PL210909B1 - Sposób oznaczania aktywności przeciw utleniającej lub utleniającej ekstraktów organicznych w oparciu o chemiluminescencję estrów akrydyniowych - Google Patents
Sposób oznaczania aktywności przeciw utleniającej lub utleniającej ekstraktów organicznych w oparciu o chemiluminescencję estrów akrydyniowychInfo
- Publication number
- PL210909B1 PL210909B1 PL381661A PL38166107A PL210909B1 PL 210909 B1 PL210909 B1 PL 210909B1 PL 381661 A PL381661 A PL 381661A PL 38166107 A PL38166107 A PL 38166107A PL 210909 B1 PL210909 B1 PL 210909B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- chemiluminescence
- antioxidant
- solution
- seconds
- decay
- Prior art date
Links
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 title claims description 27
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical class C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 24
- 239000000284 extract Substances 0.000 title claims description 18
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 59
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 39
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 33
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 22
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 9
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 7
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 2
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 claims 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical class O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- -1 OOH ions Chemical class 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- INUMMPHTUPBOEU-UHFFFAOYSA-N 1-phenylacridine Chemical class C1=CC=CC=C1C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3C=C12 INUMMPHTUPBOEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 description 2
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 description 2
- 230000009103 reabsorption Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- USMZEYPOTJAYPT-LRROQMAJSA-N (2r)-2-[(1s)-1,2-dihydroxyethyl]-3,4-dihydroxy-2h-furan-5-one;2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-[[(2r,3r,4r,5r,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxychromen-4-one Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O.O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](OC=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2C=2C=C(O)C(O)=CC=2)=O)O1 USMZEYPOTJAYPT-LRROQMAJSA-N 0.000 description 1
- XUVKSPPGPPFPQN-UHFFFAOYSA-N 10-Methyl-9(10H)-acridone Chemical compound C1=CC=C2N(C)C3=CC=CC=C3C(=O)C2=C1 XUVKSPPGPPFPQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDTSJMKGXGJFGQ-UHFFFAOYSA-N 3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 GDTSJMKGXGJFGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JMGZEFIQIZZSBH-UHFFFAOYSA-N Bioquercetin Natural products CC1OC(OCC(O)C2OC(OC3=C(Oc4cc(O)cc(O)c4C3=O)c5ccc(O)c(O)c5)C(O)C2O)C(O)C(O)C1O JMGZEFIQIZZSBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISXLDVGOKPYLMO-UHFFFAOYSA-N C1=CC=C2N=C(C=CC=C3)C3=CC2=C1.P Chemical compound C1=CC=C2N=C(C=CC=C3)C3=CC2=C1.P ISXLDVGOKPYLMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical class [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O acridine;hydron Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3[NH+]=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008046 pharmaceutical antioxidant Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 235000005493 rutin Nutrition 0.000 description 1
- IKGXIBQEEMLURG-BKUODXTLSA-N rutin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@@H]1OC[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](OC=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2C=2C=C(O)C(O)=CC=2)=O)O1 IKGXIBQEEMLURG-BKUODXTLSA-N 0.000 description 1
- 229960004555 rutoside Drugs 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 210909 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 381661 (51) Int.Cl.
G01N 31/22 (2006.01) G01N 33/00 (2006.01) G01N 33/58 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 01.02.2007
Sposób oznaczania aktywności przeciw utleniającej lub utleniającej ekstraktów organicznych w oparciu o chemiluminescencję estrów akrydyniowych
| (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET GDAŃSKI, Gdańsk, PL | |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: 04.08.2008 BUP 16/08 | (72) Twórca(y) wynalazku: |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: | KAROL KRZYMIŃSKI, Gdynia, PL ALEKSANDER D. ROSHAL, Charków, UA OLGA P. SYNCZYKOWA, Charków, UA BORYS P. SANDOMIERSKI, Charków, UA |
| 30.03.2012 WUP 03/12 | (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Andrzej M. Jaeszke |
PL 210 909 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania aktywności przeciw utleniającej lub utleniającej ekstraktów organicznych w oparciu o chemiluminescencję estrów akrydyniowych, to jest soli 10-metylo-9-(fenoksyksykarbonylo)-akrydyniowych.
Wynalazek dotyczy sposobu pomiaru parametrów procesu chemiluminescencji towarzyszącej reakcji pomiędzy prekursorem luminezującym (to jest zdolnym do emisji światła) i utleniaczem w środowisku o ustalonej wartości czynnika pH, przy której zmiany parametrów wywołane obecnością substancji o charakterze przeciw utleniającym lub utleniającym są wykorzystywane do określania zdolności przeciw utleniających lub utleniających badanego układu.
Chemiluminescencja niektórych soli akrydyniowych jest dotychczas wykorzystywana głównie do ilościowych oznaczeń immunologicznych - tak zwane znaczniki chemiluminescencyjne (CL). Aplikacje tego typu były przedmiotem wielu publikacji naukowych [między innymi G. Zomer, J.C. Stavenuiter, R.H. Van der Berg, E.H. Jansen, Pract,. Spectrosc. (1991) 12, 505 - 521, Z. Razawi, F. McCapra, Luminescence (2000) 15, 245 - 249; K. Smith, Z. Li, J. Yang, I. Weeks, S. Woodhead, J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry (2000) 132,181].
