360 | 365 | ||||||||||||
atg | atc ttc gac | ccc | tac | ggc | gcc | acc | atc | age | gcc | acc | ccg | gag | tcc | 1152 |
Met | Ile Phe Asp | Pro | Tyr | Gly | Ala | Thr | Ile | Ser | Ala | Thr | Pro | Glu | Ser | |
370 | 375 | 380 | ||||||||||||
gcc | acg ccc ttc | cct | cac | cgc | aag | ggc | gtc | ctc | ttc | aac | atc | cag | tac | 1200 |
Ala | Thr Pro Phe | Pro | His | Arg | Lys | Gly | Val | Leu | Phe | Asn | Ile | Gin | Tyr | |
385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||
gtc | aac tac tgg | ttc | gcc | ccg | gga | gcc | gcc | gcc | gcg | ccc | ctc | teg | tgg | 1248 |
Val | Asn Tyr Trp | Phe | Ala | Pro | Gly | Ala | Ala | Ala | Ala | Pro | Leu | Ser | Trp | |
405 | 410 | 415 | ||||||||||||
age | aag gac atc | tac | aac | tac | atg | gag | ccc | tac | gtg | age | aag | aac | CCC | 1296 |
Ser | Lys Asp Ile | Tyr | Asn | Tyr | Met | Glu | Pro | Tyr | Val | Ser | Lys | Asn | Pro | |
420 | 425 | 430 | ||||||||||||
agg | cag gcg tac | gca | aac | tac | agg | gac | atc | gac | ctc | ggc | agg | aac | gag | 1344 |
Arg | Gin Ala Tyr | Ala | Asn | Tyr | Arg | Asp | Ile | Asp | Leu | Gly Arg | Asn | Glu | ||
435 | 440 | 445 | ||||||||||||
gtg | gtc aac gac | gtc | tcc | acc | tac | gcc | age | ggc | aag | gtc | tgg | ggc. | cag | 1392 |
PL 215 097 B1
val val 450 | Asn Asp Yal | Ser Thr 455 | Tyr | Ala | Ser Gly | Lys 460 | Yal | Trp Gly Gin | ||||||||
aaa | tac | ttc | aag | ggc | aac | ttc | gag | agg | ctc | gcc | att | acc | aag | ggc | aag | 1440 |
Lys | Tyr | Phe | Lys | Giy | Asn | Phe | Glu | Arg | Leu | Ala | Ile | Thr | Lys | Gly | Lys | |
4S5 | 470 | 475 | 490 | |||||||||||||
gtc | gat | cct | acc | gac | tac | ttc | agg | aac | gag | cag | age | atc | ccg | cca | ctc | 1488 |
Val | Asp | Pro | Thr | Asp | Tyr | Phe | Arg | Asn | Glu | Gin | Ser | Ile | Ero | Pro | Leu | |
485 | 490 | 495 | ||||||||||||||
atc | aaa | aag | tac | tga | 1503 |
Ile lys Lys Tyr
<210> | 500 6 |
<211> | 500 |
<212> | PRT |
<213> | Phleum pratensc |
<400> | 6 |
Tyr Phe Pro 1 | Pro | Pro 5 | Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Yal | ||||||||||||
10 | 15 | ||||||||||||||
Lys | Glu | Ile | Pro | Pro | Arg | Leu | Leu | Tyr | Ala | Lys | Ser | Ser | Pro | Ala | Tyr |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Pro | Ser | Val | Leu | Gly | Gin | Thr | Ile | Arg | Asn | Ser | Arg | Trp | Ser | Ser | Pro |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Asp | Asn | Val | Lys | Pro | Leu | Tyr | Ile | Ile | Thr | Pro | Thr | Asn | Yal | Ser | His |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Ile | Gin | Ser | Ala | Yal | Val | Cys | Gly Arg | Arg | His | Ser | Val | Arg | Ile | Arg | |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Val | Arg | Ser | Gly | Gly | His | Asp | Tyr | Glu | Gly | Leu | Ser | Tyr | Arg | Ser | Leu |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Gin | Pro | Glu | Thr | Phe | Ala | Yal | Val | Asp | Leu | Asn | Lys | Met | Arg | Ala | Val |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Trp | Yal | Asp | Gly | Lys | Ala | Arg | Thr | Ala | Trp | Yal | Asp | Ser | Gly | Ala | Gin |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Leu | Gly | Glu | Leu | Tyr | Tyr | Ala | Ile | Tyr | Lys | Ala | Ser | Pro | Thr | Leu | |
