PL209950B1 - Polimer wdrukowany molekularnie, sposób jego wytwarzania oraz chemiczny czujnik piezoelektryczny do oznaczania substancji biologicznie czynnych, zwłaszcza histaminy, dopaminy i adeniny - Google Patents
Polimer wdrukowany molekularnie, sposób jego wytwarzania oraz chemiczny czujnik piezoelektryczny do oznaczania substancji biologicznie czynnych, zwłaszcza histaminy, dopaminy i adeninyInfo
- Publication number
- PL209950B1 PL209950B1 PL386665A PL38666508A PL209950B1 PL 209950 B1 PL209950 B1 PL 209950B1 PL 386665 A PL386665 A PL 386665A PL 38666508 A PL38666508 A PL 38666508A PL 209950 B1 PL209950 B1 PL 209950B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- histamine
- mip
- layer
- structural formula
- dopamine
- Prior art date
Links
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 302
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 title claims description 155
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 78
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 title claims description 40
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 title claims description 28
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 28
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 title claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims description 18
- 229920000344 molecularly imprinted polymer Polymers 0.000 title claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 100
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 claims description 49
- 239000010453 quartz Substances 0.000 claims description 47
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 47
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 46
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 29
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 15
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 13
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 claims description 11
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 7
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- -1 platinum group metals Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 4
- XEZNGIUYQVAUSS-UHFFFAOYSA-N 18-crown-6 Chemical compound C1COCCOCCOCCOCCOCCO1 XEZNGIUYQVAUSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 3
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims description 2
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 claims description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 153
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 48
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 25
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 22
- 238000006056 electrooxidation reaction Methods 0.000 description 17
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 16
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 16
- APJYDQYYACXCRM-UHFFFAOYSA-N Tryptamine Natural products C1=CC=C2C(CCN)=CNC2=C1 APJYDQYYACXCRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 13
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 13
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 12
- 229910001914 chlorine tetroxide Inorganic materials 0.000 description 10
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 9
- 238000004833 X-ray photoelectron spectroscopy Methods 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 7
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 7
- BHHGXPLMPWCGHP-UHFFFAOYSA-N Phenethylamine Chemical compound NCCC1=CC=CC=C1 BHHGXPLMPWCGHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 6
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 5
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 5
- 238000001903 differential pulse voltammetry Methods 0.000 description 5
- 238000000157 electrochemical-induced impedance spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283891 Kobus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003380 quartz crystal microbalance Methods 0.000 description 4
- RFFLAFLAYFXFSW-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichlorobenzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1Cl RFFLAFLAYFXFSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000004070 electrodeposition Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241000252506 Characiformes Species 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000026 X-ray photoelectron spectrum Methods 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 150000000180 1,2-diols Chemical class 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012895 Gastric disease Diseases 0.000 description 1
- 102000000543 Histamine Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010002059 Histamine Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710106745 Histamine oxidase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000036848 Porzana carolina Species 0.000 description 1
- 241001098666 Pterois volitans Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 229940021013 electrolyte solution Drugs 0.000 description 1
- 238000009713 electroplating Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 235000013332 fish product Nutrition 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000003574 free electron Substances 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 208000008585 mastocytosis Diseases 0.000 description 1
- 108010036691 methylamine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002644 neurohormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 150000002829 nitrogen Chemical class 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003139 primary aliphatic amines Chemical group 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 108010061116 quinohemoprotein amine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 238000004154 testing of material Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest polimer wdrukowany molekularnie, w skrócie nazywany dalej MIP, o ogólnym wzorze strukturalnym 1, 2 lub 3, sposób wytwarzania tego polimeru oraz chemiczny czujnik piezoelektryczny do wykrywania i oznaczania substancji biologicznie czynnych, zwłaszcza histaminy, dopaminy i adeniny, zawierający warstwę tego polimeru. Polimer według wynalazku otrzymywany jest z dedykowanych monomerów, którymi są pochodne bis(bitiofenu) (wzór 4). Według wynalazku, czujnik składa się z warstwy tego MIP, stanowiącego jego element rozpoznający, korzystnie osadzonej elektrochemicznie na warstwie zaporowej, zwłaszcza z poli(bitiofenu). Z kolei warstwa zaporowa jest elektrochemicznie osadzona na elektrodzie, korzystnie platynowej, rezonatora kwarcowego, korzystnie cięcia AT, o poprzecznych drganiach ścinających objętościowej fali dźwiękowej. Rezonator ten jest przetwornikiem sygnału detekcji.
Histamina (wzór 5), dopamina (wzór 6), adenina (wzór 7), to jedne z najważniejszych amin biogenicznych w chemii klinicznej i chemii produktów spożywczych.1 Na przykład histamina wykazuje aktywność neurohormonalną, wywołując szereg reakcji alergicznych.2 Nieprawidłowe stężenie histaminy u ludzi jest powodem występowania szeregu objawów zaburzeń czynnościowych, takich jak zaburzenia żołądkowe, mastocytoza i przewlekła białaczka szpikowa.3 Niewłaściwe przechowywanie ryb lub produktów rybnych może sprawić, że histamina nagromadzi się w tkankach i krwi w stężeniu powyżej poziomu toksycznego.1
Podstawowym warunkiem rzetelnego oznaczania substancji biologicznie czynnych, w mieszaninie bez uprzedniego rozdzielania, jest selektywność. Odnosi się on zwłaszcza do oznaczeń za pomocą bio- i chemosensorów. Obecnie, substancje biologicznie czynne z grupy amin biogenicznych, zwłaszcza histaminę, oznacza się w sposób nieciągły za pomocą testów immunologicznych2 lub za pomocą HPLC z detekcją fluorescencyjną,4 UV-vis5, lub elektrochemiczną. Najbardziej niezawodne jest oznaczanie za pomocą GC-MS (chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas). Jednakże oznaczanie to jest żmudne i stosunkowo kosztowne (z uwagi na konieczność prowadzenia czasochłonnego rozdzielania), jak również, w przypadku detekcji fluorescencyjnej, wymaga zsyntetyzowania pochodnych poszczególnych substancji z grupy amin biogenicznych, zwłaszcza histaminy, dopaminy i adeniny, z odpowiednimi fluoroforami.7 Ponadto substancje biologicznie czynne z grupy amin biogenicznych, zwłaszcza histaminę, są wykrywane enzymatycznie przy użyciu biosensorów chronoamperometrycznych, w których stosowana jest oksydaza histaminowa,8 dehydrogenaza metyloaminowa9 lub dehydrogenaza chinohemoproteinowa amin.10 Biosensory te obciążone są istotnymi wadami wynikającymi z ich swoistości względem substratów. Co więcej, są podatne na zakłócenia oznaczeń spowodowane przez tlen cząsteczkowy.8-11
Wdrukowywanie molekularne to skuteczna metoda otrzymywania syntetycznych materiałów, zawłaszcza polimerowych, umożliwiających rozpoznawanie na poziomie cząsteczkowym.12 Polimery otrzymywane metodą wdrukowywania molekularnego umożliwiają tworzenie miejsc wiążących dopasowanych wielkością i kształtem do cząsteczki analitu, która w jednym z początkowych etapów wdrukowania molekularnego stosowana jest jako szablon. Warstwy MIP wykorzystuje się w chemosensorach jako elementy odpowiedzialne za rozpoznawanie. Jedną z najbardziej dogodnych metod otrzymywania tych warstw jest polimeryzacja elektrochemiczna. Jest to metoda, w której grubość, właściwości wysokoelastyczne, porowatość i morfologię przygotowanej warstwy MIP można łatwo kontrolować za pomocą odpowiednio dobranych warunków eksperymentalnych, takich jak wielkość przeniesionego ładunku, pH roztworu oraz rodzaj rozpuszczalnika, elektrolitu podstawowego, monomeru sieciującego i monomeru funkcyjnego. Ponadto, elektropolimeryzacja nie wymaga dalszej obróbki warstwy a po usunięciu szablonu warstwę tę można od razu zastosować do oznaczania analitu.
Dotychczas opracowano i wytworzono wiele chemosensorów, w których wykorzystano warstwy MIP.13 Do przetwarzania sygnału stosowane są w nich następujące techniki analityczne: techniki elektroanalityczne, spektroskopowe, akustyczne (tzn. piezoelektryczne, PZ) i inne. W grupie chemosensorów akustycznych MIP, wymaganą selektywność, czułość i wykrywalność można łatwo osiągnąć dzięki połączeniu wdrukowywania molekularnego i piezoelektrycznego przetwarzania sygnału detekcji. Rezonator PZ znakomicie się do tego nadaje z uwagi na bardzo niską, tj. na poziomie subnanogramowym, granicę wykrywalności (LOD).14 W wyniku tego sprzężenia sprawność chemosensora MIP-PZ pod względem wykrywalności, czułości i selektywności można zwiększać zarówno w obszarze wiązania analitu i rozpoznawania jak i przetwarzania sygnału detekcji.
PL 209 950 B1
W polimeryzacji elektrochemicznej stosowane są elektroaktywne monomery funkcyjne. Moż na je dogodnie poddawać polimeryzacji w warunkach galwanostatycznych, potencjostatycznych i woltamperometrycznych.15 Bis(bitiofen) to elektroaktywny monomer, który łatwo ulega elektrochemicznej polimeryzacji.16 Ponadto, stosunkowo łatwo można zsyntetyzować jego pochodne zawierające podstawniki o charakterze receptorów przy metanowym atomie węgla uzyskując w ten sposób szereg przydatnych monomerów funkcyjnych.
W pracach wł asnych zgł aszają cy opracował i zbadał dział anie akustycznego chemosensora do oznaczania substancji biologicznie czynnych z grupy amin biogenicznych, zwłaszcza histaminy, dopaminy i adeniny. W chemosensorze tym warstwa MIP służyła jako element odpowiedzialny za chemiczne rozpoznawanie histaminy, dopaminy lub adeniny a rezonator kwarcowy objętościowej fali akustycznej, pracujący w mikrowadze kwarcowej (ang. quartz crystal microbalance, QCM), jako przetwornik sygnału detekcji.
Okazało się, iż możliwe jest skonstruowanie chemosensora charakteryzującego się znacznie lepszą powtarzalnością oraz znaczną stabilnością, selektywnością, czułością i wykrywalnością od dotychczas stosowanych chemosensorów.
