PL213200B1

PL213200B1 - Selektywne inhibitory PI3Kδ, kompozycje je zawierajace oraz ich zastosowania medyczne

Info

Publication number: PL213200B1
Application number: PL358590A
Authority: PL
Inventors: Chanchal Sadhu; Ken Dick; Jennifer Treiberg; C.Gregory Sowell; Edward A. Kesicki; Amy Oliver
Original assignee: Icos Corp; Icos Corporation
Priority date: 2000-04-25
Filing date: 2001-04-24
Publication date: 2013-01-31
Also published as: ES2358785T3; SI1939203T1; ZA200208698B; PL358590A1; UA76103C2

Description

Przedmiotem wynalazku są selektywne inhibitory ΡΙ3Κδ, kompozycje je zawierające oraz ich zastosowania medyczne.

Przekazywanie sygnału w komórce przez fosfoinozytydy 3'-fosforylowane wiązano z rozmaitymi procesami komórkowymi, np., zwyrodnieniem nowotworowym, przekazywaniem sygnału czynnika wzrostowego, zapaleniem i odpornością (przegląd - patrz Rameh i in., J. Biol. Chem., 274: 8347-8350 (1999)). Enzym odpowiedzialny za wytwarzanie tych fosforylowanych produktów sygnałowych, 3-kinaza fosfatydyloinozytolowa (3-kinaza PI; PI3K), został pierwotnie zidentyfikowany jako aktywność związana z onkoproteinami wirusowymi i receptorowymi kinazami tyrozynowymi czynnika wzrostowego, która fosforyluje fosfatydyloinozytol (PI) i jego fosforylowane pochodne na grupie 3'-hydroksylowej pierścienia inozytolu (Panayotou i in., Trends Cell Biol. 2: 358-60 (1992)).

Poziomy fosfatydyloinozytolo-3,4,5-trifosforanu (PIP3), pierwotnego produktu aktywacji 3-kinazy PI, wzrastają przy traktowaniu komórek rozmaitymi agonistami. Uważa się zatem, że aktywacja 3-kinazy PI jest zaangażowana w szeregu odpowiedzi komórkowych obejmujących wzrost, różnicowanie i apoptozę komórek (Parker i in., Current Biology, 5: 577-99 (1995); Yao i in., Science, 267: 2003-05 (1995)). Choć dalsze cele fosforylowanych lipidów wytwarzanych po aktywacji 3-kinazy PI nie zostały dobrze scharakteryzowane, to nagromadzone dane doświadczalne sugerują, że białka zawierające domeny PH i palca FYVE są aktywowane, kiedy wiążą się z rozmaitymi lipidami fosfatydyloinozytolu (Sternmark i in., J. Cell Sci., 112: 4175-83 (1999); Lemmon i in., Trends Cell Biol., 7: 237-42 (1997)). Niektóre izoformy kinazy białkowej C (PKC) są bezpośrednio aktywowane przez PIP3 in vitro, i wykazano, że kinaza białkowa związana z PKC, PKB, jest aktywowana przez 3-kinazę PI (Burgering i in., Nature, 375: 599-602 (1995)).

Rodzinę enzymów 3-kinaz PI obecnie dzieli się na trzy klasy na podstawie ich specyficzności w odniesieniu do substratu. PI3K klasy I mogą fosforylować fosfatydyloinozytol (PI), fosfatydyloinozytolo-4-fosforan i fosfatydyloinozytolo-4,5- bifosforan (PIP2) z wytworzeniem odpowiednio fosfatydyloinozytolo-3-fosforanu (PIP), fosfatydyloinozytolo-3,4-bifosforanu i fosfatydyloinozytolo-3,4,5-trifosforanu. PI3K klasy II fosforylują PI i fosfatydyloinozytolo-4-fosforan, podczas gdy PI3K klasy III mogą fosforylować tylko PI.

Początkowe oczyszczenie i klonowanie molekularne 3-kinazy PI ujawniło, że jest to heterodimer złożony z podjednostek p85 i p110 (Otsu i in., Cell, 65: 91-104 (1991); Hiles i in., Cell, 70: 419-29 (1992)). Od tego czasu zidentyfikowano cztery odmienne PI3K klasy I, oznaczane PI3K α, β, δ, i γ, przy czym każda składa się z odmiennej podjednostki katalitycznej 110 kDa i podjednostki regulującej. Bardziej szczegółowo, każda z trzech podjednostek katalitycznych, tj., p110a, p110β i p110δ, oddziałuje z tą samą podjednostką regulującą, p85; zaś p110γ oddziałuje z odmienną podjednostką regulującą, p110.

Jak opisano poniżej, rodzaje ekspresji każdej z tych PI3K w komórkach i tkankach ludzkich także są odmienne. Chociaż niedawno zdobyto dużo informacji o funkcjach komórkowych 3-kinaz PI w ogólności, to role odgrywane przez poszczególne izoformy są w znacznym stopniu nieznane.

Opisano klonowanie wołowej p110a. Białko zidentyfikowano, jako spokrewnione z białkiem Saccharomyces cerevisiae: Vps34p, które jest zaangażowane w przetwarzaniu białek w wakuolach. Wykazano także, że produkt rekombinacyjny p110a asocjuje z p85a, z wytworzeniem aktywności PI3K w transfekowanych komórkach COS-1. Patrz Hiles i in., Cell, 70: 419-29 (1992).

Klonowanie drugiej ludzkiej izoformy p110, oznaczonej p110β, opisali Hu i in., Mol. Cell Biol, 13: 7677-88 (1993). Stwierdzono, że ta izoforma asocjuje z p85 w komórkach, i jest wyrażana wszechobecnie, jako że mRNA p110β znaleziono w licznych tkankach ludzkich i mysich, jak również w komórkach śródbłonka ludzkiej żyły pępkowej, ludzkich białaczkowych leukocytach T Jurkat, ludzkich zarodkowych komórkach nerkowych 293, mysich fibroblastach 3T3, komórkach HeLa, i szczurzych komórkach rakowych pęcherza NBT2. Taka powszechna ekspresja sugeruje, że ta izoforma jest powszechnie ważna w szlakach przekazywania sygnału.

Identyfikację izoformy p110δ 3-kinazy PI opisali Chantry i in., J. Biol. Chem., 272: 19236-41 (1997). Zaobserwowano, że ludzka izoforma p110δ jest wyrażana w sposób ograniczony do pewnych tkanek. Jest wyrażana przy wysokich poziomach w limfocytach i tkankach limfatycznych, co sugeruje, że to białko może odgrywać rolę w przekazywaniu sygnału za pośrednictwem 3-kinazy PI w układzie odpornościowym.

PL 213 200 B1

Szczegóły dotyczące izoformy p1105 można także znaleźć w opisach patentowych USA nr 5858753; 5822910; i 5985589. Patrz też Vanhaesebroeck i in., Proc. Natl Acad. Sci. USA,

94: 4330-5 (1997), i publikacja międzynarodowa WO 97/46688.

W każdym z podtypów ΡΙ3Κ α, β, i δ podjednostka p85 funkcjonuje umiejscawiając 3-kinazę PI na błonie plazmatycznej przez oddziaływanie jej domeny SH2 z fosforylowanymi resztami tyrozyny (obecnymi w kontekście odpowiedniej sekwencji) w białkach docelowych (Rameh i in., Cell, 83: 821-30 (1995)). Zidentyfikowano dwie izoformy p85, p85a, która jest wyrażana wszechobecnie, oraz ρ85β, którą znajduje się przede wszystkim w mózgu i tkankach limfatycznych (Volinia i in., Oncogene, 7: 789-93 (1992)). Wydaje się, że asocjacja podjednostki p85 z podjednostkami katalitycznymi p110a, β, lub 3-kinazy PI jest wymagana dla aktywności katalitycznej i stabilności tych enzymów. Ponadto, wiązanie białek Ras także reguluje w górę aktywność 3-kinazy PI.

Klonowanie p110y ujawniło jeszcze dalszą złożoność w obrębie rodziny enzymów PI3K (Stoyanov i in., Science, 269: 690-93 (1995)). Izoforma p110y jest blisko spokrewniona z p110a i p110β (45-48% identyczności w domenie katalitycznej), ale, jak wspomniano, nie wykorzystuje p85 jako podjednostki kierującej do celu. Zamiast tego, w pobliżu swojego końca aminowego p110y zawiera dodatkową domenę nazywaną domeną PH (ang. „pleckstrin homology domain”). Ta domena umożliwia oddziaływanie p110y z podjednostkami βγ heterotrimerycznych białek G, i wydaje się, że to oddziaływanie reguluje jej aktywność.

Podjednostką regulująca p101 dla ΡΙ3Κγ została pierwotnie sklonowana u świni, a następnie zidentyfikowano ortolog ludzki (Krugmann i in., J. Biol. Chem., 274: 17152-8 5 (1999)). Wydaje się, że oddziaływanie między N-końcowym obszarem p101 i N- końcowym obszarem p110γ jest krytyczne dla aktywacji ΡΙ3Κγ przez wspomniane wyżej Gβγ.

Konstytutywnie aktywny polipeptyd PI3K jest opisany w publikacji międzynarodowej WO 96/25488. Publikacja ta ujawnia wytwarzanie chimerycznego białka fuzyjnego, w którym fragment 102 reszt p85 znany jako obszar inter-SH2 (iSH2) jest połączone fuzyjnie przez obszar łącznika z N-końcem mysiej p110. Widać, że domena iSH2 p85 jest zdolna do aktywowania aktywności PI3K w sposób porównywalny z nietkniętą p85 (Klippel i in., Mol. Cell Biol., 14: 2675-85 (1994)).

Tak więc, 3-kinazy PI mogą być zdefiniowane przez ich identyczność aminokwasową albo przez ich aktywność. Dodatkowe elementy tej rosnącej rodziny genów obejmują bardziej odlegle spokrewnione kinazy lipidowe i białkowe, w tym Vps34 TOR1, i TOR2 z Saccharomyces cerevisiae (i ich homologi ssacze, takie jak FRAP i mTOR), produkt genu choroby Louis-Bar (ATR, ataksja teleangiektazja) i podjednostka katalityczna zależnej od DNA kinazy białkowej (DNA-PK). Ogólnie - patrz Hunter, Cell, 83: 1-4 (1995).

Wydaje się także, że 3-kinaza PI jest zaangażowana w szeregu aspektów aktywacji leukocytów. Wykazano, że aktywność 3-kinazy PI związana z p85 jest związana fizycznie z domeną cytoplazmatyczną CD28, która jest ważną cząsteczką współstymulującą dla aktywacji limfocytów T w odpowiedzi na antygen (Pages i in., Nature, 369: 321-29 (1994); Rudd, Immunity, 4: 527-34 (1996)). Aktywacja limfocytów T przez CD28 obniża próg aktywacji przez antygen i zwiększa rząd wielkości i okres trwania odpowiedzi proliferacyjnej. Te działania wiążą się ze wzrostem transkrypcji szeregu genów obejmujących interleukinę-2 (IL2), ważny czynnik wzrostu limfocytów T (Fraser i in., Science, 251: 313-16 (1991)). Mutacja CD28 taka, że nie może ona już oddziaływać z 3-kinazą PI prowadzi do niepowodzenia inicjacji wytwarzania IL2, co sugeruje krytyczną rolę dla 3-kinazy PI w aktywacji limfocytów T.

Specyficzne inhibitory przeciw poszczególnym członom rodziny enzymów dają cenne narzędzia do rozszyfrowania funkcji każdego enzymu. Dwa związki, LY294002 i wortmannina, były szeroko stosowane jako inhibitory 3-kinazy PI. Te związki są jednak niespecyficznymi inhibitorami PI3K, gdyż nie rozróżniają między czterema członami Klasy I 3-kinaz PI. Na przykład, wartości IC50 dla wortmanniny wobec każdej z rozmaitych 3-kinaz PI Klasy I leżą w zakresie 1-10 nM. Podobnie, wartości IC50 dla LY294002 wobec każdej z tych 3-kinaz PI wynoszą około 1 μΜ (Fruman i in., Ann. Rev. Biochem., 67: 481-507 (1998)). Stąd użyteczność tych związków w badaniu ról poszczególnych 3-kinaz PI Klasy I jest ograniczona.

W oparciu o badania przy użyciu wortmanniny uzyskano dowody doświadczalne, że działanie 3-kinazy PI jest także wymagane dla pewnych aspektów przekazywania sygnału w leukocytach przez receptory sprzężone z białkiem G (Thelen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 4960-64 (1994)). Ponadto, wykazano, że wortmannina i LY294002 blokują migrację neutrofili i uwalnianie ponadtlenku.

PL 213 200 B1

Jednak, skoro te związki nie rozróżniają między rozmaitymi izoformami PI3K, to pozostaje niejasne, która poszczególna izoforma lub izoformy PI3K są zaangażowane w tych zjawiskach.

Wobec powyższych rozważań jasne jest, że istniejąca wiedza jest niedostateczna w odniesieniu do strukturalnych i funkcjonalnych cech enzymów 3-kinaz PI, obejmujących lokalizację podkomórkową, stany aktywacji, powinowactwa do substratów i tym podobne.

Ponadto, funkcje, które te enzymy spełniają w tkankach zarówno normalnych i chorobowych, pozostają do wyjaśnienia. W szczególności, funkcja PI3K8 w leukocytach nie została dotąd scharakteryzowana, i wiedza dotycząca ich funkcji w fizjologii ludzkiej pozostaje ograniczona. Współekspresja w tych tkankach innych izoform PI3K dotąd komplikowała prace nad rozdzieleniem aktywności każdego enzymu. Ponadto, rozdzielenie aktywności rozmaitych izozymów PI3K nie może być możliwe bez zidentyfikowania inhibitorów, które wykazują charakterystykę selektywnego hamowania. Zaiste, obecnie Zgłaszający nie są świadomi, żeby przedstawiono takie selektywne, albo lepiej specyficzne, inhibitory izozymów PI3K.

Tak więc, w tej dziedzinie istnieje potrzeba dalszego scharakteryzowania strukturalnego polipeptydu ΡΙ3Κδ,. Istnieje także potrzeba scharakteryzowania funkcjonalnego PI3K8. Ponadto, nasze zrozumienie PI3K8 wymaga dalszego opracowania oddziaływań strukturalnych p110S, zarówno z jego podjednostką regulującą, jak i z innymi białkami w komórce. Pozostaje także zapotrzebowanie na selektywne lub specyficzne inhibitory izozymów PI3K, żeby można było lepiej scharakteryzować funkcje każdego izozymu. W szczególności, pożądane są selektywne lub specyficzne inhibitory ΡΙ3Κδ, do badania roli tego izozymu i do opracowania farmaceutyków do modulowania aktywności izozymu. W jednym z aspektów przedmiotem niniejszego wynalazku są związki, które mogą hamować aktywność biologiczną ludzkiej ΡΙ3Κδ. W innym aspekcie przedmiotem wynalazku są związki, które hamują selektywnie ΡΙ3Κδ, a zarazem mają względnie niską siłę hamującą przeciw innym izoformom PI3K. W innym aspekcie przedmiotem wynalazku są sposoby charakteryzowania funkcji ludzkiej PI3^. W innym aspekcie przedmiotem wynalazku są sposoby selektywnego modulowania aktywności ludzkiej ΡΙ3Κδ, i przez to wspierania leczenia chorób powstających przez dysfunkcję PI3^. Inne aspekty i zalety wynalazku będą łatwo widoczne dla specjalisty.

Obecnie stwierdzono, że te i inne cele można osiągnąć dzięki niniejszemu wynalazkowi. Związki według wynalazku umożliwiają zaburzanie funkcji leukocytów przez kontaktowanie leukocytów ze związkiem według wynalazku, który selektywnie hamuje aktywność 3-kinazy delta fosfatydyloinozytolowej (ΡΙ3Κδ) w leukocytach. Leukocyty mogą obejmować komórki wybrane z grupy składającej się z neutrofili, limfocytów B, limfocytów T oraz bazofili.

PL 213 200 B1

Na przykład, w przypadkach, w których leukocyty obejmują neutrofile, zaburzanie może odnosić się do co najmniej jednej funkcji neutrofili wybranej z grupy składającej się z stymulowanego uwalniania ponadtlenku, stymulowanej egzocytozy i migracji chemotaktyczną.

Korzystnie, tego typu zaburzanie zasadniczo nie zaburza fagocytozy bakterii lub zabijania bakterii przez neutrofile. W przypadkach, w których leukocyty obejmują limfocyty B, może dochodzić do zaburzania proliferacji limfocytów B lub wytwarzania przeciwciał przez limfocyty B. W przypadkach, w których leukocyty obejmują limfocyty T, może dochodzić do zaburzania proliferacji limfocytów T.

W przypadkach, w których leukocyty obejmują bazofile, możliwe jest zaburzanie uwalniania histaminy przez bazofile.

Selektywny inhibitor ΡΙ3Κ5, korzystne jest około 10-krotnie bardziej selektywny w hamowaniu ΡΙ3Κ5, niż w doniesieniu do innych izoform PI3K Typu I w teście komórkowym. Korzystniej, związek jest co najmniej około 20-krotnie bardziej selektywny w hamowaniu ΡΙ3Κδ niż w odniesieniu do innych izoform PI3K Typu I w teście komórkowym. Jeszcze korzystniej, związek jest co najmniej około 50-krotnie bardziej selektywny w hamowaniu ΡΙ3Κδ, niż w odniesieniu do innych izoform PI3K Typu I w teście biochemicznym.

Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze

w którym Y stanowi bezpośrednie wiązanie;

R⁴ jest wybrany z grupy składającej się z H, fluorowca, OCH3 i CH3;

₅

R⁵ jest wybrany z grupy składającej się z H, OCH3 i fluorowca;

R⁶ jest wybrany z grupy składającej się z grupy C1-C6alkilowej, fenylowej, fluorowcofenylowej, C1-C6alkoksyfenylowej, C1-C6alkilofenylowej i bifenylowej;

R^d oznacza NH2; q wynosi 1;

i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole, przy czym co najmniej jeden spośród R⁴ i R⁵ jest różny od H, gdy R⁶ oznacza grupę fenylową albo 2-chlorofenylową.

Korzystnie związek według wynalazku jest wybrany z grupy składającej się z:

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-izopropylofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-bifenyl-2-ilo-5-chloro-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-fluorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-fluorofenylo)-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-8-chloro-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-metylo-3H-chinazol-in-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-fluoro-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-7-fluoro-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-6-chloro-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-6-bromo-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-6,7-dimetoksy-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-onu; i

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-metoksyfenylo)-3H-chinazolin-4-onu.

PL 213 200 B1

W innej korzystnej postaci wykonania R⁴ jest wybrany z grupy składającej się z H fluorowca, OH, OCH3 i CH3;

R⁶ jest wybrany z grupy składającej się z grupy C1-C6alkilowej, fenylowej, fluorowcofenylowej,

C1-C6alkilofenylowej i bifenylowej; przy czym 45

a) R⁴ i R⁵ niezależnie są różne od grup 6-fluorowcowej albo 6,7-dimetoksylowej; i b) R⁶ jest różny od grupy 4-chlorofenylowej.

W szczególnie korzystnej postaci wykonania związek według wynalazku jest wybrany z grupy składającej się z:

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-bifenyl-2-ilo-5-chloro-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-fluorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-fluorofenylo)-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-8-chloro-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-fluoro-3H-chinazolin-4-onu;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-7-fluoro-3H-chinazolin-4-onu; i

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-onu.

W innym aspekcie związek wynalazku ma wzór strukturalny:

w którym A oznacza purynyl ewentualnie podstawiony jedną do trzech grup wybranych z grupy obejmującej N(R^a)2, atom fluorowca, C1-3alkil, S(C1-3alkil), C=O and OR^a;

X oznacza CHR^b;

Y jest wybrany z grupy składającej się z bezpośredniego wiązania, NH, i NHC(=O)CH2S;

R¹ i R², niezależnie, są wybrane z grupy składającej się z wodoru, grupy C1-6alkilowej, atomu fluorowca, grupy NO2, OR^a, N(R^a)2, OC2-4alkilenoOR^a i NR^aC1- 4alkilenoN(R^a)2;

₃

R³ oznacza fenyl ewentualnie podstawiony jedną do trzech grup wybranych z grupy składającej się z fluorowca, grupy N(R^a)2, C(=O)OR^a, NO2, C(=O)R^a, OR^a, C(=O)OR^a, fenylowej, C1-4alkilowej, NR^aC1-4alkilenoN(R^a)2, i NR^aC(=O)R^a;

a każdy z R^a jest wybrany niezależnie z grupy składającej się z wodoru, fluorowca, grupy C1-6alkilowej, C1-3alkilenoN(R^a)2, fenylowej, benzylowej, C1-3alkilenofenylowej, C(=O)C1-4alkilowej, OH albo dwie grupy R^a wzięte razem tworzą 6-członowy pierścień, ewentualnie zawierający jeden albo dwa heteroatomy wybrane z grupy obejmującej N i O;

R^b jest wybrany z grupy składającej się z wodoru i grupy C1-6alkilowej; i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole.

W korzystnej postaci wykonania X jest wybrany z grupy składającej się z CH2, CH(CH3) i C(CH3)2, układ pierścieniowy A jest podstawiony jednym do trzech podstawników wybranych z grupy składającej się z NH2, NH(CH3), N(CH3)2, NHCH2C6H5, NH(C2H5), Cl, F, CH3, SCH3 i OH, a R¹ i R² niezależnie są wybrane z grupy składającej się z H, OCH₃, Cl, Br, F, CH₃, NO₂, OH, O NCHoCHoNH

N(CH₃)₂, \_/ i O(CH₂)₂OCH₂C₆H₅.

Korzystnie R³ jest podstawiony podstawnikiem wybranym z grupy obejmującej Cl, F, CH3, CH(CH3)2, OCH3, C6H5, NO2, NHC(O)CH3, CO2H i N(CH3)CH2CH2N(CH3)2.

W innym aspekcie wynalazek dostarcza kompozycji farmaceutycznej obejmującej związek według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym kompozycja ta stanowi selektywny inhibitor ΡΙ3Κ5.

Wynalazek dostarcza też zastosowania związku według wynalazku, jako leku do leczenia choroby wybranej z grupy składającej się z:

PL 213 200 B1

i) raków pochodzenia krwiotwórczego, korzystnie: a) chłoniaków wybranych korzystnie spośród chłoniaka Burkitta, choroby Hodgkina, chłoniaka nieziarniczego, chłoniaka limfocytowego, b) szpiczaka mnogiego, c) białaczek wybranych korzystnie spośród białaczek limfocytowych, przewlekłych białaczkek szpikowych (związanych z rozwojem szpiku);

ii) chorób, które cechuje uwalnianie histaminy, korzystnie wybranych spośród przewlekłej czopującej choroby płuc (COPD), astmy, ARDS i rozedmy płuc;

iii) chorób zapalnych stawów wybranych korzystnie spośród reumatoidalnego zapalenia stawów, jednostawowego zapalenia stawów, zapalenia kości i stawów, dnawego zapalenia stawów, zapalenia kręgosłupa;

iv) zaburzeń płucnych lub oddechowych wybranych korzystnie spośród astmy, przewlekłego nieżytu oskrzeli, alergicznego zapalenia śluzówki nosa, przewlekłej choroby zapalnej płuc i przewlekłej czopującej choroby płuc;

v) chorób autoimmunizacyjnych wybranych korzystnie spośród liszaja rumieniowatego uogólnionego (SLE), autoimmunizacyjnego zapalenia tarczycy, stwardnienia rozsianego, niektórych postaci cukrzycy i zespołu Reynauda; oraz vi) cukrzycy typu I.

Niniejszym opisano ponadto sposoby leczenia stanu medycznego powstającego za pośrednictwem neutrofili, który obejmuje podawanie potrzebującemu tego zwierzęciu ilości skutecznej związku, który selektywnie hamuje aktywność 3-kinazy delta fosfatydyloinozytolowej (PI3K5) w neutrofilach. Przykładowe stany medyczne, które można leczyć zgodnie ze sposobem według wynalazku, obejmują te stany, które charakteryzują się niepożądaną funkcją neutrofili, wybrane z grupy obejmującej stymulowane uwalnianie ponadtlenku, stymulowaną egzocytozę, i migrację chemotaktyczną.

Korzystnie, zgodnie ze sposobem według wynalazku, aktywność fagocytowa lub zabijanie bakterii przez neutrofile zasadniczo nie są zahamowane.

Związki według wynalazku można stosować do zaburzania funkcji osteoklastów, przez doprowadzenie do kontaktu osteoklastów ze związkiem, który selektywnie hamuje aktywność 3-kinazy delta fosfatydyloinozytolowej (PI3K5)) w osteoklastach. Związek taki może zawierać ugrupowanie, które selektywnie wiąże się z kością.

Niniejszym opisano ponadto sposób łagodzenia zaburzenia resorpcji kości u potrzebującego tego zwierzęcia, który obejmuje podawanie zwierzęciu ilości skutecznej związku, który hamuje aktywność 3-kinazy delta fosfatydyloinozytolowej (PI3K5)) w osteoklastach zwierzęcia.

Korzystnie zaburzenie resorpcji kości nadające się do leczenia zgodnie ze sposobem według wynalazku stanowi osteoporoza.

Związki według wynalazku mogą być stosowane w sposobie hamowania wzrostu lub proliferacji komórek raka pochodzenia krwiotwórczego, który obejmuje kontaktowanie komórek raka ze związkiem, który selektywnie hamuje aktywność 3-kinazy delta fosfatydyloinozytolowej (PI3K5) w komórkach rakowych. Sposób może być korzystny przy hamowaniu wzrostu lub proliferacji raków wybranych z grupy obejmującej chłoniaki, szpiczaki mnogie oraz białaczki.

Te i inne cechy i zalety niniejszego wynalazku zostaną docenione na podstawie szczegółowego opisu oraz przykładów, które przedstawiono niniejszym. Szczegółowy opis i przykłady są podane dla lepszego zrozumienia wynalazku, ale nie mają one ograniczać zakresu wynalazku.

Krótki opis rysunków

Figura 1 pokazuje wpływ selektywnego inhibitora PI3K5 według wynalazku na aktywność trzech izoform PI3K.

Figura 2 pokazuje wpływ selektywnego inhibitora PI3K5 na wytwarzanie ponadtlenku przez neutrofile ludzkie w obecności TNF lub IgG.

Figura 3 pokazuje wpływ selektywnego inhibitora PI3K5 na wytwarzanie ponadtlenku przez neutrofile ludzkie w obecności TNF lub fMLp.

Figura 4 pokazuje wpływ selektywnego inhibitora PI3K5 na egzocytozę elastazy przez neutrofile ludzkie w obecności fMLP.

Figura 5 pokazuje wpływ selektywnego inhibitora PI3K5 na chemotaksję przez neutrofile ludzkie indukowaną przez fMLP.

Figura 6 pokazuje, że selektywny inhibitor PI3K5 nie wpływa na fagocytozę i zabijanie S. aureus przez neutrofile.

Figura 7 pokazuje wpływ selektywnego inhibitora PI3K5 na proliferację i wytwarzanie przeciwciał przez ludzkie limfocyty B.

PL 213 200 B1

Figura 8 pokazuje wpływ selektywnego inhibitora PI3K5 na stymulowaną przez anty-IgM proliferację limfocytów B w śledzionie myszy.

Figura 9 pokazuje wpływ selektywnego inhibitora PI3K5 na egzocytozę elastazy w modelu zwierzęcym.

Szczegółowy opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są związki, które selektywnie hamują aktywność ΡΙ3Κ5. Niniejszym opisano sposoby hamowania aktywności PI3K5, w tym sposoby selektywnego modulowania aktywności izozymu PI3K5 w komórkach, zwłaszcza leukocytach, osteoklastach, i komórkach rakowych. Sposoby obejmują zastosowania in vitro, in vivo, i ex vivo.

Szczególnie korzystne są sposoby selektywnego modulowania aktywności ΡΙ3Κ5, w otoczeniu klinicznym w celu łagodzenia choroby lub zaburzeń powstających za pośrednictwem aktywności PI3K5. Tak więc, choroby lub zaburzenia cechujące się nadmierną lub nieodpowiednią aktywnością ΡΙ3Κ5, można leczyć przez zastosowanie selektywnych modulatorów PI3K5 według wynalazku.

Inne sposoby obejmują umożliwienie dalszego scharakteryzowania fizjologicznej roli izozymu. Ponadto, przedmiotem wynalazku są kompozycje farmaceutyczne zawierające selektywne inhibitory PI3K5. Obecnie opisane zostaną szczegóły tych i innych przydatnych wykonań wynalazku.

Sposoby opisane niniejszym korzystają ze stosowania związków, które selektywnie hamują, a korzystnie specyficznie hamują aktywność PI3K5 w komórkach, w tym komórkach in vitro, in vivo, lub ex vivo. Przydatne komórki stanowią komórki, które endogennie wyrażają PI3K5, przy czym endogennie oznacza, że komórki wyrażają PI3K5 bez rekombinacyjnego wprowadzenia do komórek jednego lub więcej polinukleotydów kodujących polipeptyd PI3K5 lub ich biologicznie aktywnego fragmentu. Sposoby obejmują także zastosowanie komórek, które egzogennie wyrażają PI3K5, gdzie jeden lub więcej polinukleotydów kodujących PI3K5 lub ich biologicznie aktywny fragment zostały wprowadzone do komórki przy użyciu procedur rekombinacyjnych.

Szczególnie korzystnie, komórki mogą być in vivo, tj., w osobniku żywym, np., zwierzęciu lub człowieku, w którym inhibitor PI3K5 może być stosowany jako lek do hamowania aktywności PI3K5 w osobniku. Alternatywnie, komórki mogą być wydzielone jako oddzielne komórki lub w tkance, dla sposobów ex vivo lub in vitro. Sposoby in vitro także objęte wynalazkiem mogą obejmować etap kontaktowania enzymu PI3K5 lub jego biologicznie aktywnego fragmentu ze związkiem inhibitorem według wynalazku. Enzym PI3K5 może obejmować enzym oczyszczony i wydzielony, przy czym enzym wydziela się ze źródła naturalnego (np., komórek lub tkanek, które normalnie wyrażają polipeptyd PI3K5 bez modyfikacji technologią rekombinacyjną) lub wydziela się z komórek zmodyfikowanych technikami rekombinacyjnymi w celu wyrażania enzymu egzogennego.

Stosowane niniejszym określenie „selektywny inhibitor PI3K5” odnosi się do związku, który hamuje izozym PI3K5 bardziej skutecznie niż inne izozymy z rodziny PI3K. Rozumie się, że związek będący „selektywnym inhibitorem PI3K5” jest bardziej selektywny dla PI3K5 niż związki zwyczajowo i ogólnie oznaczane, jako inhibitory PI3K, np., wortmannina lub LY294002. Równocześnie, wortmannina i LY294002 są uważane za „nieselektywne inhibitory PI3K”. Związki dowolnego typu, które selektywnie negatywnie regulują ekspresję lub aktywność PI3K5, mogą być stosowane jako selektywne inhibitory PI3K5 w sposobach według wynalazku. Ponadto, związki dowolnego typu, które selektywnie negatywnie regulują ekspresję lub aktywność PI3K5 i posiadają dopuszczalne właściwości farmakologiczne, mogą być stosowane jako selektywne inhibitory PI3K5 w sposobach terapeutycznych według wynalazku.

Względne skuteczności związków, jako inhibitorów aktywności enzymatycznej (lub innej aktywności biologicznej) można ustalić określając stężenia, przy których każdy związek hamuje aktywność w określonym stopniu, a następnie porównując wyniki. Typowo, korzystne oznaczenie to stężenie, które hamuje 50% aktywności w teście biochemicznym, tj. stężenie hamowania 50% lub „IC50”. Oznaczenia IC50 można przeprowadzić konwencjonalnymi technikami znanymi w stanie techniki.

W ogólności, IC50 można oznaczyć mierząc aktywność danego enzymu w obecności zakresu stężeń badanego inhibitora. Następnie otrzymane doświadczalnie wartości aktywności enzymu wykreśla się w odniesieniu do zastosowanych stężeń inhibitora. Jako wartość IC50 przyjmuje się stężenie inhibitora, które wykazuje aktywności enzymu 50% (w porównaniu z aktywnością pod nieobecność jakiegokolwiek inhibitora). Analogicznie, inne stężenia hamowania można zdefiniować przez odpowiednie oznaczenia aktywności. Na przykład, w niektórych układach pożądane może być ustalenie stężenia hamowania 90%, tj., IC90, itp.

PL 213 200 B1

Odpowiednio, „selektywny inhibitor PI3Ki>” alternatywnie można rozumieć, jako określenie związku, który wykazuje stężenie hamowania 50% (IC50) w odniesieniu do ΡΙ3Κδ, które jest co najmniej korzystne 10-krotnie, korzystnie co najmniej 20-krotnie, a korzystniej co najmniej 30-krotnie, niższe niż wartość IC50 w odniesieniu do dowolnego lub wszystkich pozostałych członów rodziny Klasy I PI3K. Określenie „specyficzny inhibitor PI3K>” można rozumieć jako określenie związku będącego selektywnym inhibitorem PI3K<s, który wykazuje IC₅₀ w odniesieniu do ΡΙ3Κδ, które jest co najmniej 50-krotnie, korzystnie co najmniej 100-krotnie, korzystniej co najmniej 200-krotnie, a jeszcze korzystniej co najmniej 500-krotnie, niższe niż IC50 w odniesieniu do dowolnego lub wszystkich pozostałych członów rodziny Klasy I PI3K.

Między innymi, niniejszym opisano sposoby hamowania funkcji leukocytów. Konkretniej, opisane zostały sposoby hamowania lub tłumienia funkcji neutrofili oraz limfocytów T i B. W odniesieniu do neutrofili, stwierdzono nieoczekiwanie, że hamowanie aktywności ΡΙ3Κδ, hamuje funkcje neutrofili. Na przykład, zaobserwowano, że związki według wynalazku wywołują hamowanie klasycznych funkcji neutrofili, takich jak stymulowane uwalnianie ponadtlenku, stymulowana egzocytoza, i migracja chemotaktyczna. Jednak zaobserwowano dalej, że sposób według wynalazku umożliwia stłumienie pewnych funkcji neutrofili, zarazem zasadniczo nie dotykając innych funkcji tych komórek. Na przykład, zaobserwowano, że fagocytoza bakterii przez neutrofile nie jest zasadniczo hamowana przez będące selektywnymi inhibitorami ΡΙ3Κδ, związki według wynalazku.

Zatem ujawnione niniejszym związki umożliwiają hamowanie funkcji neutrofili, bez hamowania zasadniczo fagocytozy bakterii. Funkcje neutrofili nadające się do hamowania obejmują dowolną funkcję, w której uczestniczy aktywność lub ekspresja ΡΙ3Κδ. Takie funkcje obejmują, bez ograniczania, stymulowane uwalnianie ponadtlenku, stymulowaną egzocytozę lub degranulację, migrację chemotaktyczną, adhezję do śródbłonka naczyniowego (np., wychwytywanie/toczenie się neutrofili, wyzwalanie aktywności neutrofili, i/lub przyleganie neutrofili do śródbłonka), diapedezę przez ścianę lub migrację przez śródbłonek do tkanek obwodowych. W ogólności, te funkcje można zbiorczo określać „funkcjami zapalnymi”, gdyż są one typowo związane z odpowiedzią neutrofili na zapalenie. Funkcje zapalne neutrofili można odróżnić od funkcji zabijania bakterii wykazywanych przez te komórki, np., fagocytozy i zabijania bakterii. Odpowiednio, dalszym przedmiotem wynalazku są sposoby leczenia stanów chorobowych, w których jedna lub więcej funkcji zapalnych neutrofili jest nienormalnych lub niepożądanych.

Dalej twórcy wynalazku ustalili, że ΡΙ3Κδ, odgrywa rolę w stymulowanej proliferacji limfocytów, w tym limfocytów B i limfocytów T. Ponadto wydaje się, że PI3K<s odgrywa rolę w stymulowanym wydzielaniu przeciwciał przez limfocyty B. Będące selektywnymi inhibitorami PI3K<s związki według wynalazku zostały wykorzystane do ustalenia, że te zjawiska mogą być przerwane przez hamowanie PI3Ki\ Tak więc, rozwiązania według wynalazku umożliwiają hamowanie proliferacji limfocytów oraz hamowanie wytwarzania przeciwciał przez limfocyty B. Inne sposoby umożliwione przez wynalazek obejmują sposoby leczenia stanów chorobowych, w których jedna lub wiele z tych funkcji limfocytów jest nienormalnych lub niepożądanych.

Obecnie stwierdzono, że aktywność ΡΙ3Κδ, można hamować selektywnie lub specyficznie, umożliwiając leczenie choroby powstającej za pośrednictwem ΡΙ3Κδ, a zarazem zmniejszając lub eliminując powikłania, które są typowo związane z równoczesnym hamowaniem aktywności innych 3-kinaz PI Klasy I. Sposoby tu opisane można realizować przy użyciu członów klasy związków, które, jak stwierdzono, wykazują selektywne hamowanie ΡΙ3Κδ, w odniesieniu do innych izoform PI3K.

Opisane powyżej sposoby można realizować z zastosowaniem związków według wynalazku. Korzystne sposoby wykorzystują związki, które, jak stwierdzono doświadczalnie, wykazują co najmniej 10-krotnie bardziej selektywne hamowanie PI3K<s w odniesieniu do innych izoform PI3K. Na przykład, sposoby można realizować stosując następujące związki:

3-(2-izopropylofenylo)-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

5-chloro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on;

5-chloro-3-(2-fluorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-(2-fluorofenylo)-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-(2-metoksyfenylo)-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo-3H-chinazolin-4-on;

3-(2,6-dichlorofenylo)-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-(2-chlorofenylo)-6-fluoro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

5-chloro-3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-(2-chlorofenylo)-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

PL 213 200 B1

3-(3-metoksyfenylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo-3H-chinazolin-4-on;

3-(2-chlorofenylo)-5-fluoro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-benzylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-butylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-(2-chlorofenylo)-7-fluoro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-morfolin-4-ylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on, sól octanowa;

8-chloro-3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-(2-chlorofenylo)-6,7-difluoro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-(2-metoksyfenylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

6-chloro-3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-(3-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

2- (9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3-pirydyn-4-ylo-3H-chinazolin-4-on;

3- (2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-trifluorometylo-3H-chinazolin-4-on;

3-benzylo-5-fluoro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-(4-metylopiperazyn-1-ylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on, sól octanowa;

3-(2-chlorofenylo)-6-hydroksy-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; ester etylowy kwasu

5-fluoro-4-okso-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-4H-chinazolin-3-ylo]octowego;

3-(2,4-dimetoksyfenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-bifenyl-2-ilo-5-chloro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-izopropylofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-bifenyl-2-ilo-5-chloro-3H-chinazolin-4-on;

5-chloro-3-(2-metoksyfenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-fluorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-fluoro-fenylo)-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-8-chloro-3-(2-chloro-fenylo)-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-chloro-fenylo)-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-fluoro-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-benzylo-5-fluoro-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-butylo-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-morfolin-4-ylo-3H-chinazolin-4-on;

2- (6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-7-fluoro-3H-chinazolin-4-on;

3- (2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-fenylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-izopropylo-fenylo)-3H-chinazolin-4-on; i

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on.