Zagadnienia chemiluminescencji niektórych soli akrydyniowych są również objęte licznymi zgłoszeniami patentowymi, a między innymi Europejskie Zgłoszenia Patentowe, nr nr EP 0312 248A2 L.J. Arnold, N. Ch. Nelson z roku 1989; Europejskie Zgłoszenie Patentowe, EP 0361 817 A2S w klasie Int. Cl. C07D 219/04C. CK. Chang, S.J. Klukas, Ch. Law, A Vitkuskas, z roku 1989, oraz EP 1 403 254 A1 w klasie Int. Cl. C07D 219/04 i G01N33/533, autorstwa A. Natrajan, T. Sells, H. Schroeder, G. Yang, D. Sharpe, Q. Jiang, H. Lukinsky, S.J Law z roku 2003.
Również literatura naukowa tego przedmiotu opisuje wybrane układy zastosowane w diagnostyce medycznej [patrz Acridinum C2 NHS Ester (2004), Metachem Diagnostics, Inc., Northampton, UK] oraz [Flashlight Acridinium (2000), Assay Designs, Inc., USA].
W opisanych tam przypadkach luminofor akrydyniowy musi zostać wyposażony w grupę aktywną, zdolną do wytworzenia wiązania chemicznego ze znakowaną makromolekułą, oraz w grupę separującą (określaną jako „spacer”), aby mógł on pełnić role znacznika CL [patrz G. Zomer, J.F.C. Stavenuiter, Anal. Chim. Acta (1989) 227, 11-19 oraz K. Smith, Z. Li, J. Yang, I. Weeks, S. Woodhead, J. Photochem. Photobiol. A: Chem., (2000) 132, 181-191]. Synteza układów tego typu jest znacznie bardziej skomplikowana, aniżeli synteza soli akrydyniowych wykorzystywanych w niniejszym wynalazku.
Większość stosowanych dotychczas metod diagnostycznych wykorzystujących zjawisko chemiluminescencji bazuje na pochodnych luminolu, to jest hydrazydu 3-aminoftalowego [patrz D. Atanassova, P. Kefalas, E. Psillakis, Environment International (2005) 31, 275-280], również [H.R. Schroeder i F. M. Yeager, Anal. Chem. (1978) 50, 1114-1120], również [L.J. Kricka, Anal. Chim. Acta, (2003) 500, 279-286], również [C. Dodeigne, L. Thunus, R. Lejeune, Talanta, 2000, 51, 415-439], oraz [G. Magin, I.N. Lewin, D. Popov, Yu. Izmailov, Yu. A. Vladimirov, „Photochemiluminescence as a tool to determine the antioxidant activity in biological systems. Mathematic modeling. Problems of medical chemistry” (2000), vol. 4] lub na układzie typu lucyferyna-lucyferaza [patrz R. De Suva i inni. Luminescence (2000) 15, 205 oraz F. Chen, K. Van Dyke, V. Vallayathan, V. Castranova, X. Shi, „Chemiluminescence in Analytical Chemistry”, Garcia-Campana, A.M., Baeyens, W.R.G. (Ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, 2001, 231-242].
Metody te polegają głównie na procesach wydajnego utleniania, czemu towarzyszy emisja światła widzialnego, zwykle z zakresu niebieskiego lub zielonego (425-470 nm). Obecność przeciw utleniacza w próbie powoduje, do pewnego stopnia, zahamowanie wspomnianych procesów i - co za tym idzie - redukcję maksymalnego sygnału oraz integralnej intensywności chemiluminescencji.
Metody wykorzystujące pochodne luminolu mogą być oparte zarówno na ich bezpośredniej reakcji z nadtlenkiem wodoru lub utleniaczem generującym jony OOH - (np. peroksydaza węglanowa, anoda elektrolizera), bądź na jego utlenianiu przez anionorodniki O2, generowane w procesach utleniania-redukcji w niektórych układach biologicznych. Testy tego typu zwykle zawierają luminol (bądź jego pochodną), roztwór nadtlenku wodoru oraz katalizator umożliwiający szybki rozpad utleniacza (zwykle sole metali bloku d) [patrz Yu. A. Vladimirov, „Ultraweak Luminescence Accompanying Biochemical Reactions”, Springfield, Vermont, NASA, USA, 1966]. Do wyznaczenia aktywności przeciw utleniającej ryboflawiny, za pomocą wspomnianego systemu, wykorzystuje się też roztwory aminokwasów w charakterze katalizatorów chemiluminescencji [patrz Yu.A. Vladimirov, M.P. Sherstnev. „Chemiluminescence of animals' cells. Outcomes of science and techniques”. Biophysics, vol. 24, 1989, pp.
PL 210 909 B1
6-29, 44-52, 105-109, Moscow, VINITI Edition]. Oznaczenia tego typu oparte są o pomiar maksymalnej intensywności sygnału, czasu potrzebnego do jego osiągnięcia, bądź integralnej wydajności chemiluminescencji, które to wielkości pełnią rolę parametrów analitycznych.
Znane i opisane w literaturze przedmiotu metody określania właściwości przeciw utleniających preparatów organicznych z udziałem pochodnych luminolu wykazują następujące wady:
- chwilowa wydajność kwantowa luminescencji produktu reakcji CL, to jest anionu 3-amino-ftalanowego, jest stosunkowo niska w roztworach wodnych, przez co konieczne jest użycie sprzętu o wysokiej czułości.