Nieoczekiwanie, ciiemosensor według wynalazku, w starannie dobranych warunkach, wykazuje bardzo niską dolną granicę detekcji amin biogenicznych, zwłaszcza histaminy, wynoszącą 5 nM. Wartość ta jest w dolnej granicy stężeń tych amin, występującej w organizmie ludzkim, tj. od 4,48 do 13,45 nM, np. w przypadku braku reakcji alergicznej, podczas wstrząsu anafilaktycznego stężenie histaminy jest znacznie wyższe.
Polimery wdrukowane molekularnie o ogólnych wzorach strukturalnych 1, 2 lub 3 przygotowane na drodze elektrochemicznej polimeryzacji pochodnych bis(bitiofenu), są kopolimerami dwóch monomerów funkcyjnych, monomeru o wzorze strukturalnym 8 i wzorze strukturalnym 9 z histaminą lub adeniną jako szablonem, lub monomerów o wzorze strukturalnym 9 i wzorze strukturalnym 10 z dopaminą jako szablonem.
Sposób wytwarzania polimeru wdrukowanego molekularnie, z wykorzystaniem pochodnych bis(bitiofenu) według wynalazku charakteryzuje się tym, że w obecności substancji biologicznie czynnej wybranej z grupy obejmującej aminy biogeniczne, zwłaszcza histaminy, dopaminy lub adeniny jako szablonu, przeprowadza się kopolimeryzację elektrochemiczną samouporządkowanych kompleksów dwóch monomerów funkcyjnych, korzystnie monomeru o wzorze strukturalnym 8 i wzorze strukturalnym 9 z histaminą lub adeniną jako szablonem, lub monomeru o wzorze strukturalnym 9 i wzorze strukturalnym 10 z dopaminą jako szablonem, po czym szablon usuwa się z warstwy MIP za pomocą roztworu alkalicznego.
W sposobie według wynalazku, korzystnie, najpierw, za pomocą elektropolimeryzacji przygotowuje się wewnętrzną warstwę zaporową poli(bitiofenu) na elektrodzie, korzystnie platynowej, rezonatora kwarcowego, a następnie na tej warstwie zaporowej osadza się warstwę MIP według wynalazku.
W sposobie według wynalazku, korzystnie, że warstwę zaporową i warstwę MIP osadza się na elektrodzie wykonanej z materiału wybranego z grupy obejmującej węgiel lub metale z grupy platynowców, korzystnie platynę.
Sposób postępowania, zastosowany w rozwiązaniu według wynalazku, obejmuje elektrochemiczną kopolimeryzację, w obecności szablonu histaminy, dopaminy lub adeniny, w warunkach woltamperometrii cyklicznej, elektroaktywnych monomerów funkcyjnych, którymi są pochodne bis(bitiofeno)metanu, o ogólnym wzorze strukturalnym 8, 9 lub 10.
Piezoelektryczny czujnik chemiczny do wykrywania i oznaczania substancji biologicznie czynnych wybranych z grupy obejmującej aminy biogeniczne, zwłaszcza histaminy, dopaminy lub adeniny, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że składa się z elementu rozpoznającego, którym jest warstwa polimeru wdrukowanego molekularnie, MIP, będąca kopolimerem dwóch pochodnych bis(bitiofeno)metanu, monomeru o wzorze strukturalnym 8 i wzorze strukturalnym 9 z histaminą lub adeniną jako szablonem, lub monomeru o wzorze strukturalnym 9 i wzorze strukturalnym 10 z dopaminą jako szablonem, osadzona na elektrodzie, oraz elementu przetwarzającego sygnał detekcji, którym jest rezonator kwarcowy, korzystnie cięcia AT, o poprzecznych drganiach ścinających objętościowej fali dźwiękowej.
Czujnik według wynalazku, charakteryzuje się tym, że ma wewnętrzną warstwę zaporową poli(bitiofenu) osadzoną na elektrodzie rezonatora kwarcowego, a na tej warstwie zaporowej osadzona jest warstwa MIP.
PL 209 950 B1
Czujnik według wynalazku charakteryzuje się tym, że wyposażony jest w elektrodę wykonaną z materiału wybranego z grupy obejmującej węgiel lub metale z grupy platynowców, korzystnie platynę.
Tworzenie selektywnych miejsc wiążących w MIP jest podstawowym warunkiem selektywności chemosensora. Przykładowo, histamina składa się z następujących ugrupowań: alifatycznej aminy pierwszorzędowej i heteroaromatycznego pierścienia imidazolowego (wzór 11). W zakresie pH od pKa1 = 6,14 do pKa2 = 9,85 histaminy pierwszorzędowa grupa aminowa jest sprotonowana (-NH3+). Ugrupowanie 18-korona-6, 9, w MIP stanowi miejsce rozpoznawania tej grupy (Wzór 12). Ponadto wolna para elektronowa atomu azotu w pierścieniu imidazolowym histaminy koordynuje nieobsadzony orbital atomu boru grupy dioksaborinanowej w tym zakresie pH. Bogata w elektrony cząsteczka histaminy tworzy wokół atomu boru, który charakteryzuje się niedoborem elektronów, środowisko zasadowe i przyczynia się do oddziaływań dioksaborinanu z niesprotonowanym atomem azotu pierścienia imidazolowego oraz obniża pH pracy chemosensora.17
W celu wyekstrahowania szablonu aminy biogenicznej z warstwy MIP stosowany jest roztwór mocnej zasady. W roztworze tym proton czwartorzędowej grupy aminowej histaminy, dopaminy i adeniny ulega oddysocjowaniu, dzięki czemu grupa ta pozostaje obojętna. Dlatego kompleks ugrupowania 18-korona-6 i grupy aminowej dysocjuje. Ponadto wiązanie koordynacyjne pomiędzy atomem azotu pierścienia imidazolowego histaminy i atomu boru ugrupowania dioksaborinanowego polimeru ulega zerwaniu wskutek tworzenia nowego wiązania (B-OH) pomiędzy atomem boru i grupą hydroksylową zastosowanego roztworu zasady.17 W ten sposób pozbawiona szablonu warstwa MIP jest gotowa do oznaczania analitu - histaminy, dopaminy lub adeniny. W badaniach Wnioskodawcy oznaczanie wykonano w warunkach przepływowej analizy wstrzykowej (ang. flow injection analysis, FIA) z detekcją za pomocą QCM przy użyciu nośnego roztworu buforowego o wartości pH dostosowanej do ponownego związania histaminy, dopaminy lub adeniny.
Aparatura, metody i postępowanie
Woltamperometria cykliczna (CV) i mikrograwimetria piezoelektryczna (PM)
Do przeprowadzenia doświadczeń za pomocą woltamperometrii cyklicznej (ang. cyclic voltammetry, CV) stosowano skomputeryzowany przyrząd elektrochemiczny AUTOLAB firmy EcoChemie (Utrecht, Holandia). Przyrząd ten był wyposażony w rozszerzającą kartę potencjostatu PGSTAT12 i sterowany za pomocą oprogramowania GPES 4.9 firmy EcoChemie. Zastosowano trójelektrodowe trójszyjne mininaczynko elektrochemiczne o kształcie litery M i objętości roztworu badanego poniżej 0,5 mL. Jako elektrodę pracującą, pomocniczą i odniesienia zastosowano, odpowiednio, dysk platynowy o średnicy 1 mm izolowany w szkle sodowym, zwinięty w spiralę drut platynowy i elektrodę Ag|AgCI (KCI nasyc).
W doświadczeniach przeprowadzonych za pomocą mikrograwimetrii piezoelektrycznej (PM), w warunkach stacjonarnych i przepł ywowych, zastosowano elektrochemiczną mikrowagę kwarcową , odpowiednio, modelu EQCM 5710 i EQCM 5610 produkcji Instytutu Chemii Fizycznej w Warszawie i oprogramowanie EQCM 5710-S2 tego samego producenta. Jako rezonator sensora zastosowano kryształ kwarcu (płasko-płaski, o cięciu AT i częstotliwości rezonansowej 10 MHz, o średnicy 14 mm), obustronnie pokryty warstwowymi elektrodami z napylanej platyny o średnicy 5 mm i grubości około 100 nm. Przed osadzaniem elektrolitycznym warstwy polimerowej, rezonatory oczyszczono przez 30 s roztworem „piranii (H2O2 : H2SO4; 1:3, v: v; uwaga: roztwór „pirania jest niebezpieczny w kontakcie ze skórą i oczami, ponieważ ulega gwałtownym reakcjom z większością związków organicznych). Zmiany częstotliwości rezonansowej mierzono z rozdzielczością 1 Hz. Zwinięty drut (EQCM 5710) lub pierścień (EQCM 5610) platynowy oraz drut srebrny pokryty AgCI (EQCM 5710) lub pierścień srebrny pokryty AgCI (EQCM 5610) zastosowano, odpowiednio, jako elektrodę pomocniczą i elektrodę pseudoodniesienia.
W celu przeprowadzenia elektropolimeryzacji, którą prowadzono jednocześnie za pomocą PM i CV w warunkach stacjonarnych, EQCM 5710 sprzężono z potencjostatem EP-20 produkcji Instytutu Chemii Fizycznej w Warszawie, zaś oprawkę rezonatora kwarcowego zamontowano poziomo, z elektrodą badaną rezonatora skierowaną do góry, aby objętość roztworu badanego próbki była możliwie jak najmniejsza, tj. 100 μΙ.
Spektroskopia w nadfiolecie i zakresie widzialnym (UV-vis)
Widma UV-vis rejestrowano z rozdzielczością 0,1 nm przy użyciu spektrofotometru UV 2501-PC firmy Shimadzu Corp. (Tokio, Japonia).
PL 209 950 B1
Rentgenowska spektroskopia fotoelektronów (XPS)
Widma XPS rejestrowano za pomocą spektrometru Escalab-210 firmy VG Scientific (East Greanstead, Wielka Brytania) stosując promieniowanie rentgenowskie Al. Ka (hv= 1486,6 eV). Ciśnienie w komorze spektrometru utrzymywano na poziomie ok. 5 x 10-9 mbar. Widma o wysokiej rozdzielczości rejestrowano przy energii przejścia analizatora 20 eV i skoku 0,1 eV dla widm poziomu powłoki N 1s. Oś analizatora była ustawiona prostopadle do powierzchni próbki. Do analizowania widm stosowano oprogramowanie Avantage Data System firmy Thermo Electron Corp. (East Greanstead, Wielka Brytania).
