PL214504B1 - Nowy szczep bakterii mlekowych Lactobacillus brevis - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii mlekowych Lactobacillus brevis o właściwościach probiotycznych.

Specyficzna i kontrolowana pozytywna regulacja składu mikroflory jelitowej może być osiągnięta na drodze probiozy czyli spożywania preparatów lub produktów żywnościowych zawierających żywe bakterie głównie z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium. Dlatego też producenci żywności, a w szczególności żywności funkcjonalnej, oraz przemysł farmaceutyczny zainteresowani są pozyskiwaniem nowych szczepów tych bakterii o udokumentowanych właściwościach probiotycznych.

Środowiskiem naturalnym bytowania bakterii z rodzaju Lactobacillus są produkty mleczne, napoje fermentowane, kiszonki warzywne, mięso a w szczególności wędliny fermentowane. Bakterie te zasiedlają również błony śluzowe przewodu pokarmowego człowieka i zwierząt.

Dotychczas znane są szczepy bakterii Lactobacillus o właściwościach probiotycznych, jak L. acidophilus NCFM, L. acidophilus DDS-1, L. acidophilus SBT-2062, L. acidophilus R0011, L. rhamnosus R0052, L. acidophilus LA-1, L. paracasei CRL-431, L. casei Shirota, L. casei DN-114001, L. fermentum RC-14, L. rhamnosus GR-1, L. johnsonii La1, L. plantarum 299V, L. rhamnosus 271, L. reuteri SD2112, L. rhamnosus GG, L. rhamnosus LB21, L. salivarius UCC118, L. acidophilus LB, L. paracasei F19, L. casei ŁOCK 0900, L. casei ŁOCK 0908, L. paracasei ŁOCK 0919.

Najczęściej stosowanym nośnikiem dla probiotycznych bakterii Lactobacillus sp. jest mleko i jego przetwory. Obecnie wzrasta na świecie procent ludności, która ze względu na alergię pokarmową, w szczególności na nietolerancję białek mleka krowiego, nie może spożywać probiotycznych produktów na bazie mleka. Zatem istotne jest poszukiwanie szczepów bakterii mlekowych zdolnych do ukwaszania środowisk innych niż mleko, na przykład warzyw. W klimacie umiarkowanym fermentacji mlekowej najczęściej poddawane są ogórki, kapusta, buraki. W drodze fermentacji mlekowej uzyskuje się także zakwasy piekarnicze i żur.

W wyniku poszukiwań szczepów bakterii mlekowych o cechach probiotycznych, zdolnych do zasiedlania środowisk roślinnych wyizolowano nowy szczep Lactobacillus brevis, stanowiący przedmiot wynalazku, który oznaczono symbolem ŁOCK 0944 i zdeponowano w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN z siedzibą we Wrocławiu pod numerem akcesyjnym B/00035.

Szczep wyizolowano ze spontanicznej kiszonki korzenia buraka ćwikłowego stosując podłoże Rogosa (zawierające w 1 I: 10,0 g peptonu kazeinowego, 5,0 g ekstraktu drożdżowego, 20,0 g D(+) glukozy, 6,0 g fosforanu potasu, 2,0 g cytrynianu amonu, 1,0 g Tweenu 80, 15,0 g octanu sodu, 0,575 g siarczanu magnezu, 0,034 g siarczanu żelaza II, 0,12 g siarczanu manganu i 15 g agaru), stanowiące wybiórcze medium przeznaczone do wykrywania bakterii z rodzaju Lactobacillus sp. ze złożonego mikrobiologicznie materiału.

Na podstawie przeprowadzonych testów fermentacyjnych API 50 CHL stwierdzono 99.9% homologii nowego szczepu do gatunku Lactobacillus brevis.

Sekwencję nukleotydową regionu DNA kodującego gen 16S rRNa nowego szczepu, którego sekwencja określa przynależność gatunkową bakterii, przedstawiono na końcu opisu.

Komputerowa analiza opublikowanych sekwencji genów 16S rRNA bakterii z gatunku Lactobacillus brevis, dostępnych w bazie NCBI oraz wyników sekwencjonowania nowego szczepu potwierdziła podobieństwo nowego szczepu bakterii do gatunku Lactobacillus brevis z prawdopodobieństwem 99%.

Nowy szczep otrzymuje się w drodze hodowli na płynnym modyfikowanym podłożu Rogosa, o nazwie handlowej MRS, zawierającym w 1 I: 10,0 g peptonu kazeinowego, 4,0 g ekstraktu drożdżowego, 8 g ekstraktu mięsnego, 20,0 g glukozy, 2,0 g fosforanu dwupotasowego, 2,0 g wodorocytrynianu amonu, 5,0 g octanu sodu, 0,20 g siarczanu magnezu 7-wodnego, 0,05 g siarczanu magnezu 4-wodnego, w temperaturze 30-35°C w czasie 48 h.