130 | 135 | 140 |
PL 215 097 B1
Phe Pro Ala Gly Val Cys | Pro Thr | Ile | Gly | Val Gly Gly Asn Phe Ala | |||||||||||
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Gly Gly | Gly | Phe | Gly | Met | Leu | Leu | Arg | Lys | Tyr | Gly | Ile | Ala | Ala | Glu | |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Asn | Val | Ile | Asp | Val | Lys | Leu | Val | Asp | Ala | Asn | Gly | Lys | Leu | His | Asp |
180 | IBS | 190 | |||||||||||||
Lys | Lys | Ser | Met | Gly | Asp | Asp | His | Phe | Trp | Ala | Val | Arg | Gly | Gly | Gly |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Gly | Glu | Ser | Phe | Gly | Ile | Val | Val | Ala | Trp | Gin | Val | Lys | Leu | Leu | Pro |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Val | Pro | Pro | Thr | Val | Thr | Ile | Phe | Lys | Ile | Ser | Lys | Thr | Val | Ser | Glu |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
'Gly | Ala | Val | Asp | Ile | Ile | Asn | Lys | Trp | Gin | Val | Val | Ala | Pro | Gin | Leu |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Pro | Ala | Asp | Leu | Met | Ile | Arg | Ile | Ile | Ala | Gin | Gly | Pro | Lys | Ala | Thr |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Phe | Glu | Ala | Met | Tyr | Leu | Gly | Thr | Cys | Lys | Thr | Leu | Thr | Pro | Leu | Met |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Ser | Ser | Lys | Phe | Pro | Glu | Leu | Gly | Met | Asn | Pro | Ser | His | Cys | Asn | Glu |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Met | Ser | Trp | Ile | Gin | Ser | Ile | Pro | Phe | Val | His | Leu | Gly | His | Arg | Asp |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Ala | Leu | Glu | Asp | Asp | Leu | Leu | Asn | •Arg | Asn | Asn | Ser | Phe | Lys | Pro | Phe |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Ala | Glu | Tyr | Lys | Ser | Asp | Tyr | Val | Tyr | Gin | Pro | Phe | Pro | Lys | Thr | Val |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Trp | Glu | Gin | Ile | Leu | Asn | Thr | Trp | Leu | Val | Lys | Pro | Gly | Ala | Gly | Ile |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Met | Ile | Phe | Asp | Pro | Tyr | Gly | Ala | Thr | Ile | Ser | Ala | Thr | Pro | Glu | Ser |
370 375 380
PL 215 097 B1
Ala 385 | Thr | Pro | Phe | Pro | His 390 | Arg | Lys | Gly | Yal | Leu 395 | Phe | Asn | Ile | Gin | Tyr 4 00 |
Yal | Asn | Tyr | Trp | Phe 405 | Ala | Pro | Gly | Ais | Ala 410 | Ala | Ala | Pro | Leu | Ser 415 | Trp |
Ser | Lys | Asp | Ile 420 | Tyr | Asn | Tyr | Met | Glu 425 | Pro | Tyr | Val | Ser | Lys 430 | Asn | Pro |
Arg | Gin | Ala 435 | Tyr | Ala | Asn | Tyr | Arg Asp 440 | Ile | Asp | Leu | Gly 445 | Arg | Asn | Glu | |
Val | Yal 450 | Asn | Asp | Yal | Ser | Thr 455 | Tyr | Ala | Ser | Gly | Lys 4S0 | Yal | Trp | Gly | Gin |