Przepływowa analiza wstrzykowa (FIA)
Rezonator kwarcowy z elektrodą platynową pokrytą warstwą MIP lub polimerem niewdrukowanym, NIP, (patrz poniżej w części „Wytwarzanie sensora) zamontowano w oprawce przepływowej EQCM 5610 w celu zbadania parametrów analitycznych chemosensora w warunkach FIA.18 Jako roztwór nośny zastosowano bufor HEPES (pH = 7,5) lub bufor fosforanowy (pH = 7), który pompowano przez oprawkę za pomocą pompy strzykawkowej model KDS100 firmy KD Scientific, Inc. (Holliston, Massachusetts, USA). Eksperymenty FIA przeprowadzono przy niskiej, tj. 35 μL/min, lub wysokiej, tj. 150 μL/min, szybkości przepływu. Próbki analitu rozpuszczonego w roztworze buforowym o objętości 100 μL lub 1 mL i o takim samym składzie jak roztwór nośny zastrzyknięto za pomocą sześciopozycyjnego zaworu obrotowego, model 77251 firmy Rheodyne, (Cotati, Kalifornia, USA).
Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku, nie ograniczające jego zakresu.
P r z y k ł a d I
Wytwarzanie sensora
Warstwę odpowiedzialną za rozpoznawanie analitu przez chemosensor zbudowano z dwóch warstw. Osadzono je metodą elektropolimeryzacji w warunkach CV jedna na drugiej.
Pierwszą warstwę, wewnętrzną, stanowiła warstwa zaporowa poli(bitiofenu). Została ona osadzona za pomocą cyklicznych zmian potencjału z szybkością 50 mV/s w zakresie od 0,5 do 1,5 V z roztworu bitiofenu o stężeniu 1 mM i 0,05 M (TBA)CIO4 w acetonitrylu lub 1,2-dichlorobenzenie. Wzrost polimeru kontrolowano za pomocą liczby cykli CV. Po zakończeniu cyklicznych zmian potencjału polimer przemyto acetonitrylem w celu usunięcia nadmiaru elektrolitu podstawowego.
Grubość warstwy zaporowej oszacowano na podstawie krzywych zmian częstotliwości względem potencjału zarejestrowanych podczas osadzania elektrolitycznego. Przy pełnym pokryciu elektrody monowarstwą bitiofenu, jego stężenie powierzchniowe osiąga wartość niemal 3,8 x 10-11 mol/m2, czyli 6,38 ng, przy założeniu, że cząsteczka bitiofenu ma średnicę 0,89 nm. Masę osadzonej warstwy zaporowej poli(bitiofenu) określono na podstawie zmian częstotliwości rezonansowej w trakcie osadzania elektrolitycznego warstwy, na podstawie równania Sauerbreya. Całkowitą liczbę osadzonych warstw określono dzieląc tę wartość przez masę pojedynczej warstwy bitiofenu. Grubość warstwy poli(bitiofenu) oszacowano na podstawie grubości pojedynczej warstwy (przyjęto wartość 0,89 nm) i pomnożono przez liczbę monowarstw.
Warstwa MIP stanowiła warstwę drugą, zewnętrzną. Tę warstwę otrzymano na drodze elektropolimeryzacji związków o wzorze 8 i 9 i histaminy w stosunku molowym 2:2:1, natomiast związków o wzorze 9 i 10 i dopaminy oraz związków o wzorze 8 i 9 i adeniny w stosunku molowym 1:1:1, w 0,1 M (TBA)CIO4 i TFA w acetonitrylu. Po zakończeniu elektropolimeryzacji warstwę MIP przemyto acetonitrylem w celu usunięcia elektrolitu podstawowego. Następnie szablon histaminy lub dopaminy wyekstrahowano przez zanurzenie warstwy MIP w 0,01 M NaOH na 12 godzin. Brak histaminy lub dopaminy w polimerze po ekstrakcji potwierdzono za pomocą spektroskopii UV-vis i pomiarów XPS. NIP - stosowany jako polimer kontrolny - otrzymano w nieobecności histaminy, dopaminy lub adeniny za pomocą tej samej procedury.
P r z y k ł a d II
Najpierw warstwę zaporową poli(bitiofenu) poddano elektropolimeryzacji na elektrodzie platynowej rezonatora kwarcowego. Następnie warstwę MIP z szablonem osadzono na powierzchni warstwy zaporowej przez kopolimeryzację elektrochemiczną samouporządkowanego kompleksu, odpowiednio, histaminy lub adeniny z monomerami funkcyjnymi związków o wzorze 8 i 9, dopaminy z monomerami funkcyjnymi związków o wzorze 9 i 10. Wreszcie szablon wyekstrahowano z warstwy MIP za pomocą roztworu NaOH. Obecność lub brak szablonu histaminy, dopaminy lub adeniny w warstwie MIP potwierdzono za pomocą spektroskopii UV-vis i rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronów. Następnie oznaczano histaminę, dopaminę i adeninę jako analit, zaś parametry analityczne chemosensora scharakteryzowano dla warstwy MIP, bez szablonu, w warunkach FIA z detekcją PM.
PL 209 950 B1
P r z y k ł a d III
Polimeryzacja elektrochemiczna i określenie właściwości warstw MIP i NIP
Na woltamperogramie cyklicznym pierwszego cyklu dla histaminy, zarejestrowanym na platynowej elektrodzie dyskowej (krzywa 1 na Fig. 1), pik anodowy przy około 0,80 V odpowiada nieodwracalnemu elektroutlenianiu histaminy.19, 20 Wielkość tego piku malała w kolejnych cyklach (nie pokazano) w miarę jak produkty reakcji ulegały adsorpcji na powierzchni elektrody, co powodowało jej zanie20 czyszczenie i blokowanie. 20
Na Fig. 2a pokazano krzywą CV pierwszego cyklu wdrukowywania histaminy przez kopolimeryzację elektrochemiczną związków 8 i 9 w 0,1 M (TBA)CIO4, 8,64 nM TFA, w acetonitrylu (pH = 8,0), w obecnoś ci szablonu histaminy na elektrodzie platynowej rezonatora kwarcowego. Pik anodowy przy około 0,80 V oraz szeroki i słabo wykształcony garb na wykresie zależności natężenia prądu od potencjału przy około 1,30 V - oba zmniejszające się w kolejnych cyklach (nie pokazano) - odpowiadają, odpowiednio, elektroutlenianiu histaminy i elektropolimeryzacji monomerów. Wzrost warstwy MIP został potwierdzony za pomocą jednocześnie zarejestrowanemu odpowiedniemu spadkowi częstotliwości (Fig. 2b). Histamina ulega elektroutlenianiu przy potencjale niższym niż potencjał konieczny do elektropolimeryzacji, dlatego mogła nie być dostępna do wdrukowywania w oryginalnej postaci w otoczeniu elektrody. W związku z tym przestrzenie wdrukowane w polimerze nie muszą koniecznie odpowiadać szablonowi histaminy, a równie dobrze mogą odpowiadać produktom jej elektroutlenienia. Brak wyraźnego przesunięcia rejestrowanych jednocześnie zmian rezystancji dynamicznej przy przemiataniu potencjału wskazuje (Fig. 2c), że właściwości wiskoelastyczne warstwy MIP nie zmieniają się.
W celu udoskonalenia wdrukowywania należ y wyeliminować elektroutlenianie szablonu histaminy, aby zapobiec jej zużywaniu w procesie elektrodowym i zanieczyszczeniu elektrody przez produkty tego utlenienia. Najbardziej pożądane byłoby uniemożliwienie histaminie dostępu do powierzchni elektrody. W tym celu zastosowano przewodzącą warstwę z poli(bitiofenu), o zoptymalizowanej grubości, służącą jako bariera dla dyfuzji histaminy do powierzchni elektrody i jej elektroutleniania. Krzywa 2 na Fig. 1 przedstawia odpowiedź CV dla histaminy na platynowej elektrodzie dyskowej pokrytej warstwą poli(bitiofenu). W tym przypadku pik anodowy odpowiadający elektroutlenianiu histaminy niemal zanikł, co wskazuje na skuteczne blokowanie dyfuzji histaminy przez ten film. W związku z tym warstwę MIP z histaminą, dopaminą lub adeniną jako szablonem osadzono w kolejnych eksperymentach na powierzchni takiej warstwy zaporowej przez kopolimeryzację elektrochemiczną kompleksu wybranego szablonu z odpowiednimi monomerami funkcyjnymi. Co charakterystyczne, pik anodowy przy około 1,30 V (Fig. 3a) wskazuje na elektropolimeryzację i skuteczne wdrukowywanie histaminy, potwierdzone przez znaczny spadek częstotliwości (Fig. 3b) odpowiadający osadzaniu warstwy MIP naładowanej histaminą. Początkowy spadek przy około 1,0 V, po którym zmiana rezystancji dynamicznej wzrasta ze wzrostem potencjału anodowego (Fig. 3c) przy około 1,20 V, wynika najprawdopodobniej z wyjścia kationów i wejścia anionów elektrolitu podstawowego, wskazując na zmianę wiskoelastyczności warstwy MIP.
Na Fig. 4 przedstawiono zmiany prądu, częstotliwości rezonansowej i rezystancji dynamicznej towarzyszące otrzymywaniu kontrolnej warstwy NIP za pomocą polimeryzacji elektrochemicznej 8 i 9 w nieobecnoś ci histaminy. W tym przypadku pik anodowy przy okoł o 1,15 V, który wzrasta w kolejnych cyklach, wskazuje na to, że elektropolimeryzacja (Fig. 4a) przebiega gwałtownie. Co więcej, zmiana częstotliwości rezonansowej jednocześnie znacznie maleje (Fig. 4b). Osadzanie elektrolityczne prowadzi do zmian właściwości wiskoelastycznych warstwy NIP, na co wskazują przesunięcia zmiany rezystancji dynamicznej (Fig. 4c) wskutek wbudowywania i usuwania jonów elektrolitu podstawowego. Ponadto, w celach porównawczych, kontrolną warstwę NIP przygotowano za pomocą elektropolimeryzacji na powierzchni elektrody platynowej pokrytej warstwą zaporową poli(bitiofenu) w nieobecności szablonu histaminy (nie pokazano).
Na Fig. 5 pokazano krzywą CV pierwszego cyklu wdrukowywania dopaminy przez kopolimeryzację elektrochemiczną związków 9 i 10 w 0,1 M (TBA)CIO4, 86,4 nM TFA, w acetonitrylu (pH = 7,0), w obecnoś ci szablonu dopaminy na elektrodzie platynowej rezonatora kwarcowego.