Szczególnie związki według wynalazku stanowią te, które wykazują aktywność hamującą ΡΙ3Κδ, przez to umożliwiając hamowanie aktywności ΡΙ3Κδ, w chorobach powstających za jej pośrednictwem. Ale sposoby tu opisane można także realizować stosując związki o wzorze ogólnym (I).

w którym A oznacza ewentualnie podstawiony układ pierścieniowy monocykliczny lub bicykliczny zawierający co najmniej dwa atomy azotu, i co najmniej jeden pierścień układu jest aromatyczny;

X jest wybrany z grupy obejmującej CHR^b, CH2CHR^b, i CH=C(R^b);

Y jest wybrany z grupy obejmującej bezpośrednie wiązanie, S, SO, SO2, NH, O, C(=O), OC(=O), C(=O)O, i NHC(=O)CH2S;

PL 213 200 B1 ₁

R¹ i R2, niezależnie, są wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, grupę C1-6alkilową, arylową, heteroarylową, atom fluorowca, grupę NHC(=O)C1-3alkilenoN(R^a)2, NO2, OR^a, OCF3, N(R^a)2,

CN, OC(=O)R^a, C(=O)R^a, C(=O)OR^a, arylOR^b, Het, aryloOC1-3alkilenoN(R^a)2, aryloOC(=O)R^a, C1-4alkilenoC(=O)OR^a, lenoOC1-4alkilenoC(=O)OR^a, C(=O)-NR^aSO2R^a, C1-4alkilenoN(R^a)2, -C1-4alkilenoOR^a, C(=O)NR^aC1-4alkilenoHet, OC2-4alkilenoN(R^a)2,

OC1-4alkilenoHet, OC2-4alkilenoOR^a,

NR^aC(=O)C1-3alkilenoC(=O)OR^a,

OC1-4alkilenoC(=O)OR^a, C1-4alkiC2-6alkenylenoN(R^a)2, C(=O)NR^aOC1-4alkilenoCH(OR^b)CH2N(R^a)2,

OC2-4alkilenoNR^aC(=O)OR^a, NR^aC1-4alkilenoN(R^a)2,

NR^aC(=O)R^a, NR^aC(=O)N(R^a)2, N(SO2C1-4alkilo)2, NR^a(SO2C1-4alkilową), SO2N(R^a)2, OSO2CF3,

C1-3alkilenoarylową, C1-4alkilenoHet, C1-6alkilenoOR^b

C1-3alkilenoN(R^a)2, C(=O)N(R^a)2,

NHC(=O)C1-3alkilenoarylową, C3-8cykloalkilową, C3-8heterocykloalkilową, aryloOC1-3alkilenoN(R^a)2, aryloOC(=O)R^b, NHC(=O)C1-3alkileno C3-8heterocykloalkilową, NHC(=O)C1-3alkilenoHet, OC1-4alkilenoOC1-4alkilenoC(=O)OR^b, C(=O)C1-4alkilenoHet, i NHC(=O)fluorowcoC1-6alkilową;

₁ lub R¹ i R2 wzięte razem tworzą 3- lub 4-członowy alkilenowy lub alkenylenowy łańcuch będący składnikiem 5- lub 6-członowego pierścienia, ewentualnie zawierającego co najmniej jeden heteroatom;

R3 jest wybrany z grupy obejmującej ewentualnie podstawione atom wodoru, grupę C1-6alkilową, C3-8cykloalkilową, C3-8heterocykloalkilową, C1-4alkilenocykloalkilową, C2-6alkenylową, C1-3alkilenoarylową, aryloC1-3alkilową, C(=O)R^a, arylową, heteroarylową, C(=O)OR^a, C(=O)N(R^a)a, C(=S)N(R^a)2, SO2R^a, SO2N(R^a)2, S(=O)R^a, S(=O)N(R^a)2, C(=O)NR^aC1-4alkilenoOR^a, C(=O)NR^aC1-4alkilenoHet, C(=O)C1-4alkilenoarylową, C(=O)C1-4alkilenoheteroarylową, C1-4alkilenoarylową ewentualnie podstawioną przez jeden lub więcej atomów fluorowca, grup SO2N(R^a)2, N(R^a)2, C(=O)OR^a, NR^aSO2CF3, CN, NO2, C(=O)R^a, OR^a, C1-4alkilenoN(R^a)2, i OC1-4alkilenoN(R^a)2, C1-4alkilenoheteroarylowych, C1-4alkilenoHet, C1-4alkileno-C(=O)C14alkilenoarylowych, C1-4alkilenoC(=O)C1-4alkilenoheteroarylowych, C1-4alkilenoC(=O)Het, C1-4alkilenoC(=O)N(R^a)2, C1-4alkilenoOR^a, C1-4alkilenoNR^aC(=O)R^a, C1-4alkilenoO C1-4alkilenoOR^a, C1-4alkilenoN(R^a)2, C1-4alkilenoC(=O)OR^a, i C1-4alkilenoO C1-4alkilenoC(=O)OR^a;

R^a jest wybrany z grupy obejmującej atom wodoru, grupę C1-6alkilową, C3-8cykloalkilową, C3-8heterocykloalkilową, C1-3alkilenoN(R^a)2, arylową, aryloC1-3alkilową, C1-3alkilenoarylową, heteroarylową, heteroaryloC1-3alkilową, i C1-3alkilenoheteroarylową;

lub dwie grupy R^a wzięte razem tworzą 5- lub 6-członowy pierścień, ewentualnie zawierający, co najmniej jeden heteroatom;

R^b jest wybrany z grupy obejmującej atom wodoru, grupę C1-6alkilową, arylową, heteroarylową, aryloC1-3alkilową, heteroaryloC1-3alkilową, C1-3alkilenoarylową, i C1-3alkilenoheteroarylową;

Het oznacza 5- lub 6-członowy pierścień heterocykliczny, nasycony lub częściowo lub w pełni nienasycony, zawierający co najmniej jeden heteroatom wybrany z grupy obejmującej tlen, azot i siarkę, i ewentualnie podstawiony przez grupę C1-4alkilową lub C(=O)OR^a;

i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole i solwaty (np., hydraty).

Szczególnie użyteczne są związki, które posiadają aktywność hamującą ΡΙ3Κδ, jak następuje:

5-chloro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on;

3-(2-metoksyfenylo)-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-(2-chlorofenylo)-6-fluoro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-9H-chinazolin-4-on;

3-(2-metoksyfenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-benzylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-butylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-(3-metoksyfenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

PL 213 200 B1

3-(3-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

2- (9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3-pirydyn-4-ylo-3H-chinazolin-4-on;

3- (2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-trifluorometylo-3H-chinazolin-4- on; 3-benzylo-5-fluoro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-(4-metylopiperazyn-1-ylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on, sól octanowa;

5-fluoro-4-okso-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-4H-chinazolin-3-ylo]octowego;

3-bifenyl-2-ilo-5-chloro-2-(-9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

5- chloro-3-(2-metoksyfenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-izopropylofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-on; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-bifenyl-2-ilo-t-chloro-3H-chinazolin-4-on; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-fluorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-on; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-fluoro-fenylo)-3H-chinazolin-4-on; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-8-chloro-3-(2-chloro-fenylo)-3H-chinazolin-4-on; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-chloro-fenylo)-3H-chinazolin-4-on; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-on; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-fluoro-3H-chinazolin-4-on; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-benzylo-5-fluoro-3H-chinazolin-4-on; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-butylo-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-morfolin-4-ylo-3H-chinazolin-4-on;

2- (6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-7-fluoro-3H-chinazolin-4-on;

3- (2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-fenylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

2- (6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-on;

3- (4-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-(2-chlorofenylo)-6,7-dimetoksy-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-(2-chlorofenylo)-7-nitro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-6-bromo-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-on;

2- (6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-6,7-dimetoksy-3H-chinazolin-4-on;

6- bromo-3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3- (2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-benzo[g]chinazolin-4-on; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on; i 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-metoksyfenylo)-3H-chinazolin-4-on.

Przedmiotem wynalazku są związki, które stanowią selektywne inhibitory aktywności PI3^.

Związki wykazują hamowanie PI3^ w testach biochemicznych, i selektywnie zaburzają funkcję komórek wyrażających ΡΙ3Κδ w testach opartych na komórkach. Jak opisano niniejszym, Twórcy wynalazku wykazali, że związki według wynalazku hamują pewne funkcje w neutrofilach i innych leukocytach, jak również funkcje osteoklastów.

W ogólności, przedmiotem wynalazku są związki o wzorze ogólnym (I), których znaczenia określono powyżej. Jednakże pożądane właściwości mogą wykazywać związki o strukturze określonej wzorem (I) zdefiniowane poniżej:

o (I) gdzie:

A oznacza ewentualnie podstawiony układ pierścieniowy monocykliczny lub bicykliczny zawierający co najmniej dwa atomy azotu, i co najmniej jeden pierścień układu jest aromatyczny;

PL 213 200 B1

X jest wybrany z grupy obejmującej CHR^b, CH₂CHR^b, i CH=C(R^b);

Y jest wybrany z grupy obejmującej bezpośrednie wiązanie, S, SO, SO2, NH, O, C(=O),

OC(=O), C(=O)O, i NHC(=O)CH2S;

R¹ i R², niezależnie, są wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, grupę C1-6alkilową. arylową, heteroarylową, atom fluorowca, grupę NHC(=O)C1-3alkilenoN(R^a)2, NO2, OR^a, OCF3, N(R^a)2, CN, OC(=O)R^a, C(=O)R^a, C(=O)OR^a, aryloR^b, Het, NR^aC(=O)C1-3alkilenoC(=O)OR^a, aryloOC1-3alkilenoN(R^a)2, aryloOC(=O)R^a, C1-4alkilenoC(=O)OR^a, OC1-4alkilenoC(=O)OR^a, C1-4alkilenoOC1-4alkilenoC(=O)OR^a, C(=O)NR^aSO2R^a, C1-4alkilenoN(R^a)2, C2-6alkenylenoN(R^a)2, C(=O)NR^a-C1-4alkilenoOR^a, C(=O)NR^aC1-4alkilenoHet, OC2-4alkilenoN(R^a)2, OC1-4alkilenoCH(OR^b)CH2N(R^a)2, OC1-4alkilenoHet, OC2-4alkilenoOR^a, OC2-4alkilenoNR^aC(=O)OR^a, NR^aC1-4alkilenoN(R^a)2, NR^aC(=O)R^a,

NR^aC(=O)N(R^a)2, N(SO2C1-6alkilo)2, NR^a(SO2 C1-4alkilową), SO2N(R^a)2, OSO2CF3, C1-3alkilenoarylową, C1-4alkilenoHet, C1-6alkilenoOR^b, C1-3alkilenoN(R^a)2, C(=O)N(R^a)2, NHC(=O)C1-3alkilenoab arylową, C3-8cykloalkilową, C3-8heterocykloalkilową, aryloOC1-3alkilenoN(R^a)2, aryloOC(=O)R^b, NHC(=O)C1-3alkileno C3-8heterocykloalkilową, NHC(=O)C1-3alkilenoHet, C1-4alkilenoOC1-4alkileno-C(=O)OR^b, C(=O)C1-4alkilenoHet, i NHC(=O)fluorowco C1-6Calkilową;

1a lub R¹ i R2 wzięte R^azem tworzą 3- lub 4-czlonowy alkilenowy lub alkenylenowy łańcuch będący składnikiem 5- lub 6-członowego pierścienia, ewentualnie zawierającego co najmniej jeden heteroatom;

₃

R³ jest wybrany z grupy obejmującej ewentualnie podstawione atom wodoru, grupę C1-6alkilową, C3-8cykloalkilową, C3-8heterocykloalkilową, C1-4alkilenocykloalkilową, C2-6alkenylową, C1-3alkilenoarylową, aryloC1-3alkilową, C(=O)R^a, arylową, heteroarylową, C(=O)OR^a, C(=O)N(R^a)2, C(=S)N(R^a)2, SO2R^a, SO2N(R^a)2, S(=O)R^a, S(=O)N(R^a)2, C(O)NR^aC1-4alkilenoOR^a, C(O)NR^a-C1-4alkilenoHet, C(=O)C3-4alkilenoarylową, C(=O)C1-4alkilenoheteroarylową, C1-4alkilenoarylową ewentualnie podstawioną przez jeden lub więcej atomów fluorowca, grup SO2N(R^a)2, N(R^a)2, C(=O)OR^a, NR^aSO2CF3, CN, NO2, C(=O)R^a, OR^a, C1-4alkilenoN(R^a)2, i OC1-4alkilenoN(R^a)2, C1-4alkilenoheteroarylowych, C1-4alkilenoHet, C1-4alkilenoC(O)C1-4alkilenoarylowych, C1-4alkilenoC(=O)C1-4alkilenoheteroarylowych, C1-4alkilenoC(=O)Het, C1-4alkilenoC(=O)N(R^a)2, C1-4alkilenoOR^a, C1-4alkilenoNR^aC(O)R^a, C1-4alkilenoOC1-4alkilenoOR^a, C1-4alkilenoN(R^a)2, C1-4alkilenoC(O)OR^a, i C1-4alkilenoOC1-4alkilenoC(=O)OR^a;

R^a jest wybrany z grupy obejmującej atom wodoru, grupę C1-6alkilową, C3-8cykloalkilową, C3-8heterocykloalkilową, C1-3alkilenoN(R^a), arylową, arylo C1-3alkilową, C1-3alkilenoarylową, heteroarylową, heteroaryloC1-3alkilową, i C1-3alkilenoheteroarylową;

lub dwie grupy R^a wzięte razem tworzą 5- lub 6-członowy pierścień, ewentualnie zawierający co najmniej jeden heteroatom;

R^b jest wybrany z grupy obejmującej atom wodoru, grupę C1-6alkilową, arylową, heteroarylową, arylo C1-3alkilową, heteroaryloC1-3alkilową, C1-3alkilenoarylową, i C1-3alkilenoheteroarylową;

i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole i solwaty (np., hydraty) oraz proleki.

Stosowane niniejszym określenie „grupa alkilowa” obejmuje prostołańcuchowe i rozgałęzione grupy węglowodorowe zawierające wskazaną liczbę atomów węgla, typowo grupę metylową, etylową, oraz prostołańcuchowe i rozgałęzione grupy propylowe i butylowe. Grupa węglowodorowa może zawierać aż do 16 atomów węgla, korzystnie jeden do ośmiu atomów węgla. Określenie „grupa alkilowa” obejmuje „mostkową grupę alkilową”, tj., bicykliczną lub policykliczną grupę C6-C16 węglowodorową, na przykład, grupę norbornylową, adamantylową, bicyklo[2.2.2]oktylową, bicyklo[2.2.1]heptylową, bicyklo[3.2.1]oktylową, lub dekahydronaftylową. Określenie „grupa cykloalkilowa” jest zdefiniowane, jako cykliczna grupa C3-C8 węglowodorowa, np., cyklopropylowa, cyklobutylowa, cykloheksylowa, i cyklopentylowa.

Określenie „grupa alkenylowa” jest zdefiniowane identycznie jak „grupa alkilowa”, z tym wyjątkiem, że zawiera wiązanie podwójne węgiel-węgiel. „Grupa cykloalkenylowa” jest zdefiniowana podobnie do grupy cykloalkilowej, z tym wyjątkiem, że w pierścieniu obecne jest wiązanie podwójne węgiel-węgiel.

Określenie „grupa alkilenowa” odnosi się do grupy alkilowej mającej podstawnik. Na przykład, określenie „grupa C1-3alkilenoarylowa” odnosi się do grupy alkilowej zawierającej jeden do trzech atomów węgla, i podstawionej przez grupę arylową.

PL 213 200 B1

Określenie „atom fluorowca” lub „fluorowiec” jest zdefiniowane niniejszym, jako obejmujące atom fluoru, bromu, chloru i jodu.

Określenie „grupa fluorowcoalkilowa” jest zdefiniowane niniejszym, jako grupa alkilowa podstawiona przez jeden lub więcej podstawników fluorowcowych, albo fluorowych, chlorowych, bromowych, jodowych, albo przez ich kombinacje. Podobnie, „grupa fluorowcocykloalkilowa” jest zdefiniowana jako grupa cykloalkilowa mająca jeden lub więcej podstawników fluorowcowych.

Określenie „grupa arylowa”, samo albo w kombinacji, jest zdefiniowane niniejszym jako monocykliczna lub policykliczna grupa aromatyczna, korzystnie monocykliczna lub bicykliczna grupa aromatyczna, np., grupa fenylowa lub naftylowa. O ile nie podano inaczej, to grupa „arylowa” może być niepodstawiona lub podstawiona, na przykład, przez jeden lub więcej, a w szczególności jeden do trzech, atomów fluorowca, grup alkilowych, fenylowych, hydroksyalkilowych, alkoksylowych, alkoksyalkilowych, fluorowcoalkilowych, nitrowych, aminowych, alkiloaminowych, acyloaminowych, alkilotiolowych, alkilosulfinylowych, i alkilosulfonylowych. Przykładowe grupy arylowe obejmują grupę fenylową, naftylową, bifenylową, tetrahydronaftylową, chlorofenylową, fluorofenylową, aminofenylową, metylofenylową, metoksyfenylową, trifluorometylofenylową, nitrofenylową, karboksyfenylową, itp.

Określenia „grupa aryloC1-3alkilowa” i „grupa heteroaryloC1-3alkilowa” są zdefiniowane jako grupa arylowa lub heteroarylowa mająca podstawnik C1-3alkilowy.

Określenie „grupa heteroarylowa” jest zdefiniowane niniejszym, jako monocykliczny lub bicykliczny układ pierścieniowy zawierający jeden lub dwa pierścienie aromatyczne i zawierający co najmniej jeden atom azotu, tlenu, lub siarki w pierścieniu aromatycznym, i który może być niepodstawiony lub podstawiony, na przykład, przez jeden lub więcej, a w szczególności jeden do trzech, podstawników, takich jak atom fluorowca, grupa alkilowa, hydroksylowa, hydroksyalkilowa, alkoksylowa, alkoksyalkilowa, fluorowcoalkilowa, nitrowa, aminowa, alkiloaminowa, acyloaminowa, alkilotiolowa, alkilosulfinylowa, i alkilosulfonylowa. Przykłady grup heteroarylowych obejmują grupę tienylową, furylową, pirydylową, oksazolilową, chinolilową, izochinolilową, indolilową, triazolilową, izotiazolilową. izoksazolilową, imidazolilową, benzotiazolilową, pirazynylową, pirymidynylową, tiazolilową, i tiadiazolilową.

Określenie „Het” jest zdefiniowane jako monocykliczne, bicykliczne, i tricykliczne grupy zawierające jeden lub więcej heteroatomów wybrany z grupy obejmującej tlen, azot i siarkę.

Grupa „Het” może także zawierać grupę okso (=O) przyłączoną do pierścienia. Nie ograniczające przykłady grup Het obejmują 1,3-dioksolan, 2-pirazolinę, pirazolidynę, pirolidynę, piperazynę, pirolinę, 2H-piran, 4H-piran, morfolinę, tiomorfolinę, piperydynę, 1,4-ditiani 1,4-dioksan.

Określenie „grupa hydroksylowa” jest zdefiniowane jako -OH.

Określenie „grupa alkoksylowa” jest zdefiniowane jako -OR, gdzie R oznacza grupę alkilową.

Określenie „grupa alkoksyalkilowa” jest zdefiniowane jako grupa alkilowa, w której atom wodoru został zastąpiony przez grupę alkoksylową. Określenie „grupa (alkilotio)alkilowa” jest zdefiniowane podobnie jak grupa alkoksyalkilowa, z tym wyjątkiem, że obecny jest atom siarki zamiast atomu tlenu.

Określenie „grupa hydroksyalkilowa” jest zdefiniowane jako grupa hydroksylowa przyłączona do grupy alkilowej.

Określenie „grupa aminowa” jest zdefiniowane jako -NH2, a określenie „grupa alkiloaminowa” ₂ jest zdefiniowane jako -NR², gdzie co najmniej jeden R oznacza grupę alkilową, a drugi R oznacza grupę alkilową lub atom wodoru.

Określenie „grupa acyloaminowa” jest zdefiniowane jako RC(=O)N, gdzie R oznacza grupę alkilową lub arylową.

Określenie „grupa alkilotiolowa” jest zdefiniowane jako -SR, gdzie R oznacza grupę alkilową.

Określenie „grupa alkilosulfinylowa” jest zdefiniowane jako R-SO2, gdzie R oznacza grupę alkilową.

Określenie „grupa alkilosulfonylowa” jest zdefiniowane jako R-SO3, gdzie R oznacza grupę alkilową.

PL 213 200 B1

Określenie „grupa nitrowa” jest zdefiniowane jako -NO2.

Określenie „grupa trifluorometylowa” jest zdefiniowane jako -CF3.

Określenie „grupa trifluorometoksylowa” jest zdefiniowane jako -OCF3.

Określenie „grupa cyjanowa” jest zdefiniowane jako -CN.

Szczególnie korzystne są związki, w których X jest wybrany z grupy obejmującej CH2, CH2CH2, CH=CH, CH(CH3), CH2CH(CH3), i C(CH3)2. W dalszych korzystnych wykonaniach, Y jest wybrany z grupy obejmującej bezpośrednie wiązanie, S, i NH.

Pierścień A może być monocykliczny lub bicykliczny. Monocykliczne układy pierścieniowe A są aromatyczne. Bicykliczne układy pierścieniowe A zawierają co najmniej jeden pierścień aromatyczny, ale oba pierścienie mogą być aromatyczne.

Przykłady układów pierścieniowych A obejmują, ale bez ograniczania do tego, imidazolil, pirazolil, 1,2,3-triazolil, pirydazynyl, pirymidynyl, pirazynyl, 1,3,5-triazynyl, purynyl, cynnolinyl, ftalazynyl, chinazolinyl, chinoksalinyl, 1,8-naftyrydynyl, pterydynyl, 1H-indazolil, i benzimidazolil.

W korzystnej grupie związków o wzorze (I), A ma znaczenie określone powyżej. Jednakże w pewnych związkach A oznacza ewentualnie podstawiony układ pierścieniowy wybrany z grupy obejmującej

PL 213 200 B1

Układ pierścieniowy A ewentualnie może być podstawiony przez jeden do trzech, i korzystnie jeden do dwóch, podstawników wybranych z grupy obejmującej N(R^a)2, atom fluorowca, grupę

C1-3alkilową, S(C1-3alkilową). OR^a, i

Właściwe podstawniki obejmują, ale bez ograniczania do tego, NH2, NH(CH3), N(CH3)2,

NHCH2C6H5, NH(C2H5), Cl, F, CH3, SCH3, OH, i

W innej korzystnej grupie związków o wzorze (I) R¹ i R² niezależnie, oznaczają atom wodoru, OR^a, atom fluorowca, grupę C1-6alkilową, CF3, NO2, N(R^a)2, NR^aC1-3alkilenoN(R^a)2, i OC1-3alkilenoOR^a. Właściwe podstawniki obejmują, ale bez ograniczania do tego, H, OCH3, Cl, Br, F, CH3, CF3, NO2, OH, N(CH3)2,

NHCH₂CH₂—N O i O(CH2)2OCH2C6H5. R¹ i R² mogą także wzięte razem tworzyć pierścień, na przykład, pierścień fenylowy.

R³ może obejmować ewentualnie podstawioną grupę C1-6alkilową, arylową, heteroarylową, C3-8cykloalkilową, C3-8heterocykloalkilową, C(=O)OR^a, C1-4alkilenoHet, C1-4alkilenocykloalkilową, C1-4alkilenoarylową, C1-4alkilenoC(=O)C1-4alkilenoarylową, C1-4alkilenoC(=O)OR^a, C1-4alkilenoC(=O)-N(R^a)2, C1-4alkilenoC(=O)Het, C1-4alkilenoN(R^a)2, i C1-4alkilenoNR^aC(=O)R^a. Specyficzne grupy R³obejmują, ale bez ograniczania do tego

PL 213 200 B1

Grupa może być podstawiona przez jeden do trzech podstawników, na przykład, atom fluorowca, OR

C(=O)OR^a, N(R^a)C1

Właściwe

CH(CH3)2, OCH3 grupę C1-6alkilową, arylową, heteroarylową, NO2, N(R^a)2, NR^aSO2CF3, NR^aC(=O)R^a, ^{a a} 4alkileno(R^a)2, SO2N(R^a)2, CN, C(=O)R^a, C1-4alkilenoN(R^a)2, i OC1-4alkilenoN(R^a)2.

₃ podstawniki dla grupy R³ obejmują, ale bez ograniczania do tego, Cl, F, CH3,

C6H5, NO2, NH2, NHC(=O)CH3, CO2H, i N(CH3)CH2CH2N(CH3)2.

Stosowana niniejszym struktura pierścienia chinazolinowego i numeracja struktury pierścieni, to:

Struktura pierścienia purynowego i numeracja struktury pierścieni, to:

Przykłady związków, które można stosować w opisanych tu sposobach są następujące:

5-chloro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on;

5- chloro-3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-(2-metoksyfenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-benzylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-butylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-morfolin-4-ylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on, sól octanowa; 8-chloro-3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-(2-chlorofenylo)-6,7-difluoro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-(3-metoksyfenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

6- chloro-3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-(3-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

2- (9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3-pirydyn-4-ylo-3H-chinazolin-4-on;

3- (2-chlorofenylo)-8-trifluorometylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-benzylo-5-fluoro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-(4-metylopiperazyn-1-ylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on, sól octanowa; 3-(2-chlorofenylo)-6-hydroksy-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

ester etylowy kwasu [5-fluoro-4-okso-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-4H-chinazolin-3-ylo]octowego;

3-(2-metoksyfenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-bifenyl-2-ilo-5-chloro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on;

PL 213 200 B1

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-bifenyl-2-ilo-5-chloro-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-fluorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-fluorofenylo)-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-8-chloro-3-(2-chloro-fenylo)-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-chloro-fenylo)-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-fluoro-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-benzylo-5-fluoro-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-butylo-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-morfolin-4-ylo-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-7-fluoro-3H-chinazolin-4-on;

2- (6-aminopuryn-9-ylometylo)-6-chloro-3-(2-chloro-fenylo)-3H-chinazolin-4-on;

3- (4-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-6-bromo-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-on;

2- (6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-6,7-dimetoksy-3H-chinazolin-4-on; 6-bromo-3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3- (2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-benzo[g]chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on; i

2- (6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-metoksyfenylo)-3H-chinazolin-4-on.

Korzystne związki według wynalazku mają wzór (IV), którego przykłady są następujące:

3- (2-izopropylofenylo)-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 5-chloro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on; 3-chloro-3-(2-fluorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-(2-fluorofenylo)-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-(2,6-dichlorofenylo)-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-(2-chlorofenylo)-6-fluoro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 5-chloro-3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-(2-chlorofenylo)-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-(2-chlorofenylo)-5-fluoro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-benzylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-butylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-(2-chlorofenylo)-7-fluoro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-morfolin-4-ylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on, sól octanowa; 8-chloro-3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-(2-chlorofenylo)-6,7-difluoro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-chloro-3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-(3-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

2- (9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3-pirydyn-4-ylo-3H-chinazolin-4-on;

3- (2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-trifluorometylo-3H-chinazolin-4-on; 3-benzylo-5-fluoro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on; 3-(4-metylopiperazyn-1-ylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on, sól octanowa; 3-(2-chlorofenylo)-6-hydroksy-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

3-bifenyl-2-ilo-5-chloro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-bifenyl-2-ilo-5-chloro-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-fluorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-fluoro-fenylo)-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-8-chloro-3-(2-chloro-fenylo)-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-chloro-fenylo)-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-fluoro-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-benzylo-5-fluoro-3H-chinazolin-4-on;

PL 213 200 B1

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-butylo-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-morfolin-4-ylo-3H-chinazolin-4-on;

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-7-fluoro-3H-chinazolin-4-on; i

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on.

Stosowane niniejszym określenie „prolek” odnosi się do związków, które gwałtownie przekształcają się in vivo w związek o powyższym wzorze strukturalnym (I), na przykład, przez hydrolizę. Tworzenie proleków omawiają ogólnie Hardma i in. (red.), Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, wyd. 9, str. 11-16 (1996). Gruntowną dyskusję przedstawiają Higuchi i in., Prodrugs as Novel Delivery Systems, tom 14, ASCD Symposium Series, oraz Roche (red.), Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association i Pergamon Press (1987). Krótko mówiąc, po podaniu leku następuje usunięcie z organizmu lub jakieś przekształcenie biologiczne, dzięki czemu aktywność biologiczna leku zostaje zmniejszona lub wyeliminowana. Alternatywnie, proces biotransformacji może prowadzić do metabolicznego produktu ubocznego, który sam jest bardziej aktywny lub równie aktywny w odniesieniu do początkowo podanego leku. Większe zrozumienie tych procesów biotransformacji umożliwia tworzenie tak zwanych „proleków”, które, po biotransformacji, stają się bardziej aktywne fizjologicznie w ich zmienionym stanie. Proleki obejmują więc farmakologicznie nieaktywne związki, które przekształcają się w biologicznie aktywne metabolity.

Dla ilustracji, proleki mogą zostać przekształcone w postać farmakologicznie aktywną przez hydrolizę, na przykład, wiązania estrowego lub amidowego, przez to wprowadzając lub odsłaniając grupę funkcyjną na otrzymanym produkcie. Proleki mogą zostać skonstruowane tak, żeby reagować ze związkiem endogennym z wytworzeniem rozpuszczalnego w wodzie koniugatu, który dalej wzmaga właściwości farmakologiczne związku, na przykład, zwiększony okres półtrwania w krążeniu. Alternatywnie, proleki mogą zostać skonstruowane tak, żeby ulegać kowalencyjnej modyfikacji na grupie funkcyjnej przez, na przykład, kwas glukuronowy, siarczan, glutation, aminokwasy, lub octan. Otrzymany koniugat może zostać inaktywowany i wydalony w moczu, albo stać się silniejszy niż związek macierzysty. Koniugaty o wysokiej masie cząsteczkowej mogą także być wydalane do żółci, poddawane rozszczepieniu enzymatycznemu, i uwalniane z powrotem do krążenia, przez to skutecznie zwiększając biologiczny okres półtrwania pierwotnie podanego związku.

Sposoby identyfikowania negatywnych regulatorów aktywności ΡΙ3Κδ

Białko ΡΙ3Κδ, jak również jego fragmenty posiadające aktywność biologiczną, można zastosować do badań przesiewowych związków będących próbnymi regulatorami negatywnymi w dowolnej z technik badań przesiewowych leków. Negatywny regulator ΡΙ3Κδ stanowi związek, który zmniejsza lub znosi zdolność ΡΙ3Κδ do wykonywania którejkolwiek z jej funkcji biologicznych. Przykładem takich związków jest środek, który zmniejsza zdolność polipeptydu ΡΙ3Κδ do fosforylowania fosfatydyloinozytolu lub do znajdowania właściwych struktur w komórce. Selektywność związku, który negatywnie reguluje aktywność ΡΙ3Κδ, można ocenić porównując jego aktywność wobec ΡΙ3Κδ z jego aktywnością wobec innych protein. Selektywne regulatory negatywne obejmują, na przykład, przeciwciała i inne białka lub peptydy, które szczegółowo wiążą się z polipeptydem ΡΙ3Κδ, oligonukleotydy, które szczegółowo wiążą się z polipeptydami ΡΙ3Κδ, i inne związki niepeptydowe (np. wydzielone lub syntetyczne cząsteczki organiczne), które specyficznie oddziałują z polipeptydami ΡΙ3Κδ. Regulatory negatywne obejmują także związki jak opisano wyżej, ale które oddziałują ze specyficznym partnerem wiążącym polipeptydy ΡΙ3Κδ.

Obecnie korzystne cele dla opracowania selektywnych regulatorów negatywnych ΡΙ3Κδ obejmują, na przykład:

(1) cytoplazmatyczne obszary polipeptydów ΡΙ3Κδ, które kontaktują się z innymi białkami i/lub lokalizują ΡΙ3Κδ w komórce;

(2) obszary polipeptydów ΡΙ3Κδ, które wiążą specyficznych partnerów wiązania;

(3) obszary polipeptydów ΡΙ3Κδ, które wiążą substrat;

(4) allosferyczne miejsca regulatorowe polipeptydów ΡΙ3Κδ, które mogą lub nie mogą oddziaływać bezpośrednio z miejscem aktywnym przy sygnale regulującym;

(5) obszary polipeptydów ΡΙ3Κδ, które pośredniczą w multimeryzacji.

Na przykład, celem dla konstruowania modulatorów jest zidentyfikowane oddziaływanie regulatorowe p85 z p110δ, które może być zaangażowane w aktywacji, i/lub umiejscowieniu subkomórkowym ugrupowania p110δ. Jeszcze inne selektywne modulatory obejmują te, które rozpoznają specyficzne regulatory lub sekwencję nukleotydową kodującą ΡΙ3Κδ. Modulatory aktywności ΡΙ3Κδ mogą

PL 213 200 B1 być terapeutycznie przydatne przy leczeniu szerokiego zakresu chorób i stanów fizjologicznych, w których zaangażowana jest anormalna aktywność ΡΙ3Κ5.

Opisano niniejszym sposoby charakteryzowania siły związku testowego, jako inhibitora polipeptydu ΡΙ3Κ5, przy czym wspomniany sposób obejmuje etapy (a) mierzenia aktywności polipeptydu ΡΙ3Κ5 w obecności związku testowego; (b) porównania aktywności polipeptydu ΡΙ3Κ5 w obecności związku testowego z aktywnością polipeptydu ΡΙ3Κ5 w obecności równoważnej ilości związku odniesienia (np., związku będącego inhibitorem ΡΙ3Κ5 według wynalazku jak opisano niniejszym), gdzie niższa aktywność polipeptydu ΡΙ3Κ5 w obecności związku testowego niż w obecności odnośnika wskazuje, że związek testowy jest inhibitorem silniejszym niż związek odniesienia, a wyższa aktywność polipeptydu ΡΙ3Κ5 w obecności związku testowego niż w obecności odnośnika wskazuje, że związek testowy jest inhibitorem słabszym niż związek odniesienia.

Dalej przedstawione zostały sposoby charakteryzowania siły związku testowego jako inhibitora polipeptydu ΡΙ3Κ5, które obejmują etapy (a) określania ilości związku kontrolnego (np., będącego inhibitorem ΡΙ3Κ5 związku według wynalazku jak opisano niniejszym), która hamuje aktywność polipeptydu ΡΙ3Κ5 o referencyjny procent hamowania, przez to definiując referencyjną ilość hamującą dla związku kontrolnego; (b) określania ilości związku testowego, która hamuje aktywność polipeptydu ΡΙ3Κ5 o referencyjny procent hamowania, przez to definiując referencyjną ilość hamującą dla związku testowego; (c) porównanie referencyjnej ilości hamującej dla związku testowego z referencyjną ilością hamującą dla związku kontrolnego, gdzie niższa referencyjna ilość hamująca dla związku testowego niż dla związku kontrolnego wskazuje, że związek testowy jest silniejszym inhibitorem niż związek odniesienia, a wyższa referencyjna ilość hamująca dla związku testowego niż dla związku kontrolnego wskazuje, że związek testowy jest słabszym inhibitorem niż związek odniesienia. W jednym z aspektów, sposób wykorzystuje referencyjną ilość hamującą, która oznacza ilość związku, która hamuje aktywność polipeptydu ΡΙ3Κ5 o 50%, 60%, 70%, lub 80%.

W innym aspekcie sposób wykorzystuje referencyjną ilość hamującą, która oznacza ilość związku, która hamuje aktywność polipeptydu ΡΙ3Κ5 o 90%, 95%. lub 99%. Te sposoby obejmują określenie referencyjnej ilości hamującej związków w teście biochemicznym in vitro, w teście komórkowym in vitro, lub w oznaczeniu in vivo.

Poniżej zilustrowano także sposoby identyfikowania negatywnego regulatora aktywności ΡΙ3Κ5. obejmujące etapy (i) mierzenia aktywności polipeptydu ΡΙ3Κ5 w obecności i pod nieobecność związku testowego, i (ii) identyfikowania jako negatywnego regulatora związku testowego, który zmniejsza aktywność ΡΙ3Κ5 i który konkuruje ze związkiem według wynalazku o wiązanie z ΡΙ3Κ5. Ponadto, przedmiotem wynalazku są sposoby identyfikowania związków, które hamują aktywność ΡΙ3Κ5, obejmujące etapy (i) kontaktowania polipeptydu ΡΙ3Κ5 ze związkiem według wynalazku w obecności i pod nieobecność związku testowego, i (ii) identyfikowania związku testowego jako negatywnego regulatora aktywności ΡΙ3Κ5, gdzie związek konkuruje ze związkiem według wynalazku o wiązanie z ΡΙ3Κ5.

Przedmiotem wynalazku jest więc sposób badania przesiewowego dla kandydujących negatywnych regulatorów aktywności ΡΙ3Κ5 i/lub potwierdzania trybu działania takich kandydujących regulatorów negatywnych.

Takie sposoby można równolegle wykorzystywać przeciw innym izoformom ΡΙ3Κ dla ustalenia porównawczej aktywności związku testowego między izoformami i/lub w odniesieniu do związku według wynalazku.

W tych sposobach, polipeptydem ΡΙ3Κ5 może być fragment ΡΙ3Κ5, który wykazuje aktywność kinazy, tj., fragment obejmujący miejsce katalityczne p1105. Alternatywnie, polipeptydem PI3K5 może być fragment z wiążącej p1105 domeny p85, dając sposób identyfikowania allosferycznych modulatorów ΡΙ3Κ5. Sposoby można wykorzystywać w komórkach wyrażających ΡΙ3Κ5 lub jej podjednostki, albo endogennie albo egzogennie. Odpowiednio, polipeptyd wykorzystywany w takich sposobach może być wolny w roztworze, unieruchomiony na podłożu stałym, zmodyfikowany dla prezentacji na powierzchni komórki, lub umiejscowiony wewnątrzkomórkowo. Wtedy można zmierzyć modulację aktywności lub tworzenie kompleksów wiążących między polipeptydem ΡΙ3Κ5 i testowanym środkiem.

Ludzkie polipeptydy ΡΙ3Κ są przydatne do przesiewowych oznaczeń biochemicznych lub komórkowych, o dużej przepustowości (HTS, ang. high throughput screening) zgodnie ze sposobami znanymi i realizowanymi w stanie techniki, obejmującymi układy oznaczeń na melanoforach dla badania oddziaływań receptor-ligand, układy oznaczeń oparte na drożdżach, i układy ekspresji w komórkach ssaków. Przegląd - patrz Jayawickreme i Kost, Curr. Opin. Biotechnol., 8: 629-34 (1997).

PL 213 200 B1

Oznaczenia HTS są także w pełni zautomatyzowane i zminiaturyzowane, jak opisali, na przykład, Houston i Banks, Curr. Opin. Biotechnol., 8: 734-40 (1997).

Takie oznaczenia HTS stosuje się do badań przesiewowych bibliotek związków dla zidentyfikowania poszczególnych związków, które wykazują pożądaną właściwość. Można zastosować dowolną bibliotekę związków, w tym biblioteki związków chemicznych, biblioteki produktów naturalnych, i biblioteki kombinatoryczne zawierające bezładne lub skonstruowane oligopeptydy, oligonukleotydy, lub inne związki organiczne.

Biblioteki związków chemicznych mogą zawierać związki znane, zastrzeżone analogi strukturalne związków znanych, lub związki, które identyfikuje się na podstawie badań przesiewowych produktów naturalnych.

Biblioteki produktów naturalnych stanowią kolekcje materiałów wydzielonych ze źródeł naturalnych, typowo, drobnoustrojów, zwierząt, roślin, lub organizmów morskich. Produkty naturalne wydziela się z ich źródeł metodą fermentacji drobnoustrojów, a następnie izolowania i ekstrahowania bulionów fermentacyjnych lub metodą bezpośredniej ekstrakcji z drobnoustrojów lub samych tkanek (roślin lub zwierząt). Biblioteki produktów naturalnych obejmują poliketydy, peptydy nierybosomalne, i ich warianty (w tym warianty nie występujące w przyrodzie). Przegląd - patrz Cane i in., Science, 282: 63-68 (1998).

Biblioteki kombinatoryczne składają się z wielu związków pokrewnych, takich jak peptydy, oligonukleotydy, lub inne związki organiczne, w mieszaninie. Takie związki względnie prosto jest skonstruować i wytworzyć tradycyjnymi zautomatyzowanymi procedurami syntezy, PCR klonowania, lub prawnie zastrzeżonymi sposobami syntetycznymi. Szczególnie interesujące są biblioteki kombinatoryczne peptydów i oligonukleotydów.

Jeszcze inne interesujące biblioteki obejmują biblioteki peptydów, białek, peptydomimetyczne, wielokrotnie równoległe kolekcje syntetyczne, produktów rekombinacyjnych, i polipeptydów. Opis chemii kombinatorycznej i tworzonych przez nią bibliotek - patrz Myers, Curr. Opin. Biotechnol.,

8: 701-07 (1997).

Po zidentyfikowaniu związków, które wykazują aktywność, jako negatywne regulatory funkcji ΡΙ3Κ5, można podjąć projekt optymalizacji w celu poprawy siły i/lub selektywności aktywności. Ta analiza zależności struktura-aktywność (SAR) typowo obejmuje szereg iteracyjny selektywnych modyfikacji struktur związków i ich korelacji z aktywnością biochemiczną lub biologiczną. Można skonstruować rodziny pokrewnych związków, wykazujących pożądaną aktywność, gdzie pewne człony rodziny, a mianowicie posiadające przydatne profile farmakologiczne, potencjalnie kwalifikują się, jako terapeutyki kandydujące.

Zastosowania terapeutyczne inhibitorów aktywności ΡΙ3Κ5

Przedmiotem wynalazku są zastosowania terapeutyczne. Selektywnego lub specyficzne hamowanie aktywności ΡΙ3Κ5 ma znaczenie terapeutycznie lub profilaktycznie. Zastosowania medyczne można prowadzić przez podawanie selektywnego lub specyficznego inhibitora aktywności ΡΙ3Κ5 w ilości do tego skutecznej. Ten sposób można wykorzystywać przy leczeniu ludzi lub zwierząt, które są lub mogą być przedmiotem dowolnego stanu, którego objawy lub patologia powstają za pośrednictwem ekspresji lub aktywności ΡΙ3Κ5.

Stosowane niniejszym określenie „leczenie” odnosi się do zapobiegania wystąpieniu zaburzenia u zwierzęcia, które może być predysponowane do zaburzenia, ale jeszcze go u niego nie zdiagnozowano; hamowania zaburzenia, tj., zatrzymania jego rozwoju; łagodzenia zaburzenia, tj., powodowania jego cofania; lub polepszania zaburzenia, tj., zmniejszania ciężkości objawów związanych z zaburzeniem. „Zaburzenie” ma obejmować medyczne zaburzenia, choroby, stany, zespoły, itp., bez ograniczania.

Opisane tu sposoby obejmują rozmaite tryby leczenia zwierząt, korzystnie ssaków, korzystniej naczelnych, a jeszcze korzystniej ludzi. Między ssakami, które można leczyć, są, na przykład, zwierzęta domowe trzymane dla towarzystwa, w tym psy i koty; zwierzęta hodowlane, w tym bydło, konie, owce, świnie, i kozy; zwierzęta laboratoryjne, w tym szczury, myszy, króliki, świnki morskie, i naczelne inne niż człowiek, oraz zwierzęta trzymane w zoo. Zwierzęta inne niż ssaki obejmują, na przykład, ptaki, ryby, gady i płazy.