Lys 4 65 | Tyr | Phe | Lys | Gly | Asn 470 | Phe | Glu | Arg | Leu | Ala 475 | Ile | Thr | Lys | Gly | Lys 480 |
Yal | Asp | Pro | Thr | Asp 485 | Tyr | Phe | Arg | Asn | Glu 490 | Gin | Ser | Ile | Pro | Pro 495 | Leu |
Ile Lys Lys Tyr 500 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Phleum pratense <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> (6)..(6) <22 3> nieokreślony aminokwas <400>- 7
Ile Yal Ala Leu Pro Xaa Gly Met Leu Lys 15 10 <210> 8 <211> 14
PL 215 097 B1 <212> PRT <213> Lolium perenne <400> 8
Phe Leu Glu Pro Val Leu Gly Leu Ile Phe Pro Ala Gly Val 15 10 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Lolium perenne <400> 9
Gly Leu Ile Glu Phe Pro Ala Gly Val
5
<210> | 10 |
<211> | 12 |
<212> | PRT |
<213> | Dactylus glomerata |
<400> 10
Asp Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys 15 10
<210> | 11 |
<211> | 11 |
<212> | PRT |
<213> | Dactylus glomerata |
<400> 11
Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Gly Asn Glu Gin 1 .5 10 <210> 12 .
PL 215 097 B1
<211> | 17 |
<212> | PRT |
<213> | Dactylus gloraerata |
<400> 12
Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gin Leu Gly Glu Leu Ser 15 10 15
Tyr <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Dactylus glomerata <400> 13
Gly Val Leu Phe Asn Ile Gin Tyr Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro
1 | 5 |
<210> | 14 |
<211> | 11 |
<212> | PRT |
<213> | Cynodon dactylon |
<400> | 14 |
Lys Thr Val Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro
1 | 5 | |
<210> | 15 | |
<211> | 22 | |
<212> | PRT | |
<213> | Cynodon | dactylon |
<400> | 15 |
PL 215 097 B1
Lys Gin Val Glu Arg Asp Phe Leu Thr Ser Leu Thr Lys Asp Ile Pro 15 10 15
Gin Leu Tyr Leu Lys Ser
20 | |
<210 | 16 |
<211> | 16 |
<212> | PRT |
<213> | Cynodon dactylon |
<400 | 16- |
Thr Yal Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro Ile Thr Ala Ala Met Ile
1 | 5 |
<210> | 17 |
<211> | 24 |
<212> | PRT |
<213> | Cynodon dactylon |
<4 00> | 17 |
Leu Arg Lys Tyr Gly Thr Ala Ala Asp Asn Yal Ile Asp Ala Lys Val 1 5 10 '15
Yal Asp Ala Gin Gly Arg Leu Leu
<210> | 18 |
<211> | 14 |
<212> | PRT |
<213> | Cynodon dactylon |
<400 18
Lys Trp Gin Thr Val Ala Pro Ala Leu Pro Asp Pro Asn Met 1 .5 10 <210 19
PL 215 097 B1 <211> 15 <212> PRT <213> Cynodon dactylon <4G0> 19
Yal Thr Trp Ile Glu Ser Yal Pro Tyr Ile Pro Met Gly Asp Lys | |||
1 | 5 | 10 | 15 |
<210> | 20 | ||
<211> | 19 | ||
<212> | PRT | ||
<213> | Cynodon dactylon | ||
<220> | |||
<221> | CECHA MIESZANA | ||
<222> | (Θ).. (6) | ||
<22 3> | nieokreślony aminokwas | ||
<400> | 20 | ||
Gly Thr Yal Arg Gin Leu Leu | Xaa Arg Thr Ser Asn Ile Lys | Ala Phe | |
1 | 5 | 10 | 15 |
Gly Lys Tyr | |||
<210> | 21 | ||
<211> | 23 | ||
<212> | PRT | ||
<213> | Cynodon dactylon | ||
<400 | 21 | ||
Thr Ser Asn Ile Lys Ala Phe Gly Lys Tyr Lys Ser Asp Tyr | Val Leu | ||
1 | 5 | 10 | 15 |
Glu Pro ile Pro Lys Lys Ser 20
PL 215 097 B1
<210> | 22 |
<211> | 13 |
