PL212717B1 - Sposób wytwarzania 17a-oxa-D-homo-androst-4-en-3,17-dionu (testololaktonu) - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 17a-oxa-D-homo-androst-4-en-3,17-dionu, (testololaktonu) o wzorze 2 przedstawionym na rysunku.

Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym.

Laktony steroidowe, głównie te z fragmentem laktonowym w pierścieniu D, wykazują różnorodną aktywność biologiczną, między innymi: antynowotworową, przeciwbakteryjną, antyandrogenną, obniżają poziom cholesterolu w organizmach ssaków (A. Μ. H. Brodie, V. C. O. Njar. J., Steroid Biochem. Mol. Biol. 1998, 66, ss. 1-10; S. Li, E. J. Parish. JAOCS, 1996, 73, ss. 1435-51).

Testololakton jest inhibitorem aktywności aromatazy ssaków, w tym ludzkiej, i skutecznie ogranicza rozwój hormono-zależnych guzów raka piersi, przerostu i raka prostaty.

Innym obszarem stosowania testololaktonu są zaburzenia równowagi estrogeny/androgeny, co wykorzystywane jest w terapii ginekomastii i przedwczesnego dojrzewania (G. E. Serafini, S. Moslemi. Mol. Cell. Endocrinol. 2001, 178, ss. 117-131).

Mimo iż znane jest chemiczne utlenienie typu Baeyera-Villigera, które jest wydajną metodą otrzymywania laktonów steroidowych, to przeprowadzenie tej reakcji przy użyciu kultur mikroorganizmów jest atrakcyjną, konkurencyjną metodą ze względu na wysoką wydajność uzyskiwanego produktu i ogólnie znane zalety stosowania „green chemistry”. Wykorzystanie transformacji mikrobiologicznej jest szczególnie korzystne w przekształceniach, które obejmują więcej niż jedną reakcję.

Znane są z literatury przykłady mikrobiologicznego utlenienia 4-en-3-okso ketonów steroidowych do testololaktonu, między innymi z udziałem szczepów z rodzaju Penicillium, Aspergillus, Cylindrocarpon, Rhohococcus, natomiast nieliczne są przykłady enzymatycznego utlenienia 3e-hydroksy-5-en substratów (H-M. Liu, H. Li, L. Shan, J. Wu. Steroids, 2006, 71, 931-4; T. Kołek, A. Szpineter, A. Świzdor, Steroids, 2008, 73, ss. 1441-1445; T. Kołek, A, Szpineter; A. Świzdor, Steroids, 2009, 74, ss. 859-62; A. C. Hunter, E. Coyle, F. Morse. C. Dedi, Η. T. Dodd, S-J. Koussoroplis, Biochim. Biophys. Acta, 2009, 1791, ss. 110-117).

W przekształceniu 3e-hydroksy-androst-5-en-17-onu (DHEA) do testololaktonu zachodzą trzy reakcje: utlenienie grupy hydroksylowej przy C-3 i izomeryzacja wiązania podwójnego C-5 w położenie C-4 oraz utlenienie Baeyera-Villigera C-17 ketonu. W znanym przykładzie mikrobiologicznego utlenienia DHEA przez Penicillium citreo-viride, uzyskano testololakton z wydajnością 65% (H-M. Liu, H. Li, L. Shan, J. Wu. Steroids, 2006, 71, ss. 931-4). W transformacji tego substratu przez Penicillium camembertii otrzymano 82% testololaktonu, podczas transformacji powstawał też drugi D-Iakton: 3e-hydroksy-17a-oxa-D-homo-androst-5-en-17-on (T. Kołek, A. Szpineter; A. Świzdor, Steroids, 2009, 74, ss. 859-62).

Istota wynalazku polega na tym, że DHEA przekształca się do testololaktonu (17a-oxa-D-homo-androst-4-en-3,17-dionu) za pomocą kultury szczepu grzyba strzępkowego z gatunku Penicillium lanoso-coeruleum.

Korzystne jest, gdy proces transformacji prowadzi się wodną kulturą szczepu, przy wstrząsaniu reagentów, w temperaturze 293-300 K.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach mikroorganizmu Penicillium lanoso-coeruleum, 3e-hydroksy-androst-5-en-17-on (DHEA) ulega przekształceniu, które obejmuje: utlenienie grupy hydroksylowej przy C-3, izomeryzację wiązania podwójnego C-5 w położenie C-4 oraz utlenienie typu Baeyera-Villigera C-17 ketonu. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem przez ekstrakcję octanem etylu.

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 3e-hydroksy-17a-oxa-D-homo-androst-5-en-17-onu, jako jedynego produktu reakcji, z wydajnością 90%, w temperaturze pokojowej i pH bliskim obojętnemu.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

P r z y k ł a d. Do kolby Erlenmayera o pojemności 250 cm³, w której znajduje się 100 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 3 g glukozy i 1 g aminobaku, wprowadza się 1 cm³ zawiesiny komórek Penicillium lanoso-coeruleum, wzrastających przez dwa dni na tym samym podłożu przy stałym wstrząsaniu w temperaturze 293-300 K. Po dwóch dniach wzrostu dodaje się 30 mg DHEA, o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ acetonu. Transformację prowadzi się przy ciągłym wstrząsaniu przez kolejne 72 godziny w warunkach, w których prowadzona jest hodowla mikroorganizmu. Następnie uzyskane roztwory transformacyjne ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem

PL 212 717 B1 magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymuje się 35 mg surowego produktu, który oczyszcza się chromatograficznie używając jako eluentu mieszaniny: heksan: aceton, w stosunku 1:1.

Na tej drodze otrzymuje się 27 mg testololaktonu (wydajność 90%).

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi: t.t. 481-483 K;

¹H-NMR δ (ppm) w CDCl₃: 1,16 (s, 19-H₃); 1,35 (s, 18-H₃); 2,60 (m, 16a-H); 2,67 (m, 16β-Η); 5,75 (s, 4-H);

¹³C-NMR: δ (ppm) w CDCl3: 199,4 (C-3); 171,0 (C-17); 169,4 (C-5); 124.1 (C-4); 82,6 (C-13); 52,4 (C-9); 45,6 (C-14); 39,1 (C-12); 38,3 (C-10); 38,1 (C-8); 35,5 (C-1); 33,8 (C-2); 32,3 (C-6); 30,4 (C-7); 28,6 (C-16); 21,9 (C-11); 20,2 (C-18); 19,8 (C-15); 17,5 (C-19);

IR v_max (cm^-1): 1717, 1666, 1614, 1210.

Claims (3)

1. Sposób wytwarzania 17a-oxa-D-homo-androst-4-en-3,17-dionu, testololaktonu o wzorze 2, na drodze transformacji mikrobiologicznej, w którym jako substrat stosuje się DHEA, o wzorze 1, znamienny tym, że substrat przekształca się za pomocą kultury szczepu grzyba strzępkowego z gatunku Penicillium lanoso-coeruleum.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces biotransformacji substratu prowadzi się wodną kulturą szczepu przy ciągłym wstrząsaniu reagentów.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces biotransformacji substratu prowadzi się w temperaturze 293-300 K.