Rozwiązania według wynalazku można wykorzystywać do terapeutycznego lub profilaktycznego leczenia osobników, będących lub mogących być przedmiotem zaburzenia zapalnego. Wynika to z faktu, że ΡΙ3Κ5 jest pośrednikiem procesu zapalnego. Nie ograniczając się do żadnej teorii, twórcy teoretyzują, że skoro w procesach zapalenia pośredniczy aktywacja i transmigracja chemotaktyczna

PL 213 200 B1 leukocytów (np., neutrofili, limfocytów, itp.) i skoro ΡΙ3Κδ może pośredniczyć w takich zjawiskach, to antagonisty ΡΙ3Κδ mogą zostać użyte do tłumienia urazu związanego z zapaleniem.

Stosowane niniejszym określenie „zaburzenie zapalne” może odnosić się do dowolnej choroby, zaburzenia, lub zespołu, w których nadmierna lub niekontrolowana odpowiedź zapalna prowadzi do nadmiernych objawów zapalnych, uszkodzenia tkanki gospodarza, lub utraty funkcji tkanki.

„Zaburzenie zapalne” odnosi się także do stanu patologicznego powstającego za pośrednictwem dopływu leukocytów i/lub chemotaksji neutrofili.

Stosowane niniejszym określenie „zapalenie” odnosi się do zlokalizowanej odpowiedzi ochronnej wywoływanej przez uraz lub zniszczenie tkanek, która służy do zniszczenia, rozcieńczenia, lub oddzielenia (zamaskowania) zarówno czynnika urazowego jak i uszkodzonej tkanki. Zapalenie jest w szczególności związane z dopływem leukocytów i/lub chemotaksją neutrofili. Zapalenie może wynikać z zakażenia organizmami patogennymi i wirusami oraz z przyczyn niezakaźnych, takich jak uraz lub reperfuzja po zawale mięśnia sercowego lub udarze, odpowiedź immunologiczna na obcy antygen, oraz odpowiedzi autoimmunologiczne.

Odpowiednio, zaburzenia zapalne nadające się do stosowania wynalazku obejmują zaburzenia związane z reakcjami układu odporności swoistej, jak również z reakcjami układu odporności nieswoistej.

Stosowane niniejszym określenie „układ odporności swoistej” odnosi się do składnika układu odpornościowego, który reaguje na obecność specyficznych antygenów. Przykłady zapalenia będącego skutkiem odpowiedzi układu odporności swoistej obejmują klasyczną odpowiedź na antygeny obce, choroby autoimmunizacyjne, oraz odpowiedź nadwrażliwości typu opóźnionego za pośrednictwem limfocytów T. Przewlekłe choroby zapalne, odrzucenie stałych przeszczepionych tkanek i narządów, np., przeszczepów nerek i szpiku kostnego, oraz reakcje przeszczepu przeciw gospodarzowi (GVHD, ang. graft versus host disease), to dalsze przykłady reakcji zapalnych układu odporności swoistej.

Stosowane niniejszym określenie „układ odporności nieswoistej” odnosi się do zaburzeń zapalnych, które powstają za pośrednictwem leukocytów, które są niezdolne do pamięci immunologicznej (np., granulocytów i makrofagów). Przykłady zapalenia wynikającego, co najmniej częściowo, z reakcji układu odporności nieswoistej obejmują zapalenie związane ze stanami takie jak zespół (ostrego) wyczerpania oddechowego dorosłych (ARDS, ang. adult respiratory distress syndrome) lub zespoły urazu wielonarządowego; uraz reperfuzyjny; ostre zapalenie kłębuszków nerkowych; reaktywne zapalenie stawów; dermatozy ze składnikami zapalenia ostrego; ostre ropne zapalenie opon mózgowych lub inne zaburzenia zapalne ośrodkowego układu nerwowego takie jak udar; uraz cieplny; choroba zapalna jelita; zespoły związane z transfuzją granulocytów, i toksyczność indukowana przez cytokiny.

Stosowane niniejszym określenie „choroba autoimmunizacyjna” odnosi się do dowolnej grupy zaburzeń, w których uszkodzenie tkanki wiąże się z odpowiedziami humoralnymi lub za pośrednictwem komórek na własne składniki ustroju. Stosowane niniejszym określenie „choroba alergiczna” odnosi się do dowolnych objawów uszkodzenia tkanki, lub utraty funkcji tkanki wskutek alergii. Stosowane niniejszym określenie „choroba zapalna stawów” odnosi się do dowolnej choroby, którą cechują zapalne zmiany chorobowe stawów możliwe do przypisania rozmaitym etiologiom. Stosowane niniejszym określenie „zapalenie skóry” odnosi się do dowolnej z dużej rodziny chorób skóry, które cechuje zapalenie skóry możliwe do przypisania rozmaitym etiologiom. Stosowane niniejszym określenie „odrzucenie przeszczepu” odnosi się do dowolnej reakcji odpornościowej skierowanej przeciwko przeszczepionej tkance, takiej jak narządy lub komórki (np., szpik kostny), którą cechuje utrata funkcji tkanek przeszczepionych i otaczających, ból, obrzęk, leukocytoza oraz trombocytopenia.

Sposoby terapeutyczne tu opisane obejmują sposoby leczenia zaburzeń związanych z zapalną aktywacją komórek. „Zapalna aktywacja komórek” odnosi się do indukcji przez bodziec (obejmujący, ale bez ograniczania do tego, cytokiny, antygeny lub auto- przeciwciała) rozrostowej odpowiedzi komórkowej, wytwarzanie rozpuszczalnych mediatorów (obejmujących, ale bez ograniczania do tego, cytokiny, rodniki tlenu, enzymy, prostanoidy, lub aminy naczyniowoczynne), lub ekspresji na powierzchni komórki nowych lub większej liczby mediatorów (obejmujących, ale bez ograniczania do tego, antygeny głównego układu zgodności tkankowej lub cząsteczki adhezji komórkowej) w komórkach zapalnych (obejmujących, ale bez ograniczania do tego monocyty, makrofagi, limfocyty T, limfocyty B, granulocyty (tj., leukocyty polimorfonuklearne takie jak neutrofile, bazofile, i eozynofile), komórki tuczne, komórki dendrytowe, komórki gwiaździste warstwy kolczystej naskórka, i komórki śródbłonka). Specjalista powinien rozumieć, że aktywacja jednego lub kombinacji tych fenotypów w tych komórkach może przyczyniać się do inicjacji, utrwalenia, lub zaostrzenia zaburzenia zapalnego.

PL 213 200 B1

Stwierdzono, że związki według wynalazku hamują uwalnianie ponadtlenku przez neutrofile. Ponadto tlenek jest uwalniany przez neutrofile w odpowiedzi na dowolny z rozmaitych bodźców, obejmujących sygnały zakażenia, jako mechanizm zabijania komórek. Na przykład wiadomo, że uwalnianie ponadtlenku jest indukowane przez czynnik martwicy nowotworów alfa (TNFa), który jest uwalniany przez makrofagi, komórki tuczne i limfocyty przy kontakcie ze składnikami bakteryjnej ściany komórkowej takimi jak lipopolisacharyd (LPS). TNFa jest nadzwyczaj silnym i nieselektywnym aktywatorem procesów zapalnych, zaangażowanym w aktywacji neutrofili i rozmaitych innych typów komórek, indukcji przylegania leukocytów/komórek śródbłonka, gorączce, wzmożonemu wytwarzaniu MHC klasy I, oraz stymulacji rozwoju naczyń. Alternatywnie, uwalnianie ponadtlenku może być stymulowane przez formylo-Met-Leu-Phe (fMLP) lub inne peptydy zablokowane na N-końcu przez formylowaną metioninę. Takie peptydy u eukariotów nie są normalnie spotykane, ale są fundamentalną cechą bakterii, i układowi odpornościowemu sygnalizują obecność bakterii. Leukocyty wyrażające receptor fMLP, np., neutrofile i makrofagi, są stymulowane do migrowania w kierunku rosnących gradientów tych peptydów (tj., chemotaksja) w stronę miejsca zakażenia. Jak wykazano niniejszym, związki według wynalazku hamują stymulowane uwalnianie ponadtlenku przez neutrofile w odpowiedzi na TNFa albo fMLP. Wykazano także, że inne funkcje neutrofili, obejmujące stymulowaną egzocytozę i ukierunkowaną migrację chemotaktyczną, są hamowane przez inhibitory ΡΙ3Κ5 według wynalazku. Odpowiednio należy oczekiwać, że związki według wynalazku będą przydatne przy leczeniu zaburzeń, takich jak zaburzenia zapalne, w których pośredniczą którekolwiek lub wszystkie z tych funkcji neutrofili.

Rozwiązania tu ujawnione mogą służyć do leczenia chorób, takich jak choroby zapalne stawów, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów, jednostawowe zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, dnawe zapalenie stawów, zapalenie kręgosłupa; choroba Behceta; posocznica, wstrząs septyczny, wstrząs endotoksynowy, posocznica gramujemna, posocznica gramdodatnia, i zespół wstrząsu toksycznego; wtórny zespół urazu wielonarządowego po posocznicy, uraz, lub krwotok; zaburzenia oczne takie jak alergiczne zapalenie spojówek, wiosenne zapalenie spojówek, zapalenie błony naczyniowej oka, i zanik gałki ocznej związany z tarczycą; ziarniniak kwasochłonny; zaburzenia płucne lub oddechowe takie jak astma, przewlekły nieżyt oskrzeli, alergiczne zapalenie śluzówki nosa, ARDS, przewlekła choroba zapalna płuc (np., przewlekła czopująca choroba płuc), pylica krzemowa, sarkoidoza płucna, zapalenie opłucnej, zapalenie pęcherzyków płucnych, zapalenie naczyń, rozedma płuc, zapalenie płuc, rozstrzenie oskrzelowe, i płucna toksyczność tlenu; uraz reperfuzyjny mięśnia sercowego, mózgu, lub kończyn; zwłóknienie takie jak mukowiscydoza; tworzenie bliznowców lub tworzenie tkanki bliznowatej; miażdżyca tętnic; choroby autoimmunizacyjne, takie jak liszaj rumieniowaty uogólniony (SLE, ang. systemic lupus erythematosus), wole Hashimoto, stwardnienie rozsiane, niektóre postacie cukrzycy, i zespół Reynauda; i zaburzenia odrzucania przeszczepu, takie jak GVHD i odrzucenie aloprzeszczepu; przewlekłe zapalenie kłębuszków nerkowych, choroby zapalne jelita, takie jak przewlekła choroba zapalna jelita (CIBD, ang. chronic inflammatory bowel disease), choroba Leśniowskiego i Crohna, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, oraz zapalenie jelita cienkiego i okrężnicy powodujące martwicę; zapalne choroby skóry takie jak kontaktowe zapalenie skóry, atopowe zapalenie skóry, łuszczyca, lub pokrzywka; gorączka i bóle mięśniowe wskutek zakażenia; zaburzenia zapalne ośrodkowego lub obwodowego układu nerwowego takie jak zapalenie opon mózgowych, zapalenie mózgu, i uszkodzenie mózgu lub rdzenia kręgowego wskutek mniejszych urazów; zespół grena; choroby angażujące diapedezę leukocytów; alkoholowa marskość wątroby; bakteryjne zapalenie płuc; choroby powstające za pośrednictwem kompleksów antygen-przeciwciało; wstrząs oligowolemiczny; cukrzyca Typu I; ostra i opóźniona nadwrażliwość; stany chorobowe wskutek dyskrazji leukocytów i przerzutu; uraz cieplny; zespoły związane z transfuzją granulocytów; oraz toksyczność indukowana przez cytokiny.

Sposób może być użyteczny przy leczeniu pacjentów, którzy cierpią lub mogą cierpieć na uraz reperfuzyjny, tj., uraz wynikły z sytuacji, w których tkanka lub narząd doznaje okresu niedokrwienia, a następnie reperfuzji. Określenie „niedokrwienie” odnosi się do zlokalizowanej niedokrwistości tkanki wskutek niedrożności dopływu krwi tętniczej. Przemijające niedokrwienie, po którym następuje reperfuzja, charakterystycznie powodują aktywację i transmigrację neutrofili przez śródbłonek naczyń krwionośnych w dotkniętym obszarze. Nagromadzenie aktywowanych neutrofili z kolei powoduje wytworzenie reaktywnych metabolitów tlenu, które niszczą składniki objętej tkanki lub narządu. To zjawisko „urazu reperfuzyjnego” jest powszechnie związane ze stanami takimi jak udar naczyniowy (w tym niedokrwienie ogólne i ogniskowe), wstrząs krwotoczny, niedokrwienie lub zawał mięśnia sercowego, przeszczepienie narządu, i skurcz naczyń mózgu. Dla ilustracji, uraz reperfuzyjny występuje na końcu

PL 213 200 B1 procedur z przepływem omijającym serce lub podczas zatrzymania serca, gdy serce, nie mogąc przedtem otrzymywać krwi, zaczyna być reperfundowane. Oczekuje się, że hamowanie aktywności

ΡΙ3Κ5 spowoduje zmniejszenie urazu reperfuzyjnego w takich sytuacjach.

W odniesieniu do układu nerwowego, niedokrwienie ogólne występuje, gdy przepływ krwi do całego mózgu zanika na jakiś okres. Niedokrwienie ogólne może wynikać z zatrzymania serca. Niedokrwienie ogniskowe występuje, gdy część mózgu zostaje pozbawiona swojego normalnego zasilania krwią. Niedokrwienie ogniskowe może być skutkiem zatkania skrzepem naczynia mózgu, urazu głowy, obrzęku, lub nowotworu mózgu. Niedokrwienie, zarówno ogólne jak i ogniskowe, nawet jeśli jest przemijające, może spowodować rozległe zniszczenie neuronów. Chociaż uszkodzenie tkanki nerwowej zachodzi w ciągu godzin lub nawet dni po początku objawów niedokrwienia, to pewne trwałe uszkodzenie tkanki nerwowej może rozwinąć się w początkowych minutach po ustaniu przepływu krwi do mózgu.

Niedokrwienie może także nastąpić w sercu przy zawale mięśnia sercowego i innych zaburzeniach sercowo-naczyniowych, w których tętnice wieńcowe zostały zatkane wskutek miażdżycy tętnic, skrzepu, lub skurczu. Odpowiednio, uważa się, że wynalazek jest przydatny do leczenia uszkodzenia tkanki serca, szczególnie uszkodzenia wynikłego z niedokrwienia serca lub spowodowanego przez uraz reperfuzyjny u ssaków.

W innym aspekcie, selektywne inhibitory aktywności ΡΙ3Κδ, takie jak związki według wynalazku, można wykorzystywać w sposobach leczenia chorób kości, zwłaszcza chorób, w których funkcja osteoklastów jest nienormalna lub niepożądana. Jak pokazano w Przykładzie 6 poniżej, związki według wynalazku hamują funkcję osteoklastów in vitro. Odpowiednio, zastosowanie takich związków i innych selektywnych inhibitorów ΡΙ3Κδ może być cenne przy leczeniu osteoporozy, choroby Pageta, i pokrewnych zaburzeń resorpcji kości.

Związki będące inhibitorami PI3^ można stosować do hamowania wzrostu lub proliferacji komórek raka pochodzenia krwiotwórczego, korzystnie komórek raka pochodzenia limfatycznego, a korzystniej komórek raka związanych z albo pochodzących od limfocytów B lub bezpośrednich prekursorów limfocytów B. Raki nadające się do leczenia przy użyciu sposobu według wynalazku obejmują, bez ograniczania, chłoniaki, np., nowotwory złośliwe tkanek limfatycznych i siateczkowo-śródbłonkowych, takie jak chłoniak Burkitta, choroba Hodgkina, chłoniaki nieziarnicze, chłoniaki limfocytowe itp.; szpiczaki mnogie; jak również białaczki, takie jak białaczki limfocytowe, przewlekłe białaczki szpikowe, itp.

W korzystnym wykonaniu, związki będące inhibitorami ΡΙ3Κδ można stosować do hamowania lub ograniczania wzrostu lub proliferacji komórek przewlekłej białaczki szpikowej.

Związki według wynalazku mogą być stosowane w sposobie tłumienia funkcji bazofili i/lub komórek tucznych, i przez to umożliwienie leczenia chorób lub zaburzeń, które cechuje nadmierna lub niepożądana aktywność bazofili i/lub komórek tucznych.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku, można stosować związek według wynalazku, który selektywnie hamuje ekspresję lub aktywność 3-kinazy delta fosfatydyloinozytolowej (ΡΙ3Κδ) w bazofilach i/lub komórkach tucznych. Korzystnie, sposób wykorzystuje inhibitor ΡΙ3Κδ w ilości dostatecznej do hamowania stymulowanego uwalniania histaminy przez bazofile i/lub komórki tuczne. Odpowiednio, zastosowanie takich związków i innych selektywnych inhibitorów PI3K5 może być cenne przy leczeniu chorób, które cechuje uwalnianie histaminy, tj., zaburzeń alergicznych, w tym zaburzeń takich jak przewlekła czopująca choroba płuc (COPD), astma, ARDS, rozedma płuc, i zaburzeń pokrewnych.

Kompozycje farmaceutyczne inhibitorów aktywności ΡΙ3Κδ

Związki według wynalazku można podawać jako nierozcieńczoną substancję chemiczną, ale typowo korzystne jest podawanie związku w postaci kompozycji farmaceutycznej lub preparatu. Odpowiednio, przedmiotem niniejszego wynalazku są także kompozycje farmaceutyczne, które obejmują związek chemiczny lub biologiczny („środek”), który jest aktywny, jako modulator aktywności ΡΙ3Κδ i zgodny biologicznie nośnik farmaceutyczny, środek wspomagający, lub podłoże. Kompozycja może obejmować środek jako jedyne ugrupowanie aktywne albo w kombinacji z innymi środkami, takimi jak oligo- lub polinukleotydy, oligo- lub polipeptydy, leki, lub hormony zmieszane z zaróbkami lub innymi farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami. Nośniki i inne składniki mogą być uznawane za farmaceutycznie dopuszczalne, o ile są one zgodne z innymi składnikami preparatu i nieszkodliwe dla ich biorcy.

Techniki przygotowywania i podawania kompozycji farmaceutycznych można znaleźć w Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 18, Mack Publishing Co, Easton, PA, 1990.

PL 213 200 B1

Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku można wytwarzać stosując dowolne konwencjonalne sposoby, np., sposoby mieszania, rozpuszczania, granulowania, drażetkowania, mielenia na mokro i frakcjonowania sedymentacyjnego, emulgowania, kapsułkowania, zamykania, odlewania ze stopu, suszenia rozpyłowego, lub liofilizacji. Jednak, optymalny preparat farmaceutyczny zostanie określony przez specjalistę zależnie od drogi podawania i pożądanego dawkowania. Takie preparaty mogą wpływać na stan fizyczny, stabilność, szybkość uwalniania in vivo, i szybkość usuwania in vivo podanego środka. Zależnie od leczonego stanu, te kompozycje farmaceutyczne można przygotowywać i podawać układowo lub miejscowo.

Przygotowuje się kompozycje farmaceutyczne, które zawierają przydatne farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, i mogą ewentualnie zawierać zaróbki i środki pomocnicze, które ułatwiają przerób związków aktywnych do preparatów, które mogą być stosowane farmaceutycznie. Modalność podawania będzie ogólnie określać natura nośnika. Na przykład, preparaty do podawania pozajelitowego mogą zawierać wodne roztwory związków aktywnych w postaci rozpuszczalnej w wodzie. Nośniki przydatne do podawania pozajelitowego mogą być wybierane spośród soli fizjologicznej, zbuforowanej soli fizjologicznej, dekstrozy, wody, i innych roztworów zgodnych fizjologicznie. Korzystne nośniki do podawania pozajelitowego to fizjologicznie zgodne bufory takie jak roztwór Hanka, roztwór Ringera, lub zbuforowana sól fizjologiczna. Do podawania do tkanek lub komórek, w preparacie stosuje się środki ułatwiające wnikanie odpowiednie do konkretnej przenikanej bariery. Takie środki ułatwiające wnikanie są ogólnie znane w stanie techniki. Jako preparaty zawierające białka, preparat może obejmować materiały stabilizujące, takie jak poliole (np., sacharozę) i/lub środki powierzchniowo czynne (np., niejonowe środki powierzchniowo czynne), itp.

Alternatywnie, preparaty do stosowania pozajelitowego mogą obejmować dyspersje lub zawiesiny związków aktywnych przygotowane jako odpowiednie zawiesiny w oleju do wstrzykiwania. Przydatne rozpuszczalniki lub podłoża lipofilowe obejmują oleje tłuszczowe, takie jak olej sezamowy, i syntetyczne estry kwasów tłuszczowych, takie jak oleinian etylu lub tri glicerydy, lub liposomy. Wodne zawiesiny do wstrzykiwania mogą zawierać substancje, które zwiększają lepkość zawiesiny, takie jak karboksymetyloceluloza sodowa, sorbitol, lub dekstran. Ewentualnie, zawiesina może także zawierać przydatne stabilizatory lub środki, które zwiększają rozpuszczalność związków umożliwiając wytwarzanie wysoce stężonych roztworów. Wodne polimery, które zapewniają rozpuszczanie wrażliwe na pH i/lub podtrzymane uwalnianie środka aktywnego, także mogą być stosowane jako powłoki lub struktury matrycy, np., polimery metakrylowe, takie jak seria EUDRAGIT® dostępna z firmy Rohm America Inc. (Piscataway, NJ). Stosowane także mogą być emulsje, np., dyspersje olej w wodzie i woda w oleju, ewentualnie stabilizowane środkiem emulgującym lub dyspergującym (materiały powierzchniowo czynne; środki powierzchniowo czynne). Zawiesiny mogą zawierać środki zawieszające takie jak etoksylowane alkohole izostearylowe, polioksyetylenosorbitol i estry sorbitanu, celuloza mikrocrystaliczna, meta-wodorotlenek glinu, bentonit, agar-agar, tragakant, i ich mieszaniny.

Liposomy zawierające środek aktywny można także wykorzystywać do podawania pozajelitowego. Liposomy ogólnie pochodzą z fosfolipidów lub innych substancji lipidowych. Kompozycje w postaci liposomów mogą także zawierać inne składniki, takie jak stabilizatory, środki konserwujące, zaróbki, itp. Korzystne lipide obejmują fosfolipide i fosfatydylocholiny (lecytyny), zarówno naturalne jak i syntetyczne. Sposoby tworzenia liposomów są znane w stanie techniki. Patrz, np., Prescott (red.), Methods in Cell Biology, tom XIV, str. 33, Academic Press, New York (1976).

Kompozycje farmaceutyczne zawierające środek w dawkowaniach przydatnych do podawania doustnego mogą być przygotowywane przy użyciu farmaceutycznie dopuszczalnych nośników znanych w stanie techniki.

Preparaty przygotowane do podawania doustnego mogą mieć postać tabletek, pigułek, kapsułek, opłatków, drażetek, pastylek do ssania, cieczy, żelów, syropów, rzadkich zawiesin, eliksirów, zawiesin, lub proszków. Dla ilustracji, preparaty farmaceutyczne do stosowania doustnego można otrzymać przez połączenie związków aktywnych z zaróbką stałą; ewentualnie roztarcie na proszek otrzymanej mieszaniny, i przetworzenie mieszaniny granulek, po dodaniu przydatnych składników pomocniczych, jeśli to pożądane, z wytworzeniem tabletek lub rdzeni drażetek. Preparaty doustne mogą wykorzystywać nośniki ciekłe typu podobnego do opisanych dla stosowania pozajelitowego, np., zbuforowane roztwory wodne, zawiesiny, itp.

Korzystne preparaty doustne obejmują tabletki, drażetki, i kapsułki żelatynowe. Te preparaty mogą zawierać jedną lub więcej zaróbek, który obejmują bez ograniczania:

a) rozcieńczalniki, takie jak cukry, w tym laktoza, glukoza, sacharoza, mannitol, lub sorbitol;

PL 213 200 B1

b) środki wiążące, takie jak glinokrzemian magnezu, skrobia kukurydziana, pszenna, ryżowa, ziemniaczana, itp.;

c) materiały celulozowe, takie jak metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza i karboksymetylocełuloza sodowa, poliwinylopirolidon, gumy, takie jak guma arabska i tragakant, i białka, takie jak żelatyna i kolagen;

d) środki powodujące rozpad lub zwiększające rozpuszczalność takie jak usieciowany poliwinylopirolidon, skrobie, agar, kwas alginowy lub jego sól, taka jak alginian sodu, lub kompozycje musujące;

e) środki poślizgowe, takie jak krzemionka, talk, kwas stearynowy lub jego sól magnezowa lub wapniowa, i glikol polietylenowy;

f) środki zapachowe i słodzące;

g) środki barwiące lub pigmenty, np., dla zidentyfikowania produktu lub dla scharakteryzowania ilości (dawkowania) związku aktywnego; i

h) inne składniki, taki jak środki konserwujące, stabilizatory, środki spęczniające, środki emulgujące, środki ułatwiające rozpuszczanie, sole do regulacji toniczności i bufory.

Kapsułki żelatynowe obejmują dwuczęściowe kapsułki wytworzone z żelatyny, jak również miękkie, uszczelnione kapsułki wytworzone z żelatyny i powłoki takiej jak glicerol lub sorbitol. Dwuczęściowe kapsułki mogą zawierać składnik(i) aktywne zmieszane z wypełniaczami, środkami wiążącymi, środkami poślizgowymi, i/lub stabilizatorami, itp. W kapsułkach miękkich, związki aktywne mogą być rozpuszczone lub zawieszone w przydatnych płynach, takich jak oleje tłuszczowe, parafina ciekła, lub ciekły glikol polietylenowy ze stabilizatorami lub bez.

Rdzenie drażetek mogą być powleczone przydatnymi powłokami takimi jak stężone roztwory cukrów, które mogą także zawierać gumę arabską, talk, poliwinylopirolidon, żel Carbopol, glikol polietylenowy, i/lub ditlenek tytanu, roztwory laków, i przydatne rozpuszczalniki organiczne lub mieszaniny rozpuszczalników.

Kompozycja farmaceutyczna może stanowić sól środka aktywnego. Sole bywają bardziej rozpuszczalne w rozpuszczalnikach wodnych lub innych protonowych niż odpowiednie postacie wolnych kwasów lub zasad. Farmaceutycznie dopuszczalne sole są znane w stanie techniki. Związki, które zawierają ugrupowania kwasowe, mogą tworzyć farmaceutycznie dopuszczalne sole z przydatnymi kationami. Przydatne kationy farmaceutycznie dopuszczalne obejmują, na przykład, kationy metali alkalicznych (np., sodu lub potasu) i ziem alkalicznych (np., wapnia lub magnezu).

Związki o wzorze strukturalnym (I), które zawierają ugrupowania zasadowe, mogą tworzyć farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne kwasów z odpowiednimi kwasami. Na przykład, Berge i in. szczegółowo opisują farmaceutycznie dopuszczalne sole w J. Pharm. Sci., 66: 1 (1977). Sole mogą być wytworzone in situ podczas końcowego wyodrębniania i oczyszczania związków według wynalazku lub oddzielnie przez poddanie funkcji wolnej zasady reakcji z odpowiednim kwasem.

Reprezentatywne sole addycyjne kwasów obejmują, ale bez ograniczania do tego, octan, adypinian, alginian, cytrynian, asparaginian, benzoesan, benzenosulfonian, wodorosiarczan, maślan, kamforan, kamforolosulfonian, diglukonian, glicerofosforan, hemisiarczan, heptanian, heksanian, fumaran, chlorowodorek, bromowodorek, jodowodorek, 2-hydroksyetanosulfonian (izetionian), mleczan, maleinian, metanosulfonian lub siarczan, nikotynian, 2-naftalenosulfonian, szczawian, pamoesan, pektynian, nadsiarczan, 3-fenylopropionian, pikrynian, piwalan, propionian, bursztynian, winian, tiocyjanian, fosforan lub wodorofosforan, glutaminian, wodorowęglan, p-toluenosulfonian, i undekanian.

Przykłady kwasów, które można wykorzystywać otrzymując farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne kwasów, obejmują, bez ograniczania, takie kwasy nieorganiczne jak kwas solny, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, i kwas fosforowy, i takie kwasy organiczne jak kwas szczawiowy, kwas maleinowy, kwas bursztynowy, i kwas cytrynowy.

W świetle powyższego, jakiekolwiek odniesienie do związków według niniejszego wynalazku ma obejmować również ich farmaceutycznie dopuszczalne sole i solwaty, jak również proleki.

Sole addycyjne z zasadami mogą być wytworzone in situ podczas końcowego wyodrębniania i oczyszczania związków według wynalazku lub oddzielnie przez poddanie ugrupowania zawierającego kwas karboksylowy reakcji z odpowiednią zasadą taką jak wodorotlenek, węglan, lub wodorowęglan farmaceutycznie dopuszczalnego kationu metalu, lub z amoniakiem albo organiczną aminą pierwszorzędową, drugorzędową, lub trzeciorzędową. Farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne z zasadami obejmują, ale bez ograniczania do tego, kationy na podstawie metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, takie jak sole litu, sodu, potasu, wapnia, magnezu i glinu itp., oraz nietoksyczne kationy amoniowe czwartorzędowe i aminy, w tym amoniowy, tetrametyloamoniowy, tetraetyloamo28

PL 213 200 B1 niowy, metyloamoniowy, dimetyloamoniowy, trimetyloamoniowy, etyloamoniowy, dietyloamoniowy, trietyloamoniowy, itp.

Inne reprezentatywne aminy organiczne przydatne do tworzenia soli addycyjnych zasad obejmują etylenodiaminę, etanoloaminę, dietanoloaminę, piperydynę, piperazynę, itp.

Grupy zawierające zasadowy azot mogą być czwartorzędowane takimi środkami jak halogenki niższych alkili takie chlorki, bromki i jodki jak metylu, etylu, propylu, i butylu; siarczany dialkilu jak siarczany dimetylu, dietylu, dibutylu, i diamylu; halogenki długołańcuchowych alkili takie jak decylu, laurylu, mirystylu, i stearylu chlorki, bromki, i jodki; halogenki aryloalkili takie jak bromki benzylu i fenetylu; i inne. Dzięki temu otrzymuje się produkty mające zmodyfikowaną rozpuszczalność dyspergowalność.

Kompozycje zawierające związek według wynalazku w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku mogą zostać wytworzone, umieszczone w odpowiednim pojemniku, i oznakowane do leczenia wskazanego stanu. Odpowiednio, rozważa się także wytwór, taki jak pojemnik zawierający postać dawkowania związku według wynalazku i oznakowanie zawierające instrukcję stosowania związku. W zakresie wynalazku rozważa się także zestawy. Na przykład, zestaw może zawierać postać dawkowania kompozycji farmaceutycznej i ulotkę z instrukcją stosowania kompozycji do leczenia stanu medycznego. W każdym z przypadków stany wskazane na etykiecie mogą obejmować leczenie zaburzeń zapalnych, raka, itp.

Sposoby podawania inhibitorów aktywności ΡΙ3Κδ

Kompozycje farmaceutyczne zawierające inhibitor aktywności ΡΙ3Κδ mogą być podawane leczonemu dowolnym konwencjonalnym sposobem, w tym technikami pozajelitowymi i jelitowymi. Modalności podawania pozajelitowego obejmują te, w których kompozycję podaje się drogą inną niż przez przewód pokarmowy, na przykład, jako wstrzyknięcia dożylne, dotętnicze, dootrzewnowe, dordzeniowe, domięśniowe, dostawowe, dooponowe i dokomorowe. Modalności podawania jelitowego obejmują, na przykład, podawanie doustne (w tym podpoliczkowe i podjęzykowe) i doodbytnicze. Modalności podawania przeznabłonkowego obejmują, na przykład, podawanie przez błony śluzowe i podawanie przez skórę. Podawanie przez błony śluzowe obejmuje, na przykład, podawanie jelitowe jak również podawanie do nosa, inhalację, i podawanie głęboko do płuc; podawanie dopochwowe; i podawanie doodbytnicze. Podawanie przez skórę obejmuje pasywne lub aktywne modalności przezskórne, w tym, na przykład, plastry i urządzenia do jontoforezy, jak również podawanie miejscowe past, balsamów, lub maści. Podawanie pozajelitowe można także realizować techniką wysokociśnieniową, np., POWDERJECT®.

Techniki chirurgiczne obejmują implantację kompozycji depot (w zbiornikach), pomp osmotycznych, itp. Korzystną drogą podawania dla leczenia zapalenia może być dostarczanie lokalne lub miejscowe dla zaburzeń zlokalizowanych takich jak zapalenie stawów, albo dostarczanie układowe dla zaburzeń rozproszonych, np., dostarczanie dożylne dla urazu reperfuzyjnego lub dla stanów układowych takich jak posocznica. Dla innych chorób, w tym chorób obejmujących drogi oddechowe, np., przewlekłej czopującej choroby płuc, astmy i rozedmy płuc, podawanie można realizować przez inhalację lub podawanie głęboko do płuc rozpylonych strug, aerozoli, proszków, itp.

Do leczenia chorób nowotworowych, zwłaszcza białaczki i innych raków rozsianych, typowo korzystne jest podawanie pozajelitowe. Pożądane byłyby preparaty związków optymalizujące ich rozmieszczenie biologiczne po podaniu pozajelitowym. Będące inhibitorami ΡΙ3Κδ związki mogą być podawane przez, podczas, lub po podaniu of chemioterapii, radioterapii, i/lub chirurgii.

Ponadto, wskaźnik terapeutyczny związków będących inhibitorami ΡΙ3Κδ można zwiększyć zmodyfikowanie lub przeprowadzenie w pochodne związków do ukierunkowanego dostarczania do komórek rakowych wyrażających marker, który identyfikuje komórki jako takie. Na przykład, związki mogą być połączone z przeciwciałem, które rozpoznaje marker, który jest selektywny lub specyficzny dla komórek raka, tak, że związki doprowadza się do bliskości komórek, żeby wywierały swoje działanie miejscowo, jak opisano poprzednio (patrz na przykład, Pietersz i in., Immunol. Rev., 129: 57 (1992); Trail i in., Science, 261: 212 (1993); i Rowlinson-Busza i in., Curr. Opin. Oncol., 4: 1142 (1992)). Ukierunkowane na nowotwór dostarczanie tych związków zwiększa korzyść terapeutyczną przez, między innymi, minimalizowanie potencjalnych toksyczności nieswoistych, które mogą być skutkiem leczenia radiacyjnego lub chemioterapii. W innym aspekcie, związki będące inhibitorami ΡΙ3Κδ i radioizotopy lub środki chemioterapeutyczne można sprząc z tym samym przeciwciałem przeciwnowotworowym.

Do leczenia zaburzeń resorpcji kości lub zaburzeń powstających za pośrednictwem osteoklastów, inhibitory ΡΙ3Κδ można dostarczać dowolnym przydatnym sposobem.

PL 213 200 B1

Podawanie ogniskowe może być pożądane, takie jak wstrzyknięcie do stawu. W pewnych przypadkach pożądane może być sprzężenie związków z ugrupowaniem, które może kierować związki do kości. Na przykład, inhibitor ΡΙ3Κδ może być sprzężony ze związkami o wysokim powinowactwie do hydroksyapatytu, który stanowi główny składnik kości. Można to realizować, na przykład, przez dostosowanie sposobu sprzęgania tetracyklin opracowanego do ukierunkowanego dostarczania estrogenu do kości (Orme i in., Bioorg. Med. Chem. Lett., 4 (11): 1375-80 (1994)).

Dla skuteczności terapeutycznej przy modulowaniu celów w ośrodkowym układzie nerwowym, środki używane w sposobach według wynalazku powinny łatwo penetrować barierę krew-mózg przy podaniu obwodowym. Jednak związki, które nie mogą penetrować bariery krew-mózg, wciąż mogą być skutecznie podawane drogą dożylną.

Jak zauważono wyżej, charakterystyka samego środka i receptura środka może wpływać na stan fizyczny, stabilność, szybkość uwalniania in vivo, i szybkość usuwania in vivo podanego środka. Takie informacje farmakokinetyczne i farmakodynamiczne można zebrać przez badania przedkliniczne in vitro i in vivo, później potwierdzane u ludzi podczas biegu prób klinicznych. Tak więc, dla dowolnego związku stosowanego w sposobie według wynalazku, dawkę terapeutycznie skuteczną można oszacować wstępnie z oznaczeń biochemicznych i/lub komórkowych. Wtedy dawkowanie może być określone w modelach zwierzęcych dla osiągnięcia w obiegu pożądanego zakresu stężeń, które modulują ekspresję lub aktywność ΡΙ3Κδ. W miarę prowadzenia badań na ludziach, gromadzą sole dalsze informacje dotyczące właściwych poziomów dawkowania i okresu trwania leczenia dla różnych chorób i stanów.

Toksyczność i skuteczność terapeutyczną takich związków można oznaczyć normalnymi procedurami farmaceutycznymi na hodowlach komórkowych lub zwierzętach doświadczalnych, np.. do oznaczania LD50 (dawka śmiertelna dla 50% populacji) i ED50 (dawka terapeutycznie skuteczna u 50% populacji). Proporcja dawek między działaniami toksycznymi i terapeutycznymi to „wskaźnik terapeutyczny”, który typowo wyraża się jako stosunek LD50/ED50. Korzystne są związki, które wykazują duże wskaźniki terapeutyczne, tj., dawka toksyczna jest zasadniczo wyższa niż dawka skuteczna. Dane otrzymane z takich oznaczeń dla hodowli komórkowych i dodatkowych badań na zwierzętach można zastosować przy określaniu zakresu dawkowania do stosowania u ludzi. Dawkowanie takich związków leży korzystnie w zakresie stężeń w krążeniu, które obejmują ED50 przy małej toksyczności lub bez.

Do sposobów opisanych niniejszym można zastosować dowolny skuteczny reżim podawania regulujący czasy i kolejność podawania dawek. Dawki środka korzystnie obejmują farmaceutyczne jednostki dawkowania zawierające ilość skuteczną środka. Stosowane niniejszym określenie „ilość skuteczna” odnosi się do ilości dostatecznej dla modulowania ekspresji lub aktywności ΡΙ3Κδ i/lub uzyskania mierzalnej zmiany parametru fizjologicznego u leczonego przez podawanie jednej lub więcej farmaceutycznych jednostek dawkowania.

Przykładowe poziomy dawkowania dla leczenia człowieka są rzędu od około 0,001 miligrama środka aktywnego na kilogram wagi ciała (mg/kg) do około 100 mg/kg. Typowo, jednostki dawkowania środka aktywnego obejmują od około 0,01 mg do około 10000 mg, korzystnie od około 0,1 mg do około 1000 mg, zależnie od wskazania, drogi podawania, itp. Zależnie od drogi podawania, odpowiednią dawkę można obliczyć stosownie do wagi ciała, pola powierzchni ciała lub wielkości narządu. Końcowy reżim dawkowania zostanie określony przez lekarza prowadzącego zgodnie z zasadami dobrej praktyki medycznej, przy uwzględnieniu rozmaitych czynników, które modyfikują działanie leków, np., aktywności właściwej środka, tożsamości i ciężkości stanu chorobowego, reaktywności pacjenta, wieku, stanu, wagi ciała, płci, i diety pacjenta, oraz ciężkości jakiegokolwiek zakażenia. Dodatkowe czynniki, które można brać pod uwagę, obejmują czas i częstość podawania, kombinacje leków, reakcje uczuleniowe, i tolerancję/odpowiedź na terapię. Dalsze udoskonalenie dawkowania odpowiedniego do leczenia z użyciem dowolnych preparatów wspomnianych niniejszym prowadzi rutynowo specjalista bez zbędnego eksperymentowania, zwłaszcza w świetle ujawnionych informacji o dawkowaniu i testach, jak również danych farmakokinetycznych zaobserwowanych w próbach klinicznych na ludziach. Właściwe dawkowania można ustalić przez zastosowanie zatwierdzonych testów do oznaczania stężenia środka w płynach ustrojowych lub innych próbkach razem z danymi dawkaodpowiedź.

Częstość dawkowania będzie zależeć od parametrów farmakokinetycznych środka i drogi podawania. Dawkowanie i podawanie dostosowuje się dla uzyskania pożądanych poziomów związku aktywnego lub dla utrzymania pożądanego działania. Odpowiednio, kompozycje farmaceutyczne mogą być podawane w pojedynczej dawce, wielu osobnych dawkach, jako wlew ciągły, lek o podtrzymanym

PL 213 200 B1 uwalnianiu, lub w ich kombinacjach, stosownie do potrzeb dla utrzymania pożądanego najmniejszego poziomu. Krótko działające kompozycje farmaceutyczne (tj., o krótkim okresie półtrwania) mogą być podawane raz dziennie lub więcej niż raz dziennie (np., dwa, trzy, lub cztery razy dziennie). Długo działające kompozycje farmaceutyczne można podawać co 3 do 4 dni, co tydzień, lub raz co dwa tygodnie. Do wlewu ciągłego korzystne mogą być pompy, takie jak pompy podskórne, śródotrzewnowe, lub podtwardówkowe.