<212> | PRT |
<213> | Cynodon dactylon |
<400> | 22 |
Tyr Arg Asp Leu Asp Leu Gly Val Asn Gin Val Val Gly
1 | 5 |
<210> | 23 |
<211> | 15 |
<212> | PRT |
<213> | Cynodon dactylon |
<400> | 23 |
Ser Ala Thr Pro Pro Thr His Arg Ser Gly Val Leu Phe Asn Ile
1 | 5 |
<210> | 24 |
<211> | 36 |
<212> | PRT |
<213> | Cynodon dactylon |
<400> | 24 |
Ala Ala Ala Ala Leu Pro Thr Gin Val Thr Arg Asp Ile Tyr Ala Phe 15 10 15
Met Thr Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro Arg Gin Ala Tyr Val Asn Tyr 20 25 30
Arg Asp Leu Asp 35 <210> 25 <211> 149
PL 215 097 B1
<212> | DNA | ||||
<213> | Phleum pratense | ||||
<400> | 25 | 60 | |||
caccggaagg gggtgctgtt caacatccag | tacgtcaact | actggttcgc | cccgggagcc | ||
ggcgcggcgc cattgtcgtg gagcaaggag | atctacaact | acatggagcc | gtacgtgagc | 120 | |
aaggaccccg tccaggccta cgccaacta | 149 | ||||
<210> | 26 | ||||
<211> | 299 | ||||
<212> | DNA | ||||
<213> | Phleum pratense |
<400> 26 actactggtt cgccccggga gccggcgcgg cgccattgtc gtggagcaag gagatctaca actacatgga gccatacgtg agcaagaacc ccaggcaggc ctacgccaac tacagggaca tcgacctcgg gaggaacgag gtggtgaacg acgtctccac cttcagcagc ggtttggtgt ggggccagaa atacttcaag ggcaacttcc agaggctcgc catcaccaag ggcaaggtgg atcccaccga ctacttcagg aacgagcaga gcatcccgcc gctcatcaaa aagtactga
120
180
240
299 <210> 27 <211> 33 <212> PB.T <213> Phleum pratense <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> {14},.(14) <223> nieokreślony aminokwas <400> 27 ·
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa'Leu Val
10 15
PL 215 097 B1
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr 20 25 30
Pro <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Phleum pratense <220>
<22ł> CECHA MIESZANA <222> {6),.(6) <223> nieokreślony aminokwas <400> 28
Ser Ala Thr Pro Phe Xaa His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gin 15 10 15
Tyr Val <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Phleum pratense <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> (3)..(8) <223> nieokreślony aminokwas <400> 29
Gly Leu Xaa Tyr Arg Xaa Leu Xaa Pro Glu
10
PL 215 097 B1
.<210> | 30 |
<211> | 12 |
<212> | PRT |
<213> | Phleum pratense |
<220> |
<221> CECHA MIESZANA
<222> | ¢2)..(9) |
<223> | nieokreślony aminokwas |
<400> | 30 |
Xaa Met Gly Asp Asp His Phe Xaa Ala Yal
1 | 5 10 |
<210> | 31 |
<211> | 9 |
<212> | PRT |
<213> | Phleum pratense |
<400> | 31 |
Ala Pro Glu Gly Ala Yal Asp Ile Ile
1 | 5 |
<210> | 32 |
<211> | 16 |
<212> | PRT |
<213> | Phleum pratense |
<400> | 32 |
Glu Pro Tyr Yal Ser Ile Asn Pro Yal Gin Ala Tyr Ala Asn
1 | 5 10 . 15 |
<210> | 33 |
PL 215 097 B1 <211> 15 <212> PRT <213> Phleum pratense <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> {14)..(14) <223> nieokreślony aminokwas <400> 33
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu
1 | 5 |
<210> | 34 |
<211> | 10 |
<212> | PRT . |
<213> | Phleum pratense |
<400> | 34 |
Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr Pro 15 10 <210> 35 <211> 33 <212> PRT <213> Phleum pratense <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> (14)..(14) <223> nieokreślony aminokwas <400> 35
PL 215 097 B1
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu Val 1 5 10 ' 15
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr 20 25 30
Pro <210> 36 · <211> 29 <212> PRT <213> Phleum pratense <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> (14).,(14} <223> nieokreślony aminokwas <400> 36
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu Val 15 10 15
Lys Glu Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro 2C 25 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Phleum pratense <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> (4)..(14) <223> nieokreślony aminokwas
PL 215 097 B1 <40Q> 37
Tyr Phe Pro Xaa Xaa Ala | Ala Lys | Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu | ||
1 | 5 | 10 | 15 | |
<210> | 36 | |||
<211> | 15 | |||
<212> | PRT ' | |||
<213> | Phleum pratense | |||
<220> | ||||
<221> | CECHA MIESZANA | |||
<222> | (4)..(14} | |||
<223> | nieokreślony aminokwas | |||
<400> | 38 | |||
Tyr Phe | ! Pro Xaa Xaa Ala | Lys Lys | Glu Asp Phe Leu Gly | Xaa Leu |
1 | 5 | 10 | 15 | |
<210> | 39 | |||
<211> | 15 | |||
<212> | PRT | |||
<213> | Phleum pratense | |||
<220> | ||||
<221> | CECHA MIESZANA | |||
<222> | (4}.-(14) | |||
<223> | nieokreślony aminokwas | |||
<400> | 39 | |||
Tyr Phe Pro Xaa Xaa Ala | Ala Lys | Αερ Asp Phe Leu Gly | Xaa Leu | |
1 | 5 | 10 | . 15 |
<210> 40 <211> 11
PL 215 097 B1 <212> PRT <213> Phleum pratense <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> (4),.(5) <223> nieokreślony aminokwas <400> 40
Tyr Phe Pro Xaa Xaa Leu Ala Asn Glu Asp Phe
10 <2ł0> 41 <211> 18 <212> PRT <213> Phleum pratense <22O>
<221> CECHA MIESZANA <222> (6)..(6) <223> nieokreślony aminokwas <400> 41
Ser Ala Thr Pro Phe Xaa His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gin 15 10 15
Tyr Val
<210> | 42 · |
<211> | 10 |
<212> | PRT |
<213> | Phleum pratense |
PL 215 097 B1 <220>
<221> CECHA MIESZANA <222> (3).-(6)
<223> | nieokreślony aminokwas |
<400> | 42 |
Gly Leu | i Xaa Tyr Arg Xaa Leu Xaa Pro Glu |
1 | 5 10 |
<210> | 43 |
<211> | 12 |
<212> | PRT |
<213> | Phleum pratense |
<220> | |
<221> | CECHA MIESZANA |
<222> | (2) .. (9). |
<223> | nieokreślony aminokwas |
<400> | 43 |
Lys Xas | t Met Gly Asp Asp His Phe Xaa Ala Val Arg |
1 | 5 10 |
<210> | 44 |
<211> | 9 |
<212> | PRT |
<213> | Phleum pratense( |
<400> | 44 |
Ala Pro Glu Gly Ala Yal Asp Ile Ile | |
1 | 5 ' |
<210> | 45 |
<211> | 16 |
PL 215 097 B1 <212> PRT <213> Phleum pratense <400 45
Met Glu Pro Tyr Val Ser Ile Asn Pro Yal Gin Ala Tyr Ala Asn Tyr
10 15 <210 46 <211> 29 <212> DNA <213> Phleum pratense <220 <221> cecha mieszana <222> (1) ..(293 <223> n oznacza inozynę <400 46 ytntaygcna arwsnwsncc ngcntaycc 29 <210 47 <211> 28 <212> DNA <213> Phleum pratense <220>
<221> cecha mieszana <222> (1)..(28) <223> n oznacza inozynę <400> 47 caymgnaarg gngtnytntt yaayatmc 28 <210> 48
PL 215 097 B1
