PL208384B1

PL208384B1 - Sposób jednoetapowego wytwarzania mikrokapsułek, zwłaszcza zawierających żywe (54) komórki, ich zbiory lub substancje biologicznie aktywne oraz urządzenie do ich jednoetapowego wytwarzania

Info

Publication number: PL208384B1
Application number: PL367593A
Authority: PL
Inventors: Dorota Lewińska; Józef Bukowski; Stefan Rosiński; Marek Kożuchowski; Andrzej Waryński
Original assignee: Inst Biocybernetyki I Inżynierii Biomedycznej Polska Akademia Nauk
Priority date: 2004-04-29
Filing date: 2004-04-29
Publication date: 2011-04-29
Also published as: PL367593A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób jednoetapowego wytwarzania mikrokapsułek, zwłaszcza zawierających żywe komórki, ich zbiory lub substancje biologicznie aktywne oraz urządzenie o odpowiedniej konstrukcji dyszy podłączone do generatora wysokiego napięcia elektrycznego stałego, impulsowego lub zmiennego, umożliwiające otrzymywanie sferycznych kapsułek polimerowych o rozmiarach od 0,01 do 3,00 mm, o gładkiej powierzchni i niedużym rozrzucie średnic (do około 15%).

Sposób i urządzenie według wynalazku znajduje zastosowanie do enkapsulacji różnych substancji biologicznie aktywnych naturalnych i syntetycznych, zwłaszcza żywych komórek oraz fragmentów tkanek, w tym ludzkich przytarczyc i wysp Langerhansa.

Znane dotychczas sposoby wytwarzania mikrokapsułek najczęściej składają się z dwóch etapów. Etap pierwszy to wytworzenie za pomocą specjalnego aparatu kropel zolu polisacharydowego, zawierającego enkapsulowany materiał biologiczny i usieciowanie ich odpowiednimi kationami metali w ł a ź ni ż elują cej (matryca). Natomiast w drugim etapie, w wyniku kolejnych k ąpieli tworzy się na zewnętrznej powierzchni matrycy odpowiednie błony półprzepuszczalne. Najbardziej znane techniki tego typu to metoda Lima i Suna (błona z poli-L-lizyny) [Microencapsulated islets as bioartificial pancreas. F. Lim and A. M. Sun, Science, 210, 908-909,1980] oraz metoda polielektrolitów Wanga (błona z polimetyleno-ko-guanidyny) [An encapsulation system for immunoisolation of pancreatic islets. T. Wang, I. Lacik, M. Brissova, A. Prokop, D. Hunkeler, A. V. Anilkumar, R. Green, K. Shahrokhi, A. C. Powers, Nature Biotechnol., 15, 358-362,1997].

W obydwu przypadkach powstawanie błony półprzepuszczalnej wokół żelowego rdzenia moż liwe jest dzięki chemiczno-fizycznym oddziaływaniom pomiędzy cząsteczkami matrycy (polisacharyd) a substancją błonotwórczą. Najczęściej wykorzystuje się występowanie oddziaływań natury elektrostatycznej pomiędzy np. ujemnie naładowaną powierzchnią rdzenia mikrokapsułki (alginian) a dodatnio naładowanym polimerem błonotwórczym (poli-L-lizyna, poliornityna, chitozan i podobne.)

Ta znana metoda może być zatem stosowana jedynie do łączenia materiałów o odpowiednim powinowactwie. W sytuacji, gdy choć jedna z substancji nie posiada wyraźnego ładunku elektrycznego lub obie posiadają ładunek tego samego znaku, wytworzenie półprzepuszczalnej membrany nie jest możliwe. Klasyczną sytuacją tego typu jest opłaszczanie materiału hydrofobowego (np. oleju) materiałem hydrofilowym (np. wodny roztwór polisacharydu).