Cechy morfologiczne nowego szczepu

Na modyfikowanym podłożu Rogosa szczep rośnie w postaci kremowych, owalnych kolonii, o gładkiej powierzchni i regularnych brzegach, o średnicy około 1 mm.

W podłożu płynnym MRS szczep bakterii rośnie tworząc jednorodne zmętnienie pożywki.

W obrazie mikroskopowym bakterie mają kształt długich nieruchliwych pałeczek występujących pojedynczo lub w krótkich łańcuszkach. Wybarwiają się Gram-dodatnio.

PL 214 504 B1

Cechy fizjologiczne i biochemiczne nowego szczepu

Szczep charakteryzuje się metabolizmem bezwzględnie heterofermentatywnym. Zdolny jest do fermentacji następujących sacharydów i ich pochodnych: D i L-arabinozy, rybozy, adonitolu, β-metylo-D-ksylozydu, galaktozy, glukozy, N-acetylo-glukozydu, maltozy, melibiozy, glukonianu, 5-ketoglukonianu, co stwierdzono stosując test API 50 CHL. Stosując testy API Zym stwierdzono aktywność następujących enzymów komórkowych: akrylamidaza leucyny, akrylamidaza waliny, kwaśna fosfataza, a-galaktozydaza, β-galaktozydaza, a-glukozydaza, β-glukozydaza.

Optymalna temperatura wzrostu szczepu wynosi 30-35°C, natomiast w temperaturze powyżej 45°C stwierdzono słaby wzrost szczepu.

Szczep nie wytwarza katalazy.

Jest zdolny do syntezy nadtlenku wodoru.

Cechy biotechnologiczne nowego szczepu

Szczep fermentuje glukozę z wytworzeniem kwasu mlekowego w ilości 12,30 g/l, (udział kwasu L(+) mlekowego wynosi 69,9%) oraz kwasu octowego w ilości 4,25 g/l.

Szczep ukwasza:

- kapustę z wytworzeniem kwasu mlekowego w ilości 3,75 g/l (udział kwasu L(+) mlekowego stanowi 99%) oraz kwasu octowego w ilości 7,01 g/l.

- rozdrobniony korzeń buraka ćwikłowego z wytworzeniem kwasu mlekowego w ilości 6,36 g/l (udział kwasu L(+) mlekowego wynosi 99,6%) oraz kwasu octowego w ilości 6,32 g/l.

- 10% roztwór mąki żytniej z wytworzeniem kwasu mlekowego w ilości 3,56 g/l (66% stanowi udział kwasu L(+) mlekowego wynosi 66%) oraz kwasu octowego w ilości 2,39 g/l.

Charakteryzuje się słabą zdolnością ukwaszania mleka krowiego. Zawartość kwasu mlekowego po 48 godzinnej fermentacji z udziałem szczepu wynosi 1,70 g/l (przy udziale kwasu L(+) mlekowego 54%), zaś zawartość kwasu octowego wynosi 1,69 g/l.

Cechy probiotyczne nowego szczepu

Szczep spełnia kryteria stawiane bakteriom probiotycznym, co stwierdzono w wyniku badań in vitro wykonanych według procedur zalecanych przez FAO/WHO Wykazuje odporność na niskie pH (kwasowość soku żołądkowego) w pH 3,0 przez 180 minut oraz na sole żółci w stężeniach 2%, 3% w czasie 240 minut.

Wykazuje oporność w stosunku do następujących antybiotyków i chemioterapeutyków o działaniu przeciwbakteryjnym: wankomycyny, kanamycyny, aztreonamu, metronidazolu.

Charakteryzuje się dobrym przyleganiem do linii komórkowych Caco-2 oznaczonym jako (++), przy czym adherencję określano półilościowo przyjmując, iż (-) oznacza brak przylegania, (+) - pojedyncze komórki bakterii w całym preparacie, (++) - pojedyncze komórki bakterii w poszczególnych polach widzenia, liczne w preparacie, (+++) - liczne bakterie w poszczególnych polach widzenia.

Wykazuje aktywność antagonistyczną w stosunku do bakterii patogennych przenoszonych drogą pokarmową jak Escherichia coli DSM 682, Escherichia coli ATCC 8739, Escherichia coli ATCC

10536, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Pseudomonas aeruginosa ATCC 24755, Enterococcus hire DSM 2150, Listeria monocytogenes (szczep wyizolowany z żywności).

Przedmiot wynalazku ilustrują poniższe przykłady.