- konieczne jest użycie katalizatora wywołującego reakcję chemiluminescencji (np. soli żelaza (II), EDTA i innych), co podwyższa poziom tła, a tym samym obniża czułość oznaczeń [opisano to w K.D. Gundermann, F. McCapra, „Reactivity and Structure Concepts in Organic Chemistry”, Vol. 23: Chemiluminescence in Organic Chemistry, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, 1987, str. 109-118] oraz [D.F. Roswell, E.H. White, Methods Enzymol. (1978) 57, 409], a także [D.Atanassova, P. Kefalas, E. Psillakis, Envir. Int. (2005) 31, 275-280],
- intensywność chemiluminescencji ulega znacznej redukcji w przypadku badania prób barwnych bądź nieprzeźroczystych (w mediach reabsorbujących i/lub rozpraszających promieniowanie), ze względu na niską chwilową efektywność emisji promieniowania z roztworów wodnych [H.R. Schroeder i F. M. Yeager, Anal. Chem. (1978) 50, 1114-1120].
Ponieważ trudno jest wprowadzić ilościową korektę zmętnienia lub koloru analizowanych prób, zakłada się, że wspomniane czynniki mają podobny wpływ interferencyjny w tych samych warunkach eksperymentu. Zmętnienie prób może się jednak zmieniać w czasie, co może powodować błędy w szacowaniu wydajności chemiluminescencji oraz obniżenie czułości metody. Z podobnych względów porównywanie prób różniących się kolorem ( na przykład ekstraktów pochodzących z różnych roślin), może być obarczone błędem pomiarowym, wynikającym z różnej reabsorbcji emitowanego promieniowania.
Znane metod wykorzystujące system lucyferyna-lucyferaza wykazują następujące ograniczenia:
- luminofor i wywoływacz muszą być pozyskiwane z materiału biologicznego, w wyniku czego ich wytwarzanie jest kosztowne;
- enzym lucyferaza jest mało trwały (musi być przechowywany w niskich temperaturach i stosunkowo szybko traci aktywność),
- wydajna chemiluminescencja układu lucyferyna - lucyferaza w roztworach wodnych wymaga zastosowania katalizatorów, co może być źródłem reakcji ubocznych i może podwyższać poziom tła oznaczenia.
Parametry znanego procesu chemiluminescencji fenylowych estrów akrydyniowych zależą od szeregu niżej opisanych czynników.
Pierwszym z tych czynników jest stężenie estru akrydyniowego. Jak wynika ze znanego mechanizmu chemiluminescencji estrów akrydyniowych, stężenie 10-metylo-9-akrydonu, który tworzy się w wyniku utleniania estru akrydyniowego, jest wprost proporcjonalne do stężenia początkowego soli [patrz J. Rak, P. Skurski, J. Błażejowski, J. Org. Chem. (1999) 64, 3002-3008] a także [K. Van Dyke, K. Woodfork, „Chemiluminescence in Analytical Chemistry”, Garcia-Campana, A.M., Baeyens, W.R.G. (Ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, 2001, 3-29]. Z tego powodu intensywność chemiluminescencji może być regulowana przez zmianę stężenia soli akrydyniowej w układzie. Dotyczy to roztworów rozcieńczonych, gdzie nie zachodzą procesy wygaszania stężeniowego [patrz Baltroop, J.A., Coyle, J.D., Fotochemia. Podstawy, PWN, Warszawa 1987]. Zwiększenie intensywności emisji światła umożliwia zwiększenie dokładności i precyzji oznaczeń, ze względu na wyższy stosunek sygnału do szumu. Przechowywane roztwory wyjściowe fenylowych estrów akrydyniowych muszą być lekko zakwaszone w celu zapewnienia ich stabilności, ponieważ związki tego typu stosunkowo łatwo hydrolizują w środowiskach zasadowych i neutralnych [patrz G. Zomer, J.C. Stavenuiter, R.H. Van der Berg, E.H. Jansen, Pract. Spectrosc. (1991) 12, 505-521, oraz jw. Rak i inni (1999)].
Na rysunku fig. 1 przedstawiono schemat soli 10-metylo-9-(fenoksykarbonylo)akrydyniowych, które mogą być wykorzystane do oznaczania właściwości przeciw utleniających lub utleniających prób pochodzenia organicznego według metod opisanych w niniejszym wynalazku. Wspomniane sole akrydyniowe mogą być przechowywane w roztworze zakwaszonym (pH = 3) bez mierzalnej utraty właściwości chemiluminescencyjnych przez okres co najmniej jednego miesiąca. Inną możliwością jest przygotowanie roztworu wyjściowego soli akrydyniowej w bezwodnym acetonitrylu (CH3CN), który
PL 210 909 B1 przechowywany w temperaturze 4°C bez dostępu wilgoci i powietrza może być uznany za trwały, gdyż nie wykazuje mierzalnego spadku wydajności emisji przez co najmniej 6 miesięcy.