<211> | 26 |
<212> | DNA |
<213> | Phleum pratense |
<220> | |
<221> | cecha mieszana |
<222> | (1) .. (26] |
<223> | B oznacza inozynę |
<400> 48 tarttngcrt angcytgnac nggrtt 26
<210> | 49 |
<211> | 23 |
<212> | DNA |
<213> | Phleum pratense |
<400> 49 actactggtt cgccccggga gcc 23
<210> | 50 |
<211> | 28 |
<212> | DNA |
<213> | Phleum pratense |
<400> EC tgaagtattt ctggccccac accaaacc 2Θ
<210> | 51 |
<211> | 24 |
<212> | DNA |
<213> | Phleum pratense |
<400> 51 cccttggtga tggcgagcct ctgg 24
<210> | 52 |
<211> | 23 |
<212> | DNA |
<213> | Phleum pratense |
<400> 52 ctcagtcctg gggcagacca tcc 23
Claims (10)
1. Cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej wybranej spośród SEQ ID Nr 1, SEQ ID Nr 3 oraz SEQ ID Nr 5.
2. Cząsteczka DNA zawierająca sekwencję nukleotydową zdefiniowaną w zastrz. 1, rozpoczynającą się w pozycji 70, która koduje polipeptyd o właściwościach alergenu głównego Phl p 4 z Phleum pratense.
3. Cząsteczka DNA mająca sekwencję nukleotydową zdefiniowaną w zastrz. 1, rozpoczynającą się w pozycji 70, która koduje polipeptyd o właściwościach alergenu głównego Phl p 4 z Phleum pratense.
4. Cząsteczka DNA, która ulega hybrydyzacji z cząsteczką DNA zdefiniowaną w zastrz. 1 albo 2 w warunkach rygorystycznych i pochodzi z sekwencji DNA gatunków Poaceae.
5. Cząsteczka DNA kodująca polipeptyd, znamienna tym, że polipeptyd ten jest wybrany z grupy obejmującej:
- polipeptyd mający sekwencję wybraną z grupy obejmującej SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 i SEQ ID Nr: 6,
- polipeptyd mający sekwencję aminokwasową SEQ ID Nr: 2 ze zmianami aminokwasowymi określonymi przez następujące klony 1 do 11:
klon 1: L54, I57, V62, S76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, L227, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, klon 2: L54, I57, V62, T76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, klon 3: P141, K282, L287, P299, L347, E351, klon 4: G289, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, klon 5: L347, E351, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472, klon 6: N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, klon 7: K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, klon 8: Q219, K221, I231, S235, T237, V238, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, E351, klon 9: M231, T246, A251, C263, G289, L307, L309, E334, klon 10: Q219, K221, I231, S235, T237, M238, V242, V246, K248, A258, I264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, N358, V362, S384, wstawienie GA pomiędzy pozycje 407 a 408, N452, Y456, A457, K460, E472, klon 11: wstawienie GA pomiędzy pozycje 407 a 408.
6. Cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji częściowej lub kombinacji sekwencji częściowych zdefiniowanej(ych) w jednym lub wielu zastrz. od 1 do 5, kodująca immunomodulatorowy fragment Phl p 4 reaktywny z limfocytami T wybrana spośród:
- fragmentu 1-200, z aminokwasami 1-200 Phl p 4, oraz
- fragmentu 185-500, z aminokwasami 185-500 Phl p 4.
7. Cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej zdefiniowanej w jednym lub wielu zastrz. od 1 do 6, kodująca immunomodulatorowy fragment reaktywny z limfocytami T, znamienna tym, że rzeczona sekwencja nukleotydowa została specyficznie zmodyfikowana przez specyficzne zastąpienie jednej, wielu lub wszystkich cystein odpowiedniego polipeptydu przez inny aminokwas.
8. Rekombinowany wektor ekspresyjny DNA zawierający cząsteczkę DNA zdefiniowaną w jednym lub wielu zastrz. od 1 do 7, funkcjonalnie połączony z ekspresyjną sekwencją kontrolną.
9. Organizm żywiciela transformowany cząsteczką DNA zdefiniowaną w jednym lub wielu zastrz. od 1 do 7 lub wektorem ekspresyjnym zdefiniowanym w zastrz. 8.
10. Polipeptyd otrzymany sposobami rekombinacyjnymi, który jest kodowany przez sekwencję
DNA zdefiniowaną w jednym lub wielu zastrz. 1, 3, 4, 5, 6 i 7.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP02013953 | 2002-06-25 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL372423A1 PL372423A1 (pl) | 2005-07-25 |
PL215097B1 true PL215097B1 (pl) | 2013-10-31 |
Family
ID=29797135
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL372423A PL215097B1 (pl) | 2002-06-25 | 2003-06-11 | Czasteczka DNA, zawierajacy ja rekombinowany wektor ekspresyjny DNA, organizm zywiciela transformowany taka czasteczka lub wektorem oraz polipeptyd kodowany przez sekwencje takiej czasteczki DNA o wlasciwosciach glównego alergenu pylku Phl p 4 z Phleum pratense |
PL400683A PL219272B1 (pl) | 2002-06-25 | 2003-06-11 | Sekwencja DNA oraz sposób otrzymywania rekombinowanego alergenu pyłku traw Phl p4 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL400683A PL219272B1 (pl) | 2002-06-25 | 2003-06-11 | Sekwencja DNA oraz sposób otrzymywania rekombinowanego alergenu pyłku traw Phl p4 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US8128935B2 (pl) |
EP (2) | EP2392591B1 (pl) |
JP (1) | JP2006510346A (pl) |
CN (1) | CN100391970C (pl) |
AT (1) | ATE550349T1 (pl) |
AU (1) | AU2003279352B2 (pl) |
BR (1) | BR0312068A (pl) |
CA (1) | CA2491038C (pl) |
ES (2) | ES2670573T3 (pl) |
PL (2) | PL215097B1 (pl) |
PT (2) | PT1515988E (pl) |
RU (1) | RU2327739C2 (pl) |
WO (1) | WO2004000881A1 (pl) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10359352A1 (de) * | 2003-12-16 | 2005-07-21 | Merck Patent Gmbh | DNA-Sequenz und rekombinante Herstellung des Graspollen-Allergens Lol p 4 |
AU2013204574B2 (en) * | 2003-12-16 | 2015-02-26 | Merck Patent Gmbh | DNA-sequence and recombinant production of group 4 major allergens from cereals |
AU2011202726B2 (en) * | 2003-12-16 | 2012-04-26 | Merck Patent Gmbh | DNA-sequence and recombinant production of group 4 major allergens from cereals |
DE10359351A1 (de) | 2003-12-16 | 2005-07-21 | Merck Patent Gmbh | DNA-Sequenz und rekombinante Herstellung von Gruppe-4 Majorallergenen aus Getreiden |
AU2010342532B2 (en) * | 2010-01-14 | 2016-07-21 | Merck Patent Gmbh | Variants of the group-6 allergens of the Poaceae with reduced allergenicity by mutagenesis of proline residues |
BR112014019504A2 (pt) | 2012-02-07 | 2017-06-27 | La Jolla Inst Allergy & Immunology | alérgenos da erva-dos-prados e métodos e usos para modulação de resposta imune |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030135888A1 (en) * | 2001-09-26 | 2003-07-17 | Tong Zhu | Genes that are modulated by posttranscriptional gene silencing |
