PL211753B1 - Zastosowanie koncentratu antygenowo nie-specyficznych immunoglobulin pochodzących z krwi zwierząt i kompozycja farmaceutyczna zawierająca immunoglobuliny - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie koncentratu immunoglobulin pochodzących z krwi zwierząt i kompozycja farmaceutyczna zawierająca immunoglobuliny w terapii człowieka w zaburzeniach immunologicznych, przeznaczonego do podawania doustnie.

Podstawowym źródłem składników pokarmowych dla organizmu jest krew, która zawiera wysoko funkcjonalne białka, takie jak immunoglobulina, albumina, fibrynogen i hemoglobina. Immunoglobuliny są produkowane przez dojrzałe komórki B (komórki osocza) i wyróżnia się pięć różnych klas immunoglobulin, określanych jako klasy: M, D, E, A i G.

We krwi główną klasą obecnych immunoglobulin jest IgG.

Dożylne podawanie produktów immunoglobulin jest od dawna stosowane jako próba regulowania czy wspomagania układu immunologicznego. Większość danych dotyczących wpływu podawanych dożylnie IgG na układ immunologiczny sugeruje, że frakcja stałego regionu (Fc) molekuły pełni funkcję regulatorową. Właściwości specyficznie wiązanego antygenu do poszczególnej molekuły IgG są nadawane poprzez trójwymiarową przestrzeń utworzoną poprzez uwarunkowane dziedzicznie (wrodzone) sekwencje aminokwasów w regionach zmiennych dwóch lekkich i dwóch ciężkich łańcuchów molekuły. Region stały może być oddzielony od regionu zmiennego jeżeli nienaruszona molekuła jest rozszczepiona przez enzym proteolityczny, taki jak papaina. Takie traktowanie prowadzi do otrzymania dwóch fragmentów o specyficzności przeciwciała (fragmenty Fab) i jednego względnie stałego fragmentu (Fc). Liczne komórki w organizmie mają różne receptory błonowe dla fragmentu Fc odpowiedniej molekuły IgG (Fcr). Chociaż niektóre receptory Fcr wiążą wolne IgG, większość wiąże się bardziej efektywnie jeżeli antygen jest związany z molekułą przeciwciała.

W rezultacie przyłączenia się antygenu nastę puje zmiana w kształ cie fragmentu Fc, co uł atwia wiązanie się do receptora. Kompleksowa zależność sygnałów wprowadza równowagę i stosowność odpowiedzi immunologicznej wywołanej w dowolnym czasie w odpowiedzi na dany antygen. Odpowiedzi antygenowo specyficzne są wzbudzane gdy specjalistyczne komórki prezentujące antygen wprowadzają antygen, tworząc kompleks z molekułami głównego kompleksu zgodności tkankowej i receptorami specyficznie wspomagających komórek T, zdolnych do rozpoznania tego kompleksu. Okazało się, że IgG uczestniczy w regulowaniu reakcji zarówno alergicznych jak i autoimmunologicznych. Dożylnie podawana immunoglobulina do manipulacji immunologicznych była proponowana od dłuższego czasu lecz otrzymywano różne wyniki w leczeniu stanów chorobowych. Szczegółowy przegląd zastosowania dożylnie podawanej immunoglobuliny jako leku terapeutycznego do manipulowania układem immunologicznym opisano w literaturze: Vol.326, No.2 str.107-116, New England Journal of Medicine Dwyer, John M..

Obecnie trwają wysiłki w dziedzinie udoskonalania kompozycji i sposobów immunologicznej modulacji zwierząt. Odpowiednia immunomodulacja jest istotna przy wzmacnianiu odpowiedzi na patogeny, szczepionki, zwiększaniu przyrostu wagi i polepszaniu efektywności żywienia, poprawie stanu zdrowia i wpływa na leczenie stanów chorobowych związanych z zaburzeniami immunologicznymi.

Celem obecnego wynalazku jest przedstawienie zastosowania koncentratu immunoglobulin i kompozycji farmaceutycznej przeznaczonych do leczenia człowieka cierpiącego na zaburzenia immunologiczne.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie koncentratu antygenowo nie-specyficznych immunoglobulin pochodzących z krwi zwierząt, poza człowiekiem, do wytwarzania leku do leczenia człowieka cierpiącego na zaburzenia immunologiczne, wybrane z grupy obejmującej przewlekłe pobudzenie immunologiczne, choroba Crohna, reumatoidalne zapalenie stawów, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, HIV, przy czym koncentrat immunoglobuliny jest w postaci do podawania doustnie człowiekowi. Koncentrat immunoglobuliny otrzymywany jest sposobem, który obejmuje etapy:

(i) otrzymywanie osocza z krwi zwierząt, poza człowiekiem, (ii) uwapnienie osocza związkiem wapnia dla zapobiegania utworzeniu się skrzepu, (iii) odwirowanie osocza i usunięcie fibryny, (iv) odfiltrowanie osocza, (v) precypitacja soli frakcji globulin, (vi) odwirowanie i wyizolowanie frakcji bogatej w globuliny.

Źródłem koncentratu immunoglobuliny jest osocze pochodzące od bydła, świni, drobiu, owcy, konia lub kozy.

PL 211 753 B1

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, zawierająca immunoglobuliny w klasach M, D, E, A lub G, przy czym koncentrat immunoglobulin zawiera około 35-50% IgG, immunoglobulina ma nietknięte regiony Fab i Fc, gdzie koncentrat immunoglobulin pochodzi z krwi zwierząt, poza człowiekiem, do doustnego stosowania w leczeniu u ludzi przewlekłego pobudzenia immunologicznego, choroby Crohna, reumatoidalnego zapalenia stawów, wrzodziejącego zapalenia okrężnicy lub HIV.

Kompozycja farmaceutyczna zawiera koncentrat immunoglobuliny otrzymywany sposobem według wynalazku a źródłem koncentratu immunoglobuliny jest osocze pochodzące od bydła, świni, drobiu, owcy, konia lub kozy.

Celem wynalazku jest uzyskanie wzrostu przyrostu wagi, polepszenie ogólnego stanu zdrowia i polepszenie efektywnoś ci ż ywienia zwierzą t poprzez odpowiednie modulowanie ukł adu immunologicznego zwierząt.

Ujawniono oczyszczone i wyizolowane z surowicy komponenty i ich pochodne, które są użyteczne w kompozycjach farmaceutycznych do immunologicznego modulowania ludzi. Opisano jak kompozycje osocza zawierające immunoglobulinę, gdy są podawane doustnie regulują lub obniżają niespecyficzną odpowiedź immunologiczną oraz wzbudzają obniżenie i regulowanie poziomów surowiczego IgG i poziomów TNF-Δ względem pacjentów niekarmionych doustnie immunoglobulina czy frakcjami osocza. Doustne podanie kompozycji osocza zawierającego immunoglobulinę działa na ogólny stan immunologiczny pacjentów eksponowanych na antygen, szczepienia według protokołu szczepień i na leczenie stanów chorobowych związanych z zaburzeniami immunologicznymi.

Zgłaszający niespodziewanie wykazali, że doustna forma podania białka osocza może wzbudzać zmiany w immunoglobulinie surowicy i TNF-Δ, jak również i inne niespecyficzne odpowiedzi immunologiczne. Jest to nieoczekiwane, ponieważ dotąd myślano tradycyjnie, że białka osocza takie jak immunoglobuliny muszą być wprowadzane dożylnie aby mogły oddziaływać na krążące IgG, TNF-Δ czy inne składniki niespecyficzne immunologicznie. Natomiast, zgłaszający wykazali, że doustnie podana globulina ma zdolność wpływania na poziomy surowiczego IgG czy TNF-Δ. Oprócz tego, ten efekt może być obserwowany przez co najmniej 14 dni. To ogromnie upraszcza zastosowanie immunomodulujących kompozycji takich jak immunoglobulina czy jej kompozycje, które zgodnie z wynalazkiem mogą być po prostu dodane do pokarmu czy nawet do wody, w celu modulowania szczepienia czy leczenia pacjentów w stanach chorobowych z zaburzeniami immunologicznymi.

Zgłaszający wykazali, że modulacja surowiczym IgG i TNF-Δ wpływa na odpowiedź układu immunologicznego do stymulowania szczepienia zgodnie z protokołem szczepienia oraz na zaburzenia związane z nieprawidłowościami immunologicznymi. Modulowanie surowiczym IgG i TNF-Δ pozwala układowi immunologicznemu na bardziej efektywną odpowiedź na wywołaną chorobę poprzez znaczne wzmocnienie odpowiedzi organizmu w istniejącym stanie choroby lub prezentację antygenu.

Ponadto, tak wywołana regulacja immunologiczna i osiągana wydajność, jako bio-energetyczny koszt związany z podwyższeniem funkcji immunologicznej wymaga znacznej ilości energii i środków odżywczych, które pochodzą z takich procesów jak wzrost komórkowy i przyrost wagi. Modulacja układu immunologicznego pozwala energii i składnikom odżywczym na ich wykorzystanie do innych funkcji wydzielniczych takich jak wzrost czy wydzielanie mleka, Buttgerut i wsp. Bioenergetics of Immune Functions: Fundamental and Therapeutic Aspects, Immunology Today, April 2000, Vol. 21 no.4, str.192-199.

Ponadto wykazano, że po doustnym spożyciu fragment Fc kompozycji globuliny jest istotny dla komunikowania i/lub następującej modulacji układowego surowiczego IgG. Jest to unikalne z tego względu, że fragment molekuły nie-specyficzny immunologicznie po doustnym podaniu moduluje układowe surowicze IgG, bez podania dożylnego, tak jak to opisano poprzednio (Dwyer, 1992). Specyficzne frakcje przeciwciał wytwarzają mniejszą odpowiedź bez Fc o trzeciorzędowej strukturze. Ponadto, udział globulin w nietkniętej postaci daje lepsze wyniki niż oddzielone od siebie ciężkie i lekkie łańcuchy.