Kolejnym czynnikiem, od którego zależą parametry procesu chemiluminescencji fenylowych estrów akrydyniowych, jest odczyn środowiska pomiarowego. Na rysunkach fig. 3 i fig. 4 przedstawiono zależność stałych szybkości zaniku chemiluminescencji (kCL) oraz intensywności maksymalnego sygnału (ICL) od wartości czynnika pH środowiska. Pomiary prowadzono w buforach zasadowych: wodorofosforanowym (pH = 7,50), czteroboranowym (pH = 9,18), węglanowym (pH = 9,93), oraz fosforanowym (pH = 12,09), jak również w roztworach wodorotlenku sodowego (NaOH) o różnych stężeniach. Stężenie dodawanego nadtlenku wodoru (H2O2) w każdym z eksperymentów wynosiło 2,1 M. Największa wartość stałej szybkości wygaszania chemiluminescencji (kCL) ma miejsce w obszarze wartości pH = 9,0 - 10,0 (rysunek fig. 3). Wykonywanie oznaczeń w tym obszarze pH środowiska umożliwia osiągnięcie największej intensywności chemiluminescencji (rysunek fig. 4) - i w rezultacie - uzyskanie optymalnej czułości i dokładności oznaczeń w przypadku omawianej metody. Właściwości te umożliwiają uzyskanie powtarzalnych rezultatów nawet w układach charakteryzujących się znacznym rozpraszaniem światła (mętnych) i/lub reabsorpcją światła (barwnych).
Trzecim czynnikiem, od którego zależą parametry procesu chemiluminescencji estrów akrydyniowych przedstawionych na rysunku fig. 1, jest stężenie nadtlenku wodoru. Jony nadtlenkowe (OOH) wywołujące chemiluminescencję estrów akrydyniowych, powstają w drodze dysocjacji nadtlenku wodoru (pK = 11,97) w środowisku alkalicznym [patrz Van Dyke, K., Van Dyke, Ch., Woodfork, K., (Ed.), „Luminescence Biotechnology”, CRC Press, Washington D.C., 2002, pp. 9-13, 77-105].
W literaturze przedmiotu [patrz Brown, R.C., Weeks, 1., Fisher, M., Harbron, S., Taylorson, Ch.J., Woodhead, J.S., Anal. Biochem. (1998) 259, 142-151], a także [W.J. Cooper, J.K. Moegling, R.J. Kieler, J.J. Kiddle, Marine Chem. (2000) 70, 191-200], wymienieni autorzy wskazują, że wytwarzanie jonów OOH może zachodzić również w mediach środowiskowych i biologicznych ze względu na obecność rożnych ciał utleniających. Ich stężenie w układzie wpływa na kinetykę i efektywność procesów emisyjnych, których śledzenie stanowi podstawę, na której oparte jest rozwiązanie według wynalazku. Z zależności przedstawionych na rysunkach fig. 5 i fig. 6 wynika że optymalne stężenie nadtlenku wodoru w roztworach badanych według wynalazku wynosi około 2,0 - 2,1 M.
Wynalazek rozwiązuje zagadnienie opracowania nowego prostego i czułego sposobu służącego do określania zdolności przeciw utleniającej bądź utleniającej prób stałych lub ekstraktów pozyskiwanych z roślin i zwierząt, leków oraz składników żywnościowych, w oparciu o chemiluminescencję fenylowych estrów akrydyniowych.
Sposób oznaczania aktywności przeciw utleniającej lub utleniającej ekstraktów organicznych w oparciu o chemiluminescencję estrów akrydyniowych charakteryzuje się tym według wynalazku, że wodne lub etanolowe roztwory analizowanej próby stałej lub analizowanego ekstraktu ciekłego o objętości równej 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 i 0,5 ml rozcieńcza się buforem zasadowym o odczynie pH = 9,93 (na przykład bufor węglanowy) do objętości 2,0 ml, przed pomiarami do każdego z roztworów dodaje się 0,15 ml 5% roztworu H2O2, każdy, a jego precyzyjne stężenie określa się zwłaszcza metodą manganometryczną, i tak otrzymane roztwory homogenizuje się przez krótkotrwałe wymieszanie i umieszcza się w kuwecie luminometru lub fluorymetru pracującego w opcji kinetycznej, a następnie dodaje się, intensywnie mieszając, 0,15 ml roztworu soli akrydyniowej przedstawionej na rysunku fig. 1 i mającej stężenie około 5 x 10-4 M, po czym rozpoczyna się rejestrację profilu kinetycznego chemiluminescencji po upływie od 1 do 2 sekund od momentu dodania roztworu luminofora i rejestruje się intensywność emisji światła w obszarze zaniku świecenia próby przez co najmniej 1,5 minuty w taki sposób, że wartości chwilowe intensywności chemiluminescencji (I) mierzone w jednostkach względnych w czasie (t) przedstawia się w formie logarytmicznej jako log I = f(t), przy której wartość bezwzględna współczynnika kierunkowego odcinka prostej (t > 15 sekund) określa pseudo-pierwszorzędową stałą szybkości zaniku chemiluminescencji (kCL), natomiast wyspecyfikowane w ten sposób zależności kCL, dla różnych zawartości przeciw utleniacza (lub utleniacza) w roztworach wykazują, w określonym zakresie stężeń, charakter liniowy, a wartość bezwzględną współczynnika kierunkowego zależności typu, kCL = f (zawartość przeciw utleniacza/utleniacza), określa się jako częściową stałą szybkości zaniku chemiluminescencji (kgCL), proporcjonalną do zdolności przeciw utleniających, względnie utleniających badanej próby.