P r z y k ł a d I

Nowy szczep bakterii ŁOCK 0944 hodowano na podłożu płynnym MRS zawierającym w 1 I: 4,0 g ekstraktu drożdżowego, 8,0 g ekstraktu mięsnego, 10,0 g peptonu K, 20,0 g glukozy, 2,0 g wodorocytrynianu amonu, 2,0 g fosforanu dwupotasowego, 5,0 g octanu sodu, 0,2 g siarczanu magnezu 7-wodnego oraz 0,05 g siarczanu magnezu 4-wodnego, w temperaturze 30°C. Po 24 godzinach hodowli wyhodowane komórki oddzielono od podłoża na wstrząsarce uzyskując gęstość 2,27 x 10⁹ komórek/ml. Tak otrzymaną zawiesinę bakterii umieszczono w środowisku o pH 3.0 i w temperaturze 37°C. Po 180 minutach przeżyło 94,8% komórek (7,35 x 10⁸).

P r z y k ł a d II

Zawiesinę bakterii otrzymaną jak w przykładzie I, o gęstości 5x10⁹ komórek/ml, poddano działaniu soli żółci o stężeniach 2% i 3% w czasie 6 godzin.

W wyniku działania soli żółci o stężeniu 2% po 6 godzinach przeżyło 4,47 x 10⁹ jtk/ml (99,4%). Pod wpływem działania soli żółci o stężeniu 3% po 6 godzinach przeżyło 4,42 x 10⁹ jtk/m) (99,2%).

PL 214 504 B1

P r z y k ł a d III

Przygotowano liofilizaty nowego szczepu ŁOCK 0944 w 10% mleku odtłuszczonym oraz w nośniku węglowodanowym o składzie: hydrolizat skrobiowy MD 12,5 g/l, hydrolizat kazeiny 20 g/l, laktitol 0,4 g/l, sacharoza 2 g/l i oceniano trwałość tych preparatów przechowywanych w czasie 15 tygodni, w warunkach chłodniczych (4-5°C) oraz w temperaturze pokojowej (25°C).

Na wykresie 1 zilustrowano przeżywalność liofilizatów nowego szczepu bakterii w mleku i w nośniku węglowodanowym, przechowywanych w temperaturze chłodniczej 4°C, zaś na wykresie 2 przeżywalność liofilizatów nowego szczepu w mleku i w nośniku węglowodanowym, przechowywanych

Okazało się, iż temperatura chłodnicza zapewnia większą stabilność i trwałość liofilizowanych preparatów nowego szczepu bakterii niezależnie od czynnika ochronnego. Przechowywanie preparatu nowego szczepu bakterii suszonego sublimacyjnie z mlekiem jako medium ochronnym w czasie 15 tygodni w temperaturze chłodniczej spowodowało obniżenie liczby żywych komórek szczepu o 16%, zaś w temperaturze pokojowej o 24%.

W czasie 15 tygodni przechowywania liofilizatu mieszaniny komórek nowego szczepu bakterii z nośnikiem węglowodanowym stopień redukcji liczby żywych komórek szczepu wynosił 15% w temperaturze chłodniczej i 26% w temperaturze pokojowej.

Wykaz sekwencji nukleotydowej regionu DNA kodującego gen 16S rRNa nowego szczepu bakterii Lactobacillus brevis ŁOCK 0944, którego sekwencja określa przynależność gatunkową bakterii:

PL 214 504 B1 agtcgaacga gcttccgttg aatgacgtgc ttgcactgat ttcaacaatg aagcgagtgg cgaactggtg agtaacacgt gggaaatctg cccagaagca ggggataaca cttggaaaca

121 ggtgctaata ccgtataaca acaaaatccg catggatttt gtttgaaagg tggcttcggc

181 tatcacttct ggatgatccc gcggcgtatt agttagttgt ggtgaggtaa aggcccacca

241 agacgatgat acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc

301 ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga

361 gcaatgccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac

421 acctttgaga gtaactgttc aagggttgac ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta

481 cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa

541 agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat gtgaaagcct tcggcttaac cggagaagtg

601 catcggaaac tgggagactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg

661 gaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctagt ctgtaactga

721 cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag tccatgccgt

781 aaacgatgag tgctaagtgt tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta

841 agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc

901 gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt

961 gacatcttct gccaatctta gagataagac gttcccttcg gggacagaat gacaggtggt

1021 gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac

1081 ccttattatc agttgccagc attcagttgg gcactctggt gagactgccg gtgacaaacc

1141 ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg

1201 ctacaatgga cggtacaacg agtcgcgaag tcgtgaggct aagctaatct cttaaagccg

1261 ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gttggaatcg ctagtaatcg

1321 cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca

1381 tgagagtttg taacacccaa agccggtgag ataaccttcg ggagtcagcc gtctaaggtg

1441 ggacagatga ttagggtgaa gtcgtaacaa ggtagcc w której a oznacza nukleotyd zawierający adeninę jako zasadę azotową, g - nukleotyd zawierający guaninę jako zasadę azotową, c - nukleotyd zawierający cytozynę jako zasadę azotową, zaś t nukleotyd zawierający tyminę jako zasadę azotową.

Claims (1)

1. Nowy szczep bakterii mlekowych Lactobacillus brevis ŁOCK 0944 - B/00035.