Innym istotnym ograniczeniem opłaszczania przy pomocy kolejnych kąpieli jest grubość, a co za tym idzie, wytrzymałość mechaniczna błon. Zwiększanie grubości błony można osiągnąć poprzez kilkakrotne, warstwowe nakładanie substancji błonotwórczych (na przemian polikation i polianion - metoda wieloelektrolitowa). Jednakże, znacznie utrudnia to pracę i zwiększa koszty produkcji tego typu mikrokapsułek. Dodatkowo, gdy mamy do czynienia z matrycą podatną na pęcznienie, skuteczne nałożenie kilku warstw błony wymaga ścisłego reżimu czasowego (minimalizacja pęcznienia)

Wieloetapowe, klasyczne opłaszczanie komórek, a szczególnie ich dużych agregatów lub fragmentów tkanek (jak wyspy Langerhansa) nie daje gwarancji pełnej enkapsulacji (całkowitego powleczenia materiału biologicznego matrycą, a następnie membraną). Jest to poważny problem, który szczególnie w przypadku przeszczepów międzygatunkowych (np. wszczepianie świńskich wysp trzustkowych ludziom - ksenotransplantacja) nastręcza wiele problemów. Niecałkowite opłaszczenie komórek obcego gatunku powoduje natychmiastowe rozpoznanie ich przez układ immunologiczny biorcy i w konsekwencji odrzucenie przeszczepu przez biorcę. Aby uniknąć tej sytuacji ponawia się pierwszy etap enkapsulacji, dodatkowo komplikując procedurę wytwarzania mikrokapsułek.

Nieoczekiwanie, okazało się, że możliwe jest opracowanie metody bezpośredniego, jednoetapowego wytwarzania mikrokapsułek, zawierających komórki umieszczone w centrum mikrokapsułki (nie wystające poza wnętrze kapsułki), sposobem według wynalazku, w odpowiednio zaprojektowanym urządzeniu według wynalazku posiadającym głowicę typu dysza w dyszy, podłączoną do generatora napięcia elektrycznego. Okazało się możliwe wytworzenie kropli z substancji błonotwórczej, wewnątrz której znajduje się kropla substancji rdzeniowej kapsułki, zawierająca enkapsulowany materiał aktywny biologicznie. Po utrwaleniu struktury substancji błonotwórczej (oraz w wybranych przypadkach matrycy) w odpowiedniej łaźni żelującej, efektem końcowym jest gotowa mikrokapsułka, zawierająca opłaszczany materiał biologiczny. Mikrokapsułki otrzymane tą metodą dają możliwość uniknięcia niedoopłaszczania zarówno pojedynczych komórek, jak i ich agregatów (np. wyspy trzustkowe) i tym samym dają gwarancję uniknięcia problemów związanych z odrzuceniem przeszczepu międzygatunkowego w skutek bezpośredniego zetknięcia się układu immunologicznego biorcy z obcą tkanką dawcy.

PL 208 384 B1

Nieoczekiwanie stwierdzono również, że sposobem według wynalazku możliwe jest wytworzenie trwałych mikrokapsułek w układzie dwóch cieczy nie mieszających się ze sobą (układ hydrofilowo-hydrofobowy). Zastosowane urządzenie i metoda według wynalazku pozwalają na wytworzenie mikrokapsułek, np. olejowo-alginianowych, w których zżelowana warstwa alginianowa ochrania znajdującą się w jej wnętrzu fazę olejową i rozpuszczoną w niej substancję biologicznie czynną przed niszczącym wpływem środowiska zewnętrznego (np. utlenianie, tworzenie się wolnych rodników itp.).

Sposób wytwarzania mikrokapsułek zawierających żywe komórki, ich zbiory albo naturalne, bądź syntetyczne substancje biologicznie, według wynalazku polega na tym, że wytwarza się strumień podwójnych kropli, wewnątrz których znajduje się opłaszczany (enkapsulowany) materiał biologiczny, zawieszony lub rozpuszczony w cieczach hydrofilowych lub hydrofobowych, otoczony warstwą materiału błonotwórczego, za pomocą głowicy w postaci podwójnej dyszy, przykładając jednocześnie pole elektryczne, a wytworzony strumień kropel utwardza się, utrwalając strukturę półprzepuszczalnej błony, poprzez umieszczenie ich w odpowiedniej łaźni żelującej, zawierającej wielowartościowe kationy (co najmniej dwuwartościowe), schładzając krople lub susząc ich zewnętrzną warstwę, do otrzymania gotowej mikrokapsułki.

Sposobem według wynalazku korzystnie wytwarza się mikrokapsułki o rozmiarach od 10 do

3000 μm, zawierające żywe komórki ludzkie, zwierzęce lub roślinne oraz ich zbiory (agregaty lub fragmenty tkanek).