Istotnym jest w uproszczonym sposobie postępowania według wynalazku, że pomiar zaniku chemiluminescencji w luminometrze lub fluorymetrze przeprowadza się dla jednej próby przeciwutleniacza bądź utleniacza, rejestrując dwie wartości intensywności emisji, w odstępach przynajmniej 30 sekund, w przedziale czasowym od 15 do 90 sekund, licząc od momentu rozpoczęcia pomiarów, okrePL 210 909 B1 ślając te wartości jako I1 i I2 a następnie identyczny pomiar prowadzi się dla roztworu nie zawierającego przeciwutleniacza (utleniacza), uzyskując odpowiednie wartości określone tako I1C i I2C, przy których wartość wyznacza się za pomocą równania:
kgCL ig| -ίχΧ j
Ai2 lic J
C x r x Δt lub:kgCL
Igi ł χ1· ' |
Ai2 iic J
X x m x Δt gdzie:
kgcL - częściowa stała kinetyczna (M-i χ s-i); c - stężenie początkowe roztworu przeciw utleniacza (M); r - rozcieńczenie;
t - odstęp czasowy dla punktów pomiarowych (s); m - masa przeciw utleniacza (g χ L-i); χ - mnożnik przeliczeniowy.
istotnym jest nadto w sposobie według wynalazku, że jako luminofor stosuje się estry akrydyniowe pokazane na rysunkach fig. i i fig. ·, a odczyn środowiska w którym dokonuje się oznaczenia ustala się, dodając do znanej ilości bądź objętości próby przeciwutleniacza (utleniacza) ·,0 ml buforu zasadowego o odczynie pH około 9,93, a nadto, że do tak przygotowanego roztworu dodaje się 0,i5 ml
5% roztworu nadtlenku wodoru (H2O2) o stężeniu wyjściowym wynoszącym najkorzystniej około 5%, nadto, że przed rozpoczęciem pomiarów dodaje się 150 μl roztworu soli akrydyniowej pokazanej na rysunku fig. 2 o stężeniu około 5 χ i0-4 M, sporządzonej się przez rozpuszczenie naważki związku w wodzie demineralizowanej, zakwaszonej uprzednio rozcieńczonym kwasem solnym lub siarkowym (Vi) do pH = 3,0.
Sposób oznaczania aktywności przeciw utleniającej lub utleniającej ekstraktów organicznych w oparciu o chemiluminescencję estrów akrydyniowych według wynalazku, spełniając założone zadania, wykazuje jednocześnie szereg cech korzystnych.
A. Produkt reakcji cL, i0-metylo-9-akrydon, tworzony w wyniku utleniania estrów akrydyniowych (rysunek fig. i), wykazuje wysoką wydajność kwantową (Φ > 90%), co jest jednym z głównych parametrów wpływającym na wysoką wydajność promieniowania tych układów w środowiskach wodnych (Φ = 5%) [patrz K. Smith, Z. Li, J. Yang, i. Weeks, S. Woodhead, J. Photochem. Photobiol. A: chemistry, (2000) i32, i8i-i9i].
B. Duża szybkość procesu utleniania fenylowych estrów akrydyniowych pozwala na osiągniecie wyższej niż w innych układach chwilowej wydajności emisji, co umożliwia dokonywanie pomiarów z niewielkim błędem pomiarowym w układach barwnych i/lub mętowych.
c. Zakres liniowości zależności: ig (I) = f (t) jest stosunkowo szeroki (rysunek fig. 7), co pozwala precyzyjnie wyznaczyć wartości stałych szybkości zaniku chemiluminescencji (kcL). istnienie korelacji liniowej pomiędzy wartościami kcL, a zawartością przeciwutleniacza (to jest jego masą (m) lub stężeniem molowym) pozwala na obliczenie współczynnika nachylenia prostej: kCL = f(m), przyjmującego wartości proporcjonalne do zawartości przeciwutleniacza w układzie (rysunek fig. 8). Wartość ta, określana w niniejszym zgłoszeniu jako częściowa stała szybkości zaniku chemiluminescencji (kgCL), służy jako niezależny parametr określający zdolność przeciwutleniającą układu i może być wykorzystana do porównań tej zdolności w przypadku prób pochodzących z różnych źródeł.
D. W obecności ciał wykazujących wpływ utleniający (to jest generujących jony nadtlenkowe, OOH“) obserwuje się przyspieszenie zaniku chemiluminescencji i podobne zależności liniowe, jak dla układów o charakterze przeciwutleniającym i opisane w punkcie C. Z tego powodu sposób według wynalazku może być również wykorzystywany do szacowania właściwości utleniających prób pochodzenia organicznego.
E. W odróżnieniu od innych metod chemiluminometrycznych, wynalazek nie wymaga konieczności stosowania czułych luminometrów, posiadających możliwość rejestracji integralnej wydajności emisji promieniowania, co jest konieczne przy stosowaniu znanych metod pokrewnych, ze względu na fakt, że stała kinetyczna, nie wydajność emisji promieniowania, jest w niniejszym wynalazku obrana jako parametr analityczny, [patrz D. Atanassova, P. Kefalas, E. Psillakis, Envir. int. (2005) 3i, 275-280], a także [W.J. Cooper, J.K. Moegling, R.J. Kieler, J.J. Kiddle, Marine Chem. (2000) 70, i9i-200].
PL 210 909 B1
Rezultaty przedstawione w tabeli 1 wykazują, że w badanych układach, chemiluminescencja układu na bazie luminalu (prototyp = stan techniki) charakteryzuje się długim czasem zaniku (do 30 godzin), zaś maksymalna intensywność emisji jest obserwowana po około 25 minutach.
Dodatek przeciwutleniacza zmniejsza intensywność świecenia oraz wydłuża czas potrzebny do osiągnięcia maksymalnej emisji prototypu do około 1 godziny (spowolnienia zaniku emisji światła). Integralna wydajność chemiluminescencji luminolu charakteryzuje się wysoką wartością, lecz biorąc pod uwagę czas trwania procesu, chwilowa intensywność emisji jest stosunkowo niska (0,3-0,6 jednostek względnych, a.u.). Pomiar w takich warunkach wymaga użycia czułych układów rejestrujących o wysokim współczynniku wzmocnienia sygnału.
Zmętnienie układu zawierającego luminol powoduje opóźnienie pojawienia się chemiluminescencji i wyraźne zwiększenie szybkości zaniku CL, co jest prawdopodobnie związane z dyspersją światła; ma to szczególne znaczenie na początku i na końcu pomiaru, gdy chemiluminescencja wykazuje niską intensywność. Dodatkowo, w omawianym przypadku, maksymalna intensywność emisji promieniowania maleje prawie dwukrotnie. Powyższe fakty wskazują na ograniczenia metody według stanu opisanego w literaturze w przypadku prowadzenia pomiarów w środowiskach mętnych.
Zanik chemiluminescencji luminofora wykorzystywanego w sposobie według wynalazku (estru akrydyniowego, rysunek fig. 2) trwa w tych samych warunkach poniżej 1,5 min, to jest około 1000 razy krócej w porównaniu ze znanym i opisanym w powołanej literaturze stanem techniki (tabela 1). Przedział intensywnego sygnału nie przekracza 3 sekund, zaś intensywność sygnału w tym obszarze jest około 300 razy wyższa niż w przypadku znanych technik. W roztworze mętnym obserwuje się niewielkie zmniejszenie intensywności oraz skrócenie trwania chemiluminescencji (o około 1,2 razy). Powyższe parametry nie wpływają w istotny sposób na rezultat, gdyż nie są one wykorzystywane w sposób bezpośredni do określania właściwości przeciwutleniających próby. Wysoka chwilowa intensywność chemiluminescencji umożliwia w tym przypadku uzyskanie zadowalającej czułości i dokładności pomiarów przy wykorzystaniu standardowych fluorymetrów lub luminometrów. Ta właściwość estrów akrydyniowych umożliwia też około pięciokrotną redukcję czasu wykonania analiz.
Stała szybkości zaniku chemiluminescencji w sposobie według wynalazku jest trzy rzędy wielkości wyższa niż dla układu luminol-H2O2 w środowisku alkalicznym opisanym w znanej literaturze. Z tego powodu czynniki zaburzające pomiar, takie jak zmiany zmętnienia roztworu (koagulacja lub sedymentacja w układach biologicznych), zmiany koloru (na przykład odbarwienie w wyniku kontaktu z nadtlenkiem wodoru) i inne (na przykład zmiany konsystencji, tworzenie pęcherzyków tlenu na ściankach kuwety i tym podobne) w sposobie według wynalazku, wpływają w mniejszym stopniu na rezultat niż w znanych sposobach postępowania. Wynika to z faktu, że wspomniane wyżej procesy przebiegają względnie wolno w porównaniu z zanikiem chemiluminescencji.
W tabeli 2 zestawiono porównanie charakterystyk analitycznych metody według wynalazku i prototypu - znanego stanu techniki. Przy tym samym stężeniu przeciwutleniacza sposób według wynalazku wykazuje ponad trzykrotnie większą zmianę parametru analitycznego (wartości stałej szybkości zaniku CL), niż zmiana parametru wykorzystywanego w metodzie prototypowej (zmiana maksymalnej intensywności chemiluminescencji) - cechuje się zatem wyższą czułością niż prototyp. Jeśli pomiar ma miejsce w roztworze o porównywalnym zmętnieniu, parametr analityczny metody prototypowej ulega redukcji o ponad 45%, podczas gdy w sposobie według wynalazku - o około 1,8%. W tym kontekście rezultaty uzyskane według wynalazku są mniej zależne od wpływu zewnętrznych czynników interferujących, a metoda cechuje się wyższą niż prototyp dokładnością i niezawodnością.
Wynalazek jest szczegółowo opisany na przykładach jego wykonania.
P r z y k ł a d 1
Sposób określania właściwości przeciw utleniających ekstraktu z pszczół („Apiextract”). 0,25 g ekstraktu ze śniętych pszczół („Apiextract”, Instytut Problemów Kriobiologii i Kriomedycyny, Charków, Ukraina), rozpuszcza się w 10 ml mieszaniny etanol-woda w stosunku objętościowym 1:1. Porcje roztworu wynoszące odpowiednio 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 i 0,5 ml rozcieńcza się roztworem buforowym wykazującym wartość pH = 9,93 (bufor węglanowy, to jest roztwór zawierający mieszaninę 0,05 M Na2CO3, i 0,05 M NaHCO3) do objętości 2,0 ml. Następnie do każdego roztworu dodaje się 0,15 ml 5% roztworu H2O2. Roztwór referencyjny sporządza się w identyczny sposób jednak bez dodatku ekstraktu. Następnie roztwory prób wprowadza się kolejno do kuwety luminometru lub fluorymetru, po czym do każdej dodaje się, stale mieszając, 0,15 ml roztworu soli akrydyniowej przedstawionej na rysunku fig. 2 i po około 2 sekundach od momentu dodania soli rozpoczyna się pomiar chwilowej intensywności chemiluminescencji (I, jednostki względne, a.u.), kontynuując go przez okres 1,5 minuty. W identyczPL 210 909 B1 nym sposób wykonuje się pomiar dla roztworu referencyjnego. Uzyskane wartości I logarytmuje się następnie w zakresie od 15 do 60 sekund, biorąc odczyty w określonych odstępach czasu (poniżej 5 sekund), a następnie dla kolejnych prób sporządza się wykresy zależności wartości logarytmu intensywności emisji od czasu, log I = f(t), jak pokazano na rysunku fig. 7. Zależności przedstawione na rysunku fig. 7 odzwierciedlają różne zawartości ekstraktu w roztworze, gdyż nachylenie prostych zmniejsza się w roztworach zawierających większą ilość przeciwutleniacza. Uzyskane stałe szybkości zaniku chemiluminescencji (wartość bezwzględna współczynników nachylenia prostych, kCL) pozostają, w badanym zakresie stężeń, w liniowej zależności od zawartości ekstraktu w poszczególnych roztworach (przeliczonego na masę suchego ekstraktu), jak pokazano na rysunku fig. 8, wykazując współczynnik korelacji R2 = 0,96. Uzyskana wartość bezwzględna współczynnika nachylenia wspomnianej prostej, nazwana tu częściową stałą kinetyczną (kgCL), charakteryzuje zdolność przeciw utleniającą badanego preparatu. W przypadku ekstraktu z pszczół wynosi ona kgCL = 233,6 s-1 x g-1. Podobną wartość (kgCL = 221,3 s-1 x g-1) uzyskano, stosując metodę uproszczoną, to jest mierząc intensywności emisji światła po 30 i 50 sekundach dla najbardziej stężonego roztworu ekstraktu. Różnica otrzymanych wartości kgCL otrzymana za pomocą obu wariantów metody wynosi około 5,3%.
P r z y k ł a d 2
Sposób określania właściwości przeciw utleniających farmaceutyków. Porcję 1,1 g „Kwercetyny” („Quercetine”, Chemapol, Praga, Czechy) rozpuszcza się w 25 ml mieszaniny etanol - woda w stosunku objętościowym 1:1. Metodyka pomiaru chemiluminescencji i obróbka danych są identyczne jak opisano w przykładzie 1. W tym przypadku wartości kgCL otrzymane za pomocą metody kompletnej i uproszczonej wynoszą odpowiednio 18,0 s-1 x g-1 oraz 17,6 s-1 x g-1. Rozdrobniona porcja (0,144 g) tabletki Ascorutyny (Ascoruthine, Glaxo Smith Kline Pharmaceutical S.A., Poznań, Polska), to jest mieszanina rutyny i kwasu askorbinowego w stosunku masowym 1:1, została rozprowadzona w 10 ml mieszaniny woda - alkohol etylowy (1/1 obj./obj.) i przefiltrowana w celu usunięcia osadów. Zdolność przeciw utleniającą roztworu badano w sposób analogiczny jak podano w przykładzie 1. Właściwości przeciw utleniające farmaceutyka określone za pomocą metody kompletnej wynoszą kgCL = 1,04 s-1 x g-1 w stosunku do masy tabletki oraz 3,42 s-1 x g-1 w stosunku do masy czystych przeciwutleniaczy.
P r z y k ł a d 3
Sposób określania zdolności utleniającej dodatku do żywności. Próbkę 10 mg preparatu „Phytor” (Ramona, Charków, Ukraina), to jest wysokotemperaturowego ekstraktu z liści dębu, rozpuszcza się w 10 ml mieszaniny etanol-woda (1/1 obj./obj.), uzyskując roztwór o intensywnej barwie żółto-brązowej. Pomiary chemiluminescencji wykonano analogicznie jak podano w przykładzie 1. Wartości częściowych stałych szybkości wynoszą wówczas kgCL = -22,1 s-1 x g-1 oraz -20,7 s-1 x g-1, odpowiednio dla metody kompletnej i uproszczonej. Ujemna wartość kgCL oznacza, że „Phytor” wykazuje działanie utleniające.
P r z y k ł a d 4
Sposób określania właściwości utleniających homogenizatu komórkowego. Właściwości utleniające homogenizatu komórek wątroby szczura określono za pomocą metody kompletnej (przykład 1) i uzyskano wynik kgCL = -0,23 s-1 x g-1. Rezultat oznacza, że preparat wykazuje słabe właściwości utleniające.
