PL210350B1 - Detektor warstwowy do wykrywania związków fenolowych - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest detektor warstwowy, będący biosensorem, przeznaczonym do wykrywania fenolu i jego pochodnych w środowisku wodnym.

Bioczujniki - biosensory mogą być oparte na receptorach chemicznych, immunologicznych lub biokatalitycznych. Znany jest między innymi biosensor do wykrywania neurotransmitera dopaminy, zaś biosensor zawierający wycinek kory nadnerczy połączony z elektrodą amoniakalną służy do analizy glutaminy.

Znane są bioczujniki warstwowe otrzymane z wykorzystaniem różnych technik samoorganizacji cząstek na powierzchni z kwasów tłuszczowych, fosfolipidów lub porfiryn. Tego typu systemy stanowią podstawę do budowy biosensorów oraz biologicznych sensorów optycznych.

Powszechnie znane są półprzewodniki, których powierzchnie modyfikowane są za pomocą przeciwciał lub/i kwasów nukleinowych. Ze zgłoszeniowego opisu wynalazku nr WO 2004/040407 A1, znany jest biosensor do wykrywania stężenia glukozy we krwi. Bioczujnik tego typu zbudowany jest z elektrod typu redox pokrytych filmem wytworzonym z oksydoreduktazy glukozowej.

Z opisu amerykańskiego zgłoszenia patentowego nr US2006199240, znane jest połączenie półprzewodnikowych właściwości elektrody z biologicznymi właściwościami białka do wykorzystania w optoelektronicznych urządzeniach diagnostycznych.

Z innego zgłoszenia patentowego EP 1 790984 A2 znany jest bioczujnik, stabilny w warunkach utleniania. Urządzenie to zbudowane jest z białek kowalencyjnie immobilizowanych do grup karboksylowych w hydrożelu modyfikowanym epichlorohydryną lub polisacharydami. Z innego amerykańskiego zgłoszenia patentowego nr US20050705216 znany jest warstwowy biosensor, w którym chemoczułą warstwę stanowi metal. Tego typu biosensor jest trwały, charakteryzuje go silniejszy sygnał pomiarowy.

Z europejskiego zgłoszenia patentowego EP 1873528 (A1) znany jest bienzymatyczny biosensor stosowany do wykrywania obecności alkoholu we krwi, w którym białko osadzone jest na teflonowo-grafitowej elektrodzie.

W innym opisie zgłoszeniowym EP1826564 (A1) ujawniono polimerowe matryce służące do pułapkowania białek enzymatycznych, w których hydrofilowy charakter stosowanych polimerów i związana z tym obecność wielu grup funkcyjnych umożliwia kowalencyjną immobilizację białek.

Znane jest stosowanie pochodnych kompleksów rutenu i osmu w układach z aminami i związkami N-heterocyklicznymi do modyfikowania powierzchni sensorowych elektrod pracujących bioczujników elektrochemicznych w roli mediatorów. Opisany w zgłoszeniu w trybie PCT nr WO2007072018 mediacyjny charakter kompleksów daje w efekcie lepszą efektywność pracy i stabilność bioczujnika.

Mediacyjny charakter rutynowych kompleksów został wykorzystany również w konstrukcji warstwowych biosensorów, w których białka enzymatyczne były unieruchamiane w przewodnikowych względnie półprzewodnikowych warstwach węglowych tak jak opisane z zgłoszeniu nr EP1828759 (A1).

W ostatnich latach coraz częściej warstwy Langmuira-Blodgett wykorzystywane są w konstrukcji szczególnie selektywnych urządzeń diagnozujących substancje toksyczne w środowisku.

Detektor warstwowy według wynalazku ma warstwę aktywną w postaci filmu Langmuira-Blodgett zawierającego usieciowaną kowalencyjnie tyrozynazę, otrzymanego z mieszaniny 4,4'-bis(tiofeno)-N-nonylodifenyloaminy, kwasu stearynowego i tyrozynazy sieciowanej za pomocą aldehydu glutarowego. Detektor korzystnie utworzony jest z równomolowej mieszaniny 4,4'-bis(tiofeno)-N-nonylodifenyloaminy, kwasu stearynowego i tyrozynazy.

Detektor według wynalazku zbudowany jest z ultracienkich filmów, deponowanych na podłoża stałe i nadaje się do wykrywania toksycznych pochodnych fenolu w środowiskach wodnych. Zaletą detektora jest jego bardzo duża czułość i fakt, że nadaje się do wykrywania różnych stężeń. Nie bez znaczenia jest również dość długa żywotność zimmobilizowanej tyrozynazy, która zachowuje swoją katalityczną aktywność w ciągu kolejnych 10 cykli reakcyjnych. Warstwa Langmuira-Blodgetta według wynalazku i powtarzalność otrzymanych wyników oraz różne odpowiedzi czujnika zbudowanego z bis(tiofeno)nonylodifenyloaminy, kwasu stearynowego i tyrozynazy na różne stężenia związków fenolowych, typują ten materiał do budowy czujników stosowanych w diagnostyce środowiskowej.

Przedmiot wynalazku jest wyjaśniony w przykładzie realizacji i na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat pracy detektora tyrozynazowego, fig. 2 -wykres zależności relatywnej aktywności białka unieruchomionego w filmie LB od czasu reakcji, fig. 3 - ilustruje aktywność białka zimmobilizowanego w filmie zbudowanym z dodatkiem pochodnej difenyloaminy, fig. 4 - aktywność białka zimmobilizowanego w filmie zbudowanym z dodatkiem pochodnej difenyloaminy i w obecności 4-TBC

PL 210 350 B1 i katecholu, jako substratów, a fig. 5 - wykres zależnoś ci aktywności tyrozynazy mierzonej jako zmiana absorbancji od czasu trwania immobilizacji białka.

P r z y k ł a d I

Detektor warstwowy zawiera tyrozynazę usieciowaną kowalencyjnie w filmach LangmuiraBlodgett, otrzymaną z równomolowej mieszaniny 4,4'-bis(tiofeno)-N-nonylodifenyloaminy, kwasu stearynowego i tyrozynazy sieciowanej za pomocą aldehydu glutarowego.

W celu zmierzenia aktywności zimmobilizowanej tyrozynazy, detektor tyrozynazowy T zbudowany jak wyżej, wprowadzono do próbki PR, zawierającej 8 mmoli 4-TBC - fe/f-butylokatecholu S, jako substratu, a następnie w reaktorach mieszalnikowych, o pojemności 25 ml prowadzono rekcję do momentu zmiany koloru próbki i otrzymania produktu. Proces i pomiar aktywności zimmobilizowanej tyrozynazy prowadzono w temperaturze 30°C, w 0.1 molowym buforze fosforanowym o pH 7.0. Zmianę absorbancji notowano przy użyciu spektrofotometru PRZ typu UNICAM HELIOS-α. Spektrofotometr UNICAM HELIOS-α w trakcie prowadzonego procesu zmieniał sygnał chemiczny na mierzalny sygnał optyczny SY. W trakcie prowadzonego procesu, pomiary absorpcyjne rejestrowano przy długości fali równej 400 nm.

Aktywność tyrozynazy zimmobilizowanej, przedstawiono na fig. 2 jako funkcję liczby jednostek aktywności U na 1/cm² otrzymanego filmu LB w czasie kolejnych reakcji. Za 1 U przyjęto taką ilość tyrozynazy, która w warunkach testu powoduje zmianę absorbancji o 0.0001 w ciągu jednej minuty. Omawiane badania nad aktywnością tyrozynazy wykonano przy zastosowaniu 4-TBC i fenolu jako substratów.

P r z y k ł a d II

W celu porównania aktywności tyrozynazy zimmobilizowanej w obecności 4-TBC jako substratu oraz 4-TBC i dodatkowego mediatora detektor tyrozynazowy T zbudowany jak w przykładzie pierwszym wprowadzono do próbki PR, zawierającej 8 mmoli 4-TBC - fe/f-butylokatecholu S, jako substratu, oraz 0.6 mmola katecholu jako dodatkowego mediatora. Reakcje prowadzono w reaktorach mieszalnikowych o pojemności 25 ml do momentu zmiany koloru próbki i otrzymania produktu P. Proces i pomiar aktywności zimmobilizowanej tyrozynazy prowadzono w temperaturze 30°C, w 0.1 molowym buforze fosforanowym o pH 7.0. Zmianę absorbancji notowano przy użyciu spektrofotometru PRZ typu UNICAM HELIOS-α. Spektrofotometr UNICAM HELIOS-α w trakcie prowadzonego procesu zmieniał sygnał chemiczny na mierzalny sygnał optyczny SY. W trakcie prowadzonego procesu, pomiary absorpcyjne rejestrowano przy długości fali równej 400 nm.

Porównanie aktywności tyrozynazy zimmobilizowanej w obecności 4-TBC jako substratu oraz 4-TBC i dodatkowego mediatora, przedstawiono na fig. 4. Za 1 U przyjęto taką ilość tyrozynazy, która w warunkach testu powoduje zmianę absorbancji o 0.0001 w ciągu jednej minuty. Omawiane badania nad aktywnością tyrozynazy były wykonywane przy zastosowaniu 4-TBC i katecholu jako substratów.

P r z y k ł a d III

Zmierzono aktywność dla trzech warstwowych układów detektorowych zawierających tyrozynazę usieciowaną kowalencyjnie w filmach Langmuira-Blodgett, otrzymanych z równomolowej mieszaniny 4,4'-bis(tiofeno)-N-nonylodifenyloaminy, kwasu stearynowego i tyrozynazy sieciowanej za pomocą aldehydu glutarowego, przy czym czas sieciowania dla pierwszego układu detektora wynosił 5 minut, dla drugiego wynosił 10 minut i dla trzeciego wynosił 20 minut. Każdy z trzech opisanych wyżej układów detektorowych tyrozynazy T wprowadzono do próbki PR, zawierającej 8 mmoli 4-TBC - fe/f-butylokatecholu S, jako substratu, a następnie w reaktorach mieszalnikowych, o pojemności 25 ml prowadzono rekcję do momentu zmiany koloru próbki i otrzymania produktu. Proces i pomiar aktywności zimmobilizowanej tyrozynazy prowadzono w temperaturze 30°C, w 0.1 molowym buforze fosforanowym o pH 7.0. Zmianę absorbancji notowano przy użyciu spektrofotometru PRZ typu UNICAM HELlOS-α. Spektrofotometr UNICAM HELlOS-α w trakcie prowadzonego procesu zmieniał sygnał chemiczny na mierzalny sygnał optyczny SY. W trakcie prowadzonego procesu, pomiary absorpcyjne rejestrowano przy długości fali równej 400 nm.

Aktywność tyrozynazy zimmobilizowanej w zależności od czasu sieciowania aldehydem glutarowym (GA), przedstawiono na fig. 5, jako funkcję liczby jednostek aktywności U na 1/cm² otrzymanego filmu LB w czasie kolejnych reakcji. Przy czym wynik dla pierwszego układu detektorowego oznaczono liczbą 1, dla drugiego - 2, a dla trzeciego - 3. Za 1 U przyjęto taką ilość tyrozynazy. która w warunkach testu powoduje zmianę absorbancji o 0.0001 w ciągu jednej minuty. Omawiane badania nad aktywnością tyrozynazy były wykonywane przy zastosowaniu 4-TBC i fenolu jako substratów.

PL 210 350 B1

W przedstawionym na fig. 3 wykresie uwidaczniającym porównanie aktywności danych jednoznacznie wynika, że wprowadzenie do filmu Langmuira-Blodgett, 4,4'-bis(tiofeno)-N-nonylodifenyloaminy powoduje wzrost aktywności zimmobilizowanej tyrozynazy o około 10%. Z przeprowadzonych badań wynika, że obecność pochodnej bis(tiofeno)difenyloaminy w filmach LB ze względu na mediacyjny charakter elektroprzewodzącego układu, usprawnia transport elektronów.

W przedstawionym na fig. 4, wykresie uwidaczniającym porównanie aktywności tyrozynazy z 4-TBC jako substratem oraz 4-TBC i katecholem jako dodatkowym mediatorem wynika, że modyfikacja powierzchni biosensora aldehydem glutarowym powoduje preferencyjne wiązanie białek. Natomiast wprowadzenie dodatkowego mediatora znacznie poprawia aktywność katalityczną unieruchomionego białka.

Zaobserwowano duże różnice w aktywności tyrozynazy pułapkowanej w filmie LB otrzymanym z dodatkiem lub bez pochodnej difenyloaminy. Efekt ten zwią zany jest z rolą 4,4'-bis(tiofeno)-N-nonylodifenyloaminy jako elektronowego mediatora procesu.

Zimmobilizowane białko wykazało dużą czułość na obecność fenolu oraz 4-TBC w roztworze wodnym, a jego aktywność zależy od czasu sieciowania, przy czym najlepsze rezultaty uzyskano dla immobilizacji prowadzonej w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Długość życia zimmobilizowanego białka według wynalazku wynosi co najmniej 2 miesiące. Stała, wysoka zdolność utleniania substratu zachowana jest przez kolejne 10 cykli reakcyjnych.

Aktywność białka zimmobilizowanego w filmie LB stanowi 2% aktywności użytego do immobilizacji białka natywnego.

Claims (2)

1. Detektor warstwowy, do wykrywania związków fenolowych, zawierający warstwę aktywną zimmobilizowaną w filmach Langmuira-Blodgett osadzoną na podłożu stałym, znamienny tym, że warstwę aktywną stanowi film Langmuira-Blodgetta zawierający usieciowaną tyrozynazę, otrzymany z mieszaniny 4,4'-bis(tiofeno)-N-nonylodifenyloaminy, kwasu stearynowego i tyrozynazy sieciowanej za pomocą aldehydu glutarowego, przy czym tyrozynaza sieciowana jest kowalencyjnie w filmie Langmuira-Blodgett.

2. Detektor według zastrz. 1, znamienny tym, że utworzony jest z równomolowej mieszaniny 4,4'-bis(tiofeno)-N-nonylodifenyloaminy, kwasu stearynowego i tyrozynazy.