P r z y k ł a d IV
Wpływ grubości warstwy zaporowej poli(bitiofenu) na właściwości warstwy MIP
Warstwa zaporowa, oddzielająca warstwę MIP od powierzchni elektrody, powinna skutecznie blokować elektroutlenianie histaminy. W tym celu powinna być ona wystarczająco gruba. Dlatego przeprowadzono systematyczne badania jednoczesnych zmian CV, PM i rezystancji dynamicznej względem potencjału wdrukowywania histaminy do warstwy polimeru elektroosadzonej na warstwie
PL 209 950 B1 zaporowej poli(bitiofenu) o różnej grubości. Na przykład dla warstwy poli(bitiofenu) o grubości 90 nm woltamperogram pierwszego cyklu zawiera dwa szerokie, obłe piki anodowe przy około 0,80 i 1,0 V oraz jeden dobrze wykształcony pik przy około 1,30 V (Fig. 6a). Pierwszy pik jest charakterystyczny dla elektroutleniania histaminy. Oznacza to, że warstwa zaporowa ma niewystarczającą grubość, aby skutecznie blokować elektroutlenianie histaminy. Okazuje się, że przy takiej grubości warstwy dwa różne procesy elektrochemiczne, tj. elektroutlenianie histaminy i kopolimeryzacja elektrochemiczna monomerów 8 i 9, zachodzą jednocześnie. Procesy te łatwo zaobserwować na krzywych zmian częstotliwości względem potencjału (Fig. 6b). Pierwszy spadek częstotliwości przy około 0,80 V wynika z elektroutleniania histaminy, zaś drugi przy okoł o 1,30 V - z elektropolimeryzacji. Jednakże, pomimo tego że drugi spadek wynosi aż 500 Hz, wdrukowywanie histaminy nie jest skuteczne. Bierze się to stąd, że natężenie prądu CV spada w kolejnych cyklach (nie pokazano). Oznacza to, że elektroutlenianie szablonu histaminy przed utworzeniem MIP prowadzi do zanieczyszczenia powierzchni elektrody przez produkty tego utleniania. Ponadto, brak histaminy w jej oryginalnej postaci w trakcie elektropolimeryzacji prowadzi do niezadowalającego jej wdrukowania. W związku z tym wdrukowywanie można poprawić stosując większą grubość zaporowej warstwy poli(bitiofenu), aby uniemożliwić elektroutlenianie histaminy. Fig. 3 przedstawia otrzymywanie MIP na powierzchni warstwy poli(bitiofenu) o gruboś ci okoł o 200 nm. W tym przypadku brak piku anodowego przy około 0,80 V dowodzi, ż e elektroutlenianie histaminy zostało wyeliminowane. Wyraźny pik anodowy przy około 1,30 V odpowiadający elektropolimeryzacji monomerów potwierdza, że wdrukowywanie jest bardzo skuteczne. Jednoczesny wyraźny spadek częstotliwości, wynoszący około 3,5 kHz (Fig. 3b), potwierdza osadzenie warstwy MIP naładowanej histaminą. Przedstawiona poniżej dyskusja dotyczy działania chemosensorów, w których elektrody platynowe rezonatorów kwarcowych są pokryte warstwami MIP w obecności i nieobecności warstwy zaporowej poli(bitiofenu) o grubości 200 nm.
P r z y k ł a d V
Ekstrakcja szablonu histaminy z warstwy MIP
Po zakończeniu elektropolimeryzacji, warstwę MIP najpierw przemyto dokładnie acetonitrylem w celu usunięcia substancji, które uległy na niej adsorpcji fizycznej. Na podstawie krzywych zmian częstotliwości względem potencjału zarejestrowanych w trakcie elektroosadzania warstwy i przy założeniu, że gęstość poli(bitiofenu) wynosi 1,1 g/cm3,21 objętość warstwy MIP oszacowano na 0,482 nL. Szablon histaminy usunięto z MIP przez ekstrakcję za pomocą roztworu NaOH. Na podstawie uzyskanego spadku masy określono stężenie wnęk molekularnych w MIP dostępnych dla analitu - histaminy. Korzystnie, stężenie to miało wysoką wartość równą około 3,6 M. Brak szablonu w warstwie MIR po ekstrakcji potwierdzono za pomocą pomiarów spektroskopowych XPS i UV-vis przed i po ekstrakcji.
W pomiarach metodą XPS energię wiązania azotu N 1s wykorzystano jako wartość odniesienia przy określaniu obecności histaminy we wdrukowanych wnękach molekularnych warstwy MIP. Profil energii wiązania dla warstwy MIP przed i po ekstrakcji histaminy przedstawiono, odpowiednio, na Fig. 7a i Fig. 7b. Złożone pasmo przy około 400,3 eV odpowiada poszczególnym atomom azotu w cząsteczce histaminy. Po rozłożeniu na składowe, widmo wykazuje pasma przy 402,5, 403,1 i 404,6 eV odpowiadające, odpowiednio, protonowanemu atomowi azotu ugrupowania pierwszorzędowej aminy alifatycznej (-NH3+) oraz uwodornionemu (-NH-) i nieuwodornionemu (-N=) atomowi azotu w ugrupowaniu imidazolowym histaminy (Fig. 7a).22 Pasmo odpowiadające nieuwodornionemu (-N=) atomowi azotu jest przesunięte w kierunku wyższych energii wiązania względem energii opisywanych w literaturze.22 Przesunięcie to może wynikać z oddziaływania -N= z atomem boru ugrupowania dioksaborinanowego w MIP. Pasmo przy 405,5 eV odpowiada atomowi azotu czwartorzędowego kationu amoniowego (TBA+)23 elektrolitu podstawowego zamkniętego w ilościach śladowych w warstwie MIP w trakcie jej elektroosadzania. Po dokładnym przemyciu za pomocą roztworu NaOH, widmo XPS warstwy MIP wykazuje bardzo słabe pasmo przy 400,5 eV, które przypisano atomowi azotu rozpuszczalnika - acetonitrylu24 (Fig. 7b). Brak pasm odpowiadających histaminowym atomom azotu w widmie po ekstrakcji histaminy przemawia za tym, ze została ona całkowicie usunięta z warstwy MIP.
W pomiarach spektroskopowych UV-vis (Fig. 8), szablon histaminy usuwano z MIP przez umieszczenie jej w 0,01 M NaOH na 12 godzin; w ekstrakcie wykryto histaminę. To znaczy, w widmie UV-vis roztworu po przemyciu warstwy roztworem NaOH (Krzywa 2 na Fig. 8) występuje pasmo przy około 217 nm odpowiadające histaminie (Krzywa 1 na Fig. 8). Po pięciokrotnym przemyciu warstwy MIP za pomocą 0,01 M NaOH, dla tego roztworu NaOH nie zaobserwowano pasma charakterystycznego dla histaminy (Krzywa 3 na Fig. 8), co wskazuje na całkowite usunięcie histaminy z warstwy.
PL 209 950 B1
W celu usunię cia ewentualnych zaadsorbowanych zanieczyszczeń lub rozpuszczalnika, wolną od szablonu warstwę MIP przemyto wodą przed dalszymi pomiarami.
P r z y k ł a d VI
Charakterystyka elektrochemiczna rezonatorowych przetworników sygnału pokrytych warstwą MIP
Warstwę MIP scharakteryzowano elektrochemicznie stosując układ testujący redox Fe(CN)6-3/Fe(CN)64 w celu określenia cech morfologicznych warstwy. Krzywe woltamperometrii pulsowej różniczkowej (ang. differential pulse voltammetry, DPV) dla 1 mM K4Fe(CN)6 w 0,1 M NaCI na elektrodzie platynowej rezonatora kwarcowego niepokrytej lub pokrytej warstwą MIP przedstawiono na Fig. 9. W tym drugim przypadku warstwę zaporową poli(bitiofenu) o grubości 200 nm elektroosadzono na elektrodzie platynowej rezonatora kwarcowego przed elektroosadzeniem warstwy MIP. W przypadku niepokrytej elektrody platynowej rezonatora kwarcowego, dobrze wykształcony pik DPV dla układu Fe(CN)6-3/Fe(CN)6-4 (Krzywa 1 na Fig. 9) wskazuje na niewyhamowane przeniesienie elektronu. Jednakże, pik ten jest znacznie mniejszy w przypadku elektrody platynowej rezonatora kwarcowego pokrytej warstwą MIP zawierającą szablon histaminy (Krzywa 2 na Fig. 9). Okazuje się, że warstwa MIP zawierająca szablon skutecznie blokuje powierzchnię elektrody. Krzywa 3 na Fig. 9 przedstawia woltamperogram DPV dla elektrody platynowej rezonatora kwarcowego pokrytej warstwą MIP po dokładnej ekstrakcji histaminy za pomocą 0,01 M NaOH. W tych warunkach pik DPV jest stosunkowo większy w porównaniu do piku na Krzywej 2, co oznaczałoby, że w ten sposób niektóre kanały zostały otwarte i możliwa była dyfuzja analitu w obrębie warstwy MIP. Najprawdopodobniej ekstrakcja szablonu opróżnia wdrukowane histaminą luki molekularne. W ten sposób substancja testująca redoks ma ułatwioną możliwość poruszania się w przestrzeni MIP.