W sposobie według wynalazku, jako materiał błonotwórczy stosuje się materiały znane ze stanu techniki, korzystnie polisacharydy, zwłaszcza alginian, pektynę, agarozę i skrobię, a także żelatynę oraz ich pochodne.

W sposobie według wynalazku, jako materiał biologicznie aktywny, korzystnie stosuje się również hydrofobowe substancje biologicznie aktywne znane ze stanu techniki, korzystnie witaminę E,

D, A, tran.

Sposób według wynalazku pozwala w dużej mierze na uniezależnienie składu kapsułek od własności fizyko-chemicznych obu materiałów (w tym rodzaju, rozkładu i ilości ładunku elektrycznego oraz powinowactwa chemicznego), zarówno matrycy, jak i substancji opłaszczającej. Jedynym istotnym ograniczeniem metody według wynalazku jest (w przypadku opłaszczania żywych komórek) konieczność zastosowania na zewnątrz kapsułki roztworu polimeru, żelującego w temperaturze do 60°C.

W zastosowaniach biologiczno-medycznych proponowana metoda wytwarzania kapsułek pozwala na udostępnienie badaczom całej gamy innych, do tej pory nie stosowanych materiałów błonotwórczych, które np. ze względu na brak odpowiedniego ładunku elektrycznego nie były dotychczas brane pod uwagę. Do tej grupy należeć mogą poliaminokwasy naturalne i syntetyczne o ładunku elektrycznym obojętnym lub zgodnym z ładunkiem matrycy, przykładowo sól potasowa kwasu poliadenylowego, kwas poliasparginowy, kwas poliurydylowy, siarczan polimiksyny B oraz ich kopolimery lub mieszaniny.

Zastosowanie w sposobie według wynalazku pola elektrycznego stałego, impulsowego lub zmiennego do generowania podwójnych kropel umożliwia jednoetapowe wytworzenie mikrokapsułek o średnicach, znacznie mniejszych od wielkości zewnętrznej średnicy zewnętrznej dyszy głowicy. Rozwiązanie według wynalazku ma charakter nowatorski i jak dotąd nie było prezentowane w literaturze naukowej.

Urządzenie do jednoetapowego wytwarzania mikrokapsułek według wynalazku, charakteryzuje się tym, że zawiera specjalną głowicę, wyposażoną w dwie współosiowe dysze, umożliwiające jednoczesne, tłoczenie dwóch cieczy, generator pola elektrycznego stałego, impulsowego lub zmiennego, który podłączony jest przewodem wysokiego potencjału do metalowej części dyszy, a przewodem niskiego potencjału do łaźni żelującej, kolekcjonującej gotowe mikrokapsułki, składające się z rdzenia zawierającego materiał biologiczny, otoczonego substancją błonotwórczą o utrwalonej strukturze.

Mikrokapsułki i ciecz żelująca, korzystnie mieszane są za pomocą mieszadła magnetycznego. Do wlotów dyszy zewnętrznej i wewnętrznej głowicy podłączone są skalowane zbiorniki zawierające ciecz rdzeniową (wlot dyszy wewnętrznej) i ciecz błonotwórczą (wlot dyszy zewnętrznej). Obie ciecze wypychane są ze zbiorników do głowicy za pomocą sprężonego powietrza lub pomp. Ciśnienie obu cieczy w głowicy regulowane jest za pomocą regulatorów, a mierzone odpowiednio manometrami. Pomiar czasu wypływu obu cieczy oraz ich objętości pozwala wyliczyć wartości przepływów obu cieczy.

W celu sprawdzenia możliwości wytwarzania mikrokapsułek w procesie jednoetapowym skonstruowano specjalne głowice według wynalazku, opisane poniżej, zawierające dwie dysze, umożliwiające współosiowe tłoczenie dwóch roztworów.

PL 208 384 B1

Urządzenie według wynalazku przedstawiono na załączonym rysunku, na którym fig. 1 przedstawia całościową konstrukcję urządzenia do jednoetapowego wytwarzania mikrokapsułek w układzie hydrofilowo/hydrofobowym oraz hydrofilowo/hydrofilowym, a fig. 2 i fig. 3 przedstawiają możliwą budowę głowic do jednoetapowego wytwarzania mikrokapsułek według wynalazku.