Krótki opis rysunków.

Fig. 1. przedstawia wykres wpływu doustnego podania białek osocza na produkcję przeciwciał po pierwszym i drugim szczepieniu rotawirusem.

Fig. 2 przedstawia wykres wpływu doustnego podania białek osocza na produkcję przeciwciał po pierwszym i drugim szczepieniu PRRS.

Fig. 3 przedstawia wykres TNF-α makrofagach hodowlanych: wpływ stymulacji LPS-em.

PL 211 753 B1

Zgłaszający przedstawił opis kompozycji farmaceutycznych zawierających składniki oczyszczone i zatężone z osocza zwierzęcego. Gamma-globulina izolowana ze zwierząt, przykładowo z surowicy, osocza, jaj czy mleka, jest podawana doustnie w połączeniu ze szczepieniem według protokołu szczepienia lub stosowane do leczenia różnych stanów chorobowych, zaburzeń immunologicznych poprzez modulowanie stymulacji układu immunologicznego. Całkowicie niespodziewanie stwierdzono, że doustne podanie tej kompozycji wywołało obniżenie poziomów surowiczego IgG i TNF-Δ w porównaniu do sytuacji, gdy nie podano kompozycji farmaceutycznej. Rozpoczynając od stanu mniejszej stymulacji, układ immunologiczny był zdolny do wywołania bardziej agresywnej odpowiedzi w zależności od dawki. Co więcej, stany chorobowe związane ze zwiększeniem poziomów IgG lub TNF-Δ ulegają poprawie.

W odniesieniu do kompozycji osocza stosowane są następujące określenia osocze, globulina, gamma-globulina i immunoglobulina. Te określenia mają na celu ujawnienie oczyszczonych kompozycji pochodzenia zwierzęcego z krwi, jaj lub mleka, które zawierają fragment Fc w cząsteczce immunoglobuliny. Obejmują one również immunoglobuliny transgenicznie rekombinowane i oczyszczone z transgenicznych bakterii, roślin czy zwierząt. Mogą być one zastosowane po rozpryskowym suszeniu osocza lub w postaci globuliny po dodatkowym oczyszczeniu lub jeżeli są osiągalne z innego dostępnego źródła globulin surowiczych. Jednym z takich źródeł oczyszczonej globuliny jest NutrGammax lub ImmunoLin produkowane przez Proliant Inc. Globuliny mogą być oczyszczane zgodnie z dowolną metodą dostępną w tej dziedzinie, włącznie z metodami opisanymi przez Akita E.M. i S.Nakai, 1993. Porównano cztery metody oczyszczania do produkcji immunoglobuliny z jaj złożonych przez kury immunizowane szczepem E.coli pochodzenia jelitowego, Journal of Immunological Methods 160: 207-214; Steinbuch M i R.Audran, 1969. Izolacja IgG z surowic ssaków z dodatkiem kwasu kaprylowego, Archives of Biochemistry and Biophysics 134:279-284; Lee, Y.,T.Aishima, S.Nakai, i J.S.Sim. 1987. Optymalizacja selektywnego frakcjonowania białek osocza z krwi wołu przy użyciu glikolu polietylenowego, Journal of Agricultural and Food Chemistry 35: 958-962; Polson,A., G.M.Potgieter, J.F.Langier, G.E.F. Mears i F.J.Toubert. 1964, Biochem. Biophys. Acta. 82:463-475.

Osocze zwierzęce, z którego immunoglobulina lub inne frakcje osocza mogą być izolowana to osocze świńskie, wołowe, z drobiu, końskie lub kozie. Dodatkowo ujawniono, że źródła pokrewnych gamma globulin dają także zamierzony efekt.

Koncentraty produktu mogą być uzyskane poprzez suszenie rozpryskowe, liofilizację lub inne metody suszenia czy zatężania i koncentraty mogą być stosowane w postaci płynnej lub zamrożonej. Aktywny składnik może być zamknięty w mikrokapsułkach, zabezpieczony i stabilizowany od wysokiej temperatury, utleniaczy, wilgotności wpływającej na pH, etc. Farmaceutyczne kompozycje mogą być w postaci tabletek, kapsułek, ampułek do stosowania doustnego, granulowanego proszku, kremu, zarówno jako pojedynczy składnik lub w powiązaniu z innymi rozczynnikami, aktywnymi komponentami lub nawet jako dodatek do pożywienia.

Sposób uzyskania koncentratu kompozycji gamma-globuliny Globulina może być dostarczona jako składnik osocza.

Koncentrat immunoglobuliny pochodzi z krwi zwierząt. Źródłem krwi może być jakiekolwiek zwierzę, które ma krew zawierającą osocze i immunoglobuliny. Dla wygody, korzystna jest przetworzona krew z wołu, świni czy drobiu. Do całej krwi dodawany jest antykoagulant i następnie krew wiruje się w celu oddzielenia osocza. W tym celu może być użyty dowolny antykoagulant, włącznie z cytrynianem sodu i heparyną. Znawcy dziedziny mogą łatwo wybrać takie antykoagulanty. Następnie do osocza dodawany jest wapń aby pobudzać utworzenie się skrzepu, tj. przekształcenie się fibrynogenu w fibrynę. Dopuszczalne są także inne metody. Taka mieszanina jest następnie wirowana w celu usunięcia fragmentów fibryny.

Pierwszy raz fibryna jest usuwana z osocza w wyniku otrzymania surowicy, która może być głównym źródłem Ig. Alternatywnie, można także inaktywować tę część mechanizmu krzepnięcia przy użyciu różnych antykoagulantów.

Następnie osocze pozbawione włókien jest traktowane pewną ilością mieszaniny soli czy polimeru wystarczającej do precypitacji z osocza albuminy czy frakcji globulin. Przykłady mieszanin fosforanowych, które mogą być użyte do tego celu to polifosforany, włącznie z metaheksafosforanem sodowym i polifosforan potasu. Globulina może być także izolowana poprzez dodanie glikolu polietylenowego czy siarczanu amonu.

Następnie poprzez dodanie do mieszaniny fosforanu obniża się pH roztworu osocza co stabilizuje precypitację albuminy. pH nie powinno być poniżej 3,5 bo w przeciwnym razie białka osocza ulegną

PL 211 753 B1 zniszczeniu. Do tego celu może być użyty każdy rodzaj kwasu, w ilości jaka jest potrzebna dla roztworu osocza. Znawcy dziedziny łatwo wybiorą takie kwasy. Przykładami odpowiednich kwasów są HCL, kwas octowy, H2SO4, kwas cytrynowy i H2PO4. Kwas jest dodawany w ilości niezbędnej do obniżenia pH osocza do określonego poziomu. Generalnie, ilość ta będzie w proporcji od około 1:4 do 1:2 kwasu do osocza. Osocze jest następnie wirowane w celu oddzielenia frakcji globulin od frakcji albumin.

Następnym etapem jest podniesienie pH frakcji globulin z zasadowego, do momentu, w którym nie będzie powodowało korozji separatora. Odpowiednie zasady to NaOH, KOH i inne zasady alkaliczne. Takie zasady są łatwe do dobrania przez znawców dziedziny. pH frakcji globulin jest podnoszone do takiego aby było rzędu niekorozyjnego a więc powinno być zasadniczo od 5,0 do 9,0. Frakcje immunoglobulin zaleca się przepuścić dodatkowo przez mikrofiltry i usunąć obecne tam bakterie.

Ostateczny koncentrat immunoglobulin może być opcjonalnie rozpryskowo suszony na proszek. Postać proszku ułatwia pakowanie a produkt pozostaje stabilny przez czas dłuższy aniżeli surowy koncentrat globulin w formie płynu czy zamrożony.

Proszek koncentratu immunoglobuliny zawiera w przybliżeniu od 35-50% IgG.

Oprócz podawania z konwencjonalnymi nośnikami, aktywne składniki mogą być podawane różnymi specjalistycznymi technikami dostarczania leków, które są znane znawcom dziedziny.

Znawcy w dziedzinie medycyny łatwo ocenią, że dawki i zestawienia immunoglobulin będą się zmieniać w zależności od wieku, zdrowia, płci, wysokości i wagi pacjenta. Te parametry można zbadać dla każdego systemu przez dobrze ustalone procedury i analizy tj. w fazie I, II i III prób klinicznych.

Do takiego zastosowania koncentrat globulin może być połączony z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami takimi jak odpowiednie ciekłe nośniki czy rozczynniki i z dowolnymi środkami pomocniczymi czy dodatkami. Ciekłe nośniki i rozczynniki są typowe i są one dostępne w handlu. Przykładowo są to woda destylowana, sól fizjologiczna, wodne roztwory dekstrozy i tym podobne.

Generalnie, oprócz czynników aktywnych, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać odpowiednie rozczynniki i środki pomocnicze, które ułatwiają przetwarzanie związków aktywnych do preparatów, które mogą być stosowane farmaceutycznie.

Formy do podawania doustnego obejmują tabletki, drażetki i kapsułki.

Farmaceutyczne preparaty są produkowane sposobem, który jest dobrze znany specjalistom. Na przykład, farmaceutyczne preparaty mogą być przygotowywane przy użyciu typowych procesów mieszania, granulowania, otrzymywania drażetek, rozpuszczania, liofilizowania. Procesy będą ostatecznie zależały od właściwości fizycznych użytych aktywnych składników.