Parametry impedancji warstw MIP oszacowano za pomocą elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS). Wstawka na Fig. 9 przedstawia wykres płaszczyzny zespolonej impedancji dla elektrody platynowej rezonatora kwarcowego pokrytej warstwą MIP w 1 mM K4Fe(CN)6, w 0,1 M NaCI. Krzywa 1' we wstawce przedstawia zależność części urojonej od rzeczywistej impedancji dla niepokrytej elektrody platynowej rezonatora kwarcowego. Otrzymana prosta o nachyleniu n/4 wskazuje, że proces przeniesienia elektronu nie jest hamowany; jest on kontrolowany wyłącznie szybkością dyfuzji substancji redoks, Fe(CN)64-. W przeciwieństwie do tego, wykres dla elektrody pokrytej warstwą MIP nasyconą histaminą (Krzywa 2' we Wstawce do Fig. 9) zawiera łuk i prostą, odpowiednio, w zakresie wysokich i niskich częstotliwości. Średnica tego łuku zwiększa się wraz ze wzrostem rezystancji.25 W zwią zku z tym oporność przeniesienia ł adunku w przypadku elektrody platynowej rezonatora kwarcowego pokrytej warstwą MIP z histaminą jest znacznie wyższa niż oporność elektrody niepokrytej. Im większy współczynnik nachylenia prostej, tym mniejsza jest porowatość elektrody.26 Na tak zmodyfikowanej elektrodzie proces elektrodowy Fe(CN)63-/Fe(CN)64- jest zablokowany w zakresie wysokich częstotliwości - prawdopodobnie wskutek obecności warstwy MIP blokującej dyfuzję substancji testującej. Krzywa 3' we wstawce do Fig. 8 przedstawia wykres na płaszczyźnie zespolonej impedancji dla elektrody platynowej rezonatora kwarcowego pokrytej warstwą MIP, z której wyekstrahowano szablon. Krzywa 3' przypomina Krzywą 2', jednak średnica łuku w zakresie wysokich częstotliwości jest znacznie mniejsza niż w przypadku Krzywej 2', co wskazuje na niższą oporność przeniesienia ładunku w przypadku elektrody pokrytej warstwą. Ponadto, nachylenie prostej jest mniejsze niż w przypadku Krzywej 3'. Świadczy to o tym, że po usunięciu szablonu porowatość warstwy MIP jest większa. Jak widać, usunięcie szablonu opróżnia wytworzone w wyniku wdrukowania luki molekularne ułatwiając w ten sposób dyfuzję substancji redoks poprzez warstwę MIP do powierzchni elektrody. Tym samym blokowanie przeniesienia elektronu jest mniejsze.
P r z y k ł a d VII
Parametry analityczne chemosensora MIP/QCM do oznaczania histaminy.
Oddziaływania analitu (histaminy) z miejscami wiążącymi warstwy MIP pokrywającej elektrodę platynową rezonatora kwarcowego badano w warunkach FIA. Oddziaływania te wynikają głównie z komplementarności kształtu cząsteczki histaminy i wdrukowanych luk molekularnych w MIP z jednej strony i oddziaływaniem elektrostatycznym pomiędzy histaminą a miejscami wiążącymi w MIP z drugiej. Aby zapewnić skuteczne oddziaływania analitu z MIP, miejsca wiążące w cząsteczce histaminy powinny być dostępne. Oznacza to, że atom azotu ugrupowania imidazolowego nie powinien być uwodorniony, zaś pierwszorzędowa grupa aminowa ugrupowania aminy alifatycznej powinna być sprotonowana. W związku z tym kwasowość roztworu w znacznym stopniu wpływa na sprawność chemosensora odgrywając kluczową rolę zwłaszcza w etapie wdrukowywania, ekstrahowania i oznaPL 209 950 B1 czania histaminy. Dlatego też w pierwszym i trzecim etapie należy ją utrzymywać w zakresie pKa1 < pH < pKa2 (wzór 12). Z tego powodu histaminę oznaczano przy pH = 7,5 stosując 0,5 M bufor HEPES jako roztwór nośny. Kiedy roztwór nośny przepływa nad warstwą MIP, oddziaływania pomiędzy analitem (histaminą) a miejscami wiążącymi w MIP prowadzą do zwiększenia masy tej warstwy. Prowadzi to do spadku częstotliwości rezonansowej.
Odpowiedź chemosensora w warunkach FIA, w postaci zmian częstotliwości względem czasu, na kolejne zastrzyki FIA roztworu histaminy dla osadzonej warstwy MIP w nieobecności i obecności warstwy zaporowej poli(bitiofenu) o grubości 200 nm przedstawiają, odpowiednio. Fig, 10a i Fig. 10b. Po wstrzyknięciu histaminy częstotliwość najpierw gwałtownie spada (Wstawka (i) do Fig. 10b) wskutek oddziaływania histaminy z miejscami wiążącymi MIP. Czas odpowiedzi, to znaczy czas, po którym sygnał osiąga 90% wartości maksymalnej, jest bardzo krótki: T90% = 18 s (Wstawka (i) do Fig. 10b). Następnie sygnał stosunkowo szybko powraca do wartości początkowej, w miarę jak histamina jest wymywana z MIP za pomocą nadmiaru roztworu nośnego. Dlatego czas regeneracji jest również bardzo krótki i wynosi około 60 s. Co więcej, jest bardzo korzystne, że wiązanie histaminy jest wysoce odwracalne. Ogólnie rzecz ujmując, siła oddziaływań i wielkość oporów przeniesienia masy w MIP wpływa zarówno na czas oddziaływań, jak i regenerację warstwy. Im wyższe jest stężenie histaminy, tym wyższy jest pik ujemnej zmiany częstotliwości. Co ważne, piki są lepiej wykształcone i wyższa jest czułość oznaczeń w obecności warstwy zaporowej poli(bitiofenu) o grubości 200 nm niż w jej nieobecności (Wstawka (ii) do Fig. 10b).
Początkowe części wykresów zależności częstotliwości od czasu, odpowiadające wnikaniu analitu do MIP, wykorzystano do określenia stałych trwałości kompleksów MIP i analitu (patrz poniżej w punkcie „Selektywność).
P r z y k ł a d VIII
Czułość i wykrywalność czujnika
Krzywe kalibracyjne oznaczania histaminy (Wstawka (ii) do Fig. 10b) sporządzono na podstawie pików FIA. Dla szybkości przepływu 150 μL/min i objętości zastrzykiwanego roztworu próbki 100 wartości czułości obliczone z nachylenia krzywych kalibracyjnych przedstawiono w tabeli 1. Jest istotne, że czułość chemosensora zawierającego warstwę zaporową poli(bitiofenu) o grubości 200 nm (Prosta 1 we Wstawce (ii) do Fig. 10b) jest ponad dwukrotnie wyższa niż chemosensora nie zawierającego tej warstwy (Wstawka do Fig. 10a). Liniowy zakres stężeniowy zawiera się w zakresie od 10 do 100 mM. Jest istotne, że czułość chemosensora zawierającego kontrolną warstwę NIP, którą za pomocą elektropolimeryzacji osadzono na powierzchni warstwy zaporowej poli(bitiofenu) o grubości 200 nm, była ponad czterokrotnie niższa (Tabela 1). Okazuje się, że obecność miejsc wiążących histaminę w polimerze ma decydujące znaczenie dla oznaczania tego analitu, co potwierdza wpływ wdrukowywania na czułość tego chemosensora.
Wykrywalność chemosensora wyznaczono w starannie dobranych warunkach w innej serii eksperymentów wykonanych za pomocą FIA. Utrzymywano w nich szybkość przepływu wolnego (35 μL/min), zaś objętość próbki była duża - 1 mL (Prosta 2 we Wstawce (ii) do Fig. 10b). Wyznaczona granica wykrywalności względem stężenia histaminy wynosiła 5 nM przy stosunku sygnału do szumu wynoszącym 3.
Grubość warstwy zaporowej odgrywa kluczową rolę w etapach wdrukowywania i oznaczania histaminy. Na przykład, w przypadku warstwy zaporowej poli(bitiofenu) o mniejszej grubości (90 nm) czułość chemosensora zawierającego MIP lub NIP jest podobna (Fig. 11), co świadczy o tym, że wdrukowywanie jest niepełne lub słabo określone. Okazuje się, że tak cienka warstwa zaporowa poli(bitiofenu) nie wystarcza, aby zapobiec elektroutlenianiu histaminy przed wdrukowaniem. Zamiast tego, wdrukowaniu ulegają produkty elektroutleniania histaminy, najprawdopodobniej tworząc miejsca wiążące, które są niezdolne do skutecznego oddziaływania z histaminą.
P r z y k ł a d IX
Selektywność czujnika
W celu określenia selektywności warstwy MIP wdrukowanej histaminą porównano reaktywność w odniesieniu do podobnych pod względem funkcji lub struktury substancji przeszkadzających - tryptaminy (wzór 13), dopaminy i imidazolu. Odpowiednie krzywe kalibracyjne FIA zależności zmian częstotliwości względem stężenia wstrzykiwanego związku przedstawiono na Fig. 12. Najwyższą czułość uzyskano w przypadku histaminy (Tabela 1). Była ona dwukrotnie wyższa niż dla dopaminy i tryptaminy, co potwierdza selektywność chemosensora względem typowych substancji przeszkadzających. Okazuje się, że trwałość odpowiednich kompleksów MIP i analitu (A) na Schemacie 1 zmniejsza się
PL 209 950 B1 w takiej samej kolejnoś ci (patrz niżej). Oddział ywania imidazolu z MIP, wdrukowanym za pomocą histaminy, wykazują nasycenie przy stężeniu imidazolu około 50 mM - prawdopodobnie wskutek niedopasowania miejsc wiążących MIP do cząsteczki imidazolu.
W celu okreś lenia selektywnoś ci warstwy MIP wdrukowanej dopaminą porównano reaktywność w odniesieniu do podobnych pod względem funkcji lub struktury substancji przeszkadzających - histaminy i 2-fenyloetyloaminy (wzór 14). Odpowiednie krzywe kalibracyjne FIA zależności zmian częstotliwości względem stężenia wstrzykiwanego związku przedstawiono na Fig. 13.
Warstwa MIP tworzy kompleks z analitem wykazując znaczne powinowactwo. Wskutek tego wzrasta masa warstwy i w związku z tym mierzona częstotliwość rezonansowa jest mniejsza. W ramach badań selektywności wyznaczono wartości stałych trwałości, Ks, kompleksów MIP z analitem (MIP-A) lub substancją przeszkadzającą. Szybkość powstawania i rozpadu kompleksu MIP-A opisuje, odpowiednio, stała szybkości asocjacji, ka, i dysocjacji, kd.27 Tę równowagę kompleksowania opisuje schemat 1.
Schemat 1.