Urządzenie według wynalazku składa się z głowicy zawierającej dyszę wewnętrzną 1 i dyszę zewnętrzną 2, wlot cieczy wewnętrznej 3, wlot cieczy zewnętrznej 4 i kanalik 5 doprowadzający ciecz błonotwórczą do dyszy zewnętrznej, łaźnię żelującą 6, w której powstają kapsułki 2 składające się z rdzenia 8 i membrany 9. Na dnie łaźni żelującej 6 znajduje się mieszadło magnetyczne 10. Ponadto, urządzenie zawiera generator wysokiego napięcia 11, który podłączony jest przewodem wysokiego potencjału 12 do metalowej części dyszy, a przewodem niskiego potencjału 13 do łaźni żelującej 6. W skład urządzenia według wynalazku wchodzą także regulatory ciśnień R1 i R₂, manometry do pomiaru ciśnienia M1 i M2 oraz pompy lub zbiorniki gazu P i P₂.

Głowica przedstawiona na fig. 2, zastosowana w urządzeniu według wynalazku, oznaczona symbolem JB/2 składa się z dwóch współosiowo i szczelnie zmontowanych kapilar metalowych - dysza wewnętrzna 1 i dysza zewnętrzna 2, zaopatrzonych we wloty umożliwiające podłączenie zbiorników: wlot zbiornika cieczy rdzeniowej 3, wlot zbiornika cieczy błonotwórczej 4, połączony szczelnie kanalikiem 5 z dyszą zewnętrzną głowicy, umożliwiający współosiowe, synchroniczne tłoczenie obu cieczy. Parametry konstrukcyjne głowicy JB/2 przedstawiono w tabeli 1.

T a b e l a 1

Parametry konstrukcyjne głowicy JB/2

Parametry konstrukcyjne	JB/2
Dysza wewnętrzna	Średnica wewnętrzna [mm]	0,33
Średnica zewnętrzna [mm]	0,6
Dysza zewnętrzna	Średnica wewnętrzna [mm]	0,68
Średnica zewnętrzna [mm]	1,0
Pole przekroju dyszy wewnętrznej [cm²]	0,086 · 10'
Pole przekroju dyszy zewnętrznej [cm²]	0,080 · 10'
Sumaryczne pole przekroju [cm²]	0,169 · 10'
Długość dyszy wewnętrznej [mm]	15,3
Długość dyszy zewnętrznej [mm]	15

W zmodyfikowanej wersji głowicy, przedstawionej na fig. 3, oznaczonej symbolem JB/3, wprowadzono zmianę, w celu zapewnienia wzajemnej centryczności obu igieł. Pomiędzy obie dysze wprowadzono cztery zwoje 15 sprężyny z drutu, korzystnie o średnicy 0,3 mm oraz uszczelnienie i regulację wysunięcia igły 14. Na ostatnim, 5 milimetrowym, dolnym odcinku dyszy wprowadzono kapilary metalowe o takich samych średnicach jak dysza JB/2.

Parametry konstrukcyjne dyszy JB/3 zamieszczono w tabeli 2. W stosunku do dyszy JB/2 zwiększono także całkowitą długości obu dysz: - dyszy wewnętrznej z 15,3 mm do 47 mm, - dyszy zewnętrznej z 15,0 mm do 38 mm.

T a b e l a 2

Parametry konstrukcyjne głowicy JB/3

	Dysza wewnętrzna górna	Dysza wewnętrzna dolna	Dysza zewnętrzna górna	Dysza zewnętrzna dolna
Średnica wewnętrzna [mm]	0,60	0,33	1,20	0,68
Średnica zewnętrzna [mm]	0,90	0,60	1,60	1,00
Długość [mm]	25	22	30	8
Pole przekroju [cm²]	-	0,086 · 10 ²	-	0,080 · 10 ²

PL 208 384 B1

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku.

P r z y k ł a d I

W celu sprawdzenia moż liwoś ci całkowitego opł aszczenia komórek jednolitą warstwą alginianowa, przeprowadzono doświadczenie w układzie zawiesina komórek drożdży w alginianie (ciecz rdzeniowa)/alginian (ciecz opłaszczająca-błonotwórczą).