-
2003
- 2003-06-11 AT AT03740216T patent/ATE550349T1/de active
- 2003-06-11 CN CNB038151782A patent/CN100391970C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-11 JP JP2004514687A patent/JP2006510346A/ja active Pending
- 2003-06-11 PL PL372423A patent/PL215097B1/pl unknown
- 2003-06-11 US US10/518,927 patent/US8128935B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-11 ES ES11005620.7T patent/ES2670573T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-11 WO PCT/EP2003/006092 patent/WO2004000881A1/de active Application Filing
- 2003-06-11 ES ES03740216T patent/ES2384045T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-11 RU RU2005101744/13A patent/RU2327739C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-06-11 EP EP11005620.7A patent/EP2392591B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-06-11 PT PT03740216T patent/PT1515988E/pt unknown
- 2003-06-11 AU AU2003279352A patent/AU2003279352B2/en not_active Ceased
- 2003-06-11 CA CA2491038A patent/CA2491038C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-11 PL PL400683A patent/PL219272B1/pl unknown
- 2003-06-11 PT PT110056207T patent/PT2392591T/pt unknown
- 2003-06-11 BR BR0312068-6A patent/BR0312068A/pt not_active Application Discontinuation
- 2003-06-11 EP EP03740216A patent/EP1515988B1/de not_active Revoked
-
2011
- 2011-02-24 US US13/034,210 patent/US9120866B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-11-21 US US14/550,370 patent/US9556241B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PL219272B1 (pl) | 2015-04-30 |
JP2006510346A (ja) | 2006-03-30 |
WO2004000881A9 (de) | 2004-02-26 |
PT2392591T (pt) | 2018-05-23 |
CA2491038C (en) | 2017-04-25 |
ES2384045T3 (es) | 2012-06-28 |
US8128935B2 (en) | 2012-03-06 |
US20120288526A1 (en) | 2012-11-15 |
WO2004000881A1 (de) | 2003-12-31 |
CA2491038A1 (en) | 2003-12-31 |
EP2392591B1 (de) | 2018-02-21 |
RU2005101744A (ru) | 2005-06-27 |
ES2670573T3 (es) | 2018-05-31 |
US9556241B2 (en) | 2017-01-31 |
RU2327739C2 (ru) | 2008-06-27 |
EP1515988A1 (de) | 2005-03-23 |
PL372423A1 (pl) | 2005-07-25 |
BR0312068A (pt) | 2005-03-29 |
AU2003279352A1 (en) | 2004-01-06 |
EP2392591A1 (de) | 2011-12-07 |
US20060177470A1 (en) | 2006-08-10 |
CN1665835A (zh) | 2005-09-07 |
US9120866B2 (en) | 2015-09-01 |
EP1515988B1 (de) | 2012-03-21 |
US20150079120A1 (en) | 2015-03-19 |
AU2003279352B2 (en) | 2009-09-10 |
ATE550349T1 (de) | 2012-04-15 |
PL400683A1 (pl) | 2013-02-04 |
CN100391970C (zh) | 2008-06-04 |
PT1515988E (pt) | 2012-06-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9556241B2 (en) | DNA sequence and preparation of grass pollen allergen Phl p 4 by recombinant methods | |
US9789178B2 (en) | DNA sequence, and recombinant preparation of the grass pollen allergen Lol p 4 | |
NZ263913A (en) | Lol pi protein allergen from ryegrass and related peptides coding sequences, vectors, protein production and use | |
US20170246317A1 (en) | Dna sequence, and recombinant preparation of group 4 major allergens from cereals | |
CA2574449C (en) | Variants of group 1 allergens from poaceae having reduced allergenicity and maintained t-cell reactivity | |
AU2013204574B2 (en) | DNA-sequence and recombinant production of group 4 major allergens from cereals | |
AU2011202726B2 (en) | DNA-sequence and recombinant production of group 4 major allergens from cereals |