Następujące Przykłady są podane w celu dalszego ułatwienia zrozumienia wynalazku, i zakładają rozumienie konwencjonalnych sposobów znanych specjalistom w dziedzinie, do której odnoszą się przykłady, np., konstrukcji wektorów i plazmidów, insercji genów kodujących polipeptydy do takich wektorów i plazmidów, lub wprowadzania wektorów i plazmidów do komórek żywicieli. Takie sposoby są opisane szczegółowo w licznych publikacjach obejmujących, na przykład, Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Ausubel i in. (red.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994); oraz Ausubel i in. (red.), Short Protocols in Molecular Biology, wyd. 4, John Wiley & Sons, Inc. (1999). Poszczególne materiały i warunki opisane poniżej mają podać przykłady poszczególnych aspektów wynalazku i nie powinny być uważane za ograniczenie jego uzasadnionego zakresu.

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie i oczyszczanie rekombinacyjnych ΡΙ3Κ α, β, i δ

Rekombinacyjne heterodimeryczne kompleksy PI3K złożone z podjednostki katalitycznej p110 i podjednostki regulatorowej p85 poddano nadekspresji przy użyciu systemu ekspresyjnego bakulowirusa BACTO-BAC® HT (GIBCO/BRL), a następnie oczyszczono do stosowania w testach biochemicznych. Cztery 3-kinazy PI Klasy I sklonowano do wektorów bakulowirusowych, jak następuje:

p110δ: Znaczoną FLAG® wersję ludzkiej p110δ (nr id. sekw.: 1) (patrz Chantry i in., J. Biol. Chem., 272: 19236-41 (1997)) subklonowano stosując normalne techniki rekombinacyjne DNA do miejsca BamH1Xba1 owadziego wektora ekspresyjnego pFastbac HTb (Life Technologies, Gaithersburg, MD), tak że klon znalazł się we wspólnej ramce odczytu ze znacznikiem His wektora. System FLAG® jest opisany w opisach patentowych USA nr 4703004; 4782137; 4851341; i 5011912, i reagenty są dostępne z firmy Eastman Kodak Co.

p110a: Podobnie do sposobu stosowanego dla p110δ, opisanego wyżej, znaczoną FLAG® wersję p110a (patrz Volinia i in., Genomics, 24 (3): 427-477 (1994)) subklonowano w miejscach BamH1-HindIII pFastbac HTb (Life Technologies), tak że klon znalazł się we wspólnej ramce odczytu ze znacznikiem His wektora.

p110β: Klon ρ110β (patrz Hu i in., Mol. Cell Biol., 13: 7677-88 (1993)) amplifikowano z ludzkiej biblioteki MARATHON® Ready spleen cDNA (Clontech, Palo Alto CA) zgodnie z procedurą wytwórcy przy użyciu następujących starterów:

Starter 5'

5'-GATGAATTCGGCGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGTGCTTCAGTTTCATAATGCCTCC-3' (Nr id. sekw.: 3)

Starter 3'

5'-GATCGCGGCCGCTTAAGATCTGTAGTCTTTCCGAACTGTGTG-3' (Nr id. sekw.: 4)

Starter 5' został zbudowany tak, żeby zawierał znacznik FLAG® we wspólnej ramce odczytu z sekwencją p1103. Po amplifikacji sekwencję FLAG®-p1103 subklonowano przy użyciu normalnych technik rekombinacyjnych do miejsc EcoR1-Not1 pFastbac HTa (Life Technologies), tak że klon znalazł się we wspólnej ramce odczytu ze znacznikiem His wektora.

p110y: p110y cDNA (patrz Stoyanov i in., Science, 269: 690-93 (1995)) amplifikowano z ludzkiej biblioteki Marathon Ready spleen cDNA (Clontech) zgodnie z procedurą wytwórcy przy użyciu następujących starterów:

Starter 5'

5'-AGAATGCGGCCGCATGGAGCTGGAGAACTATAAACAGCCC-3' (Nr id. sekw.: 5)

Starter 3'

5'-CGCGGATCCTTAGGCTGAATGTTTCTCTCCTTGTTTG-3' (Nr id. sekw.: 6)

PL 213 200 B1

Z kolei znacznik FLAG® przyłączono do końca 5' sekwencji p110y i sklonowano do miejsc

BamH1-Spe1 pFastbac HTb (Life Technologies) przy użyciu normalnych technik rekombinacyjnych

DNA, z sekwencją FLAG®-110y we wspólnej ramce odczytu ze znacznikiem His wektora.

p85a: Fragment BamH1-EcoR1 sekwencji p85 cDNA znaczonej FLAG® (patrz Skolnik i in., Cell, 65: 83-89 (1991)) subklonowano do miejsc BamH1-EcoR1 wektora pFastbac dual (Life Technologies).

Rekombinacyjne bakulowirusy zawierające powyższe klony wytworzono przy użyciu procedury zalecanej przez wytwórcę (Life Technologies). Bakulowirusy wyrażające znakowaną His-podjednostkę katalityczną p110a, p110p, lub p110δ oraz podjednostkę p85 współinfekowano do komórek owadzich Sf21. W celu wzbogacenia kompleksu enzymu heterodimerycznego, zainfekowano nadmiarową ilość bakulowirusa wyrażającego podjednostkę p85, i znakowaną His podjednostkę katalityczną p110 skompleksowaną z p85 oczyszczono na kolumnie, korzystając z powinowactwa do niklu. Ponieważ ρ110γ nie asocjuje z p85, to komórki Sf21 zostały zainfekowane rekombinacyjnymi bakulowirusami wyrażającymi tylko ρ110γ znakowaną His. W podejściu alternatywnym, p101 można sklonować do bakulowirusa, umożliwiając współekspresję z jego korzystnym partnerem wiążącym, p110γ.

Po 72 godzinach od infekcji komórki Sf21 (3 litry) zebrano i zhomogenizowano w buforze hipotonicznym (20 mM HEPES-KOH, pH 7,8, 5 mM KCl, koktajl zupełnego inhibitora proteaz (Roche Biochemicals, Indianapolis, IN), przy użyciu homogenizatora Bounce.

Homogenizaty wirowano przy 1000 x g przez 15 min. Supernatanty dalej wirowano przy 10000 x g przez 20 min, a następnie ultrawirowano przy 100000 x g przez 60 min. Frakcję rozpuszczalną naniesiono bezpośrednio na 10 mL kolumnę HITRAP® wykorzystującą powinowactwo do niklu (Pharmacia, Piscataway, NJ) wyrównowagowaną przy użyciu 50 mL Buforu A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,8, 0,5 M NaCl, 10 mM imidazole). Kolumnę przemyto dużą ilością Buforu A i eluowano liniowym gradientem 10-500 mM imidazolu. Wolną podjednostkę p85 usunięto z kolumny podczas etapu przemywania i sam kompleks enzymu heterodimerycznego eluowano przy 250 mM imidazolu. Porcje frakcji niklowych analizowano metodą elektroforezy na żelu poliakryloamidowym przy użyciu 10% SDS (SDSPAGE), zabarwionym SYPRO® Red (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), i mierzono ilościowo przy użyciu STORM® FosfoImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Frakcje aktywne i wprost umieszczono na kolumnie heparynowej 5 mL Hitrap wyrównowagowanej przy użyciu Buforu B zawierającego 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl, 2 mM ditiotreitolu (DTT). Kolumnę przemyto 50 mL Buforu B i eluowano liniowym gradientem 0,05-2 M NaCl. Pojedynczy pik zawierający kompleks enzymu PI3K eluowano przy 0,8 M NaCl. Analiza SDS-PAGE wykazała, że oczyszczone frakcje enzymu PI3K zawierały kompleks stechiometryczny 1:1 podjednostek p110 i p85. Profil białkowy kompleksu enzymu podczas heparynowej chromatografii odpowiadał profilowi aktywności kinazy lipidowej. Frakcje aktywne połączono i zamrożono w ciekłym azocie.

P r z y k ł a d 2

Badanie przesiewowe ΡΙ3Κδ o wysokiej przepustowości (HTS) i oznaczenie selektywności

Badanie przesiewowe o wysokiej przepustowości biblioteki zastrzeżonych związków chemicznych przeprowadzono dla zidentyfikowania kandydujących inhibitorów aktywności ΡΙ3Κδ. ΡΙ3Κδ kata32 lizuje przeniesienie fosforu z γ-[ P]ΑΤΡ na PIP₂/PS liposomów w pozycji D3' pierścienia inozytolu lipidowego PIP2. Ta reakcja jest zależna od MgCl2 i zatrzymywana buforem pH 8,0 z fosforanem potasu o wysokiej molarności zawierającym 30 mM EDTA. W badaniu przesiewowym tę reakcję przeprowadza się w obecności lub pod nieobecność związków z biblioteki. Produkty reakcji (i wszystkie produkty nie znaczone) przenosi się do wstępnie zwilżonej płytki filtracyjnej PVDF o 96 studzienkach, sączy i przemywa fosforanem potasu o wysokiej molarności. Środek scyntylacyjny dodaje się do osuszonych studzienek i mierzy ilościowo zawartą radioaktywność.

Większość operacji oznaczania przeprowadzono przy użyciu zrobotyzowanych stacji roboczych BIOMEK® 1000 (Beckman), a wszystkie płytki mierzono przy użyciu procedur licznika Wallac do pomiarów scyntylacji cieczy na płytkach.

Sporządzono roztwory podstawowe 3X do oznaczania substratu i enzymu, i przechowywano w rynience (do oznaczeń przy pomocy robota) lub płytce polipropylenowej o 96 studzienkach mających dno w kształcie V (do oznaczeń ręcznych). Reagenty były trwałe przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej.

Substrat 3X do HTS zawierał 0,6 mM Na2ATP, 0,10 mCi/mL γ-[³²P]ATP (NEN, Pittsburgh, PA), 6 μΜ PIP2/PS liposomów (Avanti Polar Lipids, Inc., Atlanta, GA), w 20 mM HEPES, pH 7,4.

PL 213 200 B1

Roztwór podstawowy enzymu 3X do HTS zawierał 1,8 nM ΡΙ3Κδ, 150 μg/mL, końskiej IgG (stosowanej tylko jako stabilizator), 15 mM MgCl2, 3 mM DTT in 20 mM HEPES, pH 7,4.

Próbki do badania przesiewowego o wysokiej przepustowości (HTS) z bibliotek związków chemicznych (z których każda zawierała zlane razem 22 związki) w dimetylosulfotlenku (DMSO) rozcieńczono do 18,75 μΜ lub 37,8 μΜ wodą dwukrotnie destylowaną, i 20 μΐ rozcieńczenia umieszczano w studzienkach płytki polipropylenowej do oznaczeń o 96 studzienkach. Negatywną próbkę kontrolną bez inhibitora (lub pozytywną próbkę kontrolną z enzymem) stanowił DMSO rozcieńczony w wodzie, a pozytywne próbki kontrolne z inhibitorem wykorzystywały stężenia LY294002 dostateczne do uzyskania 50% i 100% hamowania.

Do 20 μΐ zlanych razem rozcieńczeń związków chemicznych z biblioteki dodano 20 μL substratu 3X. Reakcję zainicjowano przy użyciu 20 μL enzymu 3X i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. To rozcieńczenie zapewniało w objętości reakcji stężenie końcowe 200 μΜ ATP. Reakcję zatrzymano przy pomocy 150 μL buforu zatrzymującego (1,0 M fosforan potasu pH 8,0, 30 mM EDTA). Następnie porcję roztworu po zatrzymaniu reakcji (180 UL) przenoszono na płytkę filtracyjną PVDF (Millipore #MAIP NOB wstępnie zwilżoną przez przemywanie kolejno 200 μΐ 100% metanolem, wodą, a na koniec buforem do przemywania 1,0 M fosforanu potasu pH 8,0).

Płytkę filtracyjną PVDF odessano pod umiarkowanie zmniejszonym ciśnieniem (2-5 mm Hg), przemyto 5 x 200 μL buforu do przemywania, a następnie osuszono przez odessanie.

Z kolei sączek odciśnięto, zostawiono do zupełnego wysuszenia na powietrzu, i wstawiono do kasety zliczającej Wallac, dodając 50 μL koktajlu scyntylacyjnego Ecoscint dodano na studzienkę. Zawartą radioaktywność zmierzono ilościowo i dane analizowano po znormalizowaniu do pozytywnej próbki kontrolnej z enzymem (przyjętej za 100%) dla zidentyfikowania przecięcia krzywej przy wartości hamowania 50% dla oszacowania wartości IC50 dla inhibitorów.

Łącznie do rozwikłania wyników wybrano 57 studzienek ze zlanymi związkami, na podstawie połączonych kryteriów <42% resztkowej aktywności przy testowanym stężeniu, oraz całkowitej dopuszczalnej częstości zliczeń wynoszącej nie więcej niż 0,2%. Przy 22 związkach na studzienkę przez to rozwikłanie zidentyfikowano łącznie 1254 związki i oznaczano osobno, przy stężeniu 1X wynoszącym 27,7 μΜ dla ustalenia, który ze związków wykazywał pożądaną aktywność. Na podstawie tych oznaczeń wybrano 73 związki i oznaczano dalej uzyskania krzywych IC50. Na podstawie wyników krzywych IC50, 34 związki wybrano do oznaczeń selektywności wobec PI3Ka i ΡΙ3Κβ (patrz procedura oznaczania w Przykładzie 11).

Na podstawie oznaczeń selektywności jako względnie silny i selektywny wybrano jeden związek, 3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (Związek D-000). Przeszukiwanie katalogów i oznaczenia selektywności wielu analogicznych związków potencjalnych i/lub selektywnych dało tylko jeden związek, który był zarówno aktywnym jak i selektywnym analogiem D-000. Ten związek został zakupiony w firmie Contract Services Corporation (nr kat. 7232154) i różnił się od D-000 podstawieniem grupy fenylowej zamiast grupy 2-chlorofenylowej w D-000.

Jak opisano wyżej, inhibitor 3-kinazy PI LY294002 (Calbiochem, La Jolla, CA) nie wykazuje znaczącej selektywności między różnymi testowanymi izoformami 3-kinazy PI. W warunkach oznaczania LY294002 hamował wszystkie trzy izoformy 3-kinaz PI przy IC50 wynoszącym 0,3 do 1 μΜ. Jednak, gdy wobec tych samych izoform 3-kinazy PI testowano związek D-000, to zaobserwowano wyraźną selektywność. Szczegółowo, jak pokazano na Figurze 1, D-000 hamował aktywność izoformy δ PI3K przy IC50 wynoszącym w przybliżeniu 0,3 μΜ, podczas gdy w podobnych warunkach nie hamował aktywności izoform a i β przy limicie 100 μΜ związku. Te wyniki pokazują, że D-000 selektywnie hamuje aktywność ΡΙ3Κδ.

PL 213 200 B1

P r z y k ł a d y 3-7

Skoro ΡΙ3Κδ jest wyrażany w znaczących ilościach tylko w leukocytach, to ważne jest zbadanie wpływu inhibitora selektywnego wobec ΡΙ3Κδ na funkcje leukocytów. Odpowiednio, sprawdzono wpływ hamowania ΡΙ3Κδ w kilku typach leukocytów. Neutrofile sprawdzano dla ustalenia skutków, które mogłoby wywołać selektywne hamowanie ΡΙ3Κδ (Przykład 3, poniżej). Nieoczekiwanie stwierdzono, że selektywne hamowanie aktywności PI3K<> wydaje się być w znacznym stopniu związane z hamowaniem niektórych, lecz nie wszystkich funkcji charakterystycznych dla aktywowanych neutrofili. Ponadto, testowano także wpływ hamowania ΡΙ3Κδ na działanie limfocytów B i limfocytów T (Przykłady 4-5, poniżej). Ponadto, skoro ΡΙ3Κδ jest wyrażana także w osteoklastach, to badano wpływ hamowania ΡΙ3Κδ na funkcję tych wyspecjalizowanych komórek (Przykład 6, poniżej).

P r z y k ł a d 3

Scharakteryzowanie roli ΡΙ3Κδ w funkcji neutrofili

Testowano wpływy inhibitora ΡΙ3Κδ według wynalazku, tj., D-000, na funkcje neutrofili takie jak wytwarzanie ponadtlenku, egzocytoza elastazy, chemotaksja, i zabijanie bakterii.

A. Wytwarzanie neutrofili z krwi ludzkiej

Porcje (8 mL) krwi heparynizowej od zdrowych ochotników umieszczano warstwami na wkładkach 3 mL 7,3% FICOLL® (Sigma, St. Louis, MO) i 15,4% HYPAQUE® (Sigma) i wirowano przy 900 obr/min przez 30 min w temperaturze pokojowej na wirówce stołowej (Beckman). Zbierano pasmo obfitujące w neutrofile tuż nad wkładką FICOLL®-HYPAQUE® i przemywano zbilansowanym roztworem soli Hanka (HBSS) zawierającym 0,1% żelatyny. Resztkowe erytrocyty usuwano metodą Iizy hipotonicznej przy użyciu 0,2% NaCl. Preparat neutrofili przemywano dwukrotnie przy użyciu HBSS zawierającego 0,1% żelatyny i stosowano niezwłocznie.

B. Pomiar wytwarzania ponadtlenku przez neutrofile

Wytwarzanie ponadtlenku to jedna z cech charakterystycznych aktywacji neutrofili. Rozmaite aktywatory wzmagają wytwarzanie ponadtlenku przez neutrofile. Mierzono wpływ D-000, inhibitora ΡΙ3Κδ, na wytwarzanie ponadtlenku przez trzy różne agonisty: TNF1a, IgG, i fMLP, które reprezentują osobne klasy aktywatorów. Ponadtlenek wytwarzany przez neutrofile mierzono kontrolując zmianę absorbancji przy redukcji cytochromu C przez następującą modyfikację sposobu, który opisali Green i in., (str. 14.5.1-14.5.11 w Supp. 12, Curr. Protocols Immunol, (red. Colligan i in.) (1994)).

Poszczególne studzienki płytki o 96 studzienkach powlekano przez noc w temperaturze 4°C 50 μL, 2 mg/mL roztworem ludzkiego fibrynogenu lub IgG. Studzienki przemywano PBS i do każdej studzienki dodano następujące reagenty: 50 μL; HBSS lub dysmutazy ponadtlenkowej (1 mg/mL), 50 μL HBSS lub TNF1 a (50 ng/mL), 50 μΕ cytochromu C (2,7 mg/mL), i 100 μL zawiesiny oczyszczonych neutrofili ludzkich (2 x 10⁶ komórek/mL). Płytkę wirowano przez 2 min przy 200 obr/min i absorbancję przy 550 nm kontrolowano przez 2 h. W celu zmierzenia względnych ilości wytworzonego ponadtlenku, wartości otrzymane ze studzienek zawierających dysmutazę ponadtlenkową zostały odjęte od wszystkich, i znormalizowane do wartości otrzymanych ze studzienek bez żadnego inhibitora.

Jak pokazano na Figurze 2, inhibitor ΡΙ3Κδ, D-000, hamuje indukowane przez TNF wytwarzanie ponadtlenku przez neutrofile w sposób zależny od stężenia. Wytwarzanie ponadtlenku indukowane przez TNF zostało zmniejszone do połowy jego wartości maksymalnej przy około 3 μΜ D-000. Figura 2 pokazuje także, że wytwarzanie ponadtlenku indukowane przez IgG nie było znacząco hamowane przez D-000. W rzeczywistości, nawet przy 10 μΜ ten inhibitor ΡΙ3Κδ nie miał żadnego wpływu na wytwarzanie ponadtlenku indukowane przez IgG.

Następnie badano wpływ D-000 na wytwarzanie ponadtlenku indukowane przez inny silny induktor, peptyd bakteryjny, formylowany-Met-Leu-Phe (fMLP). Podobnie jak wytwarzanie ponadtlenku indukowane przez TNF, wytwarzanie ponadtlenku indukowane przez fMLP także było hamowane przez D-000 (Figura 3). Te wyniki pokazują, że inhibitor ΡΙ3Κδ D-000 może zapobiegać specyficznej względem bodźca indukcji wytwarzania ponadtlenku przez neutrofile, co dowodzi, że ΡΙ3Κδ jest zaangażowany w tym procesie.

C. Pomiar egzocytozy elastazy z neutrofili

Oprócz wytwarzania ponadtlenku, aktywowane neutrofile odpowiadają także przez uwalnianie kilku proteaz, które są odpowiedzialne za niszczenie tkanek i chrząstki podczas zapalenia. Jako wskaźnik uwalniania proteazy, mierzono wpływ D-000 na egzocytozę elastazy. Egzocytozę elastazy mierzono ilościowo jak następuje przez modyfikację procedury, którą opisali Ossanna i in. (J. Clin. Invest., 77: 1939-1951 (1986)). Oczyszczone neutrofile ludzkie (0,2 x 10⁶) (potraktowane albo DMSO albo kolejnymi rozcieńczeniami D-000 w DMSO) stymulowano przy użyciu fMLP w PBS zawierającej

PL 213 200 B1

0,01 mg/mL cytochalazyny B, 1,0 μΜ azydku sodu (NaN₃), 5 μg/mL L-metioniny i 1 μΜ fMLP przez 90 min w temperaturze 37°C na płytce o 96 studzienkach. Na koniec okresu inkubacji, płytkę wirowano przez 5 min przy 1000 obr/min, i 90 μL supernatantu przeniesiono do 10 μL 10 mM roztworu peptydu substratu elastazy, MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA, gdzie MeO-Suc = grupa metoksysukcynylowa; pNA = p-nitroanilid (Calbiochem, San Diego, CA). Absorbancję przy 410 nm kontrolowano przez 2 h czytnikiem płytek o 96 studzienkach. Do mierzenia względnych ilości egzocytowanej egzocytozy, wszystkie wartości absorbancji znormalizowano do wartości bez żadnego inhibitora. Jak pokazano na Figurze 4, inhibitor ΡΙ3Κ5 D-000 znacząco hamuje indukowaną przez fMLP egzocytozę elastazy, i robi to w sposób zależny od dawki. Hamowanie wynosiło połowę maksymalnego przy stężeniu wynoszącym około 2-3 μΜ D-000.

D. Pomiar indukowanej przez fMLP migracji neutrofili ludzkich

Neutrofile mają wrodzoną zdolność do migrowania przez tkanki i są jednym z pierwszych typów komórek przybywających na miejsce zapalenia lub urazu tkanek. Mierzono wpływ D-000 na migrację neutrofili w stronę gradientu stężenia fMLP. Na dzień przed przeprowadzeniem oznaczeń migracji, płytki o 6 studzienkach powleczono rekombinacyjnym białkiem fuzyjnym ICAM-1/Fc (Van der Vieren i in., Immunity, 3: 683-690 (1995)) (25 μg/mL w buforze wodorowęglanowym, pH 9,3) i pozostawiono przez noc w temperaturze 4°C. Po przemyciu 1% roztworem agarozy w RPMI-1640 z 0,5% albuminy surowicy wołowej (BSA), dodano do studzienek z inhibitorem lub bez, i płytki umieszczono w lodówce przed przebiciem otworów w zżelowanej agarozie dla wytworzenia łysinek (1 otwór centralny otoczony przez 6 obwodowych na studzienkę).

Neutrofile ludzkie otrzymano jak opisano wyżej, i ponownie zawieszono w pożywce RPMI uzupełnionej 0,5% BSA w ilości 5 x 10⁶ komórek/ml. Po połączeniu równych objętości zawiesiny neutrofili i pożywki (albo z DMSO albo z szeregowym rozcieńczeniem związku testowego w DMSO), neutrofile wprowadzono porcjami do otworów obwodowych, zaś do otworu centralnego fMLP (5 μΜ). Płytki inkubowano w temperaturze 37°C w obecności 5% CO2 przez 4 h, a następnie zakończono migrację przez dodanie 1% roztworu glutaraldehydu w D-PBS. Po usunięciu warstwy agarozy studzienki przemyto wodą destylowaną i osuszono.

Analizę migracji przeprowadzano na stacji roboczej z wideomikroskopem inwersyjnym Nikon DIAPHOT® (1x obiektyw) przy użyciu programu NIH 1.61. Stosując programy Microsoft Excel i Table Curve 4 (SSPS Inc., Chicago IL) wyznaczono wskaźnik migracji dla wszystkich badanych warunków. Wskaźnik migracji zdefiniowano, jako pole pod krzywą przedstawiającą liczbę migrujących neutrofili w odniesieniu do wypadkowego dystansu migracji na komórkę.

Jak pokazano na Figurze 5, inhibitor ΡΙ3Κ5 D-000 miał głęboki wpływ na migrację neutrofili, hamując tę aktywność w sposób zależny od dawki. EC50 tego związku dla hamowania migracji neutrofili w tym oznaczeniu wynosi około 1 μΜ. Na podstawie oględzin zarejestrowanych ścieżek komórek w tym oznaczeniu wydaje się, że całkowita długość ścieżki dla neutrofili nie została znacznie zmieniona przez związek testowy. Związek wpływał raczej na orientację neutrofili lub zmysł orientacji, tak że zamiast migrowania wzdłuż osi gradientu chemoatraktantu komórki migrowały w sposób nie ukierunkowany bądź mniej ukierunkowany.

E. Pomiar zdolności neutrofili do zabijania bakterii

Przyjmując, że inhibitor ΡΙ3Κ5 D-000 wpływa na pewne funkcje neutrofili podane szczegółowo wyżej, interesujące było sprawdzenie, czy związek wpływa na zabijanie bakterii za pośrednictwem neutrofili. Wpływ D-000 na zabijanie Staphylococcus aureus za pośrednictwem neutrofili badano zgodnie ze sposobem, który opisali Clark i Nauseef (str. 7.23.4-7.23.6 w tomie 2, Supp. 6, Curr. Protocols Immunol. (red. Colligan i in.) (1994)). Oczyszczone neutrofile ludzkie (5 x 10⁶ komórek/mL) (potraktowane albo DMSO albo seryjnym rozcieńczeniem D-000 w DMSO) zmieszano z surowicą autologiczną. Wyrosłe przez noc komórki S. aureus przemyto, ponownie zawieszono w HBSS, i dodano do opsonizowanych surowicą neutrofili w proporcji 10:1. Dopuszczono do internalizowania bakterii przez neutrofile na drodze fagocytozy przez inkubację w temperaturze 37°C przez 20 min. Bakterie nie internalizowane zabito stosując 10 jednostek/mL lizostafiny w temperaturze 37°C przez 5 min i całą mieszaninę obracano w temperaturze 37°C. Próbki pobierano w rozmaitych momentach w ciągu do 90 min i neutrofile poddano lizie przez rozcieńczenie w wodzie. Bakterie zdolne do życia zliczono umieszczając właściwe rozcieńczenia na płytce z agarem tryptykazowo-sojowym i licząc kolonie

S. aureus po wzroście przez noc.

Jak pokazano na Figurze 6, zabijanie S. aureus za pośrednictwem neutrofili było podobne w próbkach potraktowanych DMSO (kontrolnych) oraz D-000. Te wyniki wskazują, że inhibitor ΡΙ3Κ5

PL 213 200 B1 nie wpływa znacznie na zdolność neutrofili do zabijania S. aureus, co sugeruje, że ΡΙ3Κδ nie jest zaangażowany w tym szlaku funkcji neutrofili.

P r z y k ł a d 4

Scharakteryzowanie roli ΡΙ3Κδ w funkcji limfocytów B

Zbadano także wpływ inhibitora 3-kinazy PI na funkcje limfocytów B obejmujące klasyczne wskaźniki, takie jak wytwarzanie przeciwciał i specyficzna proliferacja stymulowana.

A. Wytwarzanie i stymulacja limfocytów B z obwodowej krwi ludzkiej

Krew heparynizowaną (200 mL) od zdrowych ochotników zmieszano z równą objętością D-PBS, umieszczono w warstwie na 10 x 10 mL FICOLL-PAQUE® (Pharmacia), i wirowano przy 1600 obr/min przez 30 min w temperaturze pokojowej. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) zebrane z powierzchni granicznej FICOLL®/surowica naniesiono na 10 mL płodowej surowicy cielęcej (FBS) i wirowano przy 800 obr/min przez 10 min w celu usunięcia płytek krwi. Po przemyciu komórki inkubowano z DYNAL® Antibody Mix (zestaw limfocytów B) (Dynal Corp., Lake Success, NY) przez 20 min w temperaturze 4-8°C. Po usunięciu niezwiązanego przeciwciała PBL zmieszano z perełkami magnetycznymi powleczonymi anty-mysią IgG (Dynal) łagodnie wytrząsając przez 20 min w temperaturze 4-8°C, a następnie usunięto znaczone limfocyty inne niż B na separatorze perełek magnetycznych. Tę procedurę powtórzono jeszcze raz. Limfocyty B ponownie zawieszono w RPMI-1640 z 10% FBS, i przechowywano na lodzie aż do dalszego użycia.

B. Pomiar wytwarzania przeciwciał przez ludzkie limfocyty B

W celu zbadania wytwarzania przeciwciał limfocyty B naniesiono porcjami po 50-75 x10⁶ komórek/studzienkę na płytkę o 96 studzienkach z inhibitorem lub bez, do czego dodano IL-2 (100 U/mL) i komórki PANSORBIN® (Calbiochem) Staphylococcus aureus (1:90000). Część pożywek usunięto po 24-36 h i dodano świeże pożywki (z inhibitorem lub bez) i IL-2. Hodowle inkubowano w temperaturze 37°C, w obecności CO₂ w inkubatorze przez dodatkowe 7 dni. Pobrano próbki z każdych warunków (trzykrotne oznaczenia), i analizowano zawartość IgG i IgM, oznaczaną testem ELISA. W skrócie, 4 płytki IMMULON® o 96 studzienkach powleczono (50 μL/studzienkę) albo 150 ng/mL oślej antyludzkiej IgG (H+L) (Jackson Immuno Research West Grove, PA), lub 2 μg/mL oślej antyludzkiej IgG+IgM (H+L) (Jackson ImmunoResearch) w buforze wodorowęglanowym, i zostawiono przez noc w temperaturze 4°C. Po przemyciu 3x solanką zbuforowaną fosforanem zawierającą 0,1% TWEEN®-80 (PBST) (350 μL/studzienkę), i zablokowaniu przy użyciu 3% surowicy koziej w PBST (100 μL/studzienkę) przez 1h w temperaturze pokojowej, próbki (100 μL/studzienkę) wyczerpanych przez limfocyty B pożywek rozcieńczono w dodanej PBST.

Zakres rozcieńczeń wynosił 1:500 do 1:10000 dla płytek IgG, i 1:50 do 1:1000 dla IgM. Po 1 h, płytki wystawiono na działanie sprzężonej z biotyną antyludzkiej IgG (100 ng/mL) lub antyludzkiej IgM (200 ng/mL) (Jackson ImmunoResearch) przez 30 min, a następnie streptawidyny-HRP (1:20000) przez 30 min, i na koniec, na roztwór TMB (1:100) z H2O2 (1:10000) przez 5 min, przy przemywaniu PBST 3 x między etapami. Wywoływanie koloru zatrzymano roztworem H2SO4, i płytki zmierzono na czytniku do płytek ELISA.

Jak pokazano na Figurze 7, D-000 znacznie hamował wytwarzanie przeciwciał. Wytwarzanie IgM było bardziej zmienione niż wytwarzanie IgG: połowę maksymalnego hamowania wytwarzania IgM zaobserwowano przy około 1 μΜ, wobec około 7 μΜ dla porównywalnego hamowania wytwarzania IgG.

C. Pomiar proliferacji limfocytów B w odniesieniu na stymulację IgM powierzchni komórki

W powyższym doświadczeniu, limfocyty B stymulowano przy użyciu PANSORBIN®. Mierzono także wpływ D-000 na odpowiedź proliferacji limfocytów B, gdy stymulowano je przez ich powierzchnię komórki IgM przy użyciu przeciwciała anty-IgM. Mysie limfocyty śledziony (Balb/c) umieszczono na ₅ płytkach mikrotitracyjnych o 96 studzienkach przy 2 x 10⁵ komórek na studzienkę w 10% FBS/RPMI. Właściwe rozcieńczenia testowanego inhibitor w pożywce zupełnej dodano do komórek i przed dodaniem bodźca płytki inkubowano przez 30-60 minut. Po wstępnej inkubacji z inhibitorem testowym do studzienek dodano preparat F(ab')2 przeciwciała koziego specyficznego dla łańcucha μ mysiej IgM przy stężeniu końcowym 25 μg/mL. Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 3 dni i na ostatnie ₃ cztery godziny hodowli do każdej studzienki dodano 1 uCi [ H]-tymidyny. Płytki zebrane na włóknach filtracyjnych przemyto i oznaczano włączenie znakowania radioaktywnego przy użyciu licznika beta (Matrix 96, Packard Instrument Co., Downers Grove, IL) i wyrażano, jako zliczenia na minutę (CPM).

Figura 8 pokazuje wpływ D-000 na stymulowaną przez anty-IgM proliferację limfocytów B. Związek hamował stymulowaną przez anty-IgM proliferację limfocytów B w sposób zależny od dawki. Przy około 1 μΜ proliferacja została zmniejszona do połowy jej wartości maksymalnej.

PL 213 200 B1

Ponieważ związek D-000 hamuje proliferację limfocytów B, to przewiduje się, że ten związek i inne inhibitory ΡΙ3Κδ można stosować do tłumienia niepożądanej proliferacji limfocytów B w otoczeniu klinicznym. Na przykład, w złośliwości limfocytów B, limfocyty B na różnych etapach różnicowania wykazują niekontrolowaną proliferację. Na podstawie pokazanych wyżej wyników można wnioskować, że selektywne inhibitory ΡΙ3Κδ mogą być stosowane do regulowania, ograniczania, lub hamowania wzrostu takich komórek.

P r z y k ł a d 5

Scharakteryzowanie roli PI3K<> w funkcji limfocytów T

Mierzono proliferację limfocytów T w odpowiedzi na współstymulację CD3+CD28. Limfocyty T oczyszczono ze zdrowej krwi ludzkiej metodą selekcji negatywnej przy użyciu powleczonych przeciwciałem perełek magnetycznych zgodnie z procedurą wytwórcy (Dynal) i ponownie zawieszono w RPMI. Komórki potraktowano albo DMSO lub seryjnym rozcieńczeniem D-000 w DMSO i naniesio₅ no przy 1 x 10⁵ komórek/studzienkę na płytkę o 96 studzienkach powleczonych kozią antymysią IgG. Następnie mysie przeciwciała monoklonalne anty-CD3 i anty-CD28 dodano do każdej studzienki odpowiednio przy 0,2 ng/mL i 0,2 μg/mL. Płytkę inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 h i dodano [³H]-tymidynę (1 μCi/studzienkę). Po kolejnych 18 h inkubacji komórki zebrano automatycznym urządzeniem do zbierania komórek, przemyto i zmierzono ilościowo zawartą radioaktywność.

Chociaż inhibitor PI3K<> D-000 hamował indukowaną przez anty-CD3 i anty-CD28 proliferację limfocytów T, to jego wpływ nie jest tak silny jak jego wpływ na limfocyty B lub na niektóre z funkcji neutrofili. Połowy maksymalnego hamowania włączania tymidyny nie osiągnięto przy najwyższym testowanym stężeniu, tj., 10 μM D-000.

P r z y k ł a d 6

Scharakteryzowanie roli PI3K<> w funkcji osteoklastów

W celu przeanalizowania wpływu inhibitora PI3K<s D-000 na osteoklasty wydzielono komórki mysiego szpiku kostnego i zróżnicowano je do osteoklastów poddając komórki działaniu czynnika -1 -1 -1 stymulującego kolonie makrofagów^-1 (mCSF^-1, ang. Macrophage Colony Stimulating Factor^-1) i ligandu osteoprotegeryny (OPGL) w pożywce zawierającej surowicę (aMEM z 10% inaktywowanej cieplnie

FBS; Sigma) przez 3 dni. Na czwarty dzień, gdy rozwinęły się osteoklasty, pożywkę usunięto i komórki ₅ zebrano. Osteoklasty naniesiono na skrawki zębiny przy 10⁵ komórek/studzienkę w pożywce wzrostowej, tj., aMEM zawierającej 1% surowicy i 2% BSA przy 55 μg/mL OPGL i 10 ng/mL mCSF^- . Po 3 h pożywkę zmieniono na 1% surowicy i 1% BSA, z osteopontyną lub bez (25 μg/mL) i inhibitorami PI3K (100 nM). Pożywkę zmieniano co 24 godziny ze świeżą osteopontyną i inhibitorami. Po 72 h pożywkę usunięto, i powierzchnie zębiny przemyto wodą dla usunięcia resztek komórek i zabarwiono kwaśną hematoksyliną. Nadmiar barwnika odmyto i mierzono ilościowo głębokości dołków przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Jak pokazano w Tabeli 1, w dwóch doświadczeniach inhibitory 3-kinazy PI miały wpływ hamujący na funkcję osteoklastów. Oba inhibitory niespecyficzne LY294002 i wortmannina hamowały aktywność osteoklastów. Jednak inhibitor PI3K<> D-000 miał najgłębszy wpływ, jako że przy 100 nM ten związek niemal zupełnie hamował aktywność osteoklastów.

T a b e l a 1

Osteopontyna (OPN)	D-000 + OPN	LY294002 + OPN	Wortmannina + OPN
10 ± 0,5	1	4,6 ± 0,22	5,7 ± 0,6
9 ± 0,4	1	5,8 ± 0,5	5 ± 0,5

P r z y k ł a d 7

Scharakteryzowanie roli PI3K<> w funkcji bazofili

Oszacowanie wpływu związku według wynalazku na funkcję bazofili testowano przy użyciu konwencjonalnego oznaczenia uwalniania histaminy, ogólnie zgodnie ze sposobem, który opisali Miura i in., J. Immunol., 162: 4198-206 (1999). Krótko mówiąc, wzbogacone bazofile wstępnie inkubowano ze związkami testowymi w kilku stężeniach od 0,1 nM do 1000 nM, przez 10 min w temperaturze 37°C. Następnie dodano poliklonalną kozią anty-ludzką IgE (0,1 μg/mL) lub fMLP, i zostawiono do inkubowania przez dodatkowe 30 min. Histaminę uwolnioną do supernatantu mierzono przy użyciu zautomatyzowanej techniki fluorometrycznej. Testowano dwa pokazane poniżej związki.

PL 213 200 B1

Zależny od dawki spadek uwalniania histaminy zaobserwowano dla 3-(2-chlorofenylo)-5-metylo2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-onu (D-026), gdy bazofile stymulowano anty-IgE. To tłumienie uwalniania histaminy wynosiło zasadniczo 100% przy 1000 nM, przy EC50 wynoszącym około 25 nM. Inny związek, 3-(2-chlorofenylo)-2-(1H-pirazolo[3,4-d]-pirymidyn-4-ylosulfanylometylo)3H-chinazolin-4-on (D-999), w którym struktura pierścienia purynowego jest przegrupowana, był mniej skuteczny przy hamowaniu uwalniania histaminy. Żaden związek nie wywoływał żadnego wpływu, gdy bazofile stymulowano przy użyciu fMLP. Dla porównania, nieselektywny inhibitor PI3K LY294002 testowano przy 0,1 nM i 10000 nM, przy czym wykazywał bliskie 100% hamowanie uwalniania histaminy przy najwyższym stężeniu.

Te dane wskazują, że inhibitory aktywności 3-kinazy PI delta można zastosować do tłumienia uwalniania histaminy, która stanowi jeden z mediatorów alergii. Skoro aktywność rozmaitych 3-kinaz PI jest wymagana dla przenoszenia, wydzielania i egzocytozy białek w wielu typach komórek, to powyższe dane sugerują, że uwalnianie histaminy przez inne komórki, takie jak komórki tuczne, także może zostać przerwane przez selektywne inhibitory 3-kinazy delta PI.

Przykłady syntez chemicznych

Konkretne, nie ograniczające przykłady związków według wynalazku są podane poniżej. W stanie techniki zrozumiałe jest, że gdzie to konieczne, można wykorzystywać grupy zabezpieczające zgodnie z ogólnymi zasadami chemii syntetycznej. Te grupy zabezpieczające usuwa się w końcowych etapach syntezy w warunkach zasadowych, kwasowych, lub hydrogenolitycznych łatwo dostrzeganych przez specjalistów. Przez wykorzystanie odpowiedniej manipulacji i zabezpieczania dowolnych funkcji chemicznych można realizować syntezę nie przedstawionych szczegółowo w niniejszym opisie związków o wzorze strukturalnym (I) sposobami analogicznymi do schematów przedstawionych poniżej.

O ile nie stwierdzono inaczej, to wszystkie materiały wyjściowe otrzymano od dostawców komercyjnych i stosowano bez dalszego oczyszczania. Wszystkie reakcje i frakcje chromatografiiczne analizowano metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na płytkach 250 mm z żelem krzemionkowym, przy wizualizacji w świetle ultrafioletowym (UV) barwieniu jodem (I2). Produkty i związki pośrednie oczyszczano metodą chromatografii rzutowej lub metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami.

PL 213 200 B1

W przykładach syntetycznych stosuje się następujące skróty: aq (wodny), H2O (woda), CHCI3 (chloroform), HCl (kwas solny), MeOH (metanol), NaOH (wodorotlenek sodu), NaOMe (metanolan sodu), TFA (kwas trifluorooctowy), K2CO3 (węglan potasu), SOCI2 (chlorek tionylu), CH2CI2 (chlorek metylenu), EtOAC (octan etylu), DMF (dimetyloformamid), EtOH (etanol), DMSO (dimetylosulfotlenek), NaHCO3 (wodorowęglan sodu), TLC (chromatografia cienkowarstwowa), HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa), HOBT (hydroksybenzotriazol), EDC (etylodietyloaminopropylokarbodiimid), DIEA (diizopropyloetyloamina) i HOAc (kwas octowy).