Przy pomocy urządzenia i głowicy JB/3 według wynalazku (fig. 1 i fig 3) przeprowadzono proces, w którym jako ciecz rdzeniową zastosowano zawiesinę komórek drożdży piekarskich Saccharomyces cervisiae o stężeniu 4,6 x 10¹¹ komórek/ml w 1,5%-owym roztworze alginianu sodu średniej lepkości (lepkość nominalna 2% wodnego roztworu 3500 mPas, Sigma, USA) w 0,9% wodnym roztworze NaCl (Baxter Terpol, Sieradz, Polska) oraz 1,5%-owy roztwór tego samego alginianu sodu w 0,9% wodnym roztworze NaCl (ciecz błonotwórczą). Zastosowano następującą procedurę: przygotowano urządzenie, za pomocą regulatorów R1 i R2 nastawiono założone wartości ciśnień - dla cieczy rdzeniowej ciśnienie Pw = 0,01 At, dla cieczy błonotwórczej Pz = 0,2 At. Do naczynia z łaźnią żelująca (krystalizator o objętości 40 ml) wlano 20 ml 2% wodnego roztworu chlorku wapnia (cz. d. a., Ubichem, Wielka Brytania), włączono mieszadło magnetyczne. Na generatorze napięcia ustawiono parametry pracy:

- tryb pracy - napięcie podawane impulsowo,

- wartość napięcia U = 13 kV,

- czas podawania impulsu elektrycznego τ = 8 ms,

- częstotliwość podawania impulsu elektrycznego f = 50 Hz.

Do zbiornika dyszy wewnętrznej wlano 5 ml cieczy rdzeniowej, do zbiornika cieczy błonotwórczej wlano 5 ml 1,5% roztworu alginianu sodu w soli fizjologicznej. Włączono generator napięcia, włączono przepływy gazów wypychających obie ciecze. W czasie procesu na końcu głowicy formowały się podwójne krople (typu kropla w kropli), które wpadały do łaźni żelującej, w której na skutek oddziaływań z jonami Ca⁺² następowało żelowanie zewnętrznej, alginianowej warstwy mikrokapsułek.

Po zakończeniu procesu zebrane w łaźni żelującej mikrokapsułki zmierzono pod mikroskopem krystalograficznym, mierząc ich średnicę zewnętrzną Dz oraz średnicę wewnętrzną Dw, z pomiarów 30 kapsułek wyznaczono średnią średnicę Dz oraz Dw, wyliczono współczynnik zmienności VC od średnich średnic, wliczono średnią grubość membrany d wraz ze współczynnikiem zmienności VC, wyrażonym w procentach.

W czasie doświadczenia mierzono czas wypływu obu cieczy oraz ich objętości, co pozwoliło wyliczyć ich przepływy - Vw - przepływ cieczy rdzeniowej i Vz - przepływ cieczy błonotwórczej. Wyniki znajdują się w tabeli 3.

T a b e l a 3

Parametry fizyczne mikrokapsułek

Symbol próbki	Dz [mm]	VC Dz [%]	Dw [mm]	VC Dw [%]	d [μιτι]	VC d [%]	Vw [ml/min]	Vz [ml/min]
DAA-3	0,53	6	0,36	6	88	22	0,03	0,04

W rezultacie otrzymano sferyczne, jednorodne mikrokapsułki o bardzo małym rozrzucie średnic - 6% dla średnicy zewnętrznej i 6% dla średnicy wewnętrznej.

Wielkość średniej średnicy zewnętrznej wynosi 0,54 ± 0,03 mm i jest dwukrotnie mniejsza od zewnętrznej średnicy zewnętrznej dyszy głowicy.

Jak pokazano na rysunku fig. 4a, komórki drożdży rozmieszczone są w środku mikrokapsułki, w kuli o średnicy 360 μm i otoczone są membraną alginianową o średniej grubości 88 μm.

Dla porównania, na fig. 4b pokazano rozmieszczenie komórek drożdży w mikrokapsułkach wykonanych tradycyjną metodą, urządzeniem jednodyszowym (obydwa zdjęcia w powiększeniu 200-krotnym).