Szybkość tworzenia kompleksu MIP-A można przedstawić za pomocą zmierzonych zmian częstotliwości i stężenia nastrzykiwanego analitu, CA, d[MIP-A]/dt = -df/dt = ka CA (fmax -f)-kdf (2) gdzie fmax to maksymalne przesunięcie częstotliwości rezonansowej dla zastrzyku analitu przy danym stężeniu. Przez całkowanie równania (2) względem czasu, a następnie podstawienie feq = ka CA fmax/(ka CA + kd) (3) oraz kobs = ka CA + kd (4) otrzymuje się równanie (5).
feq = fmax [1 - exp(-kobs t] (5)
Ks = ka/kd (6)
Przesunięcia eksperymentalnych zmian częstotliwości w czasie dopasowano do kinetycznego Równania (3). Na podstawie parametrów dopasowania wyznaczono kobs. W niniejszej analizie wykorzystano początkową zmianę częstotliwości rezonansowej, rejestrowaną natychmiast po wstrzyknięciu analitu. W celu wyeliminowania dyspersji sygnału wywołanej przez układ FIA przeprowadzono chronoamperometryczne eksperymenty kontrolne, w warunkach FIA, wykorzystując niepokrytą elektrodę platynową rezonatora kwarcowego oraz układ elektroaktywny Fe(CN)63-/Fe(CN)64-. Znormalizowane krzywe chronoamperometryczne dla tego układu testującego odjęto od znormalizowanych krzywych zależności zmian częstotliwości rezonansowej od czasu zarejestrowanych dla oddziaływań wstrzykniętego analitu z elektrodą platynową rezonatora kwarcowego pokrytą warstwą MIP. Fig. 14 przedstawia skorygowane krzywe początkowych zmian częstotliwości rezonansowej w czasie dla zastrzyków próbek histaminy o różnym stężeniu. Na podstawie stosunku nachylenia i punktu przecięcia z osią rzędnych, wyznaczonego z wykresu liniowej zależności kobs od stężenia histaminy (Wstawka do Fig. 14), obliczono stałą trwałości Ks kompleksu MIP z histaminą za pomocą Równania (6) (Tabela 2). Wyznaczona wartość a; jest, odpowiednio, 7i 5-krotnie wyższa niż wartość stałej trwałości wyznaczona dla kompleksu MlP-tryptamina i MlP-dopamina (Tabela 2). Niewątpliwie oddziaływania analitu (histaminy) z miejscami wiążącymi w MIP, komplementarnymi względem cząsteczki histaminy, są silniejsze niż w przypadku funkcjonalnie lub strukturalnie podobnych substancji przeszkadzających.
Jak wynika z powyższych przykładów, potwierdzono przydatność warstwy MIP, wykorzystanej jako element odpowiedzialny za rozpoznanie, w połączeniu z kwarcowym rezonatorem objętościowej fali akustycznej, zastosowanym jako przetwornik sygnału piezoelektrycznego, do oznaczania histaminy. Obecność warstwy zaporowej poli(bitiofenu) znacznie poprawia parametry analityczne chemosenPL 209 950 B1 sora. Grubość tej warstwy powinna wynosić przynajmniej 200 nm, aby skutecznie zapobiegać elektroutlenianiu histaminy w ten sposób zapewniając znakomitą czułość i selektywność chemosensora. W starannie dobranych warunkach FIA, dolna granica detekcji była niska i wynosiła 5 nM histaminy. Chemosensor wykazuje selektywność wobec podobnych funkcjonalnie i strukturalnie substancji przeszkadzających, takich jak tryptamina, dopamina i imidazol. Stałe trwałości kompleksów MIP z histaminą, dopaminą lub tryptaminą wskazują, że wiązanie histaminy przez wdrukowane miejsca wiążące MIP jest znacznie silniejsze niż substancji przeszkadzających.
Opis rysunków
Fig. 1. Woltamperogramy cykliczne dla 1 mM 5 w 0,1 M (TBA)CIO4, w acetonitrylu, dla (1) platynowej elektrody dyskowej i (2) platynowej elektrody dyskowej pokrytej warstwą zaporową poli(bitiofenu) o grubości 200 nm. Krzywe (1') i (2') przedstawiają woltamperogramy cykliczne ślepych prób - roztworów elektrolitu podstawowego dla platynowej elektrody dyskowej i platynowej elektrody dyskowej pokrytej poli(bitiofenem) o grubości 200 nm. Szybkość przemiatania potencjału wynosiła 50 mV/s.
Fig. 2. Zarejestrowane jednocześnie krzywe (a) woltamperometrii cyklicznej, (b) zmian częstotliwości rezonansowej względem potencjału i (c) zmian rezystancji dynamicznej względem potencjału dla elektropolimeryzacji 2 mM 8, 2 mM 9 i 1 mM 5 na elektrodzie platynowej rezonatora kwarcowego w 0,1 M (TBA)CIO4 i 8,64 nM kwasie trifluorooctowym, w acetonitrylu (pH = 8,0). Szybkość przemiatania potencjału wynosiła 50 mV/s.
Fig. 3. Zarejestrowane jednocześnie krzywe (a) woltamperometrii cyklicznej, (b) zmian częstotliwości rezonansowej względem potencjału i (c) zmian rezystancji dynamicznej względem potencjału dla elektropolimeryzacji 2 mM 8, 2 mM 9 i 1 mM 5 w 0,1 M (TBA)CIO4 i 8,64 nM kwasie trifluorooctowym, w acetonitrylu (pH = 8,0), dla elektrody platynowej rezonatora kwarcowego pokrytej warstwą zaporową poli(bitiofenu) o grubości 200 nm. Szybkość przemiatania potencjału wynosiła 50 mV/s.
Fig. 4. Zarejestrowane jednocześnie krzywe (a) woltamperometrii cyklicznej, (b) zmian częstotliwości rezonansowej względem potencjału i (c) zmian rezystancji dynamicznej względem potencjału dla elektropolimeryzacji 0,16 mM 9, 0,16 mM 10 i 0,16 mM 6 w 0,1 M (TBA)CIO4 i 86,4 nM kwasie trifluorooctowym, w acetonitrylu (pH = 7,0), dla elektrody platynowej rezonatora kwarcowego pokrytej warstwą zaporową poli(bitiofenu) o grubości 200 nm. Szybkość przemiatania potencjału wynosiła 50 mV/s.
Fig. 5. Zarejestrowane jednocześnie krzywe (a) woltamperometrii cyklicznej, (b) zmian częstotliwości rezonansowej względem potencjału i (c) zmian rezystancji dynamicznej względem potencjału dla elektropolimeryzacji 2 mM 8, 2 mM 9 i 1 mM 5 na elektrodzie platynowej rezonatora kwarcowego w 0,1 M (TBA)CIO4 i 8,64 nM kwasie trifluorooctowym, w acetonitrylu (pH = 8,0). Szybkość przemiatania potencjału wynosiła 50 mV/s.
Fig. 6. Zarejestrowane jednocześnie krzywe (a) woltamperometrii cyklicznej, (b) zmian częstotliwości rezonansowej względem potencjału i (c) zmian rezystancji dynamicznej względem potencjału dla elektropolimeryzacji 2 mM 8, 2 mM 9 i 1 mM 5 w 0,1 M (TBA)CIO4 i 8,64 nM kwasie trifluorooctowym, w acetonitrylu (pH1 = 8,0), dla elektrody platynowej rezonatora kwarcowego pokrytej warstwą zaporową poli(bitiofenu) o grubości 90 nm. Szybkość przemiatania potencjału wynosiła 50 mV/s.
Fig. 7. Widma rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronów (XPS) N 1s dla warstwy MIP wdrukowanej histaminą i elektroosadzonej na elektrodzie platynowej rezonatora kwarcowego (a) przed i (b) po ekstrakcji histaminy za pomocą 0,01 M NaOH. Przypisanie atomów azotu cząsteczki histaminy rozłożonym pikom zaznaczono na krzywych. Warunki przygotowywania warstwy MIP wdrukowanej histaminą jak na Fig. 3.
Fig. 8. Widma UV-vis roztworu 0,01 M NaOH (1) 1 μM 5 oraz (2) pierwszego ekstraktu warstwy MIP wdrukowanej histaminą i (3) piątej ekstrakcji warstwy MIP wdrukowanej histaminą. Warunki przygotowywania warstwy MIR jak na Fig. 3.
Fig. 9. Krzywe różniczkowej woltamperometrii pulsowej dla 1 mM K4Fe(CN)6 w 0,1 M NaCI w przypadku (i) niepokrytej elektrody platynowej rezonatora kwarcowego oraz elektrody platynowej rezonatora kwarcowego z warstwą zaporową poli(bitiofenu) pokrytej warstwą MIP wdrukowaną histaminą (2) przed i (3) po ekstrakcji histaminy za pomocą 0,01 M NaOH. Skok potencjału wynosił 5 mV; amplituda pulsu 25 mV, szerokość pulsu 50 ms. Wstawka przedstawia wykresy impedancji na płaszczyźnie zespolonej zarejestrowane za pomocą elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS) dla 1 mM K4Fe(CN)6 w 0,1 M NaCI w przypadku (1') niepokrytej platynowej elektrody dyskowej i platynowej elektrody dyskowej pokrytej warstwą MIR wdrukowaną histaminą (2) przed i (3) po ekstrakcji
PL 209 950 B1 histaminy za pomocą 0,01 M NaOH. Częstotliwość EIS wynosiła od 0,1 Hz do 1,0 kHz. Warunki przygotowywania warstwy MIR jak na Fig. 3.
Fig. 10. Zmiany częstotliwości rezonansowej względem czasu towarzyszące kolejnym zastrzykom histaminy w warunkach FIA dla warstwy MIR osadzanej elektrolitycznie na (a) niepokrytej elektrodzie platynowej rezonatora kwarcowego i (b) elektrodzie platynowej rezonatora kwarcowego pokrytej warstwą zaporową poli(bitiofenu) o grubości 200 nm. Objętość roztworu wstrzykniętej histaminy w 0,5 M buforze HERES (pH = 7,5) wynosił a 100 μ L. Stężenie histaminy opisano przy każ dym piku.
Szybkość przepływu roztworu nośnego - 0,5 M buforu HERES (pH = 7,5) - wynosiła 150 μL/min. Warunki przygotowywania warstwy MIP jak na Fig. 3. Wstawka (a) krzywa kalibracyjna histaminy dla objętości zastrzykiwanej próbki 100 μL i szybkości przepływu 150 μL/min. Wstawka (i) w (b) przedstawia zmiany częstotliwości rezonansowej względem czasu dla warstwy MIP elektroosadzonej na elektrodzie platynowej rezonatora kwarcowego, pokrytej warstwą zaporową poli(bitiofenu) o grubości 200 nm, po wstrzyknięciu 100 μL próbki 60 mM histaminy w 0,5 M buforze HERES (pH = 7,5). Wstawka (ii) w (b) przedstawia krzywą kalibracyjna histaminy dla wstrzykniętej próbki o objętości przy szybkości przepływu, odpowiednio, 100 μL i 150 μL/min oraz (2) 1 mL i 35 μL/min.