Odpowiednimi rozczynnikami są zwłaszcza wypełniacze takie jak cukry, na przykład laktoza lub cukier trzcinowy, mannitol lub sorbitol, preparaty celulozy i/lub fosforany wapnia, na przykład fosforan (tri)wapnia lub wodorofosforan wapnia, jak również spoiwa takie jak skrobie, pasta, przy użyciu na przykład skrobi kukurydzianej, skrobi z pszenicy, skrobi ryżowej, skrobi ziemniaczanej, żelatyny, gumy trakantowej, metylocelulozy, hydroksypropylometylocelulozy, karboksymetylocelulozy sodowej i/lub poliwinylo pirolidonu. W razie potrzeby można dodać preparaty rozdrabniające, takie jak skrobie, również skrobia karboksymetylowa, pochodna poliwinylopirolidonu, agar czy kwas alginowy lub jego sól taka jak alginian sodu. Środkami pomocniczymi są środki regulujące płynność i smary, na przykład krzemionka, talk, kwas stearynowy i jego sole, stearynian magnezu czy stearynian wapnia i/lub glikol polietylenowy. Rdzenie drażetek mogą mieć odpowiednią powłokę, która na życzenie, może być odporna na sok żołądkowy.

W tym celu można stosować stężone roztwory cukru, które mogą ewentualnie zawierać gumę arabską, talk, poliwinylopirolidon, glikol polietylenowy i/lub dwutlenek tytanu, roztwory lakieru i odpowiednie organiczne rozpuszczalniki czy mieszaniny rozpuszczalników. Do produkcji otoczek opornych na kwas żołądkowy, do otoczki tabletek drażetek można dodać roztwory odpowiednich preparatów celulozy takich jak ftalan acetylocelulozy lub ftalan hydroksypropylometylocelulozy, barwniki i pigmenty, na przykład do identyfikacji lub w celu charakterystyki różnego składu dawek związku.

Inne farmaceutyczne preparaty, które mogą być podawane doustnie obejmują kapsułki spasowane na wcisk [typu push-fit] wykonane z żelatyny, jak również miękkie, zamknięte kapsułki wykonane z żelatyny i zmiękczacza, takiego jak glicerol czy sorbit. Spasowane kapsułki typu push-fit mogą zawierać aktywne związki w formie granuli, które mogą być mieszane z wypełniaczami takimi jak laktoza, spoiwami takimi jak skrobie i/lub smarami takimi jak talk czy stearynian magnezu i dowolnymi środkami stabilizującymi. W miękkich kapsułkach aktywne związki są przeważnie rozpuszczane lub

PL 211 753 B1 zawieszane w odpowiednich płynach takich jak tłuste oleje, roztwór parafiny czy ciekłe glikole polietylenowe. Ponadto mogą być dodane związki stabilizujące.

Dawki doustne globuliny czy białka osocza powodują modulowanie pierwotnej i wtórnej odpowiedzi immunologicznej w odpowiedzi na szczepienia rotawirusem i PRRS pomagając w modulowaniu IgG i układu immunologicznego.

Opisano sposoby zapobiegania i leczenia chorób przewodu pokarmowego i infekcji, zespołu złego wchłaniania pokarmowego, zapalenia jelit i polepszania stanu autoimmunologicznego i redukowania ogólnoustrojowych reakcji zapalnych u ludzi i zwierząt. Kompozycje leku, żywność i preparaty dietetyczne powinny prawidłowo wzmocnić układ immunologiczny u ludzi i zwierząt w chorobach związanych ze wzrostem IgG, chorobach związanych z zaburzeniem regulacji immunologicznej, dla podtrzymania i leczenia procesów wchłaniania pokarmowego u ludzi i zwierząt, do leczenia klinicznych objawów związanych z niedożywieniem i dla zapobiegania i leczenia chorób układu oddechowego u ludzi i zwierząt. Do chorób złego wchłaniania pokarmowego należy zaliczyć zespół jelita cienkiego, nieleczącą się biegunkę pochodzenia autoimmunologicznego, białaczkę, stan po wycięciu żołądka, biegunkę tłuszczową steatorrhea, nowotwór trzustki, rozległe resekcje trzustki, niewydolność krezki naczyniowej, amyloidoza, scleroderma, eosinophilic enteritis.

Do stanów związanych z niedożywieniem powinno się włączyć wrzodziejące zapalenie okrężnicy, chorobę Crohna, wyniszczenie nowotworowe związane z chronicznym zapaleniem jelit po leczeniu chemio czy radioterapią, infekcyjne patologie związane ze złym wchłanianiem pokarmu takie jak AIDS, zwłóknienie przewodu pęcherzykowego, wewnątrz skórna przetoka o małym obciążeniu, dziecięca niewydolność nerek.

Zastosowania kliniczne kompozycji powinny dotyczyć typowych stanów chorobowych związanych z zaburzeniami immunologicznymi, szczególnie stanów chorobowych związanych z przewlekłą stymulacją immunologiczną. Przykłady takich chorób obejmują choroby osłabienia mięśnia, stwardnienia rozsianego, tocznia rumieniowatego, zapalenia wielomięśniowego, zespołu Sjogrena, reumatoidalnego zapalenia stawów, insulino-zależnej cukrzycy, pęcherzycy pęcherzowej, tarczyco-zależnej choroby oczu, mocznicy, zespołu Kawasaki, zespołu chronicznego zmęczenia, astmy, choroby Crohna, choroby przeszczep-przeciw-gospodarzowi, ludzkiego wirusa niedoboru odpornościowego, małopłytkowości, neutropenii i hemofilii.

Doustne podanie IgG lub innych składników osocza do modulowania obiegowej niespecyficznej odporności ma ogromne korzyści w porównaniu ze stosowaniem pozajelitowym. Wiadome jest ryzyko związane z podaniem dożylnym takie jak: reakcje alergiczne, wzrost ryzyka przeniesienia choroby poprzez krew człowieka takiej jak HIV, zapalenie wątroby, wymóg źródła z tego samego gatunku, koszty zastosowania, natomiast korzyściami doustnego podania IgG jest większa neutralizacja endotoksyn oraz podstawowa stymulacja układu immunologicznego, możliwość użycia obcogatunkowego IgG. Przedstawiono nieinwazyjny sposób modulowania odpowiedzi immunologicznej. Może być on przeznaczony do leczenia chorób autoimmunologicznych (tj. odczyn Rh, toczeń, reumatoidalne zapalenie stawów, etc.) i w innych stanach gdzie immunomodulacja, immunosupresja czy immunoregulacja jest konieczna do wyleczenia (transplantacje organów, zaburzenia przewlekle immunostymulowane).

Wynalazek można zastosować w doustnej immunoterapii (użycie przeciwciał), alternatywnie do IVIG. Przedtem nie można było produkować dużej ilości przeciwciał wymaganych do długotrwałego leczenia, ponieważ IVIG, wymagały zastosowania ludzkiej IVIG. Przy doustnym zastosowaniu przeciwciała, można używać różne źródła gatunkowe bez obawy reakcji alergicznych. To umożliwia użycie mleka, siary, surowicy, osocza, jaj, etc. ze świń, owcy, kozy, bydła, etc. jako środków do produkcji relatywnie dużych ilości immunoglobulin, które będą przeznaczone do leczenia.

Doustne zastosowanie przeciwciał może:

1/ Modulować odpowiedź immunologiczną na ekspozycję do analogicznego/podobnego antygenu. Dane uzyskane z immunizacji świń rotawirusem czy PRRS wykazały, że doustne zastosowanie immunoglobuliny świńskiej modyfikuje odpowiedź immunologiczną na antygen podany domięśniowo. Następuje to poprzez działanie IgG na komórki immunologiczne zlokalizowane na drodze GI (głównie nabłonek jelit i tkanka limfatyczna). Zastosowane osocze zwierząt powinno zwykle zawierać przeciwciała zarówno do PRRS i rotawirusa. Poprzednie badania wykazały, że siara (matczyne przeciwciała) ma takie samo działanie gdy zostanie podana przed zamknięciem jelita. Zgłaszający wykazał, że przeciwciało może modulować odpowiedź immunologiczną zwierząt po zamknięciu jelita.

PL 211 753 B1

2/ Stężenia surowiczego IgG i TNF-Δ są niższe przy doustnym podaniu białek osocza. Ten efekt jest korzystny w zapobieganiu czy leczeniu wielu różnych chorób (tj. choroba Crohna, IBD, IBS, posocznica, etc.) poprzez immunosupresyjne działanie specyficznych przeciwciał. Ten efekt nie zależy od specyficzności przeciwciał. Nie powołując się na inne teorie postulujemy, że białka osocza mogą neutralizować znaczne ilości endotoksyn w świetle jelita. U niedawno odstawionej od karmienia świni, funkcja bariery jelitowej jest upośledzona i będzie nieszczelna dla endotoksyn. Endotoksyna (LPS) jest jednym z najsilniejszych znanych związków immunostymulujących. Tak więc po odstawieniu zwierzęcia od matki, ten wynalazek może pomocniczo wzmagać u zwierząt odpowiedź na endotoksynę poprzez modulowanie układu immunologicznego zapobiegając nadstymulacji.

Droga podania jest ważna dla osiągnięcia różnych efektów. Pozajelitowe podanie wzmaga przepuszczalność jelit i jak wiadomo istotnie zwiększa prawdopodobieństwo zakażenia i endotoksemii w porównaniu z podaniem dojelitowym. Doustne zastosowanie immunoglobulin polepsza funkcjonowanie bariery jelitowej i redukuje absorpcję endotoksyn. Zmniejszona absorpcja endotoksyn będzie redukowała ilość endotoksyn związanych z osoczem, co zwiększa możliwości neutralizujące osocza w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi.

Ujawniono immunomodulację zgodną z obserwacjami o działaniu IVIG przestawianymi w literaturze. Ponadto, zaobserwowano immunomodulujące działanie IgG, po doustnym podaniu IgG z różnych źródeł gatunkowych. Jest to bardzo ważne w medycynie człowieka, szczególnie w warunkach autoimmunizacji (czy w przypadkach gdzie jest wymagana immunomodulacja).

Literatura

Hardic, W.R. 1984. Oral immune globulin. Patent #4,477,432. Filed April 5, 1982.

Bier, M. Aug 1, 2000. Oral immunotherapy of bacterial overgrowth. U.S. Patent #6,096,310.

Bridger, J.C. and J.F. Brown. 1981. Development of immunity to porcine rotawirus in piglets protected from disease by bovine colostrum. Infection and Immunity 31:906.