W tym przypadku, komórki rozmieszczone są równomiernie w całej objętości mikrokapsułki, a część z nich wystaje poza obręb zewnętrznej krawędzi mikrokapsułki (dolna krawędź).

P r z y k ł a d II

W celu sprawdzenia możliwości wytwarzania mikrokapsułek metodą według wynalazku, przy zastosowaniu pola stałego wykonano doświadczenie analogiczne do podanego w przykładzie I, ale z użyciem napięcia stałego U = 13 kV.

Wyniki zamieszczono w tabeli 4.

PL 208 384 B1

T a b e l a 4

Parametry fizyczne mikrokapsułek

Symbol próbki	Dz [mm]	VC Dz [%]	Dw [mm]	VC Dw [%]	d [μιτι]	VC d [%]	Vw [ml/min]	Vz [ml/min]
DAA-4	0,28	3	0,19	6	41	18	0,03	0,05

W rezultacie otrzymano sferyczne, jednorodne mikrokapsułki o bardzo małym rozrzucie średnic - 3% dla ś rednicy zewnętrznej i 6% dla średnicy wewnętrznej. Wielkość średniej średnicy zewnętrznej wynosi o,28 ± 0,01 mm i jest trzykrotnie mniejsza od zewnętrznej średnicy zewnętrznej dyszy głowicy.

Jak widać na zdjęciu fig. 5, komórki drożdży rozmieszczone są w środku mikrokapsułki, w kuli o średnicy 190 m i otoczone są membraną alginianową o średniej grubości 41 μm.

P r z y k ł a d III

W celu sprawdzenia możliwości wytworzenia trwałych mikrokapsułek w układzie dwóch cieczy nie mieszających się ze sobą, przy pomocy urządzenia i głowicy JB/3 według wynalazku (fig. 1 i fig. 3) przeprowadzono doświadczenie, w którym jako ciecz rdzeniową zastosowano roztwór witaminy E (octan tokoferolu) o stężeniu 300 mg/ml w oleju arachidowym (Medana Pharma Group S.A., Polska) i 1,5%-owy roztwór alginianu sodu (lepkość nominalna 2% wodnego roztworu 3500 mPas, Sigma, USA) w 0,9% wodnym roztworze NaCl (Baxter Terpol, Sieradz, Polska) jako ciecz zewnętrzną. Postępowano zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie I.

Na generatorze napięcia ustawiono następujące parametry pracy:

- tryb pracy - napięcie podawane impulsowo,

- wartość napięcia U = 21 kV,

- czas podawania impulsu elektrycznego τ = 5 ms,

- częstotliwość podawania impulsu elektrycznego f = 30 Hz.

Wyniki znajdują się w tabeli 5.

T a b e l a 5

Parametry fizyczne mikrokapsułek

Symbol próbki	Dz [mm]	VC Dz [%]	Dw [mm]	VC Dw [%]	d ^m]	VC d [%]	Vw [ml/min]	Vz [ml/min]
vEA-1	0,82	6	0,49	8	168	16	0,04	0,29

W rezultacie otrzymano sferyczne, jednorodne mikrokapsułki o bardzo małym rozrzucie średnic - 6% dla średnicy zewnętrznej i 8% dla średnicy wewnętrznej. Wielkość średniej średnicy zewnętrznej wynosi 0,82 ± 0,05 mm i jest mniejsza od zewnętrznej średnicy zewnętrznej dyszy głowicy. Odpowiednio do tego, średnia średnica wewnętrzna (średnice kropel fazy olejowej, znajdujących się wewnątrz kapsułek alginianowych) wynosi 0,49 ± 0,04 mm. Średnia grubości błon alginianowych wynosi od 168 ± 30 μm. Widok mikrokapsułek spod mikroskopu optycznego, przy 40-krotnym powiększeniu pokazano na rysunku fig. 6a.

P r z y k ł a d IV

W celu sprawdzenia możliwości wytwarzania mikrokapsułek metodą według wynalazku, przy zastosowaniu pola stałego, w układzie hydrofilowo/hydrofobowym, wykonano doświadczenie analogiczne do podanego w przykładzie III, stosując następujące parametry procesu:

- tryb pracy - napięcie stałe,

- wartość napięcia U = 19 kV,

- ciśnienie cieczy rdzeniowej Pw = 0,1 At,

- ciśnienie cieczy zewnętrznej Pz = 0,6 At.