Fig. 11. Krzywe kalibracyjne oznaczania histaminy dla warstwy (1) MIP i (2) NIP. Obie warstwy osadzono elektrolitycznie na warstwie zaporowej poli(bitiofenu) o grubości 90 nm. Szybkość przepływu roztworu nośnego - 0,5 M buforu HEPES (pH = 7,5) - wynosiła 150 μL/min, zaś objętość zastrzykiwanego roztworu histaminy w 0,5 M buforze HEPES - 100 μL.
Fig. 12. Krzywe kalibracyjne FIA dla (1) histaminy, (2) tryptaminy, (3) dopaminy i (4) imidazolu dla warstwy MIP wdrukowanej histaminą, pokrywającej warstwę zaporową poli(bitiofenu) o grubości 200 nm. Objętość wstrzykniętego roztworu próbki wynosiła 100 μL. Szybkość przepływu roztworu nośnego - 0,5 M buforu HEPES (pH = 7,5) - wynosiła 35 μL/min. Przed oznaczaniem, szablon histaminy wyekstrahowano z warstwy MIP za pomocą 0,01 M NaOH.
Fig. 13. Zmiany częstotliwości rezonansowej względem czasu dla zastrzyków roztworu histaminy, w warunkach FIA, dla warstwy MIP wdrukowanej histaminą i osadzonej elektrolitycznie na elektrodzie platynowej rezonatora kwarcowego pokrytej warstwą zaporową poli(bitiofenu) o grubości 200 nm. Szybkość przepływu roztworu nośnego - 0,5 M buforu HEPES (pH = 7,5) - wynosiła 150 μL/min. Objętość wstrzykniętej histaminy w 0,5 M buforze HEPES (pH = 7,5) wynosiła 1 mL. Wstawka przedstawia zależność kobs, wielkości obliczonej przez nieliniowe dopasowanie części krzywych przedstawiających asocjację analitu i miejsc wiążących MIP, od stężenia analitu (histaminy). Szablon histaminy wyekstrahowano z warstwy MIP za pomocą 0,01 M NaOH przed wstrzyknięciem analitu (histaminy).
Fig. 14. Krzywe kalibracyjne FIA dla (1) histaminy, (2) 2-fenyloetyloaminy i (3) dopaminy dla warstwy MIP wdrukowanej dopaminą, pokrywającej warstwę zaporową poli(bitiofenu) o grubości 200 nm. Objętość wstrzykniętego roztworu próbki wynosiła 100 μL. Szybkość przepływu roztworu nośnego - 0,2 M buforu PBS (pH = 7) - wynosiła 35 μL/min. Przed oznaczaniem, szablon histaminy wyekstrahowano z warstwy MIP za pomocą 0,01 M NaOH.
Opis wzorów
Wzór 1. Fragment wzoru strukturalnego polimeru wdrukowanego molekularnie szablonem histaminy.
Wzór 2. Fragment wzoru strukturalnego polimeru wdrukowanego molekularnie szablonem dopaminy.
Wzór 3. Fragment wzoru strukturalnego polimeru wdrukowanego molekularnie szablonem adeniny.
Wzór 4. Ogólny wzór strukturalny pochodnej bis(2,2'-bitienylo)metanu (4).
Wzór 5. Wzór strukturalny histaminy (5).
Wzór 6. Wzór strukturalny dopaminy (6).
Wzór 7. Wzór strukturalny adeniny (7).
Wzór 8. Wzór strukturalny bis(2,2'-bitienylo)-5,5-dimetylo-2-fenylo-[1,3,2]dioksaborinanometanu (8).
Wzór 9. Wzór strukturalny bis(2,2'-bitienylo)-benzo-[18-korona-6]metanu (9).
Wzór 10. Wzór strukturalny bis(2,2'-bitienylo)-benzo-[1,2-diol]metanu (10).
Wzór 11. Wzór strukturalny imidazolu (11).
Wzór 12. Równanie równowagi kwasowo-zasadowej histaminy.
Wzór 13. Wzór strukturalny tryptaminy (13).
Wzór 14. Wzór strukturalny 2-fenyloetyloaminy (14).
PL 209 950 B1
T a b e l a 1
Czułość oznaczania histaminy wyznaczona z pomiarów przepływowej analizy wstrzykowej, FIA, (szybkość przepływu 150 itL/min, objętość próbk 100 μί.) za pomocą chemosensorów zawierających warstwę NIP i/lub MIP wdrukowaną histaminą, osadzonych na warstwie zaporowej poli(bitiofenu) o grubości 90 nm, 200 nm lub w nieobecności warstwy zaporowej
| Architektura sensora | Czułość (±0.01) Hz/mM | Współczynnik korelacji |
| MIP/200-nm poli(bitiofen)/Pt/kwarc | -0.33 | 0.998 |
| MlP/Pt/kwarc | -0.15 | 0.997 |
| NIP/200-nm poli(bitiofen)/Pt/kwarc | -0.08 | 0.997 |
| IMIP/90-nm poli(bitiofen)/Pt/kwarc | -0.41 | 0.996 |
| NIP/90-nm poli(bitiofen)/Pt/kwarc | -0.34 | 0.997 |
T a b e l a 2
Czułość oznaczania histaminy i podobnych pod względem struktury lub funkcji analitów wyznaczona z pomiarów FIA (szybkość przepływu 35 μL/min, objętość próbki 1 mL) za pomocą chemosensora z wdrukowaną szablonem histaminy warstwą MIR, elektroosadzoną na 200-nm grubości warstwie zaporowej poli(bitiofenu), na elektrodzie Pt rezonatora kwarcowego.
| Oznaczana amina | Czułość (±0.05) Hz/mM | Współczynnik korelacji |
| Histamina | -0.86 | 0.987 |
| Tryptamina | -0.48 | 0.988 |
| Dopamina | -0.46 | 0.988 |
| Imidazol | -0.49 | 0.986 |
Literatura (1) Lehane, L.; Olley, J. Int. J. Food Microbiol. 2000, 58, 1-37.
(2) Holgate, S. T.; Robinson, C; Church, M. K. Allergy: Principles and Practice, Vol. 1; C.V. Mosby Co.: St. Louis, Washington, Toronto, 1988.
(3) Beaven, M. A. In Monographs in Allergy. Karger, S., Ed.: Basel, 1978; Vol. 13; (a)Beaven, M. A. Klin. Wochenschr 1982. 60, 873-881.
(4) Kuruma, K.: Sakano, T. Anal. Sci 1999, 15, 489-492; (a)Lowe, D. R.; March, J. E.; James, J. E.; Karnes, H. T. J. Liq. Chromatogr. 1994, 17, 3563-3570; (a)Egger, D.: Reisbach, G.; Hultner, L. J. Chromatogr B 1994, 662, 103-107.
(5) Hockl, P. F.; Thyssen, S. M.; Libertun, C. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2000, 23, 693-703.
(6) Pihel, K.; Hsieh, S.; Jorgenson, J. W.; Wightman, R. M. Anal. Chem. 1995, 67, 4514-4521; (a)Washington, B.; Smith, M. O.; Robinson, T. J.: Olubadewo, J. O.; Ochillo, R. F. J. Liq. Chromatogr. 1991, 14, 2189-2200; (a)Okochi, M.; Yokouchi, H.; Nakamura, N.; Matsunaga, T. Biotechnol. Bioeng. 1999, 65, 480-484.
(7) Payne, N.; Zirrolli, A.; Gerber, G. Anal. Blochem 1988, 778 414-420; (a)Navert, H.; Berube, R.; Wollin, A. Can. J. Physiol. Pharmacol. 1985, 63, 766-772; (a)Keyzer, J. J.; Wolthers, E. G., Muskiet, F. A.; K. Anal. Blochem. 1984, 474-481; (a)Mita, H.: Yasueda, H.; Shida, T. J. Chromatogr. B 1980, 181, 153-159.
(8) Niwa, 0.; Kurita, R.; Hayashi, K.; Horiuchi, T.; Torimitsu, K.; Maeyama, K.; Tanizawa, K. Sens. Actuators, B 2000, 67, 43-51; (a)lwaki, S.; Ogasawara, M.; Kurita, R.; Niwa, O.; Anal. Biochem. 2002, 304, 236-243.
(9) Loughran, M. G.; Hall, J. M.; Turner. A. P. F.; Davidson, V. L. Biosens. Bioelectron. 1995, 10, 569-576; (a)Zeng, K.; Tachikawa, H.; Zhu, Z.; Davidson, V. L. Anal. Chem. 2000, 72, 2211-2215.
(10) Yamamoto, K.; Takagi. K.; Kano, K.: Ikeda, T. Electroanalysis 2001, 13, 375-379.
(11) Bao. L. L.; Sun, D. P.: Tachikawa. H.; Davidson, V. L. Anal. Chem. 2002, 74, 1144-1148.
(12) Haupt. K. Chem. Commun. 2003, 171-178; (a)Haupt, K.; Mosbach, K. Chem. Rev. 2000, 100, 2495-2504; (a)Wulff, G. Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 1995, 34, 1812-1832.
(13) Bianco-López, M. C; Lobo-Castanón, M. J.; Miranda-Ordieres, A. J.; Tunón-Blanco, P. Trends Anal. Chem. 2004, 23, 36-48; (a)Piletsky, S. A.; Turner, A. P. F. Electroanalysis 2002, 14, 317-323; (a)Henry, 0. Y. F.; Cullen, D. C; Piletsky, S. A. Anal. Bioanal. Chem. 2005, 382, 947-956.
PL 209 950 B1 (14) Avila. M.; Zougagh. M.: Rios, A.; Escarpa, A. Trends Anal. Chem. 2008, 27, 54-65.
(15) Malitesta, C; Losito, I.; Zambonin, P. G. Anal. Chem. 1999, 71, 1366-1370.
(16) Roncali, J. Chem. Rev. 1992, 92, 711-738; (a)Pei, Q.; Inganas, O., Synth. Met. 1993, 55-57, 1221-1226; (a)Trznadel, M.; Pron, A.; Zagorska, M.; Chrząszcz, R.; Pielichowski, J. Macromolecules 1998, 31, 5051-5058; (a)Demadnlle, R.; Divisia-Blohorn, B.; Zagorska, M.; Pron, A. New J. Chem. 2003, 27, 1479-1484.
(17) Hall, D. G. In Boronic Acids Preparation. Applications in Organic Synthesis and Medicine: Hall, D. G., Ed.; Wiley-VCH: Weinheim. 2005; Vol., pp 1-99.