Cunningham-Rundles, S. 1994. Malnutrition and gut immune function. Current Opinion in gastroenterology. 10:644-670.

Dwyer, J.M. 1992. Drug Therapy. Manipulating the Immune system with Immune Globulin. N.E.J.M. 326:107-116.

Eibl, M.M., H.M. Wolf, H. Furnkranz, and A Rosenkranz. 1988. Prevention of necroti/ing enterocolitis in low-birth-weight infants by IgA-IgG feeding. N.E.J.M. 319:1-7.

Hammarstrom, L., A. Gardulf, V. Hammarstrom, A. Janson, K. Lindberg, and C.I. Edvard Smith. 1994. Systemic and topical inmunoglobulin treatment in immunocompromised patients. Immunological Reviews 139:43-70.

Heneghan, J.B. 1984. Physiology of the alimentary tract. In: Coats, M.E., B.E. Gustafsson eds. The germ-free animal in biomedical research. London: Laboratory Animals Ltd. Pp. 169-191.

Henry, C. and N. Herne. 1968. J. Exp. Med. 128:133-152.

Karlsson, M.C.I., S. Wernersson, T. Diaz de stahl, S. Gustavsson i B. Heyman. 1999. Efficient IgG-mediated suppression of primary antibody responses in FdSreceptor-deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 96:2244-2249.

Klobasa, F., J.E. Butler, and F. Habe, 1990. Maternalneonatal immunoregulation: suppression of de novo synthesis of IgG and IgA, but not IgM, in neonatal pigs by bovine colostrum, is lost upon storage. Am. J. Vet. Res 51:1407-1412.

McCracken, B.A., M.E. Spurlock, M.A. Roos, F.A. Zuckermann, and H. Rex Gaskins. Weaning anorexia contribute to local inflammation in the piglet small intestine. J. Nutr. 129:613.

Mietens, C. and H. Keinhorst. 1979. Treatment of infantile E.coli 5 gastroenteritis with specific bovine anti-E.coli milk immunoglobulins. Eur. J. Pediatr. 132:239-252.

O'Gormon, P., D.C. McMillan, and C.S. McArdle. 1998. Impact of weight loss, appetite, and the inflammatory response on quality of life in gastrointestinal cancer patients. Nutrition and Cancer 32(2):76-80.

Rowlands, B.J. and K.R. Gardiner. 1998. Nutritional modulation of gut inflammation. Proceedings of the Nutrition Society 57:395-401.

Sharma, R., U. Schumacher, V. Ronaasen, and M. Coates. 1995. Rat intestinal mucosal responses to a microbial flora and different diets. Gut 36:209-214.

Van der Poll, T., M. Levi, CC. Braxton, S.M. Coyle, M. Roth, J.W. Ten Gate, and S.F. Lowry. 1998. Parenteral nutrition facilitates activation of coagulation but not fibrinolysis during human endotoxemia. J. Infect. Dis. 177:793-795.

PL 211 753 B1

Wolf, H.M. and M.M. Eibl. 1994. The anti-inflammatory effect of an oral immunoglobulin (IgA-IgG) preparation and its possible relevance for the prevention of necrotizing enterocolitis. Acta Pediatr. Suppl. 396:37-40.

Skarnes, R.C 1985, In vivo distribution and detoxification of endotoxins. In: Proctor, R.A. (ed): Handbook of Endotoxin, Vol. 3, Pp. 56-81.

Zhang, G.H., L. Baek, T. Bertelsen and C Kock. 1995. Quantification of the endotoxin-neutralizing capacity of serum and plasma. APMIS 103:721-730.

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Korzystny sposób otrzymywania koncentratu globuliny

Przedstawiono korzystny sposób otrzymywania koncentratu globuliny według wynalazku.

Osocze

JJ

Uwapnienie osocza 0

Wirowanie w celu usunięcia włóknika j;

Filtrowanie

U

Precypitacja soli U

Wirowanie

U V

Frakcja bogata w globulinę odrzucić

P r z y k ł a d 2

Konieczność nienaruszenia cząsteczki globuliny

Poprzednie badania wykazały, że doustne spożycie osocza polepsza zachowania świń odstawionych od matki (Coffey i Cromwell, 1995). Dane wykazały, że na zachowania świń wpłynęła duża masa cząsteczkowa frakcji obecnej w osoczu (Cain, 1995; Owen et al.1995, 1996; Weaver et al., 1995). Na dużą masę cząsteczkową frakcji składa się głównie białko IgG. Białko immunoglobuliny G ma około 150,000 MW i składa się z dwóch łańcuchów polipeptydowych o ciężarze 50,000 MW, które są oznaczone jako łańcuchy ciężkie i dwóch łańcuchów o 25,000 MW, oznaczonych jako lekkie (Kuby,1997). Badania hydrolizy nienaruszonej cząsteczki IgG były przeprowadzane w laboratorium - z enzymem, pepsyną. Krótkie trawienie enzymem, pepsyną, doprowadzało do powstania fragmentu o ciężarze 100,000 MW złożonego z dwóch Fab-podobnych fragmentów (Fab=wiązanie antygenu). Fragment Fc nienaruszonej cząsteczki nie był odzyskiwany, gdyż był trawiony na wiele fragmentów (Kuby,1997). Drugi typ procesu prowadzący do powstania koncentratu bogato-globulinowego to redukcja wiązań dwusiarczkowych. W rezultacie redukcji z cząsteczki globuliny powstają wolne nienaruszone ciężkie i lekkie łańcuchy.

W pierwszym przykładzie wynalazku przedstawiono ilościowe określenie wpływu doustnego spożycia różnych frakcji osocza i globulin osocza poddanego trawieniu pepsyną, na średni dzienny przyrost, średnie dziennie przyjmowane pożywienie, morfologię jelita, parametry krwi i aktywność enzymów jelitowych u świń odstawionych od matki.

Materiał i Metody

Zwierzęta i diety. 64 indywidualnie opisane świnie średnio 6,85 kg wagi ciała i 21 dni życia podzielono na cztery diety lecznicze w systemie losowo dobranych całkowitych bloków. Zajęto dwa pokoje,

PL 211 753 B1 każdy o 32 zagrodach. Pokoje dzienne, które zajmowały zwierzęta pochodzące z tego samego stada nie były uprzednio czyszczone, co miało za zadanie poddać zwierzęta testowi stymulacji pod wpływem środowiska. Świnie miały nieograniczony dostęp do wody i pożywienia.

Zastosowane diety przedstawiono w Tabeli 1 zawierającej:

1/ kontrolę

2/ 6% suszone rozpryskowo osocze

3/ 3,6% suszoną rozpryskowo globulinę

4/ 3,6% suszoną rozpryskowo globulinę trawioną pepsyną.

Diety składały się z mączki kukurydziano - sojowej na bazie serwatki, co zastępowało posiłek rybny z ryby śledziowatej na osocze o jednakowej podstawie białkowej. Frakcje osocza zawierały odpowiednie dla osocza jednakowe białka podstawowe. Diety zawierały 1,60% lizyny, która tworzy doskonały profil aminokwasowy (Chung and Baker, 1992). Diety były granulowane w 130°F lub mniej i były spożywane od 0-14 dnia po odstawieniu od matki.

Zbieranie danych. Wagi poszczególnych świń zapisywano w dniach 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 i 14 po odstawieniu od matki. Ocenę podawanego pożywienia i biegunkę zapisywano codziennie od dnia 0 do 14 po odstawieniu od karmienia. Krew pobierano w dniu 0, 7 i 14 po odstawieniu. W celu dalszej analizy krew wirowano i surowicę zamrażano. W celu uzupełnienia badań (14. dzień) 6 dobranych losowo świń/traktowanych dietą zabijano w celu otrzymania próbek do pomiaru wysokości kosmków, głębokości krypt, aktywności enzymów jelitowych i wagi organów (jelita, wątroby, płuc, serca, śledziony, grasicy, nerek, żołądka i trzustki). Bezpośrednio po bezbolesnej śmierci otwarto jamę ciała i lokalizowano połączenie krętnicze ileal-cecal. Jelito cienkie usunięto i wolno odcięto od przylegającej krezki. W odległości 1 m od czaszki do połączenia krętniczego, usunięto 10 cm jelita i utrwalono w formalinie buforowanej fosforanem do badań histologicznych. Z przekroju po linii środkowej dwunastnicy zdrapano błonę śluzową, zważono i zamrożono do analizy enzymatycznej.

Histologia. Próbki jelita czczego zatopiono w parafinie i barwiono hematoksyliną i eozyną (H&E) i analizowano przy użyciu mikroskopu świetlnego do pomiaru głębokości krypt i wysokości kosmków. Zmierzono pięć obszarów do oceny głębokości krypt i wysokości kosmków u każdej świni.

Analiza enzymatyczna. Aktywność laktazy i maltazy mierzono na zeskrobanej błonie śluzowej zgodnie z Dahlqvist, 1964.

Analizy surowicy. Całkowitą ilość białka i albuminę analizowano przy użyciu Zestawów Diagnostycznych ROCHE w systemie COBAS MIRA. Surowicze IgG analizowano według Etzel i wsp. (1997).

Analiza statystyczna. Wyniki analizowano w systemie losowo dobranych całkowitych bloków. Świnie traktowano jednostkowo a zagroda stanowiła jednostkę doświadczalną. Analizę wariancji przeprowadzano przy użyciu GLM procedury SAS (SAS/STAT Version 6.11 SAS Institute, Gary, NC). Model sumy kwadratów składał się na blok i leczenie, przy użyciu wagi początkowej jako kowariancji. Wyniki przedstawiono metodą średnich najmniejszych kwadratów.

Wyniki

Średni dzienny przyrost (ADG) i średnie dziennie przyjmowane pożywienie (ADFI) przedstawiono w Tabeli 2. Nie stwierdzono różnic dla ADG i ADFI od dnia 0-6. Od dnia 0-14, osocze i globulina zwiększały się (P<0,05) ADG i ADFI w porównaniu do kontroli, podczas gdy wyniki leczenia globuliną trawioną pepsyną były pośrednie. Wagę organów zapisywano i wyrażano w g/kg wagi ciała (Tabela 3). Nie odnotowano różnic w sercu, nerkach, wątrobie, płucach, jelicie cienkim, żołądku, grasicy czy śledzionie. Jednakże waga trzustki była zwiększona (P<0,05) w przypadku globuliny i globuliny trawionej pepsyną w porównaniu do kontroli. Leczenie osoczem dało wyniki pośrednie. Parametry krwi przedstawiono w Tabeli 4. W porównaniu z kontrolą, surowicze IgG, świń karmionych globuliną (dzień 14) było niższe (P<0,08) podczas gdy u karmionych osoczem i globuliną trawioną pepsyną było pośrednie. Nie odnotowano różnic (P>0,1) w całkowitej ilości białka. Albumina surowicy wzrosła (P<0,08) na 14 dzień przy leczeniu globuliną i osoczem, w porównaniu do kontroli, podczas gdy w grupie traktowanych globuliną trawioną pepsyną wartość ta była pośrednia. Aktywność enzymatyczną, morfologię jelita i ocenę kału przedstawiono w Tabeli 5. Nie odnotowano różnic (P>0,1) w wysokości kosmków i głębokości krypt. Aktywność laktazy i maltazy wzrosła (P<0,07) w wyniku spożycia globuliny trawionej pepsyną w porównaniu do diety kontrolnej, podczas gdy w innych podawanych dietach odnotowano wyniki pośrednie. Ocena kału była obniżona (P<0,07) przedstawiając twardy stolec, w wyniku dodania globulin trawionych pepsyną w porównaniu do kontroli, podczas gdy przy podaniu globuliny ocena kału i osocza była pośrednia.

PL 211 753 B1

T a b e l a 1

Kompozycja diet doświadczalnych (jak podawano,%)^a

Składniki	Kontrola	Osocze	Globulina	Globulina trawiona pepsyną
Kukurydza	42,932	43,012	42,962	42,957
47% SEM	23,000	23,000	23,000	23,000
Wysuszona serwatka	17,000	17,000	17,000	17,000
Ryba śledziowata	8,500		3,400	3,400
Mączka rybna
Osocze		6,000
Globulina			3,600
Globulina trawiona pepsyną				3,600
Olej sojowy	4,300	5,100	4,800	4,800
Laktoza	2,118	2,118	2,118	2,118
18,5% dwuwapń	0,400	1,700	1,150	1,150
Kamień wapienny	0,070	0,435	0,290	0,290
Tlenek cynku	0,400	0,400	0,400	0,400
Mecadox	0,250	0,250	0,250	0,250
Sól	0,250	0,250	0,250	0,250
Przedmieszka	0,400	0,400	0,400	0,400
L-Lizyna-HCL	0,250	0,195	0,290	0,290
L-Treonina	0,090
DL-Metionina	0,040	0,140	0,090	0,095

^a Przygotowane diety zawierały 1,60% lizyny, 0,48% metioniny, 14% laktozy, 0,8% wapnia i 0,7% fosforu i były podawane od dnia 0-14 po odstawieniu od matki.

T a b e l a 2

Wpływ suszonego rozpryskowo osocza i frakcji osocza na średnie dzienne spożycie(kg/d)¹

Traktowanie	Kontrola	Osocze	Globulina	Globulina trawiona pepsyną	SEM
ADG, kg/d
D 0-6	0,037	0,094	0,080	0,073	0,029
D 0-14	0,169a	0,242b	0,234b	0,222ab	0,025
ADFI, kg/d
D 0-6	0,104	0,134	0,132	0,128	0,018
D 0-14	0,213a	0,276b	0,278b	0,254ab	0,0021

¹ Wartości są średnimi metody najmniejszych kwadratów z 16 świń/traktowanie. ^ab Średnie z rzędu bez wspólnych liter u góry są różne (P<0,10).

PL 211 753 B1

T a b e l a 3

Wpływ suszonego rozpryskowo osocza i frakcji osocza na wagę narządów (g/kg wagi ciała)¹

Wagi narządów, g/kg BW	Kontrola	Osocze	Globulina	Globulina trawiona pepsyną	SEM
Jelito	44,21	50,65	50,34	44,71	3,43
Wątroba	32,34	31,20	30,23	32,27	1,42
Śledziona	1,74	1,83	1,81	2,06	0,16
Grasica	1,45	1,39	1,32	1,36	0,20
Serce	4,93	4,89	4,94	4,73	0,22
Płuca	11,26	11,28	12,14	11,95	1,03
Żołądek	6,96	7,06	6,61	6,84	0,32
Nerki	4,76	5,75	5,66	5,45	0,47
Trzustka	1,93a	2,20ab	2,42b	2,34b	0,11

¹ Wartości są średnimi metody najmniejszych kwadratów z 6 ś wiń/traktowanie. ^ab Średnie z rzędu bez wspólnych liter u góry są różne (P<0,05).

T a b e l a 4

Wpływ suszonego rozpryskowo osocza i frakcji osocza na parametry krwi^1,2

	Kontrola	Osocze	Globulina	Globulina trawiona pepsyną	SEM
IgG, mg/mL
D0	4,84a	5,70b	4,83a	5,05ab	0,34
D7	4,98	4,71	4,66	4,96	0,17
D14	4,88b	4,43ab	4,30a	4,54ab	0,24
Całkowita ilość białka, g/dL
D0	4,55	4,59	4,54	4,65	0,07
D7	4,39	4,37	4,35	4,47	0,08
D14	4,22	4,30	4,29	4,20	0,07
Albumina, g/dL
D0	3,03	3,02	3,11	3,09	0,06
D7	2,98	3,03	3,02	3,01	0,06
D14	2,61a	2,78b	2,80b	2,71ab	0,07

¹ Wartości są średnimi metody najmniejszych kwadratów z 16 (świń/traktowanie. ² Dzień 0 jest używany jako kowariancja do analizy na D7 i D14. ^ab Średnie z rzędu bez wspólnych liter u góry są różne (P<0,08).

PL 211 753 B1

T a b e l a 5

Wpływ suszonego rozpryskowo osocza i frakcji osocza na aktywność enzymów, morfologię jelita i ocenę kału¹

	Kontrola	Osocze	Globulina	Globulina trawiona pepsyną	SEM
Maltaza, μΐΓΌΐ/mg prot/godz.	7,97a	11,08ab	10,93ab	13,30b	1,93
Laktaza, μΐΓΌΐ/mg prot/godz.	1,14a	1,57ab	1,55ab	2,15b	0,31
Wysokość kosmków, mikron	378,7	370,7	374,0	387,7	34,4
Głębokość krypt, mikron	206,3	191,0	195,0	192,7	9,3
Ocena kału	5,12b	5,06b	4,19ab	2,88a	0,65

¹ Wartości są średnimi metody najmniejszych kwadratów z 6 ś wiń/traktowanie. ^ab Średnie z rzędu bez wspólnych liter u góry są różne (P<0,07).

P r z y k ł a d 3

Ilość i wpływ diety zawierającej różne frakcje osocza

Celem drugiego badania był wpływ ilości diety zawierającej różne frakcje osocza oraz efekt rozdzielonych ciężkich i lekkich łańcuchów IgG na średni dzienny przyrost wagi, średnie przyjmowane dziennie pożywienie, wagę organów i parametry krwi u odstawionych od karmienia od matki świń.

Materiały i Metody

Zwierzęta i diety. 96 indywidualnie opisanych świń średnio 5,89 kg wagi ciała i w 21 dniu życia podzielono na cztery podawane diety w systemie losowo dobranych kompletnych bloków. Zwierzęta rozmieszczano w określonym czasie pomiędzy 3 nieodkażone pokoje dzienne.

Świnie miały nieograniczony dostęp do wody i pożywienia.

Zastosowane diety zawierały (Tabela 6):

1/ kontrolę

2/ 10% suszone rozpryskowo osocze

3/ 6% suszona rozpryskowo globulina, i

4/ 6% materiał wzbogacony w globulinę traktowany w celu redukcji mostków dwusiarczkowych cząsteczki IgG (H+L).

Diety były kukurydziano - sojowym suchym posiłkiem na bazie serwatki, który zastępował posiłek sojowy osoczem, przy zachowaniu jednakowej ilości lizyny. Frakcje osocza dodano odpowiednio do osocza na podstawie równej ilości frakcji osocza. Diety zawierały 1,6% lizyny i tworzyły doskonały profil aminokwasowy (Chung and Baker, 1992). Diety były formą posiłku spożywanego od dnia 0-14 po odstawieniu.

Zbieranie danych. Wagi poszczególnych świń zapisywano w dniach 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 i 14 po odstawieniu od karmienia. Ocena podawanego pożywienia i biegunkę notowano codziennie od dnia 0 do 14 po odstawieniu od karmienia. Krew zbierano w dniu 0, 7 i 14 po odstawieniu od karmienia. Do dalszej analizy krew wirowano i surowicę zamrażano. W celu uzupełnienia badań (4 dzień) 10 badanych świń zabijano aby otrzymać wagę organów (jelita, serca wątroby, płuc, śledziony, grasicy, nerek, żołądka i trzustki).

Analizy surowicy. Całkowita ilość białka, albuminy i azotanu mocznika były analizowano przy użyciu Zestawów Diagnostycznych ROCHE w systemie COBAS MIRA. Surowicze IgG było analizowano według Etzel i wsp. (1997).

Analiza statystyczna. Wyniki były analizowane w systemie losowo dobranych kompletnych bloków, przy użyciu GLM procedury SAS (SAS/STAT Version 6,11 SAS Institute, Cary, NC). Świnie umieszczono pojedynczo, a zagroda stanowiła jednostkę doświadczalną. Model sumy kwadratów składał się z bloku i traktowania, przy użyciu początkowej wagi jako kowariancji. Wyniki przedstawiono metodą średnich najmniejszych kwadratów.

PL 211 753 B1

Wyniki

Od dnia 0-6 (Tabela 7), wzrastały wartości ADFI osocza (P<0,10) w porównaniu do kontroli i H+L, podczas gdy globulina dawała wyniki pośrednie. Od dnia 7-14, wzrastały wartości ADFI osocza (P<0,10) w porównaniu do kontroli i podawaniem diety H+L. Średnie dziennie przyjmowane pożywienie globulin pokarmu świń wzrastało (P<0,10) w porównaniu do kontroli i podawaniem diety H+L. Średni dzienny przyrost przedstawiono w Tabeli 8. Średni dzienny przyrost był podobny do ADFI od dnia 0-6. Od dnia 7-14 i 0-14, ADG osocza i globuliny wzrastało (P<0,10) w porównaniu do kontroli, podczas gdy po podaniu H+L było pośrednie. Parametry krwi przedstawiono w tabeli 9. Surowicze IgG i azotan mocznika (dzień 14) były niższe (P<0,05) gdy do diety włączono osocze i globulinę w porównaniu do kontroli. Efekt H+L był pośredni. Zastosowane diety nie miały wpływu na białko surowicy. Albumina surowicy zmniejszała się (dzień 7) (P<0,05) z powodu włączenia osocza w porównaniu do innych zastosowanych diet. Nie stwierdzono różnic w ocenie kału. Długość jelita i wagi narządów przedstawiono w Tabeli 10. Nie stwierdzono różnic w wadze narządów czy długości jelita spowodowanych zastosowaną dietą.

T a b e l a 6

Kompozycja diet doświadczalnych (jak podawano %)¹

Składniki	Kontrola	Osocze	Globulina	H+L
Kukurydza	37,937	44,96	40,006	40,034
47% mączka z ziaren soi	18	18	18	18
Serwatka wysuszona	14	14	14	14
Laktoza	6,253	6,253	6,253	6,253
Osocze		10
Globulina			6
H+L				6
Biało soi	17,31		9,07	9,07
Koncentrat
Oleju soi	3,219	3,047	3,187	3,186
18,5% dwuwapń	1,79	1,493	2,133	2,146
Wapń	0,562	0,354	0,46	0,42
Przedmieszka	0,55	0,55	0,55	0,55
Sól	0,15	0,15	0,15	0,15
DL-Metionina	0,083	0,152	0,092	0,096
L-Lizyna-HCL	0,146	0,041	0,099	0,095

¹ Przygotowane diety zawierały 1,60% lizyny, 0,48% metioniny, 16% laktozy, 0,9% wapnia i 0,8% fosforu i były podawane od dnia 0-14 po odstawieniu od karmienia.

T a b e l a 7

Efekt rozpryskowo suszonego osocza i frakcji osocza na średnie dzienne spożycie(g/d)¹

	Kontrola	Osocze	Globulina	H+L	SEM
ADFI, g/d
D 0-6	102,82a	152,43b	128,53ab	114,50a	13,44
D 7-14	280,74a	413,57c	379,21bc	319,06ab	29,07
D 0-14	193,94a	284,83b	258,55b	216,83ab	16,69

¹ Wartości są średnimi metody najmniejszych kwadratów z 24 świń/traktowanie. ^ab Średnie z rzędu bez wspólnych liter u góry są różne (P<0,10).

PL 211 753 B1

T a b e l a 8

Efekt suszonego-rozpryskowo osocza i frakcji osocza na średni dzienny przyrost(g/d)¹

	Kontrola	Osocze	Globulina	H+L	SEM
ADG, g/d
D 0-6	-41,05a	27,23b	-1,23ab	-21,86a	20,26
D 7-14	199,38a	282,46b	302,22b	255,12ab	26,40
D 0-14	96,34a	173,07b	172,17b	136,42ab	20,56

¹ Wartoś ci są średnimi metody najmniejszych kwadratów z 24 świń/traktowanie. ^ab Średnie z rzędu bez wspólnych liter u góry są różne (P<0,10).

T a b e l a 9

Efekty suszonych rozpryskowo frakcji osocza na parametry krwi^1,2

	Kontrola	Osocze	Globulina	H+L	SEM
IgG, g/dL
D 0	0,674	0,664	0,584	0,661	0,037
D 7	0,668	0,643	0,624	0,673	0,021
D 14	0,631b	0,555a	0,545a	0,596ab	0,022
Mocznik N, mg/dL
D 0	8,53	9,78	9,94	9,87	0,68
D 7	17,55b	14,65a	16,48ab	17,56b	1,01
D 14	17,57c	10,48a	14,73b	15,56bc	0,87
Całkowita ilość białka, g/dL
D 0	4,58	4,46	4,56	4,56	0,076
D 7	4,69	4,60	4,53	4,74	0,106
D 14	4,55	4,49	4,59	4,49	0,080
Albumina, g/dL
D 0	2,69	2,64	2,75	2,69	0,069
D 7	2,92b	2,79a	2,92b	2,94b	0,045
D 14	2,83	2,76	2,86	2,80	0,060

¹ Wartości są średnimi metody najmniejszych kwadratów z 24 świń/traktowanie.

² Dzień 0 stosowano jako kowariancję do analizy na D7 i D14. ^ab Średnie z rzędu bez wspólnych liter u góry są różne (P<0,05).

T a b e l a 10.

Efekt suszonego-rozpryskowo osocza i frakcji osocza na długość jelita (cale) i wagi narzą dów (g/kg wagi ciał a)¹

	Kontrola	Osocze	Globulina	H+L	SEM
1	2	3	4	5	6
Jelito, długość,cal Waga organu. g/kg BW	358,67	368,33	359,33	358,56	13,05
Jelito	41,48	41,79	42,82	41,04	2,16

PL 211 753 B1 cd. tabeli 10

1	2	3	4	5	6
Wątroba	29,61	32,61	32,29	31,09	1,10
Śledziona	2,05	2,32	2,44	2,17	0,22
Grasica	1,15	1,45	1,15	1,15	0,14
Serce	6,12	6,14	5,77	5,80	0,22
Płuco	12,24	12,33	13,65	11,63	0,74
Żołądek	9,26	9,14	10,08	10,08	0,58
Nerki	6,18	6,57	6,10	6,30	0,21
T rzustka	2,70	2,61	2,54	2,70	0,11

¹ Wartości są średnimi metody najmniejszych kwadratów z 9 świń/traktowanie.

Dyskusja

Zgodnie z opublikowanymi badaniami (Coffey i Cromwell, 1995) dane te wskazują, że po włączeniu do diety osocza i globuliny, wzrastała wydajność (ADG, ADFI) w porównaniu do kontroli. Wyniki globuliny trawionej pepsyną i frakcja H+L pośrednio polepszają wydajność. Aktywność enzymów (laktazy i maltazy) wzrosła i ocena kału była lepsza gdy dodano wszystkie frakcje osocza (osocze, globulina, globulina trawiona pepsyną czy H&L) w porównaniu do kontroli.

Stężenia surowiczego IgG i BUN były niższe po spożyciu osocza czy globuliny w porównaniu do kontroli, globuliny trawionej pepsyną czy H&L. Nieoczekiwanym była zdolność doustnie podanego osocza czy globuliny do wywołania ogólnoustrojowej odpowiedzi, jak wykazano przy niskim stężeniu surowiczego IgG w porównaniu do kontroli.

Różnice wykazane pomiędzy osoczem i frakcjami globulin w porównaniu z globuliną trawioną pepsyną czy H+L są spowodowane tym, że czwartorzędowa struktura regionu Fc jest nienaruszona tylko w osoczu i frakcjach globulin. Globulina trawiona pepsyną ma strawiony region Fc, podczas gdy w frakcji H+L region Fc pozostaje nienaruszony ale bez czwartorzędowej struktury. Fab region pozostaje nienaruszony w globulinie trawionej pepsyną. Region zmienny jest ciągle zdolny do wiązania antygenu w preparacie H+L (APC, nieopublikowane dane). Tak więc wyniki wskazują, że interakcja przeciwciało-antygen jest ważna do wywołania miejscowego efektu (zmniejszona ocena kału, wzrost aktywności laktazy i maltazy) podczas gdy nietknięty region Fab i Fc osocza i frakcji globulin jest ważny do modulowania ogólnoustrojowej odpowiedzi surowiczego IgG.

P r z y k ł a d 4

Wpływ doustnych dawek białka osocza na aktywność odpowiedzi immunologicznej po pierwszym i drugim szczepieniu Rotawirusem i PRRS u młodych prosiąt.

Ogólny cel badania

Badanie wpływu dodatku białka osocza na aktywność odpowiedzi immunologicznej w następstwie pierwszego i drugiego szczepienia rotawirusem i PRRS.

Metody

U 10 macior poród wywoływano w tym samym czasie. Zastosowane diety przydzielono losowo dla każdego miotu. Traktowanie stosowano dwa razy tygodniowo (3 lub 4 dni przerwy) rurką aplikacyjną do żołądka. Zastosowano serie 7 aplikacji poprzedzających końcowe szczepienie i odstawienie od karmienia od matki. Podania składały się: z kontroli (10 ml soli) i osoczowego IgG (0,5g podane w końcowej objętości 8 ml). Wszystkie świnie otrzymywały pierwsze szczepienie (doustne=rotawirus, zastrzyk=PRRS) 10 dni przed odstawieniem od karmienia. Drugie szczepienie podawano w czasie odstawienia od karmienia poprzez zastrzyk domięśniowy. Próbki krwi zbierano przed pierwszorazowym szczepieniem (10 dni przed odstawieniem od karmienia). Drugie szczepienie podano w czasie odstawienia od karmienia poprzez zastrzyk domięśniowy. Próbki krwi zbierano przed pierwszym szczepieniem (10 dni przed odstawieniem od karmienia), przed drugim szczepieniem (w czasie odstawienia od karmienia) i z przerwami co 3 dni aż do 12 dni po odstawieniu od karmienia.