Procedury ogólne

Procedura A

Chlorek tionylu dodano do energicznie mieszanego roztworu kwasu antranilowego lub kwasu benzoesowego w benzenie, i mieszaninę mieszano w temperaturze wrzenia przez 5 do 18 godzin. Reakcję zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, i odpędzono dwukrotnie z benzenem. Otrzymany olej rozpuszczono w CHCI3 i do tego roztworu dodano odpowiednią anilinę. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano do wrzenia i mieszano aż do zakończenia określonego metodą TLC, w którym to momencie mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury otoczenia. Osad usunięto przez odsączenie, a przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii i/lub rekrystalizacji z MeOH, otrzymując amidy 1a-1l.

Procedura B

Do energicznie mieszanej zawiesiny amidu w lodowatym kwasie octowym dodano chlorek chloroacetylu. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano do 120°C, i zostawiono mieszając w tej temperaturze, aż do zakończenia określonego metodą TLC. Po krótkim chłodzeniu mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Surową pozostałość oczyszczono metodą ekstrakcji, chromatografii, i/lub rekrystalizacji, otrzymując chlorki 2a-2r.

Procedura C

Mieszaninę chlorku, albo nukleofila azotowego lub siarkowego, na przykład, monohydratu merkaptopuryny lub adeniny, oraz K2CO3 w DMF mieszano w temperaturze pokojowej przez 15-72 godziny. Otrzymaną zawiesinę wylano do wody i utrzymywano w temperaturze 4°C przez kilka godzin. Surową substancję stałą odsączono, przemyto wodą i oczyszczono metodą chromatografii lub rekrystalizacji, otrzymując produkty końcowe.

P r z y k ł a d 8

Wytwarzanie związków pośrednich: amidy

2-Amino-N-(2-chlorofenylo)-4,5-dimetoksybenzamid (1 a)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 4,5-dimetoksyantraniIowy (5,0 g, 25,4 mmol) i SOCI2 (5,5 mL, 76,1 mmol) w benzenie (100 mL), a następnie 2-chloroanilinę (6,7 mL, 63,5 mmol) i CHCI3 (75 mL). Produkt przemyto wodnym roztworem NaHCO3 (2 x 25 mL) i HCl (0,5 M, 75 mL) i oczyszczono metodą chromatografii w CH2CI2, otrzymując 4,3 g brunatnej piany (55%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,42 (dd, J = 1,5, 8,3 Hz, 1H); 8,32 (br s, 1H); 7,40 (dd, J = 1,4, 8,0 Hz, 1H); 7,31 (dt, J = 1,4, 7,9 Hz, 1H); 7,05 (dt, J = 1,5, 7,7 Hz, 1H); 7,03 (s, 1H); 6,24 (s, 1H); 3,88 (s, 3H); 3,87 (s, 3H).

MS (ES): m/z 307,0 (M+).

2-Amino-5-bromo-N-(2-chlorofenylo)benzamid (1b)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 2-amino-5-bromobenzoesowy (5,0 g, 23,1 mmol) i SOCI2 (7,0 mL, 95,9 mmol) w benzenie (50 mL), a następnie 2-chloroanilinę (7,35 mL, 69,3 mmol) i CHCI3 (50 mL). Produkt oczyszczono przez dwie chromatografie w CH2CI2, otrzymując 1,48 g żółtopomarańczowej substancji stałej (20%).

¹H NMR (CDCI3) δ: 8,32 (dd, J = 1,2, 8,2 Hz, 1H); 8,20 (br s, 1H); 7,62 (d, J = 2,1 Hz, 1H); 7,42 (dd, J = 1,3, 8,0 Hz, 1H); 7,34 (dd, J = 2,2, 8,8 Hz, 1H); 7,28-7,33 (m, 1H); 7,09 (dt, J = 1,4, 7,7 Hz, 1H); 6,62 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 5,57 (br s, 2H).

2-Amino-N-(2-chlorofenylo)-4-fluorobenzamid (1c)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 2-amino-4-fluorobenzoesowy(1,15 g, 7,41 mmol) i SOCI2 (1,4 mL, 18,5 mmol) w benzenie (25 mL), a następnie 2-chioroanilinę (1,6 mL, 14,8 mmol) i CHCI3 (25 mL). Produkt poddano chromatografii w CH2CI2, a następnie roztarto z heksanem, otrzymując 1,02 g białawej substancji stałej (52%).

¹H NMR (CDCI3) δ: 12,91 (br s, 1H); 8,72 (dd, J = 2,7, 12 Hz, 1H); 8,34 (dd, J = 6,4, 9,2 Hz, 1H); 8,29 (dd, J = 5,9, 8,8 Hz, 1H); 7,81 (dd, J = 6,2, 8,8 Hz, 1H); 7,28 (dt, J = 2,4, 8,4 Hz, 1H);

PL 213 200 B1

7,21 (dd, J = 2,4, 9,0 Hz, 1H); 6,92 (ddd, J = 2,4, 7,3, 9,1 Hz, 1H); 6,54 (ddd, J = 2,4, 7,8, 8,8 Hz, 1H); 6,45 (dd, J = 2,4, 11Hz, 1H); 5,93 (br s, 2H).

MS (ES): m/z 265,0 (M+).

2-Amino-5-chloro-N-(2-chlorofenylo)benzamid (1d)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 2-amino-5-chlorobenzoesowy (2,0 g, 11,7 mmol) i SOCI2 (2,2 mL, 29,2 mmol) w benzenie (50 mL), a następnie 2-chloroanilinę (2,5 mL, 23,3 mmol) i CHCI3 (50 mL). Produkt oczyszczono metodą rekrystalizacji z MeOH, otrzymując 1,72 g ciemnożółtej substancji stałej (52%).

¹H NMR (CDCI3) δ: 8,37 (dd, J = 1,5, 8,3 Hz, 1H); 8,22 (br s, 1H); 7,48 (d, J = 2,3 Hz, 1H); 7,42 (dd, J = 1,5, 8,1 Hz, 1H); 7,31 (dt, J = 1,4, 7,8 Hz, 1H); 7,22 (dd, J = 2,4, 8,8 Hz, 1H); 7,09 (dt, J = 1,5, 7,7 Hz, 1H); 6,67 (d, J = 8,8 Hz, 1H); 5,56 (br s, 2H).

2-Amino-N-(2-chlorofenylo)-6-fluorobenzamid (1e)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 2-amino-6-fluorobenzoesowy (2,0 g, 12,9 mmol) i SOCI2 (2,3 mL, 32,2 mmol) w benzenie (50 mL), a następnie 2-chloroanilinę (2,7 mL, 25,8 mmol) i CHCI3 (50 mL). Produkt oczyszczono metodą chromatografii w EtOAc/heksanie, otrzymując 2,06 g blado-pomarańczowej substancji stałej (60%).

¹H NMR (CDCI3) δ: 9,00 (d, J = 17 Hz, 1H); 8,47 (d, J = 8,3 Hz, 1H); 7,41 (d, J = 8,0 Hz, 1H); 7,30 (t, J = 7,9 Hz, 1H); 7,10-7,20 (m, 1H); 7,07 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 6,49 (d, J = 8,3 Hz, 1H); 6,03 (br s, 2H).

MS (ES): m/z 265,0 (M+).

2-Amino-6-chloro-N-(2-chlorofenylo)benzamid (1f)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 2-amino-6-chlorobenzoesowy (2,5 g, 14,6 mmol) i SOCI2 (2,7 mL, 36,4 mmol) w benzenie (75 mL), a następnie 2-chloroanilinę (3,1 mL, 29,1 mmol) i CHCI3 (75 mL). Produkt poddano chromatografii w CH2CI2 otrzymując 1,05 g żółtopomarańczowej substancji stałej (26%).

¹H NMR (CDCI3) δ: 8,54 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 8,30 (br s, 1H); 7,41 (dd, J = 1,5, 8,0 Hz, 1H); 7,33 (t, J = 7,8 Hz, 1H); 7,10 (t, J = 8,1 Hz, 1H); 7,09 (dt, J = 1,6, 7,8 Hz, 1H); 6,78 (dd, J = 0,4, 7,9 Hz, 1H); 6,63 (dd, J = 0,9, 8,2 Hz, 1H); 4,69 (br s, 2H).

MS (ES): m/z 303,0 (M+22), 281,0 (M+).

2-Amino-N-(2-chlorofenylo)-6-metylobenzamid (1g)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 2-amino-6-metylobenzoesowy (2,5 g, 16,5 mmol) i SOCI2 (3,0 mL, 41,3 mmol) w benzenie (75 mL), a następnie 2-chloroanilinę (3,5 mL, 33,0 mmol) i CHCI3 (75 mL). Produkt poddano chromatografii w CH2CI2 z wytworzeniem 2,19 g brunatnego oleju (51%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,58 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 7,99 (br s, 1H); 7,40 (dd, J = 1,4, 8,0 Hz, 1H); 7,34 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,11 (t, J = 7,8 Hz, 1H); 7,09 (dt, J = 1,5, 7,7 Hz, 1H); 6,64 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 6,59 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 4,29 (br s, 2H); 2,45 (s, 3H).

MS (ES): m/z 283,0 (M+22).

2-Amino-3-chioro-N-(2-chlorofenylo)benzamid (1h)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 2-amino-3-chlorobenzoesowy (1,0 g, 5,82 mmol) i SOCI2 (1,1 mL, 14,6 mmol) w benzenie (25 mL), a następnie 2-chloroanilinę (1,2 mL, 11,7 mmol) i CHCI3 (25 mL). Produkt rekrystalizowano z MeOH, otrzymując 1,29 g żółtej substancji stałej (78%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,43 (dd, J = 1,4, 8,3 Hz, 1H); 8,30 (br s, 1H); 7,47 (dd, J = 1,1, 8,0 Hz, 1H); 7,42 (d, J = 8,0 Hz, 2H); 7,33 (dt, J = 1,4, 7,9 Hz, 1H); 7,09 (dt, J = 1,5, 7,7 Hz, 1H); 6,68 (t, J = 7,9 Hz, 1H); 6,13 (br s, 2H).

MS (ES): m/z 281,0 (M+).

2-Amino-N-bifenyl-2-ilo-6-chlorobenzamid (1i)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 2-amino-6-chlorobenzoesowy (2,0 g, 11,7 mmol) i SOCI2 (2,1 mL, 29,3 mmol) w benzenie (60 mL), a następnie 2-aminobifenyloaminę (4,15 g, 24,5-mmol) i CHCI3 (60 mL). Produkt poddano chromatografii w CH2CI2, otrzymując 2,16 g pienistej ciemnobursztynowej pozostałości (57%).

¹H MR (CDCI3) δ: 8,48 (dd, J = 8,2 Hz, 1H); 7,79 (br s, 1H); 7,34-7,46 (m, 6H); 7,20-7,30 (m, 2H); 7,00 (t, J = 8,1 Hz, 1H); 6,63 (dd, J = 0,6, 7,9 Hz, 1H); 6,54 (d, J = 8,3-Hz, 1H); 4,58 (br s, 2H).

MS (ES): m/z 323,1 (M+).

2-Amino-6-chloro-N-o-tolilobenzamid (1j)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 2-amino-6-chlorobenzoesowy (1,0 g, 5,83 mmol) i SOCI2 (1,1 mL, 14,6 mmol) w benzenie (30 mL), a następnie o-toluidynę (1,4 mL, 12,8 mmol)

PL 213 200 B1 i CHCI3 (30 mL). Produkt poddano chromatografii w CH2CI2 otrzymując 840 mg żółtej oleistej substancji stałej (55%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 7,96 (d, J = 7,9 Hz, 1H); 7,60 (br s, 1H); 7,23-7,30 (m, 2H); 7,14 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 7,11 (t, J = 8,3 Hz, 1H); 6,78 (d, J = 7,9 Hz, 1H); 6,64 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 4,73 (br s, 2H); 2,35 (s, 3H).

MS (ES): m/z 261,0 (M+).

2-Amino-6-chloro-N-(2-fluorofenylo)benzamid (1k)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 2-amino-6-chlorobenzoesowy (2,0 g, 11,7 mmol) i SOCI2 (2,1 mL, 29,1 mmol) w benzenie (60 mL), a następnie 2-fluoroanilinę (2,3 mL, 23,4 mmol) i CHCl3 (60 mL). Produkt poddano chromatografii w CH2CI2, z wytworzeniem 1,05 g żółtej substancji stałej (34%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,45 (t, J = 8,0 Hz, 1H); 8,01 (br s, 1H); 7,02-7,22 (m, 4H); 6,78 (dd, J = 0,5,

7,9 Hz, 1H); 6,64 (dd, J = 0,8, 8,2 Hz, 1H); 4,73 (br s, 2H).

MS (ES): m/z 265,0 (M+).

2-Amino-6-chloro-N-(2-metoksyfenylo)benzamid (1l)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 2-amino-6-chlorobenzoesowy (2,0 g, 11,7 mmol) i SOCI2 (2,1 mL, 29,1 mmol) w benzenie (60 mL), a następnie o-anizydynę (2,6 mL, 23,4 mmol) i CHCl3 (60 mL). Produkt poddano chromatografii w CH2CI2, otrzymując 2,61 g ciemnożółtego oleju (81%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,53 (dd, J = 1,7, 7,9 Hz, 1H); 8,39 (br s, 1H); 7,11 (dt, J = 1,6, 7,8, Hz, 1H); 7,09 (t, J = 8,1 Hz, 1H); 7,02 (dt, J = 1,4, 7,8 Hz, 1H); 6,92 (dd, J = 1,4, 8,0 Hz, 1H); 6,62 (dd, J = 0,9,

8,2 Hz, 1H); 4,66 (br s, 2H); 3,87 (s, 3H).

MS (ES): m/z 277,0 (M+).

2-Amino-N-(2-chlorofenylo)-3-trifluorometylobenzamid (1m)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 3-trifluorometyloantranilowy (2,0 g, 9,75 mmol) i SOCI2 (1,8 mL, 24,4 mmol) w benzenie (50 mL), a następnie 2-chloroanilinę (2,1 mL, 19,5 mmol) i CHCI3 (50 mL). Produkt oczyszczono metodą rekrystalizacji z MeOH, otrzymując 2,38 g żółtych kryształów (78%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,40 (dd, J = 1,4, 8,3 Hz, 1H); 8,25 (br S, 1H); 7,71 (d, J = 7,8 Hz, 1H); 7,60 (d, J = 7,8 Hz, 1H); 7,43 (dd, J = 1,4, 8,0 Hz, 1H); 7,34 (dt, J = 1,3, 7,9 Hz, 1H); 7,11 (dt, J = 1,5, 7,7 Hz, 1H); 6,77 (t, J = 7,8 Hz, 1H); 6,24 (br s, 2H).

MS (ES): m/z 315,0 (M+).

(2-Chlorofenylo)amid kwasu 3-aminonaftaleno-2-karboksylowego (1n)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 3-amino-2-naftoesowy (2,0 g, 10,7 mmol) i SOCI2 (1,9 mL, 26,7 mmol) w benzenie (50 mL), a następnie 2-chloroanilinę (2,3 mL, 21,4 mmol) i CHCI3 (50 mL). Produkt rekrystalizowano z MeOH, otrzymując 1,71 g brunatnej substancji stałej (54%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 10,88 (br s, 1H); 9,21 (s, 1H); 8,91 (s, 1H); 8,70 (dd, J = 1,0, 8,3 Hz, 1H); 7,95-8,01 (m, 1H); 7,87-7,94 (m, 10 1H); 7,60-7,68 (m, 2H); 7,41 (dd, J = 1,3, 8,0 Hz, 1H); 7,34 (dt, J = 1,2, 7,8 Hz, 1H); 7,07 (dt, J = 1,4, 7,7 Hz, 1H).

MS (ES): m/z 297,1 (M+).

2-Amino-N-(2-chlorofenylo)-4-nitrobenzamid (1o)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 4-nitroantranilowy (5,0 g, 27,5 mmol) i SOCI2 (5,0 mL, 68,6 mmol) w benzenie (150 mL), a następnie 2-chloroanilinę (5,8 mL, 55,0 mmol) i CHCl3 (150 mL). Produkt oczyszczono metodą chromatografii w CH2CI2, a następnie rekrystalizacji z MeOH, otrzymując 2,20 g pomarańczowobrunatnej substancji stałej (31%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,41 (dd, J = 1,3, 8,3 Hz, 1H); 8,31 (br s, 1H); 7,67 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,57 (d, J = 2,1 Hz, 1H); 7,52 (dd, J = 2,2, 8,5 Hz, 1H); 7,44 (dd, J = 1,3, 8,1 Hz, 1H); 7,35 (dt, J = 1,3, 7,9 Hz, 1H); 7,13 (dt, J = 1,4, 7,8 Hz, 1H); 5,88 (br s, 2H).

MS (ES): m/z 292,0 (M+).

2-Amino-N-(2-chlorofenylo)-5-hydroksybenzamid (1p)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 2-amino-5-hydroksybenzoesowy (5,0 g,

32,7 mmol) i SOCI2 (6,0 mL, 81,6 mmol) w benzenie (150 mL), a następnie 2-chloroanilinę (6,9 mL,

65,4 mmol) i CHCI3 (150 mL). Produkt oczyszczono przez dwie chromatografie w MeOH/CH2Cl2, otrzymując 990 mg brunatnej substancji stałej (12%).

PL 213 200 B1 ¹H NMR (MeOH-d4 δ: 7,92 (dd, J = 1,6, 8,1 Hz, 1H); 7,48 (dd, J = 1,5, 7,7 Hz, 1H); 7,34 (dt, J = 1,5, 7,7 Hz, 1H), 7,20 (dt, J = 1,7, 7,7 Hz, 1H); 7,16 (d, J = 2,7 Hz, 1H); 6,83 (dd, J =2,7, 8,7 Hz, 1H); 6,76 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 6,24 (br s, 2H)).

MS (ES): m/z 263,0 (M+).

2-Amino-N-(2-chlorofenylo)-4,5-difluorobenzamid (1q)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 4,5-difluoroantranilowy (2,0 g, 11,6 mmol) i SOCI2 (2,1 mL, 28,9 mmol) w benzenie (60 mL), a następnie 2-chloroanilinę (2,4 mL, 23,2 mmol) i CHCI3 (60 mL). Produkt oczyszczono przez dwie chromatografie w CH2CI2 i EtOAc/heksan, otrzymując 769 mg żółtej substancji stałej (23%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,69-8,82 (m, 1H); 8,00 (dd, J = 8,4, 9,0 Hz, 1H); 7,90 (dd, J = 8,9, 12 Hz, 1H); 7,39 (dd, J = 6,8, 10 Hz, 1H); 6,53 (dd, J = 6,6, 12 Hz, 1H); 6,41 (br s, 2H); 5,79 (br s, 1H).

MS (ES): m/z 283,1 (M+).

2-Amino-N-(2-chlorofenylo)-5-fluorobenzamid (1r)

Wytworzono zgodnie z Procedurą A, stosując kwas 2-amino-5-fluorobenzoesowy (1,0 g, 6,45 mmol) i SOCI2 (1,2 mL, 16,1 mmol) w benzenie (30 mL), a następnie 2-chloroanilinę (1,4 mL,

12,9 mmol) i CHCl3 (30 mL). Produkt roztarto z CH2CI2, otrzymując 985 mg musztardowożółtej substancji stałej (58%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 7,66 (dd, J = 2,9, 8,7 Hz, 1H); 7,52-7,55 (m, 1H); 7,32-7,37 (m, 3H); 7,09 (dt, J = 3,0, 8,5 Hz, 1H); 6,71 (dd, J = 4,3, 8,7 Hz, 1H).

MS (ES): m/z 305,0 (M+40).

P r z y k ł a d 9

Wytwarzanie związków pośrednich: chlorki

2-Chlorometylo-3-(2-chlorofenylo)-6,7-dimetoksy-3H-chinazolin-4-on (2a)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1a (2,95 g, 9,63 mmol) i chlorek chloroacetylu (2,3 mL, 28,9 mmol) w kwasie octowym (30 mL). Oczyszczono metodą ekstrakcji z aq. K2CO3 i rekrystalizacji z izopropanolu, otrzymując 1,61 g brunatnej krystalicznej substancji stałej (46%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 7, 59-7,66 (m, 2H); 7,45-7,56 (m, 3H); 7,20 (s, 1H); 4,37 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,08 (d, J = 12 Hz, 1H); 4,04 (s, 3H); 4,00 (s, 3H).

MS (ES): m/z 365,0 (M+).

6-Bromo-2-chlorometylo-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-on (2b)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1b (500 mg, 1,54 mmol) i chlorek chloroacetylu (0,37 mL, 4,61 mmol) w kwasie octowym (10 mL). Oczyszczono metodą rekrystalizacji z izopropanolu, otrzymując 490 mg białawej substancji stałej (83%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,43 (d, J = 2,3 Hz, 1H); 7,91 (dd, J = 2,3, 8,7 Hz, 1H); 7,67 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,60-7,65 (m, 1H); 7,47-7,56 (m, 2H); 7,52 (t, J = 5,3 Hz, 1H); 7,47-7,56 (m, 1H); 4,37 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,06 (d, J = 12 Hz, 1H).

MS (ES): m/z 385,0 (M+).

2-Chlorometylo-3-(2-chlorofenylo)-7-fluoro-3H-chinazolin-4-on (2c)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1c (500 mg, 1,89 mmol) i chlorek chloroacetylu (0,45 mL, 5,67 mmol) w kwasie octowym (10 mL). Oczyszczono metodą ekstrakcji z wodnego K2CO3, a następnie rekrystalizacji z izopropanolu, otrzymując 501 mg żółtej krystalicznej substancji stałej (82%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,32 (dd, J = 6,0, 8,9 Hz, 1H); 7,59-7,66 (m, 1H); 7,50-7,55 (m, 3H); 7,44 (dd, J = 2,4, 9,4 Hz); 7,27 (dt, J = 2,5, 8,5 Hz, 1H); 4,37 (d, J = 12 Hz, 1H),

4,07 (d, J = 12 Hz, 1H).

MS (ES): m/z 323,0 (M+).

6-Chloro-2-chlorometylo-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-on (2d)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1d (500 mg, 1,78 mmol) i chlorek chloroacetylu (0,42 mL, 5,33 mmol) w kwasie octowym (10 mL). Oczyszczono metodą rekrystalizacji z izopropanolu, otrzymując 555 mg żółtej substancji stałej (92%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,27 (d, J = 1,9 Hz, 1H); 7,74-7,78 (m, 2H); 7,60-7,66 (m, 1H); 7,48-7,57 (m, 3H);

4,37 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,07 (d, J = 12 Hz, 1H).

MS (ES): m/z 339,0 (M+).

2-Chlorometylo-3-(2-chlorofenylo)-5-fluoro-3H-chinazolin-4-on (2e)

PL 213 200 B1

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1e (500 mg, 1,89 mmol) i chlorek chloroacetylu (0,45 mL, 5,67 mmol) w kwasie octowym (10 mL). Oczyszczono metodą ekstrakcji z aq. K2CO3 i rekrystalizacji z izopropanolu, otrzymując 430 mg białawej krystalicznej substancji stałej (70%).

¹H NMR (CDCis) δ: 7,76 (dt, J = 5,3, 8,2 Hz, 1H); 7,56-7,65 (m, 2H); 7,47-7,56 (m, 3H); 7,16-7,25 (m, 1H); 4,35 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,07 (d, J = 12 Hz, 1H).

MS (ES): m/z 323,0 (M+).

5-Chloro-2-chlorometylo-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-on (2f)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1f (1,00 g, 3,56 mmol) i chlorek chloroacetylu (0,85 mL, 10,7 mmol) w kwasie octowym (15 mL). Oczyszczono metodą rekrystalizacji z izopropanolu, otrzymując 791 mg białawej krystalicznej substancji stałej (65%).

¹H NMR (CDCI3) δ: 7,70 (s, 1H); 7,68 (d, J = 3,8 Hz, 1H); 7,61-7,65 (m, 1H); 7,55 (dd, J = 2,7, 6,4 Hz, 1H); 7,51 (d, J = 3,1 Hz, 1H); 7,50 (s, 2H); 4,35 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,05 (d, J = 12 Hz, 1H).

MS (ES): m/z 339,0 (M+).

2- Chlorometylo-3-(2-chlorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-on (2g)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1g (2,18 g, 8,36 mmol) i chlorek chloroacetylu (2,0 mL, 25,1 mmol) w kwasie octowym (40 mL). Oczyszczono przez dwie chromatografie w CH2CI2 i EtOAc/heksan, a następnie rekrystalizację z izopropanolu, otrzymując 638 mg białawej krystalicznej substancji stałej (24%).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 7,73-7,80 (m, 3H); 7,58 7,64 (m, 3H); 7,41 (d, J = 7,4 Hz, 1H) 4,40 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,26 (d, J = 12 Hz, 1H); 2,74 (s, 3H).

MS (ES): m/z 319,0 (M+).

8-Chloro-2-chlorometylo-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-on (2h)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1h (500 mg, 1,78 mmol) i chlorek chloroacetylu (0,49 mL, 6,13 mmol) w kwasie octowym (10 mL). Oczyszczono metodą ekstrakcji z wodnego K2CO3, a następnie rekrystalizacji z izopropanolu, otrzymując 448 mg żółtej substancji stałej (74%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,23 (dd, J = 1,4, 8,0 Hz, 1H); 7,90 (dd, J = 1,4, 7,8 Hz, 1H); 7,61-7,66 (m, 1H); 7,51-7,55 (m, 3H); 7,47 (t, J = 8,0 Hz, 1H); 4,48 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,12 (d, J = 12 Hz, 1H).

MS (ES): m/z 339,0 (M+).

3- Bifenyl-2-iIo-5-chloro-2-chlorometylo-3H-chinazolin-4-on (2i)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1i (2,0 g, 6,20 mmol) i chlorek chloroacetylu (1,5 mL, 18,6 mmol) w kwasie octowym (30 mL). Oczyszczono metodą chromatografii w CH2CI2, a następnie rekrystalizacji z izopropanolu, otrzymując 1,44 g białawej substancji stałej (61%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 7,61-7,64 (m, 1H); 7,58-7,59 (m, 1H); 7,54-7,57 (m, 2H); 7,52-7,53 (m, 1H); 7,45-7,52 (m, 2H); 7,24 (s, 5H); 3,92-4,03 (m, 2H).

MS (ES): m/z 381,0 (M+).

5-Chloro-2-chlorometylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (2j)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1j (750 mg, 2,88 mmol) i chlorek chloroacetylu (0,69 mL, 8,63 mmol) w kwasie octowym (15 mL). Oczyszczono metodą chromatografii w CH2CI2, a następnie rekrystalizacji z izopropanolu, otrzymując 340 mg białej substancji stałej (37%).

¹H NMR (CDCI3) δ: 7,69 (d, J = 2,1 Hz, 1H); 7,68 (q, J = 7,4 Hz, 1H); 7,54 (dd, J = 2,2, 7,0 Hz, 1H); 7,35-7,47 (m, 3H); 7,21-7,25 (m, 1H); 4,27 (d, J = 12 Hz, 1H); 4,11 (d, J = 12 Hz, 1H); 2,18 (s, 3H).

MS (ES): m/z 319,0 (M+).

5-Chloro-2-chlorometylo-3-(2-fluorofenylo)-3H-chinazolin-4-on (2k)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1k (1,0 g, 3,78 mmol) i chlorek chloroacetylu (0,90 mL, 11,3 mmol) w kwasie octowym (20 mL). Oczyszczono metodą chromatografii w CH2CI2, otrzymując 484 mg bladoróżowej substancji stałej (40%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 7,69 (s, 1H); 7,68 (d, J = 3,2 Hz, 1H); 7,56 (d, J = 3,0 Hz, 1H); 7,54 (d, J = 3,0 Hz, 1H); 7,40-7,47 (m, 1H); 7,35-7,38 (m, 1H); 7,27-7,32 (m, 1H); 4,35 (d, J = 12 Hz, 1H); 4,18 (d, J = 12 Hz, 1H).

MS (ES): m/z 323,0 (M+).

5-Chloro-2-chlorometylo-3-(2-metoksyfenylo)-3H-chinazolin-4-on (2l)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 11 (2,6 g, 9,41 mmol) i chlorek chloroacetylu (2,2 mL,

28,2 mmol) w kwasie octowym (40 mL). Oczyszczono metodą chromatografii w CH2CI2, a następnie rekrystalizacji z izopropanolu, otrzymując 874 mg bladożółtej substancji stałej (28%).

PL 213 200 B1 ¹H NMR (CDCl3) δ: 7,55-7,74 (m, 2H); 7,47-7,54 (m, 2H); 7,34 (dd, J 20 = 1,7, 7,8 Hz, 1H); 7,13 (dt, J = 1,2, 7,7 Hz, 1H); 7,08 (dd, J = 1,0, 8,4 Hz, 1H); 4,29 (d, J = 12 Hz, 1H); 4,11 (d, J = 12 Hz, 1H); 3,80 (s, 3H).

MS (ES): m/z 335,0 (M+).

2-Chlorometylo-3-(2-chlorofenylo)-8-trifluorometylo-3H-chinazolin-4-on (2m)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1m (500 mg, 1,59 mmol) i chlorek chloroacetylu (0,38 mL, 4,77 mmol) w kwasie octowym (10 mL). Oczyszczono metodą rekrystalizacji z izopropanolu, otrzymując 359 mg białej krystalicznej substancji stałej (61%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,51 (dd, J = 1,0, 8,0 Hz, 1H); 8,14 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 7,65 (dd, J = 2,5, 5,6 Hz, 1H); 7,62 (d, J = 3,9 Hz, 1H); 7,48-7,60 (m, 3H); 4,44 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,12 (d, J = 12 HZ, 1H).

MS (ES): m/z 373,0 5 (M+).

2-Chlorometylo-3-(2-chlorofenylo)-3H-benzo[g]chinazolin-4-on (2n)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1n (500 mg, 1,68 mmol) i chlorek chloroacetylu (0,40 mL, 5,05 mmol) w kwasie octowym (10 mL). Oczyszczono metodą chromatografii w CH2CI2, a następnie rekrystalizacji z izopropanolu, otrzymując 232 mg jasnobrunatnej substancji stałej (39%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,92 (s, 1H); 8,29 (s, 1H); 8,81 (d, J = 8,3, 1H), 8,32 (d, J = 8,3 Hz, 1H); 7,51-7,69 (m, 4H); 7,55 (d, J = 5,2 Hz, 1H); 7,53 (d, J = 3,8 Hz, 1H); 4,43 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,12 (d, J = 12 Hz, 1H).

MS (ES): m/z 355,0 (M+).

2-Chlorometylo-3-(2-chlorofenylo)-7-nitro-3H-chinazolin-4-on (2o)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1o (500 mg, 1,71 mmol) i chlorek chloroacetylu (0,41 mL, 5,14 mmol) w kwasie octowym (10 mL). Oczyszczono metodą ekstrakcji z wodnego K2CO3, a następnie przez dwie chromatografie w CH2CI2, otrzymując 338 mg żółtego oleju (56%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,64 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 8,48 (d, J = 8,8 Hz, 1H); 8,32 (dd, J = 2,2, 8,7 Hz, 1H); 7,66 (dd, J = 2,5, 6,0 Hz, 1H); 7,52-7,59 (m, 3H); 4,41 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,10 (d, J = 12 Hz, 1H).

MS (ES): m/z 350,0 (M+).

Ester 2-chlorometylo-3-(2-chlorofenylo)-4-okso-3,4-dihydrochinazolin-6-ylowy kwasu octowego (2p)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1p (670 mg, 2,55 mmol) i chlorek chloroacetylu (0,61 mL, 7,65 mmol) w kwasie octowym (10 mL). Oczyszczono metodą chromatografii w 0-3% MeOH/CH2Cl2, a następnie rekrystalizacji z izopropanolu, otrzymując 523 mg octanu jako bladobrzoskwiniowe kryształy (57%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,00 (d, J= 2,7 Hz, 1H); 7,82 (d, J = 8,8 Hz, 1H); 7,60-7,66 (m, 1H); 7,56 (dd, J = 2,7, 8,8 Hz, 1H); 7,51 (t, J = 4,7 Hz, 2H); 7,50 (s, 1H); 4,3 8 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,08 (d, J = 12 Hz, 1H), 2,36 (s, 3H).

MS (ES): m/z 363,0 (M+).

2-Chlorometylo-3-(2-chlorofenylo)-6,7-difluoro-3H-chinazolin-4-on (2q)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1q (700 mg, 2,48 mmol) i chlorek chloroacetylu (0,60 mL, 7,43 mmol) w kwasie octowym (12 mL). Oczyszczono metodą chromatografii w CH2CI2, a następnie rekrystalizacji z izopropanolu, otrzymując 219 mg żółtej krystalicznej substancji stałej (26%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 8,07 (dd, J = 8,5, 9,7 Hz, 1H); 7,64 (dd, J = 2,5, 5,6 Hz, 1H); 7,60 (dd, J = 3,5, 11 Hz, 1H); 7,55 (q, J = 2,9 Hz, 3H); 7,52 (d, J = 1,9 Hz, 1H); 7,49-7,51 (m, 1H); 4,36 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,06 (d, J = 12 Hz, 1H).

MS (ES): m/z 341,0 (M+).

2-Chlorometylo-3-(2-chlorofenylo)-6-fluoro-3H-chinazolin-4-on (2r)

Wytworzono zgodnie z Procedurą B, stosując 1r (850 mg, 3,21 mmol) i chlorek chloroacetylu (0,77 mL, 9,63 mmol) w kwasie octowym (15 mL). Oczyszczono metodą ekstrakcji z wodnego K2CO3, a następnie chromatografii w EtOAc/heksanie. Druga chromatografia w acetonie/heksanie dała 125 mg białej substancji stałej (12%).

¹H NMR (CDCl3) δ: 7,95 (dd, J = 2,9, 8,2 Hz, 1H); 7,81 (dd, J = 4,8, 9,0 Hz, 1H); 7,61-7,66 (m, 1H); 7,57 (dd, J = 2,7, 8,6 Hz, 1H); 7,57 (dd, J = 2,7, 8,6 Hz, 1H); 7,52 (dd, J = 3,2, 6,9 Hz, 1H); 7,52 (br s, 2H); 4,38 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,08 (d, J = 12 Hz, 1H).

MS (ES): m/z 323,0 (M+).

PL 213 200 B1

P r z y k ł a d 10

Wytwarzanie związków będących inhibitorami PI3K<s

Związek D-001

2-(6-Aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-6,7-dimetoksy-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2a (200 mg, 0,546 mmol), adeninę (81 mg, 0,601 mmol), K2CO3 (83 mg, 0,601 mmol), i DMF (4 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z etanolu (EtOH), otrzymując 164 mg beżowej substancji stałej (65%), t.t. 281,5-282,7°C (rozkład).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,06 (s, 1H); 8,04 (s, 1H); 7,76-7,81 (m, 1H); 7,70-7,76 (m, 1H); 7,60-7,67 (m, 2H); 7,45 (s, 1H); 7,22 (s, 2H); 6,90 (s, 1H); 5,08 (d, J = 17 Hz, 1H); 4,91 (d, J = 17 Hz, 1H); 3,87 (s, 3H); 3,87 (s, 3H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 159,9, 156,2, 155,4, 152,9, 150,0, 149,7, 149,4, 143,0, 141,9, 133,7,

132,1, 131,9, 131,2, 130,8, 129,3, 118,4, 113,6, 108,4, 105,8, 56,5, 56,1, 44,7.

MS (ES): m/z 464,1 (M+).

Anal. obl. dla C22H18ClN₂O3 . 0,1 C2H6O . 0,05 KCl: C, 56,47; Η, 3,97; Cl, 7,88; N, 20,76.

Stwierdzono: C, 56,54; H, 4,05; Cl, 7,77; N, 20,55.

Związek D-002

2-(6-Aminopuryn-o-ylometylo)-6-bromo-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2b (100 mg, 0,260 mmol), adeninę (39 mg, 0,286 mmol), K2CO3 (40 mg, 0,286 mmol), i DMF (2 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 52 mg białawej substancji stałej (41%), t.t. 284,2-284,7°C (rozkład).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,24 (d, J = 2,0 Hz, 1H); 8,05 (s, 1H); 8,03 (s, 1H); 7,98 (dd, J = 1,9, 8,6 Hz, 1H); 7,74-7,83 (m, 2H); 7,59-7,68 (m, 2H); 7,46 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,22 (s, 2H); 5,12 (d, J = 17 Hz, 1H); 4,94 (d, J = 17 Hz, 1H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 159,5, 156,2, 152,9, 152,0, 150,1, 145,8, 141,8, 138,4, 133,1, 132,2, 131,9, 131,1, 130,9, 130,1, 129,4, 128,9, 122,4, 120,4, 118,4, 45,0.

MS (ES): m/z 482,0 (M+).

Anal. obl. dla C2₀H13ClBrNyO .-0,1 KCl: C, 49,01; H, 2,67; Cl, 7,96; N, 20,00.

Stwierdzono: C, 48,82; H, 2,82; Cl, 8,00; N, 19,79.

Związek D-003

2-(6-Aminopuryn-o-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-7-fluoro-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2c (100 mg, 0,310 mmol), adeninę (46 mg, 0,340 mmol), K2CO3 (47 mg, 0,340 mmol), i DMF (1 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 57 mg beżowej substancji stałej (44%), t.t. 216,8-217, 20°C.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,22 (dd, J = 6,3, 8,7 Hz, 1H); 8,05 (s, 1H); 8,03 (s, 1H); 7,78-7,80 (m, 2H); 7,61-7,64 (m, 2H); 7,46 (dt, J = 2,1, 8,6 Hz, 1H); 7,32 (d, J = 9,8 Hz, 1H); 7,22 (s, 2H); 5,13 (d, J = 17 Hz, 1H); 4,95 (d, J = 17 Hz, 1H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 166,1 (d, J = 253 Hz), 159,6, 155,8, 152,5, 149,7, 148,6 (d, J = 14 Hz),

141,4, 132,8, 131,8, 131,6, 130,8, 130,5, 129,8 (d, J = 11 Hz), 129,0, 118,1, 117,4, 116,2 (d, J = 24 Hz), 112,7 (d, J = 22 Hz), 44,6.

MS (ES): m/z 422,0 (M+).

Anal. obl. dla C20H13ClFN7O . 0,1 H2O (0,15 KCl: C, 55,25; H, 3,06; Cl, 9,38; N, 22,55.

Stwierdzono: C, 55,13; H, 2,92; Cl, 9,12; N, 22,30.

Związek D-004

2-(6-Aminopuryn-9-ylometylo)-6-chloro-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2d (100 mg, 0,294 mmol), adeninę (44 mg, 0,323 mmol), K2CO3 (45 mg, 0,323 mmol), i DMF (1 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 50 mg żółtej substancji stałej (39%), t.t. 294, 5-294, 8°C (rozkład).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,10 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 8,05 (s, 1H); 8,03 (s, 1H); 7,86 (dd, J = 2,4, 8,8 Hz, 1H); 7,75-7,82 (m, 2H); 7,59-7,67 (m, 2H); 7,53 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,22 (br s, 2H); 5,13 (d, J = 17 Hz, 1H); 4,95 (d, J = 17 Hz, 1H).

¹³C NMR (DMSO-d6): ppm: 159,7, 156,2, 152,9, 151,9, 150,1, 145,5, 141,8, 25 135,7, 133,1,

132,3, 132,2, 131,9, 131,1, 130,9, 130,0, 129,4, 125,9, 122,0, 118,4, 44,9.

MS (ES): m/z 438,0 (M+).

Anal. obl. dla C20H13CI2N7O: C, 54,81; H, 2,99; N, 22,37.

Stwierdzono: C, 54,72; H, 2,87; N, 22,18.

PL 213 200 B1

Związek D-005

2-(6-Aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-fluoro-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2e (200 mg, 0,619 mmol), adeninę (92 mg, 0,681 mmol), K2CO3 (94 mg, 0,680 mmol), i DMF (4 mL). Surowy produkt poddano chromatografii w MeOH/CH2Cl2, otrzymując 168 mg białawej substancji stałej (64%), t.t. 159-172°C (stopniowy rozkład).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,10 (s, 1H); 8,08 (s, 1H); 7,73-7,89 (m, 3H); 7,57-7,71 (m/ 2H); 7,377,48 (m, 2H); 7,34 (d, J =11 Hz, 1H); 7,30 (d, J = 8,3 Hz, 1H); 5,14 (d, J = 17 Hz, 1H); 4,94 (d, J = 17 Hz, 1H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 160,8 (d, J = 264 Hz), 157,5 (d, J = 4,2 Hz), 155,8, 152,4, 152,4, 150,0, 148,7, 142,1, 136,4 (d, J = 11 Hz), 133,0, 132,2, 132,1, 131,2, 130,9, 129,4, 123,8 (d, J = 3,6 Hz),

118,4, 114,5 (d, J = 20 Hz), 110,2 (d, J = 6,0 Hz), 44,9.

MS (ES): m/z 422,0 (M+).

Anal. obl. dla C20H13ClFN7O: C, 56,95; H, 3,11; Cl, 8,40; N, 23,24.

Stwierdzono: C, 54,62; H, 3,32; Cl, 9,40; N, 21,29.