(18) Kochman, A.; Krupka, A.; Gnssbach, J.; Kutner, W.; Gniewinska, B.; Nafalski, L. Electroanalysis 2006, 18, 2168-2173.
(19) Manica, D. P.; Mitsumoh, Y.; Ewing, A. G. Anal. Chem. 2003, 75, 4572-4577.
(20) Sarada. B. V.; Rao, T. N.; Tryk. D A.: Fujishima, A. Anal. Chem. 2000, 72, 1632-1638.
(21) Skompska, M.; Jackson, A.; Hillman, A. R. Phys. Chem. Chem. Phys 2000, 2, 4748-4757.
(22) Bradley, R. H.; Ling, X.; Sutherland. I.; Beamson, G. Carbon 1994, 32, 185-186.
(23) Wojtowicz, M. A.; Pels, J. R.; Moulijn, J. A. Fuel 1995, 74, 507-516.
(24) Zheng, T.; Xing, K. Z.; Hellgren. N.; Logdlund, J.-E. J. Electron Spectrosc. Relat. Phenom 1997, 87, 45-49.
(25) Lasia, A. In Modern Aspects of Electrochemistry; Conway, B. E., Bockhs, J., White, R. E., Eds.; Kluwer Academic/Plenum: New York 1999; Vol. 32, pp 143-248.
(26) DeLevie, R. In Advances in electrochemistry and electrochemical engineering, Delahay, P., Tobias, C. W., Eds.; John Wiley; New York, 1967; Vol. 6, pp 329-397.
(27) Skladal. P J. Braz. Chem. soc. 2003, 14, 491-502
Claims (7)
1. Polimer wdrukowany molekularnie, o ogólnym wzorze strukturalnym-1, 2 lub 3 przygotowany polimerami dwóch monomerów funkcyjnych, monomeru dioksoborinanowego o wzorze strukturalnym 8 i bis(2,2'-bitienylo)-benzo-[18-korona-6] o wzorze strukturalnym 9 z histaminą lub adeniną jako szablonem, albo monomerów o wzorze strukturalnym 9 i wzorze strukturalnym 10 z dopaminą jako szablonem.
2. Sposób wytwarzania polimeru wdrukowanego molekularnie, MIP, z zastosowaniem pochodnych bis(bitiofenu), znamienny tym, że w obecności substancji biologicznie czynnej wybranej z grupy obejmującej aminy biogeniczne, zwłaszcza histaminy, dopaminy lub adeniny jako szablonu, przeprowadza się kopolimeryzację elektrochemiczną samouporządkowanych kompleksów dwóch monomerów funkcyjnych, korzystnie monomeru o wzorze strukturalnym 8 i wzorze strukturalnym 9 z histaminą lub adeniną, lub monomeru o wzorze strukturalnym 9 i wzorze strukturalnym 10 z dopaminą, po czym szablon usuwa się z warstwy MIP za pomocą roztworu alkalicznego.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że za pomocą elektropolimeryzacji przygotowuje się najpierw wewnętrzną warstwę zaporową poli(bitiofenu) na elektrodzie, rezonatora kwarcowego, a następnie na tej warstwie zaporowej osadza się warstwę MIP.
4. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że warstwę zaporową i warstwę MIP osadza się na elektrodzie wykonanej z materiału wybranego z grupy obejmującej węgiel lub metale z grupy platynowców, korzystnie platynę.
5. Chemiczny czujnik piezoelektryczny do wykrywania i oznaczania substancji biologicznie czynnych wybranych z grupy obejmującej aminy biogeniczne, zwłaszcza histaminy, dopaminy i adeniny, znamienny tym, że składa się z elementu rozpoznającego, którym jest warstwa polimeru wdrukowanego molekularnie, MIP, będąca kopolimerem dwóch pochodnych bis(bitiofeno)metanu, monomeru o wzorze strukturalnym 8 i wzorze strukturalnym 9 z histaminą lub adeniną jako szablonem, lub monomeru o wzorze strukturalnym 9 i wzorze strukturalnym 10 z dopaminą jako szablonem, osadzona na elektrodzie, oraz elementu przetwarzającego sygnał detekcji, którym jest rezonator kwarcowy, korzystnie cięcia AT, o poprzecznych drganiach ścinających objętościowej fali dźwiękowej.
PL 209 950 B1
6. Czujnik według zastrz. 5, znamienny tym, że warstwa MIP osadzona jest na wewnętrznej warstwie zaporowej poli(bitiofenu) na elektrodzie rezonatora kwarcowego.
7. Czujnik według zastrz. 5, znamienny tym, że elektroda wykonana jest z materiału wybranego z grupy obejmującej węgiel lub metale z grupy platynowców, korzystnie z platyny.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL386665A PL209950B1 (pl) | 2008-12-02 | 2008-12-02 | Polimer wdrukowany molekularnie, sposób jego wytwarzania oraz chemiczny czujnik piezoelektryczny do oznaczania substancji biologicznie czynnych, zwłaszcza histaminy, dopaminy i adeniny |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL386665A PL209950B1 (pl) | 2008-12-02 | 2008-12-02 | Polimer wdrukowany molekularnie, sposób jego wytwarzania oraz chemiczny czujnik piezoelektryczny do oznaczania substancji biologicznie czynnych, zwłaszcza histaminy, dopaminy i adeniny |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL386665A1 PL386665A1 (pl) | 2010-06-07 |
| PL209950B1 true PL209950B1 (pl) | 2011-11-30 |
Family
ID=42990441
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL386665A PL209950B1 (pl) | 2008-12-02 | 2008-12-02 | Polimer wdrukowany molekularnie, sposób jego wytwarzania oraz chemiczny czujnik piezoelektryczny do oznaczania substancji biologicznie czynnych, zwłaszcza histaminy, dopaminy i adeniny |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL209950B1 (pl) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103760208A (zh) * | 2013-01-23 | 2014-04-30 | 南京医科大学 | 一种用于检测多巴胺的金纳米粒掺杂的分子印记电化学传感器的制备方法 |
-
2008
- 2008-12-02 PL PL386665A patent/PL209950B1/pl unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103760208A (zh) * | 2013-01-23 | 2014-04-30 | 南京医科大学 | 一种用于检测多巴胺的金纳米粒掺杂的分子印记电化学传感器的制备方法 |
| CN103760208B (zh) * | 2013-01-23 | 2015-09-30 | 南京医科大学 | 一种用于检测多巴胺的金纳米粒掺杂的分子印记电化学传感器的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL386665A1 (pl) | 2010-06-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6022480B2 (ja) | 分子インプリント導電性ポリマフィルム付き水性アミノ酸センサー | |
| Mazzotta et al. | Development of a sensor prepared by entrapment of MIP particles in electrosynthesised polymer films for electrochemical detection of ephedrine | |
| Aghaei et al. | A novel capacitive biosensor for cholesterol assay that uses an electropolymerized molecularly imprinted polymer | |
| Alizadeh et al. | Molecularly imprinted polymer nano-sphere/multi-walled carbon nanotube coated glassy carbon electrode as an ultra-sensitive voltammetric sensor for picomolar level determination of RDX | |
| Wang et al. | Covalent modification of glassy carbon electrode with L-cysteine for the determination of acetaminophen | |
| Florea et al. | Electrochemical sensing of cocaine in real samples based on electrodeposited biomimetic affinity ligands | |
| Kong et al. | Molecularly imprinted quartz crystal microbalance sensor based on poly (o-aminothiophenol) membrane and Au nanoparticles for ractopamine determination | |
| Pietrzyk et al. | Molecularly imprinted polymer (MIP) based piezoelectric microgravimetry chemosensor for selective determination of adenine | |
| Bagheri et al. | Fabrication of a novel electrochemical sensing platform based on a core–shell nano-structured/molecularly imprinted polymer for sensitive and selective determination of ephedrine | |
| Ktari et al. | Design of a polypyrrole MIP-SAW sensor for selective detection of flumequine in aqueous media. Correlation between experimental results and DFT calculations | |
| Li et al. | Molecularly imprinted polymer-based sensors for atrazine detection by electropolymerization of o-phenylenediamine | |
| Downard et al. | Suppression of protein adsorption at glassy carbon electrodes covalently modified with tetraethylene glycol diamine | |
| Pietrzyk et al. | Molecularly imprinted poly [bis (2, 2′-bithienyl) methane] film with built-in molecular recognition sites for a piezoelectric microgravimetry chemosensor for selective determination of dopamine | |
| Gokoglan et al. | A novel architecture based on a conducting polymer and calixarene derivative: its synthesis and biosensor construction | |
| Taei et al. | Simultaneous determination of cysteine, uric acid and tyrosine using Au-nanoparticles/poly (E)-4-(p-tolyldiazenyl) benzene-1, 2, 3-triol film modified glassy carbon electrode | |
| Bakshi et al. | Rapid fabrication of homogeneously distributed hyper-branched gold nanostructured electrode based electrochemical immunosensor for detection of protein biomarkers | |
| Pellicer et al. | Using a portable device based on a screen-printed sensor modified with a molecularly imprinted polymer for the determination of the insecticide fenitrothion in forest samples | |
| Liao et al. | Preparation of the molecularly imprinted polymers-based capacitive sensor specific for tegafur and its characterization by electrochemical impedance and piezoelectric quartz crystal microbalance | |
| Kupis-Rozmysłowicz et al. | Biomimetic membranes based on molecularly imprinted conducting polymers as a sensing element for determination of taurine | |
| Wawrzyniak et al. | Gly‐Gly‐His Immobilized On Monolayer Modified Back‐Side Contact Miniaturized Sensors for Complexation of Copper Ions | |
| Mazzotta et al. | Electrochemical detection of the toxic organohalide 2, 4-DB using a Co-porphyrin based electrosynthesized molecularly imprinted polymer | |
| Filik et al. | Simultaneous electrochemical preconcentration and determination of dopamine and uric acid by square-wave adsorptive stripping voltammetry using a poly (Safranine O)-modified glassy carbon electrode | |
| González de la Huebra et al. | Determination of carbendazim in soil samples by anodic stripping voltammetry using a carbon fiber ultramicroelectrode | |
| Liu et al. | Study on the Electrochemical Behavior of Dopamine and Uric Acid at a 2‐Amino‐5‐mercapto‐[1, 3, 4] Triazole Self‐Assembled Monolayers Electrode | |
| KR102806997B1 (ko) | 돔페리돈 검출용 센서전극 및 이의 제조방법 |