Wyniki

U świń otrzymujących doświadczalne dawki białka osocza (P<0,05) miana swoistych przeciwciał spadały w następstwie pobudzenia szczepieniem. Taka odpowiedź miana przeciwciał była widoczna zarówno przy szczepieniu rotawirusem (Fig. 1) jak i przy szczepieniu PRRS (Fig. 2).

PL 211 753 B1

Dyskusja

Dane te dostarczają doskonałych wskazówek działania doustnie podanych białek osocza u młodych świń. Immunologiczna aktywacja ma działanie silnej energii i stanowi ujście preparatu odżywczego. W czasie aktywacji systemu immunologicznego energia i składniki odżywcze są ukierunkowywane do produkcji składników immunologicznych (immunoglobuliny, cytokin, białek ostrej fazy, itd.) a nie na wzrost. Doustnie podane osocze może modulować układ immunologiczny, pozwalając energii i składnikom odżywczym być ukierunkowywanym na inne funkcje życiowe takie jak wzrost.

P r z y k ł a d 5

Wpływ doustnego zastosowania osocza na funkcje immunologiczne.

Odpowiedź immunologiczną na zastosowane białko osocza nie badano. Jednakże odkryto, że niektóre poszczególne komponenty z siary czy mleka mają działanie immunomodulacyjne. IgA i sIgA mają funkcje przeciwzapalne u noworodków^1-3. Eibl stwierdził, że doustne zastosowanie ludzkiej immunoglobuliny redukuje produkcję krążącego TNF-Δ w izolowanych makrofagach i redukuje także stężenie immunoglobulin u małych dzieci dotkniętych martwiczym zapaleniem jelita cienkiego i okrężnicy¹. Schriffrin stwierdził, że siara była efektywna w modulowaniu doświadczalnego zapalenia okrężnicy⁴.

W niekontrolowanym badaniu, Schriffrin i jego współpracownicy wykazali, że uzupełnienie diety TGF-E2-bogatą frakcją kazeiny było użyteczne w modulowaniu przypadków zapalenia w chorobie Crohna⁵. Sposób działania nie został wyjaśniony lecz wykazano, że TGF-E2 hamuje interferon-θ który pobudza ekspresję receptorów MHC klasy II u noworodków⁶. Receptory MHC klasy II jak wiadomo wspomagają regulację u zwierząt niedawno odstawionych od karmienia⁷. Inne peptydy znalezione w mleku, siarze i osoczu mogą także mieć działanie przeciwzapalne. Wykazano, że pozajelitowe zastosowanie TGF-E1 polepsza przeżycie myszy zakażonych salmonellą.

TNF-Δ jest główną cytokiną biorącą udział w procesach zapalnych i ma negatywny wpływ na apetyt i wykorzystanie białka^8,9. Jak dobrze wiadomo, produkcja TNF-Δ jest stymulowana poprzez ekspozycję fagocytów na endotoksynę. Białka osocza zawierają immunoglobulinę, białka wiążące endotoksynę, lektyny wiążące mannan i TGF-E. Te wszystkie białka mogą odgrywać rolę w redukowaniu ekspozycji układu immunologicznego na bakterie pochodzące z przewodu pokarmowego i endotoksynę i dlatego zmienia się aktywność układu immunologicznego. Dodatkowo, immunomodulacyjny efekt TGF-E może zmieniać odpowiedź układu immunologicznego na endotoksynę.

Zadaniem tego eksperymentu było zbadanie immunomodulacyjnego wpływu białek osocza zastosowanych u zwierząt poza okresem po odstawieniu od karmienia przez matkę poprzez pomiar:

(a) wybuchu oddechowego w monocytach krwi obwodowej, (b) wybuchu oddechowego w makrofagach otrzewnowych, (c) produkcję TNF-α makrofagów otrzewnowych w obecności i nieobecności lipopolisacharydów.

1.0 Plan badań

1.1 Zwierzęta samic myszy białych Balb/c otrzymano z Laboratorium Charles River. Po odbiorze zwierzęta lokowano po cztery w klatce. Na początku dawkowania waga ciała wynosiła 15-19 g. Trzy klatki przeznaczono do testowania diet, ogółem 12 zwierząt na dietę. Dawkowanie należało rozłożyć na 3 kolejne dni tak aby przystosować proces do wymogów sekcji zwłok.

W 1-szym dniu po przybyciu dawkowanie rozpoczęto na zwierzętach w klatce pierwszej z każdego traktowania/kontrolna grupa, w 2-gim dniu dawkowanie rozpoczęto na wszystkich zwierzętach z drugich klatek i w 3-cim dniu klatki trzecie otrzymywały dawki z wszystkich grup. Sekcję zwłok rozłożono podobnie, tak aby zwierzęta otrzymywały dawki łącznie przez 7 dni. Wszystkie klatki oznakowano numerami zwierząt i przeznaczoną dietą. Temperatura w pokojach zwierząt utrzymywała się pomiędzy 66 a 82°F. Oświetlenie było w cyklach: przez 12 godzin włączone - 12 godzin wyłączone.

1.2 Płukanie otrzewnowe, skrwawianie i opracowywanie próbek krwi.

Komórki zbierano z każdego zwierzęcia na drodze płukania otrzewnowego. Po zakończeniu, mięśnie brzuszne odrzucano z organów brzusznych i do jamy otrzewnowej wstrzykiwano 9 ml sterylnego PBS. Brzuch masowano i odzyskiwano 6-8 ml płynu płuczącego. 4 myszy przebywające razem zebrano tworząc jedną próbkę. Próbki przetrzymywano w lodzie przed opracowywaniem. Komórki wirowano i osad zawieszano w 1 ml płynu Eagla w modyfikacji Dulbeco z surowicą płodów cielęcych i penicyliną/streptomycyną. Liczbę komórek oceniano przy użyciu licznika Coulter Z1.

Po zebraniu komórek z płukania, z otwartej jamy brzusznej pobrano krew z tętnicy nerkowej i przeniesiono do 3 ml probówki zawierającej EDTA. I tym razem myszy zebrano w jedną próbkę.

PL 211 753 B1

Próbki krwi rozcieńczano w PBS do całkowitej objętości 8 ml. Tę mieszaninę nawarstwiano od góry na 3 ml Histopaqu-1077. Próbki wirowano i nieprzezroczystą warstwę interfazy zawierającą komórki jednojądrzaste usuwano przy użyciu pipety Pasteura. Po trzykrotnym płukaniu w PBS osad zawieszano w 0,5 ml PBS. Liczbę komórek liczono przy użyciu licznika Coultera Z1.

1.3 Wybuch oddechowy [respiratory burst]

Po określeniu liczby komórek zarówno monocyty jak i próbki otrzewnowe doprowadzono do stężenia 1x10⁶ komórek/ml. Wszystkie próbki oznaczano w 3 powtórzeniach. 100 μl każdej zawiesiny komórek (1x10⁵ komórek/na studzienkę) dodawanych na płytkę do hodowli tkankowej o 96 studzienkach. Do każdej studzienki dodawano dioctan 2,7-dichlorofluoresceiny (Molecular Probe) i płytki inkubowano w 37°C aby umożliwić wniknięcie substratu do komórek. Po inkubacji, dodano forbol octanu mistyrianowego (PMA) (Sigma) do 3 studzienek w powtórzeniach w stężeniu 10 ng/studzienkę w celu stymulacji produkcji rodników tlenowych. Płytki inkubowano w 37°C. Po 1 godzinie inkubacji, do każdej studzienki na płytce dodano po 200 μl standardu 2,7-dichlorofluoresceiny (Polyscience).

Wzrost fluorescencyjnego produktu mierzono przy użyciu czytnika fluorescencji mikropłytek Cytofluor-4000 (PerSeptive Biosystems)(Długość fali: wzbudzenie -485, emisja - 530). Dane przenoszono z programu Cytofluorymetru na Excel. Z Excela układ płytek kopiowano i przenoszono do pliku Softmax Pro (Molecular Devices), gdzie wyniki odczytywano automatycznie poprzez interpolację na krzywej standardowej.

1.4 Fagocytoza

Po 100 gl każdej zawiesiny komórek dodawano do 5 studzienek na płytce do hodowli tkankowej o 96-studzienkach, w stężeniu 1x10⁶ komórek/ml (1x10⁵ komórek/na studzienkę). Do każdej studzienki dodawano 50 μl płynu hodowlanego (DMEM) uzyskując końcową objętość 100 gl. 5 studzienek zawierało tylko DMEM i stanowiło próby ślepe. Wszystkie próbki i ślepe próbki nastawiano w pięciu (5) powtórzeniach. Komórki inkubowano w 37°C i następnie oceniano pod mikroskopem.

W trakcie inkubacji przygotowano zawiesinę biocząsteczek E.coli K-12 w HBSS (Molecular Probe). Mieszaninę wstrząsano i sonifikowano. Po 1h inkubacji płytki odwirowano i supernatant odciągano pod ciśnieniem. Następnie do każdej studzienki dodawano po 100 gl mieszaniny E.coli/HBSS i inkubowano dwie godziny w 37°C.

Po inkubacji biocząsteczki E.coli odciągano pod ciśnieniem i do każdej studzienki dodawano po 100 gl błękitu trypanu/cytrynianu - zrównoważonego roztworem soli (Molekular Probe). W przybliżeniu po 1 minucie usuwano błękit trypanu poprzez aspirację pod ciśnieniem i produkt fluorescencji mierzono przy użyciu czytnika fluorescencji mikropłytek Cytofluor 4000.(Długość fali: wzbudzenie -485, emisja - 530).

2.0 Materiał

Użyto następujące materiały:

Dieta A - Kontrola (Mleko odtłuszczone)

Dieta B - Surowica świńska (PP)

Dieta C - Białko osocza wołowego (BP)

Dieta D - Lekka faza osocza - traktowanego-Nalco (BL)

Dieta E - Ciężka faza osocza - traktowanego-Nalco (BH)

Do doświadczenia II zastosowano następujące diety:

1. Kontrola (Mleko odtłuszczone)

2. Koncentrat Ig, 2,5%

3. Koncentrat Ig, 0,5%

4. Surowica wołowa, 5%

5. Surowica wołowa, 1%

6. Faza ciężka, 0,5%

7. Aktywowane HP, 0,5%

8. Aktywowane, odpopielone HP,0,1%

2.1 Przechowywanie i używanie materiału badawczego.

Testowane diety przechowywano w 4°C w ich oryginalnych torbach żywnościowych. W czasie kontaktu z materiałem badawczym używano bezpieczne szkło laboratoryjne, rękawiczki i fartuchy laboratoryjne.

2.2 Zastosowanie materiału badawczego

Miski żywieniowe napełniano dwa razy dziennie i zwierzętom pozwalano pożywiać się bez ograniczeń przez 7 dni.

PL 211 753 B1

TNF-TNF-TNF

Wyniki i Dyskusja

Stwierdzono, że osocze pochodzenia wołowego albo świńskiego wpływało na zmniejszenie produkcji TNF-Δ zarówno przez stymulowane jak i niestymulowane makrofagi otrzewnowe. Ponadto, zastosowanie zarówno ciężkiej jak i lekkiej fazy osocza traktowanego 5% dwutlenkiem krzemu powodowało zmniejszenie produkcji TNF-Δ jednakże w różnych stężeniach. Frakcje nie były oceniane w jednakowych stężeniach. Zmiany TNF-Δ które towarzyszyły stymulacji makrofagów były wyższe gdy zwierzęta były karmione frakcją osocza, niezależnie od źródła czy stężenia. Te obserwacje wskazują, że odpowiedź immunologiczna makrofagów była wzmagana po dodaniu osocza i/lub jego składników do diety młodych myszy.

W drugim doświadczeniu, potwierdzono supresorowy efekt frakcji osocza na produkcję TNF-Δ przez niestymulowane makrofagi otrzewnowe. Jednakże poziom suplementacji i frakcja zmieniały ten efekt. Precypitacja Nalco zmniejszała produkcję TNF-Δ przez niestymulowane komórki zarówno przy 0,5% jak i 0,1%. Frakcja bogata w immunoglobulinę zmniejszała produkcję TNF-Δ przy 0,5% lecz nie przy 2,5%. Dodatek surowicy zmniejszył produkcję TNF-Δ przy 5% ale nie przy 1,0%.

Warunki doświadczalne w doświadczeniu II różniły się od poprzedniego doświadczenia. W badaniu tym wszystkie myszy prowokowano endotoksyną w 1-szym dniu w celu sprawdzenia układu immunologicznego u wszystkich zwierząt. Poprzednie doniesienia wykazały, że makrofagi redukują reaktywność odpowiedzi immunologicznej w następstwie prowokacji. Wyniki pierwszego doświadczenia wydają się potwierdzać te obserwacje. Izolowane makrofagi od zwierząt karmionych dietą kontrolną produkowały wyższe poziomy TNF-Δ gdy nie były stymulowane i dlatego też produkowały mniej TNF-Δ w przypadku stymulowania LPS, w porównaniu do zwierząt karmionych dietami z dodatkiem osocza i/lub frakcjami. Poziomy TNF-Δ znacznie różniły się u zwierząt kontrolnych w dwóch doświadczeniach. Produkcja TNF-Δ była 15 razy wyższa w pierwszym doświadczeniu niż w drugim doświadczeniu. Niemniej jednak gdy układ immunologiczny był aktywowany produkcja była niższa w obu doświadczeniach, reaktywność immunologiczna była wyższa u myszy karmionych dietą z dodatkiem frakcji osocza. Oba stężenia TNF-Δ i IL-10 znacznie wzrastały gdy makrofagi poddawano działaniu LPS.

Osocze jest bogate w aktywne biologicznie białka, peptydy, cytokiny i inne immunomodulujące związki. Frakcje osocza zastosowane w tych doświadczeniach różniły się w kompozycjach i wielkościach włączonych diet. Efekt tych frakcji na produkcję TNF-Δ był zgodny w obu doświadczeniach. Zwierzęta karmione osoczem i/lub jego frakcjami produkowały mniej TNF-Δ w niestymulowanym stanie i dlatego odpowiadały wzrostem produkcji TNF-Δ po stymulacji endotoksyną. Wyniki tych dwóch doświadczeń są zgodne z koncepcją, że obie frakcje bogate w immunoglobulinę i frakcje dwutlenku krzemu zmniejszały stymulację układu immunologicznego. Doustne zastosowanie białek osocza czy jego frakcji jest nowym środkiem zmniejszania produkcji TNF-Δ i jego poziomów.

T a b e l a 1

Wpływ wołowego i świńskiego białka osocza zastosowanego do mierzenia odpowiedzi immunologicznej u myszy

Traktowanie	TNF-Δ pg/ml	Wybuch oddechowy
-LPS	+LPS	TNF-α zmienne	-LPS	+LPS
Kontrola	1540a	1867a	322a	17,4a	23,9a
Osocze świńskie	70b	1156b	1085b	12,2b	14,6b
Osocze wołowe	28b	1135b	1107b	10,1b	11,1b
Osocze wołowe (frakcja ciężka)	136b	1260b	1101b	10,6b	13,7b
Osocze wołowe (frakcja lekka)	34b	1135b	1124b	9,3b	11,2b

PL 211 753 B1

T a b e l a 2

Średnie wyniki fagocytozy przez makrofagi otrzewnowe (Fig. 5)

Dieta	Zwierzęta No.	Średnie wyniki	Se
Kontrola	1-12	298	47,6
PP	13-24	264	46,2
BP	25-36	311	52,1
BL	37-48	360	66,5
BH	49-60	375	63,9

T a b e l a 3

Produkcja TNF-Δ przez makrofagi otrzewnowe hodowane z myszy karmionych składnikami białka osocza

Traktowanie	Produkcja TNF-Δ, pg/ml
-LPS	+LPS	Zmiana
Kontrola	128a	296a	169a
Ig stężenie, 2,5%	107ab	308a	201ab
Ig stężenie, 0,5%	20b	325a	306b
Surowica wołowa,5%	5b	371a	366b
Surowica wołowa, 1%	130a	306a	176a
Frakcja ciężka,0,5%	48ab	271a	223ab
Aktywowany HP,0,5%	30ab	303a	272ab
Aktywowany, odpopielony HP,0,1	11b	352a	341b

T a b e l a 4

Produkcja IL-10 przez makrofagi otrzewnowe hodowane z myszy karmionych składnikami białek osocza

Traktowanie	Produkcja IL-10, pg/ml
-LPS	+LPS	Zmiana
Kontrola	80a	237a	156a
Ig stężenie, 2,5%	92a	366a	274a
Ig stężenie, 0,5%	45a	374a	329ab
Surowica wołowa,5%	22a	369a	347b
Surowica wołowa,1%	116a	354a	238ab
Frakcja ciężka,0,5%	64a	348a	284ab
Aktywowany HP, 0,5%	54ab	394a	339b
Aktywowany, odpopielony HP, 0,1%	32b	412a	381b

Zastrzeżenia patentowe

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie koncentratu antygenowo nie-specyficznych immunoglobulin pochodzących z krwi zwierząt, poza człowiekiem, do wytwarzania leku do leczenia człowieka cierpiącego na zaburzenia immunologiczne, wybrane z grupy obejmującej przewlekłe pobudzenie immunologiczne, choroba Crohna, reumatoidalne zapalenie stawów, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, HIV, przy czym koncentrat immunoglobuliny jest w postaci do podawania doustnie człowiekowi.

   PL 211 753 B1
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że koncentrat immunoglobuliny otrzymywany jest sposobem, który obejmuje etapy:

   (i) otrzymywanie osocza z krwi zwierząt, poza człowiekiem, (ii) uwapnienie osocza związkiem wapnia dla zapobiegania utworzeniu się skrzepu, (iii) odwirowanie osocza i usunięcie fibryny, (iv) odfiltrowanie osocza, (v) precypitacja soli frakcji globulin, (vi) odwirowanie i wyizolowanie frakcji bogatej w globuliny.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że źródłem koncentratu immunoglobuliny jest osocze pochodzące od bydła, świni, drobiu, owcy, konia lub kozy.
4. 4. Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca immunoglobuliny w klasach M, D, E, A lub G, przy czym koncentrat immunoglobulin zawiera około 35-50% IgG, immunoglobulina ma nietknięte regiony Fab i Fc, gdzie koncentrat immunoglobulin pochodzi z krwi zwierząt, poza człowiekiem, do doustnego stosowania w leczeniu u ludzi przewlekłego pobudzenia immunologicznego, choroby Crohna, reumatoidalnego zapalenia stawów, wrzodziejącego zapalenia okrężnicy lub HIV.
5. 5. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 4, znamienna tym, że koncentrat immunoglobuliny otrzymywany jest sposobem, który obejmuje etapy:

   (i) otrzymywanie osocza z krwi zwierząt, poza człowiekiem, (ii) uwapnienie osocza związkiem wapnia dla zapobiegania utworzeniu się skrzepu, (iii) odwirowanie osocza i usunięcie fibryny, (iv) odfiltrowanie osocza, (v) precypitacja soli frakcji globulin, (vi) odwirowanie i wyizolowanie frakcji bogatej w globuliny.
6. 6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 4, znamienna tym, że źródłem koncentratu immunoglobuliny jest osocze pochodzące od bydła, świni, drobiu, owcy, konia lub kozy.

   PL 211 753 B1

   Rysunki

   Wpływ doustnego zastosowania białek osocza na produkcję przeciwciał po pierwszym i