Związek D-006

2-(6-Aminopuryn-o-ylometylo)-5-chloro-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2f (300 mg, 0,883 mmol), adeninę (131 mg, 0,972 25 mmol), K2CO3 (134 mg, 0,972 mmol), i DMF (4 mL). Surowy produkt poddano chromatografii w MeOH/CH2Cl2 i rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 188 mg bladopomarańczowej krystalicznej substancji stałej (49%), t.t. 245,7-246,0°C (zaczyna się pocić w temperaturze 220°C).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,06 (s, 1H); 8,04 (s, 1H); 7,76-7,81 (m, 2H); 7,72 (d, J = 8,0 Hz, 1H); 7,59-7,66 (m, 3H); 7,41 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 7,26 (br s, 2H); 5,11 (d, J = 17 Hz, 1H); 4,93 (d, J = 17 Hz, 1H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 158,5, 156,2, 152,9, 152,2, 150,1, 149,2, 141,8, 135,4, 133,3, 133,2,

132.1, 132,0, 131,2, 130,9, 130,4, 129,4, 127,3, 118,4, 117,7, 44,9.

MS (ES): m/z 438,0 (M+).

Anal. obl. dla C2_OH13C12N7O.0,1 C2H6O.0,05 H2O: C, 54,67; H, 3,11; Cl, 15,98; N, 22,09.

Stwierdzono: C, 54,35; H, 3,00; Cl, 15,82; N, 22,31.

Związek D-007

2-(6-Aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2g (250 mg, 0,783 mmol), adeninę (116 nag, 0,862 mmol), K2CO3 (119 mg, 0,862 mmol), i DMF (4 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 93 mg bladożółtej substancji stałej (28%), t.t. 190,7-190,9°C.

¹HNMR (DMSO-d6) δ: 8,05 (s, 1H); 8,03 (s, 1H); 7,76-7,79 (m, 1H); 7,71-7,74 (m, 1H); 7,59-7,67 (m, 1H); 7,34 (d, J = 7,4 Hz, 1H); 7,28 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 7,24 (br s, 2H); 5,07 (d, J = 17 Hz, 1H); 4,92 (d, J = 17 Hz, 1H); 2,73 (s, 3H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 161,1, 156,2, 152,8, 150,9, 150,1, 148,3, 141,9, 141,0, 134,6, 133,6,

132.2, 131,9, 131,3, 130,8, 130,3, 129,3, 125,9/119,1, 118,4, 44,8, 22,8.

MS (ES): m/z 418,1 (M+).

Anal. obl. dla C21H16ClN7O«H2O: C, 57,87; H, 4,16; Cl, 8,13; N, 22,49.

Stwierdzono: C, 57,78; H, 3,99; Cl, 8,38; N, 22,32.

Związek D-008

2-(6-Aminopuryn-9-ylometylo)-8-chloro-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2h (100 mg, 0,294 mmol), adeninę (44 mg, 0,324 mmol), K2CO3 (45 mg, 0,324 mmol), i DMF (1 mL). Surowy produkt poddano chromatografii w MeOH/CH2Cl2, otrzymując 50 mg bladożółtej substancji stałej (39%), t.t. 273,3-273,5°C (zmiana barwy).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,11 (dd, J = 1,3, 8,0 Hz, 1H); 8,08 (s, 1H); 8,05 (s, 1H); 8,00 (dd, J = 1,3, 7,8 Hz, 1H); 7,79-7,83 (m, 2H); 7,63-7,66 (m, 2H); 7,56 (t, J = 7,9 Hz, 1H); 7,21 (br s, 2H); 5,17 (d, J = 17 Hz, 1H); 4,97 (d, J = 17 Hz, 1H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 160,2, 156,1, 152,8, 152,2, 150,2, 143,3, 142,0, 135,6, 133,1, 132,3,

131,9, 131,1, 131,0, 130,9, 129,4, 128,4, 126,0, 122,5, 118,4, 45,0.

MS (ES): m/z 438,0 (M+).

Anal. obl. dla C2_OH13Cl2N7O.0,1 CH4O.6 H2O (0,15 KCl : C, 52,09; H, 3,18; N, 21,15.

Stwierdzono: C, 51,85; H, 2,93; N, 21,01.

PL 213 200 B1

Związek D-009

2-(6-Aminopuryn-9-ylometylo)-3-bifenyl-2-ilo-5-chloro-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2i (400, mg, 1,05 mmol), adeninę (155 mg, 1,15 mmol), K2CO3 (159 mg, 1,15 mmol), i DMF (5 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 344 mg białej substancji stałej (68%), t.t. 299,9-300,1°C (zmiana barwy).

¹HNMR (DMSO-d6) δ: 8,08 (s, 1H); 7,89 (s, 1H); 7,58-7,73 (m, 5H); 7,51 (d, J = 7,9 Hz, 1H); 7,46 (d, J = 7,5 Hz, 2H); 7,27-7,41 (m, 3H); 7,14-7,27 (m, 3H); 5,14 (d, J = 17 Hz, 1H); 4,82 (d, J = 17 Hz, 1H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 159,6, 156.2, 152,8, 152,5, 150,0, 149,0, 141,7, 140,2, 137,7, 135.0,

133.3, 133,2, 131,8, 130,7, 130,1, 129,8, 129,5, 5 128,8, 128,6, 128,4, 127,1, 118,4, 117,6, 45,3.

MS (ES): m/z 480,1 (M+).

Anal. obl. dla C26H18ClN7O: C, 65,07; H, 3,78; Cl, 7,39; N, 20,43.

Stwierdzono: C, 64,77; H, 3,75; Cl, 7,43; N, 20,35.

Związek D-010

5-Chloro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2j (200 mg, 0,626 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (93 mg, 0,546 mmol), K2CO3 (95 mg, 0,689 mmol), i DMF (4 mL).

Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 125 mg białawej substancji stałej (46%), t.t. 213,9°C.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,53 (br s, 1H); 8,49 (s, 1H); 8,44 (s, 1H); 7,78 (t, J = 7,9 Hz, 1H); 7,63 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 7,59 (d, J = 7,7 Hz, 1H); 7,49 (d, J = 6,9 Hz, 1H); 7,24-7,41 (m, 3H); 4,32-4,45 (m, 2H); 2,14 (s, 3H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 158,9, 157.2, 154,2, 151,5, 149,7, 149,6, 143,5, 136,1, 135,9, 135.1,

133,2, 131,3, 130,3, 130,0, 129,9, 129,1, 127,6, 127.1, 117,8, 32,4, 17,5.

MS (ES): m/z 438,0 (M+).

Anal. obl. dla C21H15ClN6OS: C, 58,00; H, 3,48; Cl, 8,15; N, 19,32; S, 5 7,37.

Stwierdzono: C, 58,05; H, 3,38; Cl 8,89; N, 18,38; S, 7,00.

Związek D-011

5-Chloro-3-(2-fluorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2k (210 mg, 0,650 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (122 mg, 0,715 mmol), K2CO3 (99 mg, 0,715 mmol), i DMF (4 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 240 mg białawej substancji stałej (84%), t.t. 244,O0C.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,56 (br s, 1H); 8,50 (s, 1H); 8,45 (s, 1H); 7,81 (t, J = 8,0 Hz, 1H); 7,74 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,67 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 7,62 (d, J = 7,7 Hz, 1H); 7,46-7,55 (m, 1H); 7,29-7,42 (m, 2H); 4,47-4,59 (m, 2H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 158,4, 157,3 (d, J = 249 Hz), 156,4, 153,8, 151,0, 149,1, 143,2, 135,0, 132,9, 131,8 (d, J = 8,0 Hz), 130,8, 129,9, 126,7, 125,3 (d, J = 3,5 Hz), 123,6 (d, J = 13 Hz), 117,0, 116,2 (d, J = 19 Hz), 31,7.

MS (ES): m/z 439,0 (M+).

Anal, obl. dla C20H12CIFN5OS: C, 54,74; H, 2,76; Cl, 8,08; N, 19,15; S, 7,31.

Stwierdzono: C, 54,42; H, 2,88; Cl, 8,08; N, 18,87; S, 7,08.

Związek D-012

2-(6-Aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-fluorofenylo)-3H- chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2k (210 mg, 0,650 mmol), adeninę (97 mg, 0,715 25 mmol), K2CO3 (99 mg, 0,715 mmol), i DMF (4 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 137 mg beżowej substancji stałej (50%), t.t. 295,6-295,8°C (rozkład).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,05 (s, 1H); 8,04 (B, 1H); 7,75 (t, J = 7,6 Hz, 1H); 7,74 (t, J = 7,9 Hz, 1H); 7,62-7,69 (m, 1H); 7,61 (d, J = 7,6 Hz, 1H); 7,47-7,55 (m, 1H); 7,48 (d, J = 7,8 Hz, 1H); 7,41 (d, J = 8,0 Hz, 1H); 7,24 (br s, 2H); 5,19 (d, J = 17 Hz, 1H); 5,03 (d, J = 17 Hz, 1H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 158,7, 157,6 (d, J = 250 Hz), 156,2, 152,8, 152,4, 150,0, 149,2, 141,8, 135,4, 133,3, 132,5 (d, J = 8,0 Hz), 131,0, 130,4, 127,3. 126,2 (d, J = 3,5 Hz), 123,1 (d, J = 14 Hz),

118.4, 117,6, 117,2 (d, J = 19 Hz), 45,1.

MS (ES): m/z 422,0 (M+).

Anal. obl. dla C2_OH13ClFN7O.0,05 C2H6O: C, 56,92; H, 3,16; Cl, 8,36; N, 23,12.

Stwierdzono: C, 56,79; H, 3,20; Cl, 8,46; N, 22,79.

PL 213 200 B1

Związek D-013

3-Bifenyl-2-ilo-5-chloro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2i (400 mg, 1,05 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (196 mg, 1,15 mmol), K2CO3 (159 mg, 1,15 mmol), i DMF (5 mL). Surowy produkt poddano chromatografii w MeOH/CH2Cl2 i z kolei rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 439 mg bladoźółtej krystalicznej substancji stałej (84%), t.t. 222,0-222,5°C (rozkład).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,56 (br s, 1H); 8,55 (s, 1H); 8,45 (s, 1H); 7,73 (t, J = 8,0 Hz, 1H); 7,64 (d, J = 7,7 Hz, 1H); 7,50-7,59 (m, 4H); 7,41-7,48 (m, 1H); 7,25-7,38 (m, 5H); 4,41 (d, J = 16 Hz, 1H); 4,16 (d, J = 16 Hz, 1H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 160,2, 157,0, 153,7, 151,5, 149,7, 149,3, 143.5, 139,9, 137,8, 135,1,

134.1, 133,3, 131,5, 130,5, 130,3, 130,1, 129,1, 128,9, 128,4, 128,4, 126,9, 117,5, 32,3.

MS (ES): m/z 497,0 (M+).

Anal. obl. dla C26H17ClN6OS: C 62,84; H, 3,45; Cl, 7,13; N, 16,91; S, 6,45.

Stwierdzono: C, 62,60; Η, 3,47; Cl, 7,15; N, 16,65; S, 6,41.

Związek D-014

5-Chloro-3-(2-metoksyfenylo)-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 21 (250 mg, 0,746 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (140 mg, 0,821 mmol), K2CO3 (113 mg, 0,821 mmol), i DMF (4 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 254 mg białawej substancji stałej (76%), t.t. 237,0°C (dec; zmienia barwę w temperaturze 154,6°C).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,53 (br s, 1H); 8,52 (s, 1H); 8,45 (s, 1H); 7,78 (t, J = 7,9 Hz, 1H); 7,64 (d, J = 8,0 Hz, 1H); 7,59 (d, J = 7,7 Hz, 1H); 7,48 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 7,42 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,15 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 7,03 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 4,45 (s, 2H); 3,76 (s, 3H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 158,9, 157,1, 154,8, 154,7, 151,5, 149,6, 143,6, 135,1, 133,2, 131,3,

130,4, 130,0, 127,0, 124,8, 121,2, 117,8, 112,7, 56,1, 32,0.

MS (ES): m/z 451,0 (M+).

Anal. obl. dla C21H15ClN6O2S.0,1 5C2H6O*0,05KCl: C, 55,43; H, 3,47; Cl, 8,07; N, 18,21; S, 6,95.

Stwierdzono: C, 55,49; H, 3,68; Cl, 7,95; N, 17,82; S, 6, 82.

Związek D-015

3-(2-Chlorofenylo)-5-fluoro-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2e (200 mg, 0,619 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (116 mg, 0,681 mmol), K2CO3 (94 mg, 0,681 mmol), i DMF (5 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 152 mg białej substancji stałej (56%), t.t. 222,7-223,80C (zmiana barwy).

¹H NMR (DMS0-d6) δ: 13,56 (br s, 1H); 8,48 (s, 1H); 8,44 (s, 1H); 7,89 (dt, J = 5,6, 8,1 Hz, 1H);

7,76 (dd, J = 5 1,6, 7,3 Hz, 1H); 7,67 (d, J = 7,4 Hz, 1H); 7,56 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 7,47 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 7,41-7,53 (m, 2H); 7,37 (dd, J = 8,7, 11 Hz, 1H); 4,38-4,52 (m, 2H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 160,9 (d, J = 264 Hz), 157,6, 156,8, 154,1, 151,5, 149,6, 149,0, 143,6, 136,4 (d, J = 11 Hz), 133,9, 132,2, 131,7, 131,6, 130,5, 130,2, 128,8, 123,6, 114,4 (d, J = 20 Hz),

110.2, 32,0.

MS (ES): m/z 439,0 (M+).

Anal. obl. dla C2_OH12ClFN6OS.0,5 C2H6O: C 54,61; H, 3,27; Cl, 7,68; N, 18,19; S, 6,94.

Stwierdzono: C, 54,37; H, 3,26; Cl, 7,89; N, 18,26; S, 6,55.

Związek D-016

3-(2-Chlorofenylo)-6,7-dimetoksy-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2a (200 mg, 0,546 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (102 mg, 0,601 mmol), K2CO3 (83 mg, 0,601 mmol), i DMF (5 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 172 mg białawej substancji stałej (65%), t.t. 160-180°C (stopniowy rozkład).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,55 (br s, 1H); 8,49 (s, 1H); 8,44 (s, 1H); 7,72 (d, J = 6,9 Hz, 1H); 7,66 (d, J = 6,9 25 Hz, 1H) 7,38-7,54 (m, 3H); 7,22 (s, 1H); 4,36-4,52 (m, 2H); 3,94 (s, 3H); 3,89 (s, 3H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 160,1, 155,4, 151,5, 151,1, 149,4, 143,2, 134,6, 132,3, 131,6, 131,5,

130,4, 128,7, 113,6, 108,4, 105,8, 56,5, 56,1, 32,0.

MS (ES): m/z 481,1 (Μ+).

Anal. obl. dla C22H_vClN6O3Se.0,5 C2H6O.0,05 KCl: C, 54,41; Η, 3,97; Cl, 7,33; N, 16,55; S, 6,32.

Stwierdzono: C, 54,43; Η, 3,94; Cl, 7,69; N, 16,69; S, 6, 52.

PL 213 200 B1

Związek D-017

6-Bromo-3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2b (200 mg, 0,519 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (97 mg, 0,570 mmol), K2CO3 (79 mg, 0,572 mmol), i DMF (5 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 123 mg białawej substancji stałej (47%), t.t. 212-242°C (stopniowy rozkład).

¹HNMR (DMSO-d6) δ: 13,07 (br S, 1H); 8,48 (s, 1H); 8,44 (s, 1H); 8,24 (d, J = 2,3 Hz, 1H); 8,06 (dd, J = 2,3, 15 8,7 Hz, 1H); 7,76 (dd, J = 1,9, 7,4 Hz, 1H); 7,70 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,66 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 7,51 (dd, J = 2,1, 7,9 Hz, 1H); 7,46 (dd, J = 1,9, 7,9 Hz, 1H); 4,47 (s, 2H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 159,7, 156,8, 153,6, 151,5, 146,1, 143,6, 138,5, 134,0, 132,1, 131,8,

131,5, 130,5, 130,2, 129,9, 20 128,9, 128,8, 122,2, 120,3, 32,0.

MS (ES): m/z 499,0 (M+).

Anal. obl. dla C2_OH12ClBrN6OS.0,2 C2H6O.0,05 KCl: C, 47,79; H, 2,59; N, 16,39; S, 6,25.

Stwierdzono: C, 47,56; H, 2,54; N, 16,25; S, 6,58.

Związek D-018

3-(2-Chlorofenylo)-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-8-trifluorometylo-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2m (200 mg, 0,536 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (100 mg, 0,588 mmol), K2CO3 (82 mg, 0,593 mmol), i DMF (4 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 148 mg białej substancji stałej (56%), t.t. 218,5-219,4°C.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,52 (br s, 1H); 8,48 (s, 1H); 8,44 (s, 1H); 8,43 (d, J = 6,0 Hz, 1H); 8,26 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 7,84 (dd, J = 2,5, 6,7 Hz, 1H); 7,70-7,75 (m, 2H); 7,51-7,59 (m, 2H); 4,40-4,55 (m, 2H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 160,0, 157,2, 154,2, 151,4, 149,6, 144,4, 143,4, 133,8, 133,0 (q, J = 5,1 Hz), 132,0, 131,9, 131,6, 131,4, 130,6, 129,0, 127,3, 125,2 (q, J = 30 Hz), 123,6 (q, J = 273 Hz), 121,8, 32,6.

MS (ES): m/z 489,0 (M+).

Anal. obl. dla C21H12ClF3N6OS: C, 51,59; H, 2,47; Cl, 7,25; N, 17,19; S, 6,56.

Stwierdzono: C, 51,51; H, 2,55; Cl, 7,37; N, 17,05; S, 6,38.

Związek D-019

3-(2-Chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-benzo[g]chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2n (200 mg, 0,563 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (105 mg, 0,619 mmol), K2CO3 (86 mg, 0,619 mmol), i DMF (4 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 128 mg ciemnożółtej substancji stałej (48%), t.t. 247,8-254,4°C (rozkład).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,56 (br s, 1H); 8,90 (s, 1H); 8,50 (s, 1H); 8,46 (s, 1H); 8,34 (s, 1H); 8,27 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 8,16 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 7,81 (dd, J = 1,6, 7,3 Hz, 1H); 7,70 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 7,61-7,74 (m, 2H); 7,49 (t, J = 7,5 Hz, 1H); 7,44-7,53 (m, 1H); 4,44-4,56 (m, 2H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 161,3, 151,6, 151,5, 143,9, 142,2, 128.8,128,6, 128,3, 128,3, 127,1,

125,2, 119,5, 32,4.

MS (ES): m/z 471,0 (M+).

Anal. obl. dla C24H1₅ClN6OS.0,2 C2H6O.0,05 KCl: C, 60,57; H, 3,37; Cl, 7,69; N, 17,37; S, 6,63.

Stwierdzono: C, 60,24; H, 3,46; Cl, 7,50; N, 17,34; S, 6, 69.

Związek D-020

6-Chloro-3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2d (200 mg, 0,587 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (110 mg, 0,646 mmol), K2CO3 (90 mg, 0,651 mmol), i DMF (5 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 113 mg żółtej krystalicznej substancji stałej (42%), t.t. 237,1-238,2°C (rozkład).

¹HNMR (DMS0-d6) δ: 13,55 (br s, 1H); 8,48 (s, 1H); 8,44 (s, 1H); 8,11 (s, 1H); 7,94 (d, J = 8,3 Hz, 1H); 7,78 (d, J =8,1 Hz, 2H); 7,66 (d, J = 6,7 Hz, 1H); 7,48-7,56 (m, 2H); 4,48 (s, 2H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 159,8, 156.8, 153,5, 151,5, 149,6, 145,8, 143,6, 135,7, 134,0, 132,2,

132,1, 131,7, 131,5, 130,5, 130,2, 129,8, 128,8, 125.8, 121,9, 32,0.

MS (ES): m/z 455,0 (M+).

Anal. obl. dla C2_OH12Cl2N6OS.0,1 C2^O«6 H2O (0,15 KCl: C, 50,34; H, 2,89; Cl, 15,82;

N, 17,44; S, 6,65.

PL 213 200 B1

Stwierdzono: C, 50,02; H, 2,63; Cl, 15,51; N, 17,39; S, 6,81.

Związek D-021

8-Chloro-3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2h (200 mg, 0,589 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (124 mg, 0,726 mmol), K2CO3 (100 mg, 0,726 mmol), i DMF (4 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 202 mg białej substancji stałej (75%), t.t. 211,9-212,7°C (rozkład).

¹H NMR (DMS0-d6) δ: 13,54 (br s, 1H); 8,47 (s, 1H); 8,44 (s, 1H); 8,12 (d, J = 1,9 Hz, 1H); 8,07 (d, J = 1,6 Hz, 1H); 7,78 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 7,67 (d, J = 7,1 Hz, 1H); 7,58 (t, J = 7,9 Hz, 1H); 7,427,54 (m, 2H); 4,52 (s, 2H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 160,3, 156,9, 153,9, 151,5, 149,7, 143,5, 135,7, 134,0, 132,1, 131,8,

131,4, 131,1, 130,5, 130,3, 128,9, 128,3, 126,1, 122,4, 32,5.

MS (ES): m/z 455,0 (M+).

Anal. obl. dla C20H12Cl2N6OS: C, 52,76; H, 2,66; Cl, 15,57; N, 18,46; S, 7,04.

Stwierdzono: C, 52,65; H, 2,79; Cl, 15,32; N, 18,47; S, 7,18.

Związek D-022

3-(2-Chlorofenylo)-7-fluoro-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2c (200 mg, 0,619 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (116 mg, 0,681 mmol), K2CO3 (95 mg, 0,687 mmol), i DMF (4 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 143 mg białej krystalicznej substancji stałej (53%), t.t. 151,4-154,2°C (zmiana barwy).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,55 (br s, 1H); 8,48 (s, 1H); 8,44 (s, 1H); 8,23 (dd, J = 6,3, 8,7 Hz, 1H);

7,77 (dd, J = 1,7, 7,4 Hz, 1H); 7,64 (d, J = 7,4 Hz, 1H); 7,57 (d, J = 9,8 Hz, 1H); 7,45-7,52 (m, 3H);

4,48 (s, 2H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 169,0 (d, J = 253 Hz), 162,6, 159,3, 157,0, 154,0, 152,2, 151,7 (d, J = 13 Hz), 146,1, 136,5, 134,7, 134,2, 134,0, 133,0, 132,6 (d, J = 11 Hz), 131,3, 120,2, 118,9 (d, J = 24 Hz), 115,3 (d, J = 22 Hz), 34,6.

MS (ES): m/z 439,0 (M+).

Anal. obl. dla C.U.-ClFN.-OS.O^ C2H6O.0,4 H2O (0,15 KCl: C, 52,52; Η, 3,22; Cl, 8,57; N, 17,67.

Stwierdzono: C, 52,25; H, 3,11; Cl, 8,20; N, 17,69.

Związek D-023

3-(2-Chlorofenylo)-7-nitro-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2o (216 mg, 0,617 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (116 mg, 0,681 mmol), K2CO3 (94 mg, 0,680 mmol), i DMF (4 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 212 mg żółtej krystalicznej substancji stałej (74%), t.t. 218,0-218,3°C (rozkład).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,56 (br s, 1H); 8,49 (s, 1H); 8,42 (s, 1H); 8,38-8,45 (m, 2H); 8,31 (d, J = 8,4 Hz, 1H); 7,81 (d, J = 6,5 Hz, 1H); 7,68 (d, J = 6,7 Hz, 1H); 7,43-7,58 (m, 2H); 4,53 (s, 2H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 157,7, 154,4, 153,3, 149,8, 149,3, 147,6, 145,2, 141,4, 131,5, 129,8, 129,7, 129,2, 128,4, 127,1, 126,7, 122,7, 120,3, 119,4, 29,9.

MS (ES): m/z 466,0 (M+).

Anal. obl. dla C2_OH12ClN7O3S.0,4 C2H6O.0,05 KCl: C, 51,19; H, 2,97; Cl, 7,63; N, 20,09; S, 6,57.

Stwierdzono: C, 51,27; H, 2,88; Cl, 7,40; N, 20,04; S, 6,52.

Związek D-024

3-(2-Chlorofenylo)-6-hydroksy-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2p (200 mg, 0,552 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (117 mg, 0,685 mmol), K2CO3 (95 mg, 0,687 mmol), i DMF (4 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 182 mg białej substancji stałej, mieszaniny pożądanego produktu i pochodnej acetylowej. Porcję tego materiału (120 mg) zawieszono w mieszaninie MeOH (2 mL) i wodnego NaHCO3 (nasyc., 1 mL) i mieszano energicznie przez 4 godziny. Mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, zawieszono w H2O (10 mL), i przechowywano w temperaturze 4°C przez noc. Białą substancję stałą zebrano i osuszono, otrzymując 103 mg (66%), t.t. 186-214°C (stopniowy rozkład).

¹H NMR (DMS0-d6) δ: 8,48 (s, 1H); 8,45 (s, 1H); 7,71 (d, J = 6,8 Hz, 1H); 7,62-7,64 (m, 2H); 7,43-7,51 (m, 2H); 7,40-7,43 (m, 1H); 7,35 (d, J = 8. 8 Hz, 1H); 4,39-4,52 (m, 2H).

PL 213 200 B1 ¹³C NMR (DMS0-d6) ppm: 160,6, 157,1, 156,2, 151,4, 150,8, 149,3, 144,1, 140,2, 134,5, 132,2,

131.6, 131,4, 130,4, 129,3, 128,7, 124,8, 15 121,7, 109,3, 32,0.

MS (ES): m/z 437,0 (M+).

Anal. obl. dla (2 C_2OH13ClN6O₂S.0,1 C₂^O, 6 H₂O: C, 49,68; H, 3,88; Cl, 7,26; N, 17,21; S, 6,57.

Stwierdzono: C, 49,43; H, 3,62; Cl, 7,32; N, 17,07; S, 6,58.

Związek D-025

5-Chloro-3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2f (300 mg, 0,883 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (165 mg, 0,972 mmol), K2CO3 (134 mg, 0,972 mmol), i DMF (4 25 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 341 mg bladopomarańczowej krystalicznej substancji stałej (85%), t.t. 233,7-234,4°C (rozkład).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,58 (br s, 1H); 8,50 (s, 1H); 8,47 (s, 1H); 7,77-7,85 (m, 2H); 7,68 (d, J = 8,1 Hz, 2H); 7,65 (d, J = 7,7 Hz, 1H); 7,41-7,56 (m, 2H); 4,45 (d, J = 1,2 Hz, 2H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 158,7, 156,8, 153,8, 151,5, 149,6, 149,5, 143,5, 135,4, 134,1, 133,3,

132,2, 131,6, 131,6, 130,5, 130,2, 128,8, 127,1, 117,6, 32,0.

MS (ES): m/z 455,0 (M+).

Anal. obl. dla C_2OH1₂Cl₂N6OS.C₂H6»0,3 H₂O: C, 52,14; H, 3,70; Cl, 13,99; N, 16,58; S, 6,33.

Stwierdzono: C, 52,07; H, 3,37; Cl, 13,40; N, 16,65; S, 6,42.

Związek D-026

3-(2-Chlorofenylo)-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2g (300 mg, 0,940 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (176 mg, 1,03 mmol), K2CO3 (142 mg, 1,03 mmol), i DMF (5 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 324 mg białej krystalicznej substancji stałej (79%), t.t. 227,8-230,1°C (rozkład).

¹HNMR (DMSO-d6) δ: 13,57 (br s, 1H); 8,49 (S, 1H); 8,47 (s, 1H); 7,69-7,78 (m, 2H); 7,66 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 7,55 (d, J = 7,9 Hz, 1H); 7,39-7,52 (m, 2H); 7,36 20 (d, J = 6,9 Hz, 1H); 4,38-4,50 (m, 2H); 2,74 (s, 3H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 161,2, 156,3, 152,4, 151,5, 148,6, 143,9, 141,0, 134,6, 134,5, 132,3,

131.7, 131,4, 130,4, 130,2, 128,7, 125,7, 119,0, 32,0, 22,8.

MS (ES): m/z: 435,0 (M+).

Anal. obl. dla C₂1H1₅ClN6OS.0,65 C₂H6O.0,1 H₂O: C, 57,40; H, 4,13; Cl, 7,60; N, 18,01; S, 6,87.

Stwierdzono: C, 57,11; H, 3,96; Cl, 7,45; N, 17,79; S, 6,90.

Związek D-027

3-(2-Chlorofenylo)-6,7-difluoro-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2q (200 mg, 0,586 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (110 mg, 0,645 mmol), K2CO3 (89 mg, 0,645 mmol), i DMF (4 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 143 mg bladożółtej krystalicznej substancji stałej (53%), t.t. 207,8°C (zmienia barwę; poci się w temperaturze 136°C).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,57 (br S, 1H); 8,49 (s, 1H); 8,46 (s, 1H); 8,11 (t, J = 9,4 Hz, 1H); 7,88 (dd, J = 7,3, 11 Hz, 1H); 7,77 (dd, J = 1,7, 7,3 Hz, 1H); 7,67 (d, J = 7,4 Hz, 1H); 7,42-7,55 (m, 2H);

4,48 (s, 2H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 159,5 (d, J = 2,5 Hz), 154,6 (dd, J = 14,255 Hz), 154,0 (d, J = 1,5 Hz),

151,5, 149,3 (dd, J = 14, 250 Hz), 145,1 (d, J = 12 Hz), 143,9, 133,9, 132,1, 131,8, 131,4, 130,5, 128,9, 118,0 (d, J = 4,9 Hz), 115,8 (d, J = 18 Hz), 114,6 (d, J = 20 Hz), 32,0.

MS (ES): m/z 457,0 (M+).

Anal. obl. dla C20H11ClF2N6OS: C, 52,58; H, 2,43; Cl, 7,76; N, 18,40; S, 7,02.

Stwierdzono: C, 51,81; H, 2,37; Cl, 7,49; N, 18,04; S, 7,55.

Związek D-028

3-(2-Chlorofenylo)-6-fluoro-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując związek pośredni 2r (118 mg, 0,365 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (68 mg, 0,402 mmol), K2CO3 (56 mg, 0,402 mmol), i DMF (2 mL). Surowy produkt rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 103 mg białawej krystalicznej substancji stałej (64%), t.t. 232,8-233,0°C (zmiana barwy).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,56 (br s, 1H); 8,48 (s, 1H); 8,44 (s, 1H); 7,81-7,86 (m, 3H); 7,76 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 7,67 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 7,40-7,54 (m, 2H); 4,48 (br s, 2H).

PL 213 200 B1 ¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 160,8 (d, J = 247 Hz), 160,2 (d, J = 3,3 Hz), 156,9, 152,3 (d, J = 1,9 Hz),

151,5, 149,7, 144,0, 143,6, 134,1, 132,1, 131,7, 131,5, 130,5, 130,4, 130,2, 128,8, 124,0 (d, J = 24 Hz), 122,0 (d, J = 8,7 Hz), 111,7 (d, J = 24 Hz), 32,0.

MS (ES): m/z 439,0 (M+).

Anal. obl. dla C2_OH12ClFN6OS.0,2 C2H6O.0,1 H2O: C, 54,46; H, 3,00; Cl, 7,88; N, 18,68.

Stwierdzono: C, 54,09; H, 2,73; Cl, 7,80; N, 18,77.

Związek D-029

2-(6-Aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-izopropylofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-on

Chlorek tionylu (2,2 mL, 30 mmol) dodano do mieszanego roztworu kwasu 2-amino-6-metylobenzoesowego (1,51 g, 10 mmol) w benzenie (50 mL) i mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 18 h. Po ochłodzeniu rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i odpędzono dwukrotnie z benzenem (25 mL). Pozostałość rozpuszczono w CHCI3 (50 mL) i potraktowano 2-izopropyloaniliną (2,83 mL, 20 mmol). Następnie zawiesinę ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 3 h. W tym momencie TLC (50% EtOAc/heksan) wykazała, że reakcja była zakończona. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej mieszaninę reakcyjną wylano na wierzch warstwy 4 cm żelu krzemionkowego i spłukano przez nią przy użyciu 20% EtOAc/heksan. Frakcje zawierające produkt połączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w HOAc (50 mL) i potraktowano chlorkiem chloroacetylu (1,6 mL, 2 0 mmol) i mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 18 h. Reakcję ochłodzono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostały HOAc usunięto przez destylację azeotropową z toluenem (25 mL) trzy razy. Pozostałość rozpuszczono w toluenie (10 mL) i przelano przez warstwę 4 cm żelu krzemionkowego, spłukując przez nią przy użyciu 20% EtOAc/heksan. Frakcje zawierające produkt zidentyfikowano metodą LCMS (MS (ES): m/z 327 (M+)), i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 975 mg (30%) jako białą pianę. Białą pianę chlorku (450 mg, 1,36 mmol) rozpuszczono w DMF (10 mL) i potraktowano adeniną (275 mg, 2,04 mmol) i K2CO3 (281 mg, 2,04 mmol) i mieszaninę mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie zawiesinę wylano do 200 mL wody, mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 min, po czym oziębiono w lodówce przez 3 0 min. Otrzymaną substancję stałą zebrano przez odsączenie pod zmniejszonym ciśnieniem i rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 285 mg (49%) białawej substancji stałej, t.t. 258,0-258,2°C.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,19 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,60 (m, 3H), 7,45 (m, 2H), 7,23 (m, 3H), 5,11 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 4,71 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 2,68 (s, 3H), 2,73 (q, J = 6,9 Hz, 1H), 1,34 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,13 (d, J = 6,8 Hz, 3H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 161,9, 156,2, 152,8, 151,6, 150,1, 148,4, 146,1, 142,2, 25 140,8,

134,3, 133,7, 130,6, 130,0, 129,0, 127/7, 127,6, 125,8, 119,2, 118,4, 44,8, 28,3, 24,4, 23,3, 22,9.

MS (ES): m/z 426,4 (M+).

Anal. obl. dla C24H23N7O: C, 67,75; H, 5,45; N, 23,04.

Stwierdzono: C, 67,60; H, 5,45; N, 22,82.

Związek D-030

2-(6-Aminopuryn-9-ylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on

Chlorek tionylu (2,2 mL, 30 mmol) dodano do mieszanego roztworu kwasu 2-amino-6metylobenzoesowego (1,51 g, 10 mmol) w benzenie (50 mL) i mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 18 h. Po ochłodzeniu rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i odpędzono dwukrotnie z benzenem (25 mL). Pozostałość rozpuszczono w CHCI3 (5,0 mL) i potraktowano o-toluidyną (2,13 mL, 20 mmol). Następnie zawiesinę ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 3 h. W tym momencie TLC (50% EtOAc/heksan) wykazała, że reakcja była zakończona. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej mieszaninę reakcyjną wylano na wierzch warstwy 4 cm żelu krzemionkowego i spłukano przez nią przy użyciu 20% EtOAc/heksan. Frakcje zawierające produkt połączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w HOAc (50 mL) i potraktowano chlorkiem chloroacetylu (1,6 mL, 20 mmol) i mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 18 h. Reakcję ochłodzono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostały HOAc usunięto przez destylację azeotropową z toluenem (25 mL) trzy razy. Pozostałość rozpuszczono w toluenie (10 mL) i przelano przez warstwę 4 cm żelu krzemionkowego, spłukując przez nią przy użyciu 20% EtOAc/heksan, Frakcje zawierające produkt zidentyfikowano metodą LCMS [MS (ES): m/z 299 (M+)], i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 476 mg (16%) jako białą pianę. Białą pianę chlorku (470 mg, 1,57 mmol) rozpuszczono w DMF (10 mL) i potraktowano adeniną (423 mg, 3,14 mmol) i K2CO3 (433 mg, 3,14 mmol) i mieszaninę mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie zawiesinę

PL 213 200 B1 wylano do 200 mL H2O, mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 min, po czym oziębiono w lodówce przez 30 min.

Otrzymaną substancję stałą zebrano przez odsączenie pod zmniejszonym ciśnieniem i rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 123 mg (20%) białawej substancji stałej, t.t. 281,5-282,7°C (rozkład).

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,07 (s, 1H); 8,05 (s, 1H); 7,61 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,48 (m, 4H), 7,25 (m, 3H), 5,09 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 4,76 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 2,73 (s, 3H), 2,18 (s, 3H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 161,3, 156,2, 152,8, 151,4, 150,0, 148,5, 142,2, 140,9, 136,1, 135,4,

134,3, 131,7, 130,1, 130,0, 129,0, 128,0, 125,8, 119,2, 118,5, 44,8, 22,9, 17,4.

MS (ES): m/z 398,2 (M+).

Anal. obl. dla C22H19N7O: C, 66,49; H, 4,82; 15 N, 24,67.

Stwierdzono: C, 66,29; H, 4,78; N, 24,72.

Związek D-031

3-(2-Fluorofenylo)-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Chlorek tionylu (2,2 mL, 30 mmol) dodano do mieszanego roztworu kwasu 2-amino-6-metylobenzoesowego (1,51 g, 10 mmol) w benzenie (50 mL) i mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 18 h. Po ochłodzeniu rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i odpędzono dwukrotnie z benzenem (25 mL). Pozostałość rozpuszczono w CHCI3 (50 mL) i potraktowano 2-fluoroaniliną (1,93 mL, 20 mmol). Następnie zawiesinę ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 3 h. W tym momencie TLC (50% EtOAc/heksan) wykazała, że reakcja była zakończona. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej mieszaninę reakcyjną wylano na wierzch warstwy 4 cm żelu krzemionkowego i spłukano przez nią przy użyciu 20% EtOAc/heksan. Frakcje zawierające produkt połączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w HOAc (50 mL) i potraktowano chlorkiem chloroacetylu (1,6 mL, 20 mmol) i mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 18 h. Reakcję ochłodzono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostały HOAc usunięto przez destylację azeotropową z toluenem (25 mL) trzy razy.

Pozostałość rozpuszczono w toluenie (10 mL) i przelano przez warstwę 4 cm żelu krzemionkowego, spłukując przez nią przy użyciu 20% EtOAc/heksan. Frakcje zawierające produkt zidentyfikowano metodą LCMS [MS (ES): m/z 303 (M+)), i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 1,12 g (37%) jako białą pianę. Białą pianę chlorku (455 mg, 1,50 mmol) rozpuszczono w DMF (10 mL) i potraktowano monohydratem 6-merkaptopuryny (510 mg, 3,0 mmol) i K2CO3 (414 mg, 3,0 mmol) i mieszaninę mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie zawiesinę wylano do 200 mL wody, mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 min, po czym oziębiono w lodówce przez 30 min. Otrzymaną substancję stałą zebrano przez odsączenie pod zmniejszonym ciśnieniem i rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 487 mg (77%) białawej substancji stałej, t.t. 151,9-152,2°C.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,48 (s, 1H), 8,44 (s, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,48 (m, 2H), 7,33 (m, 3H), 4,55 (d, J = 15,1 Hz, 1H), 4,48 (d, J = 15,1 Hz, 1H), 2,73 (s, 3H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 161,3, 157,8 (d, J = 249,1 Hz), 156,9, 152,8, 151,5, 149,6, 148,6,

143,6, 140,9, 134,7, 131,9 (d, J = 8,0 Hz), 131,4, 130,2, 125,6 (d, J = 3,6 Hz), 125,5, 124,4 (d, J = 13,5 Hz), 118,8, 116,6 (d, J = 19,6 Hz), 56,4, 22,9.

MS (ES): m/z 419,5 (M+).

Anal. obl. dla C21H15FN6O.0,15 C2H6O: C, 60,14; H, 3,77; F, 4,47; N, 19,76; S, 7,54.

Stwierdzono: C, 59,89; H, 3,88; F, 4,42; N, 19,42; 5 S, 7,23.

Związek D-032

2-(6-Aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-o-tolilo-3H-chinazoIin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 2j (200 mg, 0,626 mmol), adeninę (93 mg, 0,689 mmol), K2CO3 (95 mg, 0,689 mmol), i DMF (3 mL). Surowy produkt poddano chromatografii w MeOH/CH2Cl2, z wytworzeniem 101 mg białawej substancji stałej (39%), t.t. 262,0-266,5°C.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,08 (s, 1H); 8,07 (s, 1H); 7,70 (t, J = 8,0 Hz, 1H); 7,58 (dd, J = 0,6,

7,9 Hz, 1H); 7,43-7,57 (m, 4H); 7,36 (dd, J = 0,7, 8,0 Hz, 1H); 7,26 (br S, 2H); 5,12 (d, J = 18 Hz, 1H);

4,78 (d, J = 18 Hz, 1H); 2,20 (s, 3H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 158,7, 156,2, 152,9, 152,7, 150,0, 149,4, 142,1, 136,1, 135,1, 135,0,

133,2, 131,8, 130,3, 130,1, 128,9, 128,1, 127,2, 118,5, 117,9, 44,9, 17,4.

MS (ES): m/z 418,1 (M+).

Anal. obl. dla C21H16ClNyO«1 H2O.0,05 KCl: C, 59,57; H, 3,86; Cl, 8,79; N, 23,16.

Stwierdzono: C, 59,65; H, 3,80; Cl, 8,70; N, 22,80.

PL 213 200 B1

Związek D-033

2- (6-Aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-metoksyfenylo)-3H-chinazolin-4-on

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 21 (250 mg, 0,746 mmol), adeninę (111 mg,

0,821 mmol), K2CO3 (113 mg, 0,821 mmol), i DMF (4 mL). Surowy produkt poddano chromatografii w MeOH/CH2Cl2 i rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 124 mg brunatnej substancji stałej (38%), t.t. 257,0-257,1°C.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,06 (s, 1H); 8,01 (s, 1H); 7,71 (t, J = 8,0 Hz, 1H); 7,57 (dd, J = 0,9, 7,9 Hz, 1H); 7,52-7,59 (m, 1H); 7,50 (dd, J = 1,6, 7,8 Hz, 1H); 7,38 (dd, J = 1,1, 8,2 Hz, 1H); 7,27 (dd, J = 0,6, 8,3 Hz, 1H); 7,24 (br s, 2H); 7,17 (dt, J = 0,9, 7,6 Hz, 1H); 5,07 (d, J = 17 Hz, 1H); 4,97 (d, J = 17 Hz, 1H); 3,79 (s, 3H).

¹³C NMR (DMSO-d6) ppm: 158,8, 156,2, 154,7, 153,2, 152,8, 150,1, 149,3, 142,0, 135,1, 133,2,

131,8, 130,1, 130,1, 127,2, 123,8, 121,6, 118,4, 117,9, 113,1, 56,2, 44,8.

MS (ES): m/z 434,0 (M+).

Anal. obl. dla C21H16CW7O2· 0,5 ^^0,04 KCl: C, 56,57; H, 3,84; Cl, 8,27; N, 21,99.

Stwierdzono: C, 56,29; H, 3,75; Cl, 8,21; N, 21,61.

Następujące związki zostały wytworzone ogólnie zgodnie z opisanymi wyżej sposobami i służą do dalszego zilustrowania konkretnych wykonań związków według wynalazku:

3- (2,6-dichlorofenylo)-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-034)

3-(2-izopropylofenylo)-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-035)

3-(2-metoksyfenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-036)

3-benzylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-037)

3-butylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-038)

3-morfolin-4-ylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on, sól octanowa (D-039)

3-(3-metoksyfenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-040)

3-(3-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-041)

2- (9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3-pirydyn-4-ylo-3H-chinazolin-4-on (D-042)

3- benzylo-5-fluoro-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-043)

3-(4-metylopiperazyn-1-ylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on, sól octanowa (D-044) ester etylowy kwasu

[5-fluoro-4-okso-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-4H-chinazolin-3-ylo]octowego (D-045)

3-(2-metoksyfenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-046)

3-(2-metoksyfenylo)-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-047)

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-fluorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-on (D-048)

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-benzylo-5-fluoro-3H-chinazolin-4-on (D-049)

2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-butylo-3H-chinazolin-4-on (D-050)

2- (6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-morfolin-4-ylo-3H-chinazolin-4-on, sól octanowa (D-051)

3- (4-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-052).

Dodatkowe związki według niniejszego wynalazku wytworzono następującymi procedurami syntetycznymi.

Następujące związki pośrednie wytworzono opisaną wyżej Procedurą A.

ci

3a R = cyklopropyl

3b R = cyklopropylometyl

3c R = fenetyl

3d R = cyklopentyl

3e R = 3-(2-chloro)pirydyl

3f R = kwas 4-(2-metylo)benzoesowy

3g R = 4-nitrobenzyl

3h R = cykloheksyl

3i R = E-(2-fenylo)cyklopropyl

PL 213 200 B1

W następującym dziale doświadczalnym są omawianie dodatkowe związki według niniejszego wynalazku (D-053 do D-070) mające następującą strukturę rdzenia. Wszystkie zostały wytworzone zgodnie z Procedurą C.

Struktura rdzenia:

Nr związku	R	R'
D-053	cyklopropyl	C
D-054	cyklopropylometyl	B
D-055	cyklopropylometyl	A
D-056	cyklopropylometyl	C
D-057	fenetyl	B
D-058	fenetyl	C
D-059	cyklopentyl	B
D-060	cyklopentyl	A
D-061	3-(2-chloro)pirydyl	B
D-062	3-(2-chloro)pirydyl	A
D-063	kwas 4-(2-metylo)benzoesowy	B
D-064	cyklopropyl	B
D-065	cyklopropyl	A
D-066	4-nitrobenzyl	B
D-067	cykloheksyl	B
D-068	cykloheksyl	A
D-069	cykloheksyl	C
D-070	E-(2-fenylo)cyklopropyl	B

PL 213 200 B1

2- (2-Amino-9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3-cyklopropylo-5-metylo-3H-chinazolin-4-on (D-053)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3a (100 mg, 0,4 mmol), 2-amino-6-merkaptopurynę (80 mg, 0,48 mmol), i K2CO3 (77 mg, 0,56 mmol). Produkt oczyszczono przez roztarcie z H2O.

¹H NMR (DMSO-dg) δ: 7,89 (d, J = 0,9 Hz, 1H); 7,54 (t, J = 7,4 Hz, 1H); 7,34 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 7,19 (d, J = 7,2 Hz, 1H); 6,28 (s, 2H); 4,94 (s, 2H); 2,70 (s, 3H); 1,24 (d, J = 6,5 Hz, 2H); 0,91 (s, 2H).

MS (ES): m/z 380 (M+H), 190.

3- Cyklopropylometylo-5-metyło-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-054)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3b (300 mg, 1,14 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (214 mg, 1,26 mmol), i K2CO3 (189 mg, 1,37 mmol). Produkt oczyszczono przez roztarcie z H2O, a następnie rekrystalizację z MeOH.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,60 (br s, 1H); 8,72 (s, 1H); 8,48 (s, 1H); 7,63 (t, J = 7,8 Hz, 1H); 7,42 (d, J = 8,0 Hz, 1H); 7,28 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 5,01 (s, 2H); 4,11 (d, J = 6,8 Hz, 2H); 2,78 10 (s, 3H); 1,35 (kwint, J = 6,2 Hz, 1H); 0,44-0,59 (m, 4H).

MS (ES): m/z 379 (M+H), 325.

2-(6-Aminopuryn-9-ylometylo)-3-cyklopropylometylo-5-metylo-3H-chinazolin-4-on (D-055)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3b (300 mg, 1,14 mmol), adeninę (170 mg, 1,26 mmol), i K2CO3 (189 mg, 1,37 mmol). Produkt oczyszczono przez roztarcie z H2O, a następnie rekrystalizację z MeOH.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,21 (s, 1H); 8,10 (s, 1H); 7,52 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,18-7,31 (m, 3H); 7,06 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 5,68 (s, 2H); 4,14 (d, J = 6,8 Hz, 2H); 2,77 (s, 3H); 1,34 (kwint, J = 6,4 Hz, 1H); 0,45-0,60 (m, 4H).

MS (ES): m/z 362 (M+H), 308.

2-(2-Amino-9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3-cyklopropylometylo-5-metylo-3H-chinazolin-4-on (D-056)

PL 213 200 B1

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3b (280 mg, 1,1 mmol), 2-amino-6-merkaptopurynę (200 mg, 1,2 mmol), i K2CO3 (180 mg, 1,3 mmol). Produkt oczyszczono przez roztarcie z MeOH.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 12,70 (br s, 1H); 7,95 (s, 1H); 7.64 (t, J = 7,8 Hz, 1H); 7,44 (d, J = 7,9 Hz, 1H); 7,28 (d, J = 7,4 Hz, 1Η); 6,41 (s, 2H); 4,91 (s, 2H); 4,05 (d, J = 6,8 Hz, 2H); 2,78 (s, 3H); 1,26-1,43 (m, 1H); 0,36-0,56 (m, 4H).

MS (ES): m/z 394 (M+H), 340.

5-Metylo-3-fenetylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-057)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3c (750 mg, 2,4 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (442 mg, 2,6 mmol), i K2CO3 (398 mg, 2,9 mmol). Produkt oczyszczono przez roztarcie z H2O.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,61 (s, 1H); 8,71 (s, 1H); 8,48 (s, 1H); 7,65 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,44 (d, J = 7. 9 Hz, 1H); 7,16-7,35 (m, 6H); 4,89 (s, 2H); 4,29 (br t, J = 7,9 Hz, 2H); 3,08 (br t, J = 7,8 Hz, 2H); 2,81 (s, 3H).

MS (ES): m/z 429 (M+H), 105.

2- (2-Amino-9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-5-metylo-3-fenylo-3H-chinazolin-4-on (D-058)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3c (750 mg, 2,4 mmol), 2-amino-6-merkaptopurynę (435 mg, 2,6 mmol), i K2CO3 (398 mg, 2,9 mmol). Produkt oczyszczono przez roztarcie z H2O.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 12,61 (s, 1H); 7,95 (s, 1H); 7,65 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,45 (d, J = 7,9 Hz, 1H); 7,14-7,32 (m, 6H); 6,44 (s, 2H); 4,81 (s, 2H); 4,24 (br t, J = 7,9 Hz, 2H); 3,04 (br t, J = 7,8 Hz, 2H); 2,81 (s, 3H).

MS (ES): m/z 444 (M+H), 340.

3- Cyklopentylo-5-metyło-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-059)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3d (100 mg, 0,36 mmol), monohydrat

6-merkaptopuryny (73 mg, 0,43 mmol), i K2CO3 (100 mg, 0,72 mmol). Produkt oczyszczono metodą rekrystalizacji z MeOH.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,62 (br s, 1H); 8,77 (s, 1H); 8,48 (s, 1H); 7,62 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,42 (d, J = 7,8 HZ, 2H); 7,26 (d, J = 7,4 Hz, 1H); 5,03 (s, 2H); 5 4,80 (kwint, J = 8,0 Hz, 1H); 2,76 (s, 3H); 2,12-2,31 (m, 2H); 1,79-2,04 (m, 4H); 1,44-1,58 (m, 2H).

MS (ES): m/z 393 (M+H), 325.

2- (6-Aminopuryn-9-ylometylo)-3-cyklopentylo-5-metylo-3H-chinazolin-4-on (D-060)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3d (100 mg, 0,36 mmol), adeninę (58 mg,

0,43 mmol), i K2CO3 (100 mg, 0,72 mmol). Produkt oczyszczono metodą rekrystalizacji z MeOH.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,15 (s, 1H); 8,11 (s, 1H); 7,52 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,16-7,31 (m, 3H);

7,10 (d, J = 8,0 Hz, 2H); 5,68 15 (s, 2H); 4,78 (kwint, J = 8,3 Hz, 1H); 2,74 (s, 3H); 2,09-2,32 (m, 2H); 1,86-2,04 (m, 2H); 1,68-1,86 (m, 2H); 1,43-1,67 (m, 2H).

MS (ES): m/z 376 (M+H), 308, 154.

3- (2-Chloro-pirydyn-3-ylo)-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-061)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3e (500 mg, 1,6 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (289 mg, 1,7 mmol), i K2CO3 (262 mg, 1,9 mmol). Produkt oczyszczono przez roztarcie z H2O.

MS (ES): m/z 436 (M+H), 200.

2-(6-Aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chloro-pirydyn-3-ylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-on (D-062)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3e (500 mg, 1,6 mmol), adeninę (230 mg,

1,7 mmol), i K2CO3 (262 mg, 1,9 mmol). Produkt oczyszczono przez roztarcie z H2O.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,59 (dd, J = 1,7, 4,8 Hz, 1H); 8,22 (dd, J = 1,7, 7,8 Hz, 1H): 8,025 (s, 1H); 8,017 (s, 1H); 7,60-7,72 (m, 2H); 7,35 (t, J = 8,2 Hz, 2H); 7,22 (s, 2H); 5,12 (d, J = 17,0 Hz, 1H); 5,02 (d, J = 17,0 Hz, 1H); 2,72 (s, 3H).

MS (ES): m/z 419 (M+H).

Kwas 3-metylo-4-[5-metylo-4-okso-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-4H-chinazolin-3-ylo]-benzoesowy (D-063)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3f (400 mg, 1,17 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (219 mg, 1,29 mmol), i K2CO3 (226 mg, 1,64 mmol). Produkt oczyszczono metodą rekrystalizacji z MeOH.

PL 213 200 B1 ¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,54 (br s, 1H); 8,44 (s, 1H); 8,42 (s, 1H); 7,80 (s, 2H); 7,71 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,59 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,52 (d, J = 7,9 Hz, 1H); 15 7,34 (d, J = 7,4 Hz, 1H); 4,46 (d, J = 15,4 Hz, 1H); 4,34 (d, J = 15,7 Hz, 1H); 3,17 (d, J = 4,4 Hz, 1H); 2,73 (s, 3H); 2,17 (s, 3H).

MS (ES): m/z 459 (M+H).

3-Cyklopropylo-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-064)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3a (100 mg, 0,40 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (90 mg, 0,53 mmol), i K2CO3 (97 mg, 0,7 mmol). Produkt oczyszczono przez roztarcie z H2O.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,69 (d, J = 0,8 Hz, 1H); 8,47 (s, 1H); 7,57 (d, J = 7,9 Hz, 1H); 7,37 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 7,23 25 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 5,08 (s, 2H); 3,06-3,18 (m, 1H); 2,74 (s, 3H); 1,14-1,36 (m, 2H); 0,92-1,06 (m, 2H).

2- (6-Aminopuryn-9-ylometylo)-3-cyklopropylo-5-metylo-3H-chinazolin-4-on (D-065)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3a (100 mg, 0,40 mmol), adeninę (94 mg,

0,7 mmol), i K2CO3 (121 mg, 0,88 mmol). Produkt oczyszczono przez roztarcie z H2O.

¹H NMR (DMSO-dg) δ: 8,19 (d, J = 0,9 Hz, 1H); 8,09 (d, J = 1,0 Hz, 1H); 7,48 (t, J = 7,8 Hz, 1H); 7,13-7,29 (m, 3H); 7,04 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 5,74 (s, 2H); 3,00-3,13 (m, 1H); 2,73 (s, 3H); 1,18-1,38 (m, 2H); 0,94-1,09 (m, 2H) .

5-Metylo-3-(4-nitro-benzylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-066)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3g (200 mg, 0,58 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (148 mg, 0,87 mmol), i K2CO3 (160 mg, 1,16 mmol). Produkt oczyszczono przez roztarcie z MeOH.

¹H NMR (DMSO-dg) δ: 13,44 (br s, 1H); 8,50 (s, 1H); 8,31 (s, 1H); 8,03 (d, J = 8,6 Hz, 2H); 7,58 (t, J = 7,9 Hz, 1H); 7,37 (d, J = 8,3 Hz, 3H), 7,22 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 5,44 (s, 2H); 4,70 (s, 2H); 2,66 (s, 3H).

MS (ES): m/z 460 (M+H).

3- Cykloheksylo-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-067)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3h (150 mg, 0,52 mmol), monohydrat 6-merkaptopuryny (97 mg, 0,57 mmol), i K2CO3 (86 mg, 0,62 mmol). Produkt oczyszczono przez roztarcie z MeOH.

¹H NMR (DMSO-dg) δ: 13,66 (br s, 1H); 8,82 (s, 1H); 8,50 (s, 1H); 7,62 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,42 (d, J = 8,0 Hz, 1H); 7,26 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 5,01 (s, 2H); 4,11 (br s, 1H); 2,75 (s, 3H); 2,38-2,65 (m, 2H); 1,58-1,90 (m, 4H); 1,37-1,57 (m, 1H); 0,71-1,26 (m, 3H).

MS (ES): m/z 407 (M+H), 325.

2-(6-Aminopuryn-9-ylometylo)-3-cykloheksylo-5-metylo-3H-chinazolin-4-on (D-068)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3h (150 mg, 0,52 mmol), adeninę (77 mg, 0,57 mmol), i K2CO3 (86 mg, 0,62 mmol) . Produkt oczyszczono przez roztarcie z MeOH.

¹H NMR (DMS0-d6) δ: 8,15 (s, 2H); 7,54 (t, J = 7,9 Hz, 1H); 7,06- 7,35 (m, 4H); 5,65 (s, 2H); 4,09 (br s, 1H); 2,73 (s, 3H); 1,41-1,90 (m, 6H); 0,99-1,34 (m, 4H).

MS (ES): m/z 390 (M+H), 308 .

2-(2-Amino-9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3-cykloheksylo-5-metylo-3H-chinazolin-4-on (D-069)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3h (150 mg, 0,52 mmol), 2-amino-6-merkaptopurynę (95 mg, 0,57 mmol), i K2CO3 (86 mg, 0,62 mmol) . Produkt oczyszczono metodą HPLC z odwróconymi fazami (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220).

MS (ES): m/z 422 20 (M+H), 340, 170.

5-Metylo-3-(E-2-fenyIo-cyklopropylo)-2-(9H-puryn-6-ylo-sulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-070)

Wytworzono zgodnie z Procedurą C, stosując 3i i monohydrat 6-merkaptopuryny). Produkt oczyszczono metodą HPLC 25 z odwróconymi fazami (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm,

4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220).

MS (ES): m/z 441.

Następują dodatkowe związki według wynalazku, razem z drogą syntetyczną do związków D-071 do D-118.

PL 213 200 B1

Procedura D:

Mieszaninę amidu 4a lub 4b, chlorku FMOC-glicylu, i lodowatego kwasu octowego ogrzewano do 120°C przez 1 do 4 godzin. Otrzymaną mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i oczyszczono metodą chromatografii rzutowej, otrzymując zabezpieczoną zcyklizowaną aminę. Ten materiał połączono z 10 równoważnikami oktanotiolu i katalityczną ilością DBU w THF i mieszano w temperaturze otoczenia, aż LCMS wykazała zużycie materiału wyjściowego. Reakcję wylano wprost na kolumnę rzutową (wyrównowagowaną w CH2Cl2) i eluowano 0-5% MeOH/CH2Cl2, otrzymując wolną aminę, 5a lub 5b. Związek 5c wytworzono w sposób analogiczny stosując (±) - chlorek FMOC-alanylu zamiast chlorku FMOC-glicylu.

Procedura E:

Równomolowe ilości 5a lub 5b, odpowiedniej 6-chloropuryny, i DIEA połączono z EtOH w małej fiolce i ogrzewano do 80°C. Reakcję kontrolowano regularnie metodą LCMS i oczyszczono jak podano.

Procedura F:

Mieszaninę amidu 4b, chlorku acetoksyacetylu, i lodowatego kwasu octowego ogrzewano do 120° C i mieszano przez 2 godziny. Ochłodzoną mieszaninę reakcyjną przesączono i substancje stałe przemyto CH2Cl2, otrzymując zcyklizowany octan jako białą substancję stałą. Ten materiał połączono z K2CO3 w wodnym metanolu i mieszano przez jedną godzinę, po czym zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną substancję stałą roztarto z H2O, otrzymując 6a jako białą substancję stałą.

3-(2-Chlorofenylo)-5-fluoro-2-[(9H-puryn-6-yloamino)-metylo]-3H-chinazolin-4-on (D-072)

Wytworzono zgodnie z Procedurą E, stosując 5b (50 mg, 0,165 mmol) i 6-chloropurynę (26 mg, 0,165 mmol) w 1 mL EtOH. Po 5 dniach mieszaninę reakcyjną oczyszczono metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ).

¹H NMR (DMS0-d6) δ: 12,99 (br s, 1R); 8,14 (br s, 1H); 8,12 (s, 1H); 7,85 (dt, J = 5,7, 8,1 Hz, 1H); 7,68-7,79 (m, 3H); 7,57 (t, J = 6,2 Hz, 1H); 7,57 (d, J = 7,7 Hz, 1H); 7,50 (d, J = 8,1 Hz, 1H); 7,35 (dd, J = 8,4, 10,7 Hz, 1H); 4,15-4,55 (m, 2H).

MS (ES): m/z 422 (M+H), 211.

2-[(2-Amino-9H-puryn-6-yloamino)metylo]-3-(2-chlorofenylo)-5-fluoro-3H-chinazolin-4-on (D-074)

Wytworzono zgodnie z Procedurą E, stosując 5b (50 mg, 0,165 mmol) i 2-amino-6-chloropurynę (28 mg, 0,165 mmol) w 1 mL EtOH. Po 5 dniach mieszaninę reakcyjną oczyszczono metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ).

PL 213 200 B1 ¹H NMR (DMSO-d6) δ: 12,13 (br s, 1H); 7,86 (dt, J = 5,6, 8,2 Hz, 1H); 7,76-7,83 (m, 2H); 7,68 (br s, 1H); 7,61 (t, J = 5,7 Hz, 1H); 7,61 (d, J = 7,2 Hz, 1H); 7,53 (d, J = 8,2 Hz, 1H); 7,35 (dd, J = 8,2, 10,9 Hz, 1H); 5,66 (br s, 2H); 4,16-4,50 (m, 1H); 4,09 (q, J = 5,3 Hz, 2H).

MS (ES): m/z 437 (M+H), 219.

5-Metylo-2-[(9H-puryn-6-yloamino)metylo]-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-071)

Wytworzono zgodnie z Procedurą E, stosując 6-chloropurynę (11 mg, 0,072 mmol) i 5a (20 mg, 0,072 mmol). Po 5 dniach reakcję zatrzymano wodą i otrzymaną zawiesinę przesączono. Substancję stałą oczyszczono metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ).

¹HNMR (DMSO-d6) δ: 12,98 (br s, 1H); 8,14 (br s, 1H); 8,10 (s, 1H); 7,58-7,79 (m, 2H); 7,37-7,48 (m, 4H); 7,26-7,36 (m, 2H); 3,93-4,39 (m, 2H); 2,75 (s, 3H); 2,18 (s, 3H).

MS (ES): m/z 398 (M+H), 199.

2-[(2-Amino-9H-puryn-6-yloamino)metylo]-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-073)

Wytworzono zgodnie z Procedurą E, stosując 5a (189 mg, 0,677 mmol) i 2-amino-6-chloropurynę (115 mg, 0,677) w 3 mL EtOH. Po 3 dniach mieszaninę reakcyjną przesączono dla usunięcia nadmiaru puryny, a przesącz oczyszczono metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm,

4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ), otrzymując 7 mg produktu jako sól TFA.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,88 (br s, 1H); 8,21 (s, 1H); 7,71 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,45-7,56 (m, 2H); 7,38-7,44 (m, 3H); 7,35 (d, J = 7,5 Hz, 1H); 7,30 (br s, 1H); 4,40 (dd, J = 4,5, 17,5 Hz, 1H); 4,27 (dd, J = 5,3, 17,4 Hz, 1H); 2,75 (s, 3H); 2,09 (s, 3H).

MS (ES): m/z 413 (M+H), 207, 163.

PL 213 200 B1

2-[(2-Fluoro-9H-puryn-6-yloamino)metylo]-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-076)

Wytworzono zgodnie z Procedurą E, stosując 5a (20 mg, 0,072 mmol) i 2-fluoro-6-chloropurynę (16 mg, 0,094 mmol) w 1 mL EtOH. Po 18 godzinach mieszaninę reakcyjną oczyszczono metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ) i z kolei rekrystalizowano z EtOH, otrzymując 14 mg produktu jako żółtą substancję stałą.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,12 (br s, 1H); 8,40 (br s, 1H); 8,15 (s, 1H); 7,66 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,35-7,49 (m, 4H); 7,31 (d, J = 7,2 Hz, 1H); 4,00-4,22 (m, 2H); 3,17 (s, 1H); 2,74 (s, 3H); 2,18 (s, 3H).

MS (ES): m/z 416 (M+H), 208.

(2-Chlorofenylo)-dimetyloamino-(9H-puryn-6-ylosulfanylo-metylo)-3H-chinazolin-4-on (D-075)

D-015 (100 mg, 0,228 mmol) połączono z wodorotlenkiem amonu (28-30%, 1 mL) w DMF (2 mL) i ogrzewano do 80°C. Po 2 dniach mieszaninę reakcyjną oczyszczono metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda over 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ), otrzymując produkt jako żółtą substancję stałą, ~2 mg.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 13,52 (br s, 1H); 8,46 (s, 1H); 8,42 (s, 1H); 7,69 (dd, J = 2,1, 7,3 Hz, 1H); 7,62 (dd, J = 1,6, 7,6 Hz, 1H); 7,6-1 (t, J = 8,0 Hz, 1H); 7,37-7,48 (m, 2H); 7,05 (d, J = 7,9 Hz, 1H); 6,96 (d, J = 7,8 Hz, 1H); 4,32-4,45 (m, 2H); 2,80 (s, 6H).

MS (ES): m/z 464 (M+H), 232.

5-(2-Benzyloksyetoksy)-3-(2-chlorofenylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-078)

Do roztworu 2-benzyloksyetanolu (0,3 mL) w DMF (1,0 mL) dodano NaH (50 mg, 2,08 mmol).

Po 5 minutach mieszania 0,5 mL dodano do roztworu IC-87185 (50 mg, 0,114 mmol) w bezwodnym

DMF (0,75 mL). Reakcję ogrzewano do 50°C i mieszano przez 3 dni. Oczyszczanie metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ) dało produkt jako niejednorodną substancję stałą, 150 μg.

MS (ES): m/z 571 (M+H), 481.

PL 213 200 B1

Ester 3-(2-chlorofenylo)-5-fluoro-4-okso-3,4-dihydrochinazolin-2-ylometylowy kwasu 6-aminopuryno-9-karboksylowego (D-079)

Do roztworu 3b (20 mg, 0,066 mmol) w CH₂CI₂ (500 μί) w temperaturze 0°C dodano fosgen (2M/toluen, 36 μΙ 0,072 mmol), a następnie adeninę (10 mg, 0,072 mmol), i DIEA (25 μί, 0,145 mmol). Reakcję zostawiono do osiągnięcia temperatury otoczenia i mieszano przez 8 dni. Oczyszczanie metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ) dało produkt jako mieszaninę.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 11,04 (br s, 1H); 8,61 (s, 1H); 8,40 (s, 1H); 7,85-7,95 (m, 1H); 7,76 (dd, J = 5,4, 9,6 Hz, 1H); 7,70-7,78 (m, 1H); 7,52-7,63 (m, 3H); 7,38 (dt, J = 8,3, 10,6 Hz, 1H); 4,76-4,89 (m, 2H).

MS (ES): m/z 466 (M+H), 331, 305.

N-[3-(2-Chlorofenylo)-5-fluoro-4-okso-3,4-dihydrochinazolin-2-ylometylo]-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylo)acetamid (D-077)

Kwas (9H-puryn-6-ylosulfanylo)octowy (63 mg, 0,296 mmol), 5b (108 mg, 0,355 mmol), EDC (68 mg, 0,355 mmol), HOBT (48 mg, 0,355 mmol), DIEA (62 μί, 0,355 mmol), i DMF (1 mL) połączono w kolbie i mieszano w temperaturze otoczenia przez jedną godzinę. Reakcję rozcieńczono EtOAc (20 mL) i przemyto rozcieńczoną solanką (2 x 13 mL). Fazę organiczną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i poddano chromatografii w 5% MeOH/CH2Cl2, otrzymując 91 mg produktu jako lepką brzoskwiniową pianę.

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 12,88 (br s, 1H); 8,72 (s, 1H); 8,62 (t, J = 5,0 Hz, 1H); 8,49 (s, 1H); 7,88 (dt, J = 5,6, 8,2 Hz, 1H); 7,73-7,78 (m, 1H); 7,67-7,72 (m, 1H); 7,57-7,65 (m, 2H); 7,38 (d, J = 8,1 Hz,

1H); 7,36 (dd, J = 8,3, 11,1 Hz, 1H); 4,11-4,24 (m, 2H); 3,96 (dd, J = 5,0, 17,4 Hz, 1H); 3,78 (dd,

J = 5,2, 17,4 Hz, 1H).

MS (ES): m/z 496 (M+H), 248.

PL 213 200 B1

2-[1-(2-Fluoro-9H-puryn-6-yloamino)etylo]-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-080)

Wytworzono zgodnie z Procedurą E stosując 5c (50 mg, 0,17 mmol) i 2-fluoro-6-chloropurynę (35 mg, 0,204 mmol) w 1,2 mL EtOH. Oczyszczanie metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm,

4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ) dało atropoizomery jako białe substancje stałe. Oto dane dla jednej z nich:

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,48 (br d, J = 6,4 Hz, 1H); 8,17 (s, 1H); 7,69 (t, J = 7,8 Hz, 1H); 7,53 (d, J = 7,8 Hz, 1H); 7,44 (d, J = 7,8 Hz, 2H); 7,33 (d, J = 7,2 Hz, 2H); 7,07 (br t, J = 7,2 Hz, 1H); 4,80 (br t, J = 6,8 Hz, 1H); 2,74 (s, 3H); 2,09 (s, 3H); 1,38 (d, J = 6,7 Hz, 3H).

MS (ES): m/z 430 (M+H), 215.

5-Metylo-2-[1-(9H-puryn-6-yloamino)etylo]-3-o-tolilo-3H- chinazolin-4-on (D-081)

Wytworzono zgodnie z Procedurą E, stosując 5c (50 mg, 0,17 mmol) i 6-chloropurynę (32 mg, 0,204 mmol) w 1,2 mL EtOH. Oczyszczanie metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 2 50 mm,

4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ) dało atropoizomery jako żółte substancje stałe. Oto dane dla jednej z nich:

¹H NMR (DMSO-d6) δ: 8,39 (br s, 1H); 8,34 (s, 1H); 8,18 (s, 1H); 7,71 (t, J = 7,7 Hz, 1H); 7,56 (d, J = 7,9 Hz, 1H); 7,49 (d, J = 6,9 Hz, 1H); 7,28-7,43 (m, 3H); 7,20 (br s, 1H); 5,06 (br s, 1H); 2,73 (s, 3H); 2,04 (s, 3H); 1,51 (d, J = 6,6 Hz, 3H),

MS (ES): m/z 412 (M+H), 206.

Następujące związki według niniejszego wynalazku (D-082 do D-109) wytworzono jak naszkicowano w Procedurze C, stosując 2-chlorometylo-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (10 mg), właściwy nukleofil XH (20 mg, nadmiar), i węglan potasu (10 mg) w DMF (0,25 mL). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 16 h w temperaturze pokojowej, zatrzymano reakcję wodą, i surowy produkt

PL 213 200 B1 stały zebrano przez odsączenie i wysuszono na powietrzu. Surowy materiał rozpuszczono w 0,5 mL DMSO i oczyszczono metodą HPLC z odwróconymi fazami (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm,

4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ). Właściwe frakcje zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując produkty końcowe.

2-(6-Dimetyloaminopuryn-9-ylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-082)

Wydajność: 8,1 mg.

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 8,13 (s, 1H), 8,11 (s, 1H), 7,60 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,54-7,38 (m, 4H), 7,30 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,20 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,11 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 4,76 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 3,33 (s, 6H), 2,73 (s, 3H), 2,20 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 426 (M+1).

5-Metylo-2-(2-metylo-6-okso-1,6-dihydro-puryn-7-yIometylo)-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-083)

Wydajność: 3,3 mg.

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 12,06 (s, 1H), 8,12 (s, 1H), 7,60 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,55-7,38 (m, 4H), 7,30 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 5,26 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 4,94 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 2,73 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 2,24 (s, 3H).

Alkilowanie na N7 puryny przypisane arbitralnie na podstawie przesunięcia w dół pola protonów metylenowych wskutek grupy karbonylowej.

LRMS (ES dodatni) m/z = 413 (M+1).

5-Metylo-2-(2-metyIo-6-okso-1,6-dihydro-puryn-9-ylometylo)-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-084)

Oczyszczono z tej samej mieszaniny reakcyjnej co D-083. Wydajność: 3,6 mg.

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 12,17 (s, 1H), 7,96 (s, 1H), 7,63 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,57-7,39 (m, 4H), 7,32 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,26 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 4,70 (d, J = 17,2 Hz,

1H), 2,73 (5, 3H), 2,27 (s, 3H), 2,17 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 413 (M+1).

PL 213 200 B1

2-(Amino-dimetyloaminopuryn-9-ylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-085)

Wydajność: 6,7 mg.

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 7,66 (s, 1H), 7,61 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,55-7,40 (m, 4H), 7,32-7,26 (m, 2H), 6,74 (s, 2H), 4,94 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 4,63 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 4,63 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 2,97 (s, 6H), 2,73 20 (s, 3H), 2,17 (s, 3H), 2,08 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 441 (M+1).

2-(2-Amino-9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-086)

Wydajność: 9,5 mg.

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 12,54 (s, 5 1H), 7,89 (s, 1H), 7,69 (t, J = 1,8 Hz, 1H), 7,51 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,51 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,43 (t, J = 3,9 Hz, 1H), 7,34 = 7,26 (m, 4H), 6,16 (s, 2H), 4,32 (AB kwartet, Jab = 14,8 Hz, Δn = 23,7), 2,74 (s, 3H), 2,09 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 430 (M+1).

2-(4-Amino-1,3,5-triazyn-2-ylosulfanylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-087)

Wydajność: 5,8 mg.

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 8,10 (s, 1H), 7,70 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,58 (s, 1H), 7,52 (d, J = 8,0 Hz, 15 1H), 7,48-7,26 (m, 6H), 4,08 (s, 2H), 2,73 (s, 3H), 2,09 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 391 (M+1).

5-Metylo-2-(7-metylo-7H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-088)

PL 213 200 B1

Wydajność: 3,1 mg.

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 8,52 (s, 1H), 8,49 (s, 1H), 7,70 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,45 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 7,35-7,20 (m, 4H), 4,41 (AB kwartet, JAB = 15,3 Hz, Δν = 19,2 Hz), 4,08 (s, 3H), 2,73 (s, 3H), 2,12 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 406 (M+1).

5-Metylo-2-(2-okso-1,2-dihydro-pirymidyn-4-ylosulfanylometylo)-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-089)

Wydajność: 2,4 mg.

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 11,49 (s, 1H), 7,70 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,60 (br t, J = 6,0 Hz, 1H), 7,53-7,48 (m, 2H), 7,46-7,28 (m, 4H), 6,31 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 4,05 (s, 2H), 2,73 (s, 3H), 2,12 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 391 (M+1).

5-Metylo-2-puryn-7-ylometylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-090)

¹HNMR (300 MHz, dg-DMSO) δ: 9,04 (s, 1H), 8,97 (s, 1H), 8,48 (s, 1H), 7,65-7,54 (m, 2H), 7,53-7,39 (m, 3H), 7,31 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,13 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,31 (d, J = 17,6 Hz, 1H), 5,16 (d, J-17, 6 Hz, 1H), 2,73 (s, 3H), 2,09 (s, 3H). Alkilowanie na N7 puryny stwierdzono przez wzmocnienie NOE między protonem w pozycji 6 puryny a protonami metylenowymi na łączniku między grupami puryny i chinazolinonu.

LRMS (ES dodatni) m/z = 383 (M+1).

5-Metylo-2-puryn-9-ylometylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-091)

Z tej samej reakcji co D-090.

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 9,17 (s, 1H), 8,86 (s, 1H), 8,55 (s, 1H), 7,59 (t, J = 7,8 Hz, 1H),

7,55-7,42 (m, 4H), 7,30 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,13 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,26 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 4,92 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 2,73 (s, 3H), 2,19 (s, 3H). Alkilowanie na N9 puryny sugerowane przez brak wzmocnienia NOE między protonami w pozycji 6 puryny i protonami metylenowymi łącznika.

LRMS (ES dodatni) m/z = 383 (M+1).

PL 213 200 B1

5-Metylo-2-(9-metylo-9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-092)

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 8,52 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 7,69 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,44 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,36-7,27 (m, 4H), 4,38 (AB kwartet, JAB =15,5 Hz, Δν = 21,0 Hz), 3,80 (s, 3H), 2,73 (s, 3H), 2,12 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 429 (M+1).

2-(2,6-Diamino-pirymidyn-4-ylosulfanylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-093)

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 7,710 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,45-7,27 (m, 5H), 6,22 (br s, 1H), 5,80 (br s, 1H), 3,99 (AB kwartet, JAB = 14,6 Hz, Δν = 26,9 Hz, 2H), 2,73 (s, 3H), 2,08 (s, 3H)

LRMS (ES dodatni) m/z = 405 (M+1).

5-Metylo-2-(5-metylo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piramidyn-7-ylosulfanylometylo)-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-094)

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 8,57 (s, 1H), 7,73 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,55-7,35 (m, 4H) 7,18 (s, 1H), 4,27 (s, 2H), 2,74 (s, 3H), 2,55 (s, 3H), 2,08 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 429 (M+1)

5-Metylo-2-(2-metylosulfanylo-9H-puryn-6-ylosulfanylo-metylo)-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-095)

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 13,30 (s, 1H), 8,29 (s, 1H), 7,72 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,47 9d, J = 6,3 Hz, 1H), 7,38-7,26 (m, 4H), 4,34 (AB kwartet, JAB = 16,1 Hz, Δν = 23,6 Hz, 2H), 2,74 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 2,10 (s, 3H).

PL 213 200 B1

LRMS (ES dodatni) m/z = 461 (M+1).

2-(2-Hydroksy-9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-096)

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 8,08 (s, 1H), 7,69 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,50 (br d, J = t, 8 Hz, 2H), 7,33-7,50 (m, 4H), 4,28 (AB kwartet, J_AB = 15,5 Hz, Δν = 21,3 Hz, 2H), 2,74 (s, 3H), 2,12 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 431 (M+1).

5-Metylo-2-(1-metylo-1H-imidazol-2-ilosulfanylo-metylo)-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-097)

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 7,69 t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,46-7,37 (m, 5H), 7,32 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 7,20 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 6,48 (d, J = 1,0 Hz), 3,83 (AB kwartet, JAB = 15,5 Hz, Δν = 18,8 Hz, 1H), 3,55 (s, 3H), 2,73 (s, 3H), 2,09 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 364 (M+1).

5-Metylo-3-o-toliIo-2-(1H-[1,2,4]triazol-3-ilosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-098)

N-Ęf

H ¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 13,98 (s, 1H), 8,47 (s, 1H), 7,70 (t, J = 7; 8 Hz, 1H), 7,49 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,44-7,31 (m, 5H), 4,04 (AB kwartet, JAB =15,5 Hz, Δν = 19,1 Hz, 1H), 2,74 (s, 3H),

2,10 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 364 (M+1).

2-(2-Amino-6-chloro-puryn-9-ylometyło)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-099)

LRMS (ES dodatni) 432 (M+1).

PL 213 200 B1

2-(6-Aminopuryn-7-ylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-100)

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 8,19 (s, 3Η), 7,66 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,59-7,43 (m, 5H), 7,34 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,23 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,90 (s, 2H) 5,21 (AB kwartet, Jab = 17,4 Hz, Δν = 22,1 Hz, 2H), 2,72 (s, 3H), 1,93 (s, 3H). Alkilowanie na N7 puryny zostało potwierdzone przez wzmocnienie NOE między następującymi protonami: 1) egzocyklicznymi protonami aminowymi i metylenowymi; 2) egzocyklicznymi protonami aminowymi i metylowymi protonami toluilu.

LRMS (ES dodatni) m/z = 398 (M+1).

2-(7-Amino-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirymidyn-3-ylo-metylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-101)

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 8,43 (br s, 1H), 8,19 (s, 1H), 8,10 (br s, 1H), 7,62 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,49-7,28 (m, 5H), 7,22 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,49 (d, J = 17,0 Hz, 1H), 5,19 (d, J= 17,0 Hz, 1H), 2,73 (s, 3H), 2,11 (s, 3H). Alkilowanie na N7 puryny stwierdzone przez podobieństwo do widma NMR D-030.

LRMS (ES dodatni) m/z = 399 (M+1).

2-(7-Amino-1,2,3-triazolo[4,5-d]pirymidyn-1-ylo-metylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-102)

Z tej samej mieszaniny reakcyjnej co D-101.

¹H NMR (300 MHz, (d6-DMSO) δ: 8,2,7 (s, 1H), 8,20 (br s, 1H), 8,05 (br s, 1H), 7,70 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,47-7,26 (m, 6H), 5,61 (AB kwartet, JAB = 16,0 Hz, Δν = 20,7 Hz, 2H), 2,75 (s, 3H), 1,98 (s, 3H)). Alkilowanie na N7 puryny stwierdzone przez podobieństwo do widma NMR D-100.

LRMS (ES dodatni) m/z = 399 (M+1).

2-(6-Amino-9H-puryn-2-ylosulfanylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-103)

PL 213 200 B1 ¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 12,62 (s, 1H), 7,93 (s, 1H), 7,69 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 7,51 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,42 (dd, J = 7,6, 1,7 Hz, 1H), 7,35-7,15 (m, 6H), 4,12 (AB kwartet, JAB=14,5 Hz, Δν = 18,2 Hz, 2H) 2,73 (s, 3H), 2,10 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 430 (M+1).

2-(2-Amino-6-etyloamino-pirymidyn-4-ylosulfanylo-metylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-104)

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 7,70 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,53 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,44-7,31 (m, 5H), 6,69 (br s, 1H), 5,83, (br s, 2H) 5,61 (s, 1H), 4,03 (d, J = 14,6 Hz, 1H), 3,95 (d, J = 14,6 Hz, 1H), 3,22-3,11 (m, 2H), 2,73 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 1,06 (t, J = 7,1 Hz, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 433 (M+1).

2-(3-Amino-5-metylosulfanylo-1,2,4-triazol-1-ilo-metylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-105)

Wydajność: 5,0 mg.

¹H NMR (300 MHz, d4-MeOH) δ: 7,67 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,55-7,37 (m, 4H), 7,35-7,27 (m, 2H), 4,77 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 4,60 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 2,80 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 2,14 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 393 (M+1).

2-(5-Amino-3-metylosulfanylo-1,2,4-triazol-1-ilo-metylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-106)

Wydajność: 0,6 mg.

Oczyszczono z tej samej mieszaniny reakcyjnej co D-105.

¹H NMR (300 MHz, d4-MeOH) δ: 7,67 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,50-7,24 (m, 6H), 4,83 (d, J = 16,5 Hz,

1H), 4,70 (d, J = 16,5 Hz, 1H), 2,79 (s, 3H), 2,47 (s, 3H), 2,14 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 393 (M+1).

PL 213 200 B1

5-Metylo-2-(6-metyloaminopuryn-9-ylometylo)-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-107)

Wydajność: 5,0 mg.

¹H NMR (300 MHz, d4-MeOH) δ: 8,17 (s, 1H), 8,03 (s, 1H), 7,54-7,43 (m 4H), 7,31-7,23 (m, 2H), 5,14 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 4,90 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 3,14 (br s, 3H), 2, 79 (s, 3H), 2,22 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 412 (M+1).

2-(6-Benzyloaminopuryn-9-ylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-108)

Wydajność: 6,7 mg.

¹H NMR (300 MHz, d4-MeOH) δ: 8,13 (s, 1H), 8,04 (s, 1H), 7,58 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,51-7,21 (m, 11H), 5,15 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 4,91 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 4,83 (s, 2H, pod sygnałem H2O), 2,79 (s, 3H), 2,22 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 488 (M+1).

2-(2,6-Diaminopuryn-9-ylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-109)

Podwójne ilości wszystkich reagentów. Wydajność: 14 mg.

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 8,53 (br S, 2H), 8,01 (s, 1H), 7,64 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,53-7,40 (m, 4H), 7,33 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,27 9d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,96 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 4,64 (d, J = 17,5 Hz, 1H), 2,74 (s, 3H), 2,17 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 413 (M+1).

PL 213 200 B1

Związki D-110 do D-115 o następującym wzorze ogólnym wytworzono z następujących związków pośrednich E-1 do E-3.

Związek pośredni E-1.

5-Metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3,1-benzoksazyn-4-on

Etap 1. Zawiesinę kwasu 6-metyloantranilowego (2 g, 13,2 mmol) w chlorku chloroacetylu (12 mL, duży nadmiar) mieszano w temperaturze 115°C w zamkniętej fiolce przez 30 min. Otrzymany roztwór ochłodzono do temperatury pokojowej i potraktowano eterem (~5 mL). Po ochłodzeniu w temperaturze 4°C przez noc, otrzymany beżowy osad zebrano przez odsączenie, przemyto eterem, i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując chlorowy związek pośredni (1,39 g, 50%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 7,67 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,46 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,35 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 4,39 (s, 2H), 2,81 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 210, (M+1).

Etap 2. Mieszaninę chlorowego związku pośredniego (50 mg, 0,25 mmol), monohydratu 6-merkaptopuryny (43 mg, 0,25 mmol), i węglanu potasu (25 mg, 0,2 5 mmol) w suchym DMF (0,5 mL) mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 min.

Mieszaninę wylano do octanu etylu (20 mL) i cały materiał nierozpuszczalny odsączono i odrzucono. Przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem dla usunięcia wszystkiego octanu etylu, a pozostałość potraktowano eterem, co dało jasno- pomarańczowy osad. Osad zebrano przez odsączenie, przemyto eterem, i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując związek pośredni E-1 (41 mg, 51%).

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 8,64 (s, 1H), 8,39 (s, 1H), 7,73 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,44-7,37 (m, 2H), 4,69 (s, 2H), 2,69 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 326 (M+1).

PL 213 200 B1

Związek pośredni E-2

Roztwór 2-nitroacetanilidu (1,0 g, 5,6 mmol) w EtOH przedmuchano azotem, potraktowano Pd(OH)2 (20% wag. na C, 200 mg, kat.), i wytrząsano przez 2 h pod osłoną H2 (20 psi). Katalizator usunięto metodą odsączenia przez filtr membranowy 0,22 μm z octanu celulozy (Corning), a przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując biały, krystaliczny produkt stały (800 mg, 96%).

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 9,12 (s, 1H), 7,14 (dd, J = 7,8, 1,3 Hz, 1H), 6,88 (dt, J = 7,6,

1,5 Hz, 1H), 6,70 (dd, J = 8,0, 1,3 Hz, 1H), 6,52 (dt, J = 7,5, 1,4 Hz, 1H), 4,85 (br s, 2H), 2,03 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 151 (M+1).

Związek pośredni E-3

związek pośredni E-3

Mieszaninę 2-fluoro-nitrobenzenu (1,41 g, 10 mmol) i NaHCO3 w EtOH (20 mL) potraktowano (N,N,N'-trimetylo)-1,2-diaminoetanem (1,1 g, 11 mmol) i mieszano przez 16 h w temperaturze 80°C. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość potraktowano 0,1 M NaOH (120 mL), i mieszaninę ekstrahowano octanem etylu (2 x 50 mL). Warstwy organiczne połączono i przemyto 20 mL wody (1x) i solanką (2x), osuszono siarczanem sodu, i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując pomarańczową ciecz (2,2 g, 100%; ESMS: m/z = 224, M+1).

Ten związek pośredni rozpuszczono w EtOH, roztwór przedmuchano azotem, potraktowano Pd(OH)2 (20% wag. na C, 180 mg, kat.), i wytrząsano przez 2 h pod H2 (50 psi). Katalizator usunięto przez odsączenie przez filtr membranowy 0,22 μm z octanu celulozy (Corning), i przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując czerwony ciekły produkt E-3 (1,8 g, 95%).

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 8,64 (s, 1H), 7,03 (dd, J = 8,3, 1,4 Hz, 1H), 6,91 (ddd, J = 7,6, 7,2, 1,4 Hz, 1H), 6,73- 6,67 (m, 2H), 4,20 (br s, 2H), 2,95 (t, J = 6,7 Hz, 2H), 2,68 (s, 3H), 2,41 (t, J = 6,7 Hz, 1H), 2,26 (s, 6H).

LRMS (ES dodatni) m/z=194 (M+1).

Związki D-110 do D-115 wytworzono jak następuje:

5-Metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-on (D-110)

PL 213 200 B1

Mieszaninę związku pośredniego E-1 (40 mg) i o-toluidyny (0,3 mL, duży nadmiar) ogrzewano w temperaturze 100°C w zamkniętej fiolce przez 16 h. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono, potraktowano 1 N HCl (2 mL) i eterem (2 mL), i otrzymany szary osad zebrano przez odsączenie, przemyto eterem, i wysuszono na powietrzu (19 mg surowego produktu). Surową substancję stałą rozpuszczono w 0,5 mL DMSO i oczyszczono metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ). Odpowiednie frakcje zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując produkt końcowy, jako białą substancję stałą (4 mg).

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 13,52 (s, 1H), 8,47 (s, 1H), 8,43 (s, 1H), 7,69 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,46-7,43 (m, 1H), 7,37-7,25 (m, 4H), 4,37 (AB kwartet, JAB = 15,4 Hz, Δν = 22,4 Hz, 2H), 2,74 (5, 3H), 2,12 (5, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 415 (M+1).

3-Izobutylo-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3Η-chinazolin-4-on (D-111)

Mieszaninę związku pośredniego E-1 (40 mg) i izobutyloaminy (0,4 mL, duży nadmiar) ogrzewano w temperaturze 120°C w zamkniętej fiolce przez 16 h. Nadmiar izobutyloaminy odparowano, pozostałość rozpuszczono w 1 mL DMSO i oczyszczono w dwóch porcjach metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ). Odpowiednie frakcje zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując produkt końcowy jako białą substancję stałą (4 mg).

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 13,75 (br s, 1H), 8,73 (s, 1H), 8,50 (s, 1H), 7,63 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 7,42 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,28 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,00 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 2,77 (s, 3H), 2,30-2,15 (m, 1H), 0,98 (d, J = 6,7 Hz, 1H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 381, (M+1).

N-{2-[5-Metylo-4-okso-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylo-etylo)-4H-chinazolin-3-ylo]-fenylo}-acetamid (D-112)

Mieszaninę związku pośredniego E-1 (80 mg, 0,25 mmol) i związku pośredniego E-2 (75 mg, 0,5 mmol, 2 eq) ogrzewano aż do stopienia w zamkniętej fiolce przy użyciu nagrzewnicy. Mieszaninę reakcyjną roztarto z eterem i przez odsączenie zebrano substancję stałą. Surowy materiał rozpuszczono w 1 mL DMSO i oczyszczono w dwóch porcjach metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm,

4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ). Odpowiednie frakcje zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując produkt końcowy jako białą substancję stałą.

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 13,52 (s, 1H), 9,52 (s, 1H), 8,48 (s, 3H), 8,42 (s, 3H), 8,02 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,69 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,51 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,45-7,37 (m, 2H), 7,31 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 7,19 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 4,38 (s, 2H), 2,74 (s, 3H), 1,93 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 458 (M+1).

5-Metylo-3-(E-2-metylo-cykloheksylo)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-113)

PL 213 200 B1

Mieszaninę związku pośredniego E-1 (80 mg, 0,25 mmol) i trans-2-metylo-1-aminocykloheksanu (0,25 mL, duży nadmiar) ogrzano w zamknięciu w temperaturze 100°C przez 16 h. Mieszaninę reakcyjną roztarto z eterem i przez odsączenie zebrano substancję stałą. Surowy materiał rozpuszczono w 0,5 mL DMSO i oczyszczono metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm,

4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ). Odpowiednie frakcje zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując produkt końcowy jako białą substancję stałą (1,5 mg).

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 13,5 (br s, 1H), 8,82 (s, 1H), 8,51 (s, 1H), 7,63 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 7,43 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,27 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 5,11 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 3,78-3,69 (m, 1H), 2,73 (s, 3H), 2,55-2,40 (m, 3H), 1,88-1,46 (m, 4H), 1,31-1,11 (m, 1H), 0,90-0,65 (m, 1H), 0,74 (d, J = 6,7 Hz, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 421 (M+1).

Kwas 2-[5-metylo-4-okso-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-4H-chinazolin-3-ylo]-benzoesowy (D-114)

Mieszaninę związku pośredniego E-1 (80 mg, 0,25 mmol) i antranilanu metylu (0,25 mL, duży nadmiar) ogrzewano w zamkniętej fiolce w temperaturze 100°C przez 16 h. Mieszaninę reakcyjną roztarto z eterem i przez odsączenie zebrano substancję stałą. Surowy materiał rozpuszczono w 0,5 mL DMSO i oczyszczono metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ). Odpowiednie frakcje zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując produkt końcowy jako białą substancję stałą (8 mg).

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 13,51 (s, 1H), 8,51 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 8,11 (dd, J = 7,4, 1,1 Hz, 1H), 7,88 (dt, J = 7,7, 1,4 Hz, 1H), 7,70 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,57 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,49-7,35 (m, 3H), 4,58 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 4,35 (d, J = 15,5 Hz, 1H), 2,44 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 445 (M+1).

3-{2-[(2-Dimetyloamino-etylo)-metylo-amino]-fenylo}-5-metylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-115)

Mieszaninę związku pośredniego E-1 (40 mg, 0,25 mmol) i związku pośredniego E-3 (0,2 mL, duży nadmiar) ogrzewano w zamkniętej fiolce w temperaturze 100°C przez 16 h. Mieszaninę reakcyjną roztarto z eterem i przez odsączenie zebrano substancję stałą. Surowy materiał rozpuszczono w 1 mL DMSO i oczyszczono metodą HPLC w dwóch porcjach (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm,

4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, 0,05% TFA we wszystkich rozpuszczalnikach, detektor przy 220λ). Odpowiednie frakcje zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując produkt końcowy jako sól TFA (11 mg).

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 13,4 (br s, 1H), 9,27 (s, 1H), 8,52 (s, 1H), 8,44 (s, 1H), 7,72 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,53 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,40-7,33 (m, 4H), 7,10-7,04 (m, 1H), 4,42 (s, 3H), 3,5 (m,

2H), 3,23-3,03 (m, 3H), 2,75 (s, 3H), 2,68-2,56 (m, 8H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 501 (M+1).

PL 213 200 B1

Związki D-116 do D-118 wytworzono jak następuje:

3-(2-Chlorofenylo)-5-metoksy-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-116) (R = Me, X = O)

Mieszaninę D-015 (25 mg) w 0,5 M NaOMe (2 mL w MeOH; duży nadmiar) mieszano w temperaturze 50°C przez 16 h w zamkniętej fiolce. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej, potraktowano wodą (5 mL), i otrzymany osad zebrano przez odsączenie, przemyto wodą, i wysuszono na powietrzu. Surowy materiał rozpuszczono w 0,5 mL DMSO i oczyszczono metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ). Odpowiednie frakcje zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując produkt końcowy jako białą substancję stałą (5,3 mg).

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 13,52 (s, 1H), 8,48 (s, 1H), 8,44 (br s, 1H), 7,77 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 7,71-7,60 (m, 2H), 7,51- 7,34 (m, 2H), 7,23 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,10 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,39 (AB kwartet, JAB = 5,2 Hz, Δν = 23,2 Hz, 2H), 3,85 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 451 (M+1).

3-(2-Chlorofenylo)-5-(2-morfolin-4-ylo-etyloamino)-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on (D-117)

Mieszaninę D-015 (25 mg) i 4-(aminoet-2-ylo)-morfoliny (650 mg, duży nadmiar) mieszano w temperaturze 50°C przez 16 h. Surową mieszaninę reakcyjną oczyszczono metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ). Odpowiednie frakcje zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując produkt końcowy.

1H NMR (300 MHz, d6-aceton) δ: 8,57 (br s, 1H), 8,47 (s, 1H), 8,37 (s, 1H), 7,72 (dd, J = 7,7,

1,6 Hz, 1H), 7,65 (dd, J = 8,0, 1,2 Hz, 1H), 7,57 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 7,49 (dt, J = 7,7, 1,6 Hz, 1H), 7,40 (dt, J = 7,7, 1,5 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,55 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 4,42 (d, J = 15,1 Hz, 1H), 4,05-3,90 (m, 4H), 3,90 (t, J = 6,9 Hz, 2H), 3,75-3,4 (m, 4H), 3,54 (t, J = 6,9 Hz, 2H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 549 (M+1).

PL 213 200 B1

3-Benzylo-5-metoksy-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H- chinazolin-4-on (D-118)

Mieszaninę D-043 (25 mg) w 0,5 M NaOMe (2 mL w MeOH; duży nadmiar) mieszano w temperaturze 50°C przez 16 h w zamkniętej fiolce. Mieszaninę reakcyjną potraktowano 1 N HCl (1 mL) i porcje tego roztworu (po 0,5 mL) oczyszczono metodą HPLC (kolumna C18 Luna, 4,6 x 250 mm,

4,7 mL/min, 10-75% acetonitrylu/woda przez 15 min, 100% acetonitrylu w 18 min, detektor przy 220λ). Odpowiednie frakcje zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując produkt końcowy jako białą substancję stałą (6,6 mg).

¹H NMR (300 MHz, d6-DMSO) δ: 13,57 (s, 1H), 8,60 (s, 1H), 8,45 (s, 1H), 7,72 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 7,42-7,30 (m, 2H), 7,30-7,19 (m, 3H), 7,15 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,06 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,43 (s, 2H), 4,80 (s, 2H), 3,87 (s, 3H).

LRMS (ES dodatni) m/z = 431 (M+1).

Związek D-999 (porównawczy)

3-(2-ChlorofenyIo)-2-(1H-pirazolo[3,4-d]pirymidyn-4-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

Związek analogiczny, 3-(2-chlorofenylo)-2-(1H-pirazolo[3,4-d]pirymidyn-4-ylosulfanylometylo)3H-chinazolin-4-on, także zsyntetyzowano ogólnie zgodnie z opisanymi sposobami, z tym wyjątkiem, że w etapie końcowym zamiast merkaptopuryny podstawiono 4-merkapto-1H-pirazolo[3,4-d]pirymidynę.

P r z y k ł a d 11

Oznaczenia biochemiczne siły i selektywności PI3K

A. Oznaczenie biochemiczne przy użyciu 20 μΜ ATP

Stosując sposób opisany w Przykładzie 2, powyżej, dla związków według wynalazku testowano aktywność i siłę hamującą PI3K<s, oraz selektywność wobec PI3K<s w odniesieniu do innych izozymów PI3K Klasy I. W Tabeli 2 podano wartości IC₅₀ (μΜ) dla PI3Ka (Alfa), ΡΙ3Κβ (Beta), ΡΙ3γ (Gamma), i PI3K<s (Delta). Dla ilustracji selektywności związków podano stosunki wartości IC₅₀ związków dla ΡΙ3Κα, Ρΐ3Κβ, i ΡΙ3Κγ w odniesieniu do PI3K<s, odpowiednio, jako Stosunek Alfa/Delta, Stosunek Beta/Delta, i Stosunek Gamma/Delta. Wstępne oznaczenia selektywności wykonywano identycznie z procedurą oznaczania selektywności w Przykładzie 2, z tym wyjątkiem, że stosowano 100 μL Ecoscint do wykrywania znaczenia radioaktywnego. Kolejne oznaczenia selektywności wykonywano podobnie, stosując takie same roztwory podstawowe 3X substratu, z tym wyjątkiem, że zawierały

0,05 mCi/mL γ[ P]ATP i 3 mM PIP₂. Kolejne oznaczenia selektywności także stosowały takie same roztwory podstawowe 3X enzymu, z tym wyjątkiem, że obecnie zawierały 3 nM którejkolwiek danej izoformy PI3K.

Dla wszystkich oznaczeń selektywności, związki testowe odważano i rozpuszczano w roztworach podstawowych 10-50 mM w 100% DMSO (zależnie od ich odnośnych rozpuszczalności) i przechowywano w temperaturze -20°C. Związki rozmrażano (do temperatury pokojowej lub 37°C), rozcieńczano do 300 μΜ w wodzie, skąd 3-krotnie wykonywano serię rozcieńczeń w wodzie. Z tych rozcieńczeń 20 μΕ dodawano do studzienek testowych obok ślepych prób z wodą stosowanych dla prób kontrolnych z enzymem (pozytywnych) i prób kontrolnych bez enzymu (tła). Resztę oznaczenia wykonywano zasadniczo zgodnie z procedurą oznaczania selektywności w Przykładzie 2.

Dla tych przypadków, w których największe stężenie użyte w oznaczeniu, tj., 100 μΜ, nie hamowało aktywności enzymu o co najmniej 50%, tabela przytacza procent aktywności pozostającej przy tym stężeniu (tj., przy 100 μΜ). W tych przypadkach, nie można obliczyć rzeczywistego stosunku aktywności dla związków, ponieważ brak jednej z potrzebnych wartości IC50. Jednak dla uzyskania

PL 213 200 B1 niejakiego wglądu w charakterystykę tych związków, hipotetyczny stosunek aktywności wylicza się stosując 100 μΜ podstawione zamiast brakującej wartości. W takich przypadkach, stosunek selektywności musi w rzeczywistości być większy niż wartość hipotetyczna, i jest to wskazywane przez zastosowanie symbolu większości (>).

T a b e l a 2

Związek	Alfa IC50	Beta IC50	Delta IC50	Gamma IC50	Stosunek Alfa/Delta	Stosunek Beta/Delta	Stosunek Gamma/Delta
1	2	3	4	5	6	7	8
D-000	86%	74%	0,33	7,7	>302	>302	23
D-001	83%	45	68		>1,5	0,66
D-002	88%	78%	44		>2,3	>2,3
D-003	92	53%	4		22	>24
D-004	93%	89%	64		>2	>1,6
D-005	89%	46	0,8		>121	56
D-006	78%	6	0,15		>652	38
D-007	82%	30	0,16		>619	188
D-008	82%	68	1,2		>85	57
D-009	82	6	0,12		683	50
D-010	48	11	0,06	0,70	800	183	12
D-011	72%	55	0,10	1,0	>1000	550	10
D-012	69%	11	0,17		>588	65
D-013	71%	13	0,05	2,1	>2000	260	42
D-014	63%	3,6	0,06	0,56	>1667	60	9,3
D-015	65%	69%	0,21	3,6	>480	>480	17
D-016	91%	81%	40		>2,5	>3
D-017	89%	108%	12		>8	>8
D-018	88%	93%	4,2		>24	>24
D-019	67	105	7		10	15
D-020	69%	69%	1,9		>53	>53
D-021	100	110	1,6		62	68
D-022	81%	110	0,8	40	>125	137,50	50
D-023	83%	91%	26		>4	>3,9
D-024	100	76%	2,6		38	>38
D-025	73%	61%	0,11	1,5	>909	>909	14
D-026	68%	54%	0,08	1,7	>1250	>1250	21
D-027	59%	58	0,6		>169	97
D-028	67%	13	0,18		>556	69
D-029	49	3,0	0,06		882	54
D-030	50	5	0,07		758	70
D-031	74	10	0,12		>833	83
D-034	19	11	0,15		131	74

PL 213 200 B1 cd. Tabeli 2

1	2	3	4	5	6	7	8
D-035	9	3	0,05		199	65
0-036	63%	31	0,4		>226	69
D-037	64%	80	0,8		>125	100
D-038	77%	63%	0,6	60	>167	>170	100
D-039	77%	66%	0,9	38	>111	>111	42
D-040	77%	64%	1,7		>61	>61
D-041	67%	65%	4		>25	>25
D-042	70%	25	3		>32	8
D-043	83%	77%	2,1		>47	>47
D-044	105	61	4,2		25	15
D-045	98%	74%	7,6		>13	>13
D-046	64%	95	9		>11	11
D-047	30	9	0,09	0,5	333	100	5,6
D-048	70	14	0,16		449	90
D-049	110%	30	1,0		>100	30
D-050	99%	41	1,6		>63	26
D-051	89%	57%	3,3		>31	>31
D-052	0,7	69%	8		0,09	>13
D-121	69%	70%	0,48		>211	>211
D- 999	105	71%	47	60	2, 2	2,1	1,3
LY 294002	1,2	0,4	0,23		5, 3	1,7

Związek D-121 to 3-fenylo-2-(9H-puryn-6-ylosulfanylometylo)-3H-chinazolin-4-on

B. Oznaczenie biochemiczne przy użyciu 200 μΜ ATP

W części A wyżej, związki według wynalazku testowano w celu ustalenia ich IC₅₀ dla hamowania izoform alfa, beta, delta, i gamma PI3K, stosując 20 μΜ ATP. Dalsze badanie przesiewowe przeprowadzono dla ustalenia IC50 dla hamowania czterech izoform PI3K przy stężeniu końcowym wynoszącym 200 μΜ ΔΤΡ, 10-krotnie większym, i zasadniczo bliższym normalnemu stężeniu fizjologicznemu ATP w komórkach. Ta procedura selektywności jest identyczna z opisaną wyżej, z tym wyjątkiem, że 3X stężenie podstawowe ATP wynosiło 600 μΜ. Dane z tego oznaczenia są zestawione w Tabeli 3, poniżej. Zaobserwowana czułość na stężenie ATP sugeruje, że te związki inhibitory ΡΙ3Κδ działają jako konkurenci ATP.

PL 213 200 B1

T a b e l a 3

Związek	Alfa IC50	Beta IC50	Delta IC50	Gamma IC50	Stosunek Alfa/Delta	Stosunek Beta/Delta	Stosunek Gamma/Delta
D-000	91 ± 1%	84 ± 2%	2 ± 1	35 ± 35	91	84	18
D-005	104%	82%	11	91%	20	16	17
D-006	104 ± 1%	44 ± 5	0,92 ± 0,1	87 ± 33	226	48	95
D-007	92 ± 11%	72 ± 12	0,73 ± 0,2	88 ± 4	252	99	121
D-009	70%	18	0,7	53	200	26	76
D-010	74 ± 18%	33 ± 4	0,23 ± 0,2	6 ± 3	658	144	27
D-011	88 ± 4%	105 ± 35	0,25 ± 0,2	61 ± 70	700	420	244
D-012	70 ± 4%	108 ± 4	1,3 ± 0,4	50 ± 0	107	83	38
D-013	117 ± 8%	73 ± 24%	0,51 ± 0,6	12 + 1	461	289	24
D-014	100 ± 6%	13 ± 0	0,5 ± 0,4	5 ± 3	398	26	10
D-015	95 ± 22%	81 + 3%	1,1 ± 0,5	83 ± 37%	180	154	160
D-019	100%	100	30	33	7	3	1
D-022	88%	101%	4,2	60%	42	48	29
D-025	89 ± 11%	77 ± 6%	0,32 ± 0,3	7, 8 ± 3	556	478	24
D-026	83 ± 1%	77 ± 8%	0,38 ± 0,2	13 ± 10	443	411	34
D-027	74%	110	4	60	37	28	15
D-028	100%	81%	1,6	29	125	101	18
D-029	110 ± 12%	34 ± 4	0,34 ± 0,08	13 ± 0,7	653	101	37
D-030	95 ± 11%	80 ± 14	0,53 ± 0,05	31 ± 10	362	152	59
D-031	87 ± 10%	137 ± 23	0,2 ± 0,01	155 ± 60	903	707	802
D-034	92 ± 11%	103 ± 4	1,2 ± 0,3	34 ± 1	153	85	28
D-035	95 ± 6	34 ± 6	0,49 ± 0,1	6,8 ± 1	193	69	14
D-036	99%	73%	4,1	72	48	36	18
D-037	112%	58%	3,5	45	64	33	13
D-038	69%	74%	1,8	55	77	82	31
D-039	85%	65%	2,6	57%	65	50	44
D-047	81%	30	0,2	4,5	810	150	23
D-048	90 ± 57	95 + 7	1,4 ± 0,9	123 ± 40	67	70	91
D-121	71%	62%	0,9	61%	158	138	136
D-999	62%	71%	75	90	2	2	1
LY 294002	23 ± 5	3,7 ± 2	2,1 ± 1,5	29 ± 13	11	2	13

P r z y k ł a d 12

Dane z oznaczenia komórkowego dla inhibitorów aktywności PI3K5

Stosując sposoby opisane w Przykładach 3-5, powyżej, dla związków według wynalazku testowano aktywność i siłę hamującą w oznaczeniach stymulowanej proliferacji limfocytów B i T, migracji neutrofili (PMN), i uwalniania elastazy z neutrofili (PMN). Dane z tych oznaczeń przedstawiono w Tabeli 4, poniżej. Wartości pokazane w Tabeli 4 to stężenia skuteczne związku (EC₅₀; μΜ). Gdzie nie podano wartości, tam nie przeprowadzono oznaczenia.

PL 213 200 B1

T a b e l a 4

Związek	Stymulacja mysich BCR (EC50)	Stymulacja mysich TCE (EC50)	Elastaza z ludzkich PMN (EC50)	Migracja z ludzkich PMN (EC50)
1	2	3	4	5
D-000	0,9 ± 0,4	5,5 ± 4	2,2 ± 2	1-5
D-003	3,9	5,7
D-005	0,7 ± 0,1	3,9	4,3 ± 1
D-006	0,2 ± 0,1	5,3	0,3 ± 0,1
D-007	0,3 ± 0,1	4,2	0,4
D-008	1,0
D-009	0,3 ± 0,2		10,5
D-010	0,2 ± 0,1		0,3 ± 0,3
D-011	0,3 ± 0,1		0,9 ± 0,7
D-012	0,3 ± 0,2		0,3
D-013	1,4
D-014	0,2 ± 0,1	4,3
D-015	1,2 ± 0,2	1,8	1,3 ± 0,4	2, 0
D-019	0,9 ± 0,01	0,9
D-021	1,8	3,5
D-022	1,8	2,3
D-024			2,9
D-025	0,3 ± 0,1	4,4 ± 0,6	0,3 ± 0,2	0,3 ± 0,3
D-026	0,3 ± 0,1	3,5	0,2 ± 0,2	0,3 ± 0,3
D-027	>2		2
D-028	0,4 ± 0,2		1
D-029	0,1 ± 0,03	3,4 ± 2	0,5 ± 0,6	0,3
D-030	0,1 ± 0,1	6	0,4 ± 0,5	0,2
D-031	0,2 ± 0,1
D-034	0,6 ± 0,4
D-035		2,9 ± 0,7	0,3 ± 0,1
D-036	0,9 ± 0,04	4,1	5, 5 ± 5	0,2
D-037	1,2 ± 0,4		1,3 ± 0,4	2,0
D-038		2,9	5
D-039	0,9 ± 0,1		5
D-043	1,4	2,6
D-045			9,0
D-047	0,3 ± 1		0,5 ± 0,2
D-048	0,4 ± 0,2	5	0,9+ 012
D-049	2,0	6,3	5,0

PL 213 200 B1 cd. Tabeli 4

1	2	3	4	5
D-21	1,4
D-999	3,1 ± 0,7	5,9	>20	1
LY294002	0,9 ± 0,5

P r z y k ł a d 13

Oznaczenie inhibitorów aktywności PI3K<> w komórkach rakowych

Wpływ związków według wynalazku na proliferację komórek rakowych oceniano przez testowanie jednego ze związków na zestawie linii komórkowych przewlekłej białaczki szpikowej (CML, ang. Chronic Myeloid Leukemia), obejmujących KU812, RWLeu4, K562, i MEG-01.

Aktywność hamującą związku (D-000, rozpuszczonego w DMSO) oznaczono jak następuje. Testowany związek dodawano w szeregu stężeń (0,001 μΜ do 20 μΜ) do płytek mikrofiltracyjnych o 96 studzienkach z komórkami (1000 do 5000 komórek/studzienkę). Płytki inkubowano przez pięć dni w temperaturze 37°C, podczas których hodowle kontrolne bez związku testowego mogły przejść co o

najmniej dwa cykle podziałów komórkowych. Wzrost komórek mierzono przez włączenie [³H]-tymidyny przez osiemnaście godzin dodawanej w dniach trzecim, czwartym i piątym. Komórki przeniesiono na filtr, przemyto i radioaktywność zliczono przy użyciu licznika beta Matrix 96 (Packard). Procent wzrostu komórek mierzono jak następuje:

(przeciętne liczby komórek inkubowanych danym stężeniem inhibitora) x 100 % wzrostu komórek = ---:—:—:--—:-—--(przeciętne liczby komorek inhibitora)

Wartość EC50 w tych doświadczeniach wyznaczano jako stężenie związku testowego, które spowodowało zliczenie radioaktywności o 50% niższe niż zliczenie otrzymane przy użyciu próby kontrolnej bez inhibitora. Związek D-000 wykazywał aktywność hamującą o EC50 w przybliżeniu 2 μΜ dla linii KU812 i RWLeu4. Nie stwierdzono, żeby związek miał wpływ w liniach K562 i MEG-01.

Widać, że inhibitory PI3K<> według wynalazku hamują wzrost komórek CML, a więc mogą być przydatne przy leczeniu łagodnych lub złośliwych nowotworów. Jak dotąd wykazano ekspresję PI3K<> głównie w komórkach pochodzenia krwiotwórczego. Jednak, może ona być obecna w szerszej rozmaitości proliferujących komórek. Zatem związki według wynalazku mogą być stosowane do indukowania regresji nowotworu i do zapobiegania tworzeniu przerzutów nowotworu zarówno w białaczkach, jak i w guzach litych lub przy proliferacji pochodzenia innego niż nowotworowe. Ponadto, związki mogą być stosowane zarówno same jak i w kombinacji z innymi związkami farmakologicznie aktywnymi lub w kombinacji z promieniowaniem jako środkiem uczulającym.

P r z y k ł a d 14

Pomiar egzocytozy elastazy w płynie z płukania kieszonki powietrznej myszy

Testowano wpływ D-030 na dopływ leukocytów i egzocytozę elastazy neutrofili w modelach zwierzęcych. Model sześciodniowej kieszonki powietrznej to model zapalenia in vivo, który histologicznie przypomina błonę maziową stawu. Powstaje wyściółka ze zorganizowanych komórek jednojądrzastych i fibroblastów, która blisko przypomina jamę maziówkową. Model przedstawia „ostry” model choroby przewlekłej (np., reumatoidalnego zapalenia stawów). Ten model pozwala na ocenę in vivo środków do blokowania dopływu komórek do kieszonki powietrznej pod wpływem bodźca zapalnego.

PL 213 200 B1

Test przeprowadzono jak następuje: dnia zerowego, grupy szczurów ogolono i 10 ml powietrza wstrzyknięto w grzbiet każdego, tworząc kieszonkę. Trzeciego dnia ponownie wstrzyknięto 10 ml powietrza. Na sześć godzin przed prowokacją TNF, jedna grupa szczurów (n = 6) otrzymała doustnie D-030 (100 mg/kg w nośniku PEG 400), a druga grupa (n = 12) otrzymała doustnie sam nośnik. Po sześciu godzinach od dawkowania, kieszonki powietrzne obu grup otrzymały 2,5 ng TNF. Po dwunastu godzinach od dawkowania kieszonki przemyto solanką, i w otrzymanym płynie z płukania analizowano liczby leukocytów i aktywność elastazy neutrofili. Ponadto, pobierano krew dla określenia poziomów D-030 w krążeniu. Wyniki były następujące: szczury, które otrzymywały D-030 przez dwanaście godzin, miały przeciętnie 8,7 μΜ związku w krążeniu i miały 82% zmniejszenie liczby leukocytów całkowitych w płynie po płukaniu w porównaniu z próbami kontrolnymi z nośnikiem. Zmniejszenia konkretnych liczb leukocytów były jak następuje: neutrofile (90%), eozynofile (66%), i limfocyty (70%). Pomiar ilościowy elastazy neutrofili wykazał, że szczury potraktowane D-030 miały raczej zmniejszone poziomy elastazy (15%) w odniesieniu do prób kontrolnych z nośnikiem.

W innym teście, ostrzyżono maszynką pole grzbietu myszy i wytworzono kieszonkę powietrzną wstrzykując podskórnie 3 ml powietrza. Na trzeci dzień wstrzykiwanie powietrza powtórzono. Na szósty dzień zwierzętom podano albo D-030 (32 mg/kg ine LABRAFIL®) albo tylko LABRAFIL® na jedną godzinę przed i dwie godziny po prowokacji TNF-α (0,5 ng in 1 ml PBS), albo tylko PBS. PBS oznacza solankę zbuforowaną fosforanem. Po czterech godzinach od prowokacji TNF, zwierzęta znieczulono i kieszonki przepłukano 2 mL 0,9% solanki z 2 mM EDTA. Płyn po płukaniu wirowano przy 14000 obr/min w mikrowirówce. Pięćdziesiąt mikrolitrów supernatantu użyto do mierzenia egzocytozy elastazy zgodnie z procedurą opisaną wyżej.

Jak pokazano na Figurze 9, prowokacja TNF indukowała wysoki poziom egzocytozy elastazy w porównaniu ze zwierzętami prowokowanymi przez PBS. Jednak, gdy zwierzęta prowokowane TNF potraktowano D-030, to zaobserwowano znaczący spadek aktywności elastazy w płynie z płukania kieszonek powietrznych.

Wszystkie publikacje i dokumenty patentowe cytowane w niniejszym opisie stanowią dla niego odnośnik ze wszystkim, co ujawniają.

Podczas gdy niniejszy wynalazek został opisany w konkretnym odniesieniu do pewnych korzystnych wykonań dla celów klarowności i zrozumiałości, to dla specjalisty będzie widome, że można zrealizować dalsze zmiany i modyfikacje leżące w zakresie wynalazku, jaki jest zdefiniowany w zastrzeżeniach podanych poniżej. Odpowiednio, na wynalazek nie powinno się nakładać ograniczeń innych niż ograniczenia konkretnie przytoczone w zastrzeżeniach.

Claims

1. Związek o wzorze w którym Y stanowi bezpośrednie wiązanie;

R⁴ jest wybrany z grupy składającej się z H, fluorowca, OCH3 i CH3;

₅

R⁵ jest wybrany z grupy składającej się z H, OCH3 i fluorowca;

R^d oznacza NH2;

PL 213 200 B1 q wynosi 1;

2. Związek według zastrz. 1 wybrany z grupy składającej się z: 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-izopropylofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-bifenyl-2-ilo-5-chloro-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-fluorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-fluorofenylo)-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-8-chloro-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-metylo-3H-chinazol-in-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-fluoro-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-7-fluoro-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-6-chloro-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-6-bromo-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-6,7-dimetoksy-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-onu; i 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-metoksy-fenylo)-3H-chinazolin-4-onu.

3. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że jest wybrany z grupy składającej się z H, fluorowca, OH, OCH3 i CH3;

C1-C6alkilofenylowej i bifenylowej; przy czym (a) R⁴ i R⁵, niezależnie, są różne od grup 6-fluorowcowej albo 6,7-dimetoksylowej; i (b) R⁶ jest różny od grupy 4-chlorofenylowej.

4. Związek według zastrz. 2 wybrany z grupy składającej się z: 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-izopropylofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-metylo-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-bifenyl-2-ilo-5-chloro-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-fluorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-fluorofenylo)-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-8-chloro-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-(2-chlorofenylo)-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-metylo-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-5-fluoro-3H-chinazolin-4-onu; 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-3-(2-chlorofenylo)-7-fluoro-3H-chinazolin-4-onu; i 2-(6-aminopuryn-9-ylometylo)-5-chloro-3-o-tolilo-3H-chinazolin-4-onu.

5. Związek o ogólnym wzorze strukturalnym w którym A oznacza purynyl ewentualnie podstawiony jedną do trzech grup wybranych z grupy obejmującej N(R^a)2, atom fluorowca, C1-3alkil, S(C1-3alkil), C=O and OR^a;

X oznacza CHR^b;

R¹ i R², niezależnie, są wybrane z grupy składającej się z wodoru, grupy C1-6alkilowej, atomu fluorowca, grupy NO2, OR^a, N(R^a)2, OC2-4alkilenoOR^a i NR^aC1-4alkilenoN(R^a)2;

PL 213 200 B1 ₃

R³ oznacza fenyl ewenulanie podstawiony jedną do trzech grup wybranych z grupy składającej się z fluorowca, grupy N(R^a)2, C(=O)OR^a, NO2, C(=O)R^a, OR^a, C(=O)OR^a, fenylowej, C1-4alkilowej, NR^aC1-4alkilenoN(R^a)2, i NR^aC(=O)R^a;

a każdy z R^a jest wybrany niezależnie z grupy składającej się z wodoru, fluorowca, grupy C1-6alkilowej, C1-3alkilenoN(R^a)2, fenylowej, benzylowej, C1-3alkilenofenylowej, C(=O)C1-4alkilowej, OH albo dwie grupy R^a wzięte razem tworzą 6-członowy pierścień, ewentualnie zawierający jeden albo dwa heteroatomy wybrane z grupy obejmującej N i O; R^b jest wybrany z grupy składającej się z wodoru i grupy C1-6alkilowej; i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole.

6. Związek według zastrz. 5, znamienny tym, że X jest wybrany z grupy składającej się z CH2, CH(CH3) i C(CH3)2.

7. Związek według zastrz. 5, znamienny tym, że układ pierścieniowy A jest podstawiony jednym do trzech podstawników wybranych z grupy składającej się z NH2, NH(CH3), N(CH3)2, NHCH2C6H5, NH(C2H5), Cl, F, CH3, SCH3 i OH.

8. Związek według zastrz. 5, znamienny tym, że R¹ i R² niezależnie są wybrane z grupy składającej się z H, OCH3, Cl, Br, F, CH3, NO2, OH, N(CH3)2, / \ ο nch₂ch₂nh

\......./ ^{ά 1} i O(CH2)2OCH2C6H5.

₃

9. Związek według zastrz. 5, znamienny tym, że R³ jest podstawiony podstawnikiem wybranym z grupy obejmującej Cl, F, CH3, CH(CH3)2, OCH3, C6H5, NO2, NHC(=O)CH3, CO2H i N(CH3)CH2CH2N(CH3)2.

10. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje związek określony w zastrz. 1 i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym kompozycja ta stanowi selektywny inhibitor PI3^.

11. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje związek określony w zastrz. 2 i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym kompozycja ta stanowi selektywny inhibitor PI3^.

12. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje związek określony w zastrz. 5 i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym kompozycja ta stanowi selektywny inhibitor PI3^.

13. Związek określony w zastrz. 1 do zastosowania jako lek do leczenia choroby wybranej z grupy składającej się z:

i) raków pochodzenia krwiotwórczego, korzystnie:

a) chłoniaków wybranych korzystnie spośród chłoniaka Burkitta, choroby Hodgkina, chłoniaka nieziarniczego, chłoniaka limfocytowego,

b) szpiczaka mnogiego,

c) białaczek wybranych korzystnie spośród białaczek limfocytowych, przewlekłych białaczek szpikowych (związanych z rozwojem szpiku);

PL 213 200 B1

14. Związek określony w zastrz. 2 do zastosowania jako lek do leczenia choroby wybranej z grupy składającej się z:

i) raków pochodzenia krwiotwórczego, korzystnie:

b) szpiczaka mnogiego,

15. Związek określony w zastrz. 5 do zastosowania jako lek do leczenia choroby wybranej z grupy składającej się z:

i) raków pochodzenia krwiotwórczego, korzystnie:

b) szpiczaka mnogiego,

v) chorób autoimmunizacyjnych wybranych korzystnie spośród liszaja rumieniowatego uogólnionego (SLE), autoimmunizacyjnego zapalenia tarczycy, stwardnienia rozsianego, niektórych postaci cukrzycy i zespołu Reynauda; oraz