Claims (2)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób oznaczania aktywności przeciw utleniającej lub utleniającej ekstraktów organicznych w oparciu o chemiluminescencję estrów akrydynowych, znamienny tym, że wodne lub etanolowe roztwory badanego przeciw utleniacza (lub utleniacza) o objętości równej 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 i 0,5 ml, rozcieńcza się buforem zasadowym wykazującym pH = 9,93 do objętości 2,0 ml, przed pomiarami do każdego z roztworów soli akrydyniowej dodaje się 0,15 ml 5,0% roztworu H2O2, każdy z tak otrzymanych roztworów homogenizuje się przez krótkotrwałe wymieszanie i umieszcza się w kuwecie urządzenia rejestrującego emisję promieniowania świetlnego, a następnie dodaje się, intensywnie mieszając, 0,15 ml roztworu soli akrydyniowej pokazanej na rysunku fig. 1 a mającej stężenie około 5 x 10-4 M, po czym rozpoczyna się rejestrację profilu kinetycznego chemiluminescencji po upływie około 2 sekund od momentu dodania roztworu luminofora, stosując jako układ odniesienia wspomniany wyżej bufor zasadowy i rejestruje się intensywność promieniowania w obszarze zaniku świecenia próby przez co najmniej 1,5 minuty w taki sposób, że wartości chwilowe intensywności chemiluminescencji (I)PL 210 909 B1 mierzone w jednostkach względnych w czasie (t) przedstawia się w formie logarytmicznej jako log I = f(t), przy której wartość bezwzględna współ czynnika kierunkowego odcinka prostej (t > 15 sekund) określa pseudo-pierwszorzędową stałą szybkości zaniku chemiluminescencji (kCL), natomiast wyspecyfikowana w ten sposób zależność (kCL) od zawartości przeciwutleniacza (jego stężenia, masy lub objętości) w roztworze wykazuje, w określonym zakresie stężeń, charakter liniowy, natomiast wartość bezwzględną współczynnika kierunkowego prostej określa się jako częściową stałą szybkości zaniku chemiluminescencji (kgCL), proporcjonalną do zdolności przeciw utleniającej próby.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w uproszczonym sposobie postępowania podczas pomiaru zaniku chemiluminescencji rejestruje się, dla najbardziej stężonego roztworu próby przygotowanego jak wyżej, dwie wartości intensywności emisji, w odstępach od 20 do 30 sekund, w przedziale czasowym od 15 do 90 sekund, licząc od momentu rozpoczęcia pomiarów, określając wartości jako I1, i I2, a następnie identyczny pomiar prowadzi się dla roztworu referencyjnego, to jest nie zawierającego przeciw utleniacza, uzyskując odpowiednie wartości określone jako I1C, i I2C, przy których wartość kgCL, wyznacza się za pomocą równania:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL381661A PL210909B1 (pl) | 2007-02-01 | 2007-02-01 | Sposób oznaczania aktywności przeciw utleniającej lub utleniającej ekstraktów organicznych w oparciu o chemiluminescencję estrów akrydyniowych |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL381661A PL210909B1 (pl) | 2007-02-01 | 2007-02-01 | Sposób oznaczania aktywności przeciw utleniającej lub utleniającej ekstraktów organicznych w oparciu o chemiluminescencję estrów akrydyniowych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL381661A1 PL381661A1 (pl) | 2008-08-04 |
| PL210909B1 true PL210909B1 (pl) | 2012-03-30 |
Family
ID=43035912
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL381661A PL210909B1 (pl) | 2007-02-01 | 2007-02-01 | Sposób oznaczania aktywności przeciw utleniającej lub utleniającej ekstraktów organicznych w oparciu o chemiluminescencję estrów akrydyniowych |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL210909B1 (pl) |
-
2007
- 2007-02-01 PL PL381661A patent/PL210909B1/pl not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL381661A1 (pl) | 2008-08-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lu et al. | Reactive oxygen species and their chemiluminescence-detection methods | |
| Wu et al. | Fluorescent probes containing selenium as a guest or host | |
| Bai et al. | HKOH‐1: a highly sensitive and selective fluorescent probe for detecting endogenous hydroxyl radicals in living cells | |
| Lehóczki et al. | Ferrioxalate actinometry with online spectrophotometric detection | |
| Mestre et al. | Flow‐chemiluminescence: a growing modality of pharmaceutical analysis | |
| Kong et al. | Fluorescence imaging of selenol in HepG2 cell apoptosis induced by Na 2 SeO 3 | |
| US20170122954A1 (en) | Profiling reactive oxygen, nitrogen and halogen species | |
| Chen et al. | A red fluorescent probe for thiols based on 3-hydroxyflavone and its application in living cell imaging | |
| Elabd et al. | Spectroflourimetric assessment of UO22+ by the quenching of the fluorescence intensity of Clopidogrel embedded in PMMA matrix | |
| CN107356539A (zh) | 一种快速检测海水中氮营养盐浓度的方法 | |
| CN103740360B (zh) | 荧光比率法检测次氯酸的荧光探针及其制备方法 | |
| Hu et al. | Fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid in water samples and cell models | |
| Nie et al. | Reversible and dynamic fluorescence imaging of cellular redox self-regulation using fast-responsive near-infrared Ge-pyronines | |
| Borthakur et al. | A new dihydrazone based “turn on” fluorescent sensor for Zn (II) ion in aqueous medium | |
| Bregnhøj et al. | Uric acid: a less‐than‐perfect probe for singlet oxygen | |
| Krzymiński et al. | On the use of acridinium indicators for the chemiluminescent determination of the total antioxidant capacity of dietary supplements | |
| Wang et al. | Development and validation of a LC/MS-based method for the measurement of intracellular superoxide anion | |
| Narayana et al. | An easy spectrophotometric method for the determination of hypochlorite using thionin | |
| PL210909B1 (pl) | Sposób oznaczania aktywności przeciw utleniającej lub utleniającej ekstraktów organicznych w oparciu o chemiluminescencję estrów akrydyniowych | |
| Groegel et al. | A New Fluorescent PET Probe for Hydrogen Peroxide and its Use in Enzymatic Assays for L‐Lactate and D‐Glucose | |
| Zomer et al. | Chemiluminescent reductive acridinium triggering (CRAT)—mechanism and applications | |
| Schadelin et al. | Chemiluminescence of phagocytic cells | |
| CN101639445A (zh) | 一种用化学发光法体外检测血液丙酮酸的方法 | |
| Zhu et al. | Highly selective speciation and fluorimetric determination of Se (IV) in infant formulas using micelle-capped nile blue A | |
| Biddle et al. | Fluorometric determination of manganese (II) via catalyzed enzymic oxidation of 2, 3-diketogulonate |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20120201 |