Parametry fizyczne mikrokapsułek zawiera tabela 7.

T a b e l a 7

Parametry fizyczne mikrokapsułek olejowo-alginianowych wytworzonych w polu stałym

Symbol próbki	Dz [mm]	VC Dz [%]	Dw [mm]	VC Dw [%]	d ^m]	VC d [%]	Vw [ml/min]	Vz [ml/min]
vEA-2	0,92	13	0,68	12	240	20	0,07	0,29

W rezultacie otrzymano sferyczne, jednorodne mikrokapsułki o małym rozrzucie średnic - 13% dla średnicy zewnętrznej i 12% dla średnicy wewnętrznej. Wielkość średniej średnicy zewnętrznej wynosi 0,92±0,06 mm i jest mniejsza od zewnętrznej średnicy zewnętrznej dyszy głowicy. OdpowiedPL 208 384 B1 nio do tego, średnia średnica wewnętrzna (średnice kropel fazy olejowej, znajdujących się wewnątrz kapsułek alginianowych) wynosi 0,65 ± 0,12 mm. Średnia grubości błon alginianowych wynosi od 240 ± 150 μ m. Widok mikrokapsułek spod mikroskopu optycznego, przy 40-krotnym powię kszeniu pokazano na zdjęciu fig. 6b.

P r z y k ł a d V. Badanie wpływu pola elektrycznego na przeż ywalność żywych komórek, enkapsulowanych w mikromatrycach polisacharydowych

Wpływ pola elektrycznego użytego w omawianej metodzie, na przeżywalność opłaszczanych żywych komórek ssaków zbadano na aparacie jednodyskowym; z zastosowaniem dwóch modelowych układów komórek:

1. zawiesina mysich komórek limfoidalnych WEHI-3B w 1,5% roztworze alginianu sodu o średniej lepkości w soli fizjologicznej;

2. komórki ludzkich przytarczyc zawieszone w takim samym roztworze.

W obu przypadkach doś wiadczenia wykonano jałowo (boks laminarny, aparatura, narzę dzia i roztwory sterylizowane). Oba rodzaje mikrokapsułek hodowano następnie w cieplarce, w pożywce hodowlanej przez 28 i 21 dni, odpowiednio. Przeżywalność opłaszczonych komórek przytarczyc badano pobierając próbki pożywki z hodowli i oznaczając w nich stężenie produkowanego przez komórki przytarczyc hormonu PTH. Stwierdzono, że po 5 dniach stężenie PTH było wysokie i wynosiło 2590 pg/ml. Uznano to za wytaczający dowód na to, że zastosowana procedura nie zabiła, ani nie uszkodziła komórek przytarczyc, ponieważ zachowały one swoje podstawowe funkcje, w tym najważniejszą z punktu widzenia zastosowania - zdolność wytwarzania PTH. Wynik badania przeżywalności komórek opisano w literaturze naukowej [Electrostatic microencapsulation of parathyroid cells as a tool for the investigation of cells activity after transplantation. S. Rosiński, D. Lewińska, M. Migaj, B. Woźniewicz and A. Weryński, Landbauforschung Voelkenrode, SH, 241,47-50, 2002].

Przeżywalność opłaszczanych w żelu alginianowym komórek WEHI-3B badano przez 4 tygodnie hodowli, monitorując ich zdolność do produkowania interleukiny-3 (IL-3). Zastosowano metodę pośrednią z użyciem zależnych od IL-3 komórek BF-4. Po 4 tygodniach hodowania stwierdzono, że opłaszczone WEHI-3B nadal żyją i produkują IL-3. Wynik badania przeżywalności komórek opisano w literaturze naukowej [Selected aspects of microencapsulated cells cultivation exemplified for hybridoma and parathyroid cells. D. Lewińska, S. Rosiński, L. Granicka, B. Woźniewicz, J. Kawiak and A. Weryński, Proceedings of the X-th BRG Workshop „Cell Physiology and Interactions of Biomaterials and Matrices”, Praga, Republika Czeska, 26-28 kwietnia 2002].

W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, ż e:

1. Sposób i urządzenