PL213167B1 - Sposób immobilizacji komórek drobnoustrojóww kapsułkach z membraną alginianową - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób immobilizacji komórek drobnoustrojów w kapsułkach z membraną alginianową, prowadzący do otrzymania biokatalizatora, który można stosować w okresowych lub ciągłych procesach biotransformacji i biosyntezy. Powyższy sposób można także wykorzystywać do kapsułkowania drobnoustrojów, które mają być konsumowane.

Znany jest tradycyjny sposób immobilizacji komórek drobnoustrojów w trójwymiarowej sieci splecionych łańcuchów polimerowych alginianu wapnia. W tej procedurze przygotowuje się najpierw wodny roztwór alginianu sodu, w którym rozprowadza się materiał biologiczny. Następnie zawiesinę komórek drobnoustrojów w roztworze alginianu sodu wkrapla się do roztworu chlorku wapnia. W wyniku wymiany jonów sodowych na wapniowe dochodzi do przekształcenia kropli alginianu w granulkę żelu. Opisaną powyżej procedurę stosowano m.in. podczas immobilizacji komórek drożdży Saccharomyces bayanus (US 5 070 019), aby otrzymać immobilizowany biokatalizator do produkcji napojów alkoholowych. Wadą konwencjonalnego sposobu immobilizacji jest istotne ograniczenie dotyczące ilości komórek, które można pułapkowa w jednostce objętości żelu. Liczne dane literaturowe wskazują na to, że przy wzrastającej zawartości materiału biologicznego w żelu alginianu wapnia spada wytrzymałość mechaniczna biokatalizatora i nie można go stosować w bioreaktorach przemysłowych. Istotny postęp uzyskano po opracowaniu procedury opisanej w amerykańskim patencie US 5 766 907, która polega na produkcji kapsułek z membraną alginianową. Wewnątrz kapsułek znajdują się immobilizowane komórki drobnoustrojów. Z przytoczonego w patencie przykładu wynika, że pierwszy etap immobilizacji polegał na rozprowadzeniu komórek drożdży w roztworze zawierającym 1,3% chlorku wapnia i 0,26% ksantanu jako składnika zagęszczającego. Następnie poprzez igłę lekarską wkraplano zawiesinę komórek do roztworu alginianu o stężeniu 0,6% z dodatkiem 0,1% substancji powierzchniowo czynnej o nazwie handlowej Tween. Po 10 minutach mieszania otrzymywano kuliste kapsułki z membraną alginianową. Następnie oddzielano kapsułki, przemywano wodą i utwardzano przez minut w roztworze chlorku wapnia o stężeniu 1,3%. Zawartość komórek drożdży w kapsułkach po ₃ przeliczeniu na suchą masę wynosiła tylko 4,01 g/dm³. Z tego względu inkubowano kapsułki w me₃ dium hodowlanym i uzyskiwano wzrost zawartości komórek drożdży do 83 g/dm³. Opisane w patencie kapsułki z immobilizowanymi komórkami drożdży były stosowane do okresowej i ciągłej hydrolizy roztworów sacharozy. Taki proces może być wykorzystywany do przemysłowej produkcji cukru inwertowanego. Prezentowana metoda immobilizacji była stosowana również do kapsułkowania komórek Lactobacillus casei przy produkcji kwasu mlekowego (Enzyme and Microbial Technology, 1996 r., tom 19, s. 428-433), a także komórek Pseudomonas putida przy produkcji benzaldehydu (Enzyme and Microbial Technology, 2002 r., tom 30, s. 726-733). W innych procedurach dokonano zmiany ksantanu jako substancji zagęszczającej zawiesinę drobnoustrojów na karboksymetylocelulozę (Journal of Biotechnology, 2006 r., tom 125, s. 377-384) lub glikol polietylenowy (Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2007 r., tom 34, s. 381-391).

We wszystkich tych procedurach stosowano odpowiednie substancje zagęszczające i dodatkowo konieczne było w drugim etapie przetrzymywanie kapsułek w mediach hodowlanych, aby doprowadzić do namnożenia komórek. Ma to istotne znaczenie, ponieważ zawartość aktywnego materiału biologicznego wewnątrz kapsułek decyduje zazwyczaj o aktywności immobilizowanego biokatalizatora. Jednak ze względu na występujące ograniczenia tlenowe przy hodowli komórek drobnoustrojów wewnątrz kapsułek jest to operacja czasochłonna i kosztowna.

Znany jest również z opisu patentowego CA 2012409 i publikacji A. Mortzawianan et al., 2007; B. C. Larisch et al., 1994; K. Yamagiwa et al., 1994 sposób odnoszący się jednakże do granulek a nie do kapsułek. Przy produkcji granulek dyspergowany jest roztwór alginianu sodu przez wkraplanie lub emulsyfikację a przy produkcji kapsułek dyspergowany jest roztwór soli z kationami dwuwartościowymi lub/i trójwartościowymi (najczęściej chlorku wapnia). Przy produkcji granulek istnieje górny limit ilości komórek. Natomiast przy produkcji kapsułek istnieje dolny limit ilości komórek.

W publikacji A. Mortazaviana et al., 2007, wskazano na niepożądane efekty w postaci, np. niesmaku przy konsumowaniu kapsułek, gdy zawartość komórek w „kapsułce” jest większa niż specjalny limit. Opinia ma jedynie sens w przypadku granulek, które w całej swej objętości, a zatem i na powierzchni zawierają komórki drobnoustrojów. Natomiast kapsułki z membraną alginianową na powierzchni bardzo dobrze maskują smak zawartych wewnątrz nich komórek drobnoustrojów. Ten przykład wyraźnie pokazuje, że próba przeniesienia wiedzy z zakresu wytwarzania granulek na kapsułki

PL 213 167 B1 może prowadzić do błędnych wniosków. Zamieszanie w nazewnictwie wynika stąd, że część autorów publikacji nie stosuje tego rozgraniczenia i granulki nazywa często kapsułkami.

Celem wynalazku było opracowanie metody produkcji kapsułek z membraną alginianową o wysokiej zawartości komórek drobnoustrojów przy zastosowaniu możliwie najprostszej procedury.

Zaskakująco okazało się, że mieszanie miedzy wkraplaną zawiesiną komórek drobnoustrojów a roztworem alginianu sodu podczas formowania się membrany można wyeliminować również bez obecności substancji zagęszczającej, gdy zawartość komórek w zawiesinie osiągnie pewną minimalną wartość. Podstawową zaletą opracowanej procedury jest uzyskanie bardzo wysokiej zawartości komórek w kapsułkach alginianowych bez konieczności ich dalszego namnażania w mediach hodowlanych.

Dodatkową zaletą rozwiązania według wynalazku jest całkowita eliminacja substancji zagęszczających takich jak ksantyn, karboksymetyloceluloza, skrobia czy glikol polietylenowy. Wykonane próby przy zastosowaniu skoncentrowanych zawiesin komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae i bakterii Escherichia coli o zawartości suchej masy komórek drobnoustrojów powyżej 18% mas., w roztworach soli związków żelujących alginian sodu, pozwoliły na uzyskiwanie kulistych kapsułek z membraną alginianową. Po oddzieleniu kapsułek od roztworu alginianu i przemyciu wodą stabilizowano je w wodnych roztworach soli żelujących alginiany. Otrzymywane kapsułki charakteryzują się bardzo dobrą wytrzymałością mechaniczną na zgniatanie i można je stosować w bioreaktorze kolumnowym w długim okresie.

Claims (1)

1. Sposób immobilizacji komórek drobnoustrojów w kapsułkach z membraną alginianową, składających się ze rdzenie utworzonego z półpłynnej zawiesiny drobnoustrojów i zewnętrznej membrany, znamienny tym, że zawiesinę zawierającą co najmniej 18% mas. komórek drobnoustrojów w wodnym roztworze soli z kationami dwuwartościowymi lub/i trójwartościowymi, wkrapla się do roztworu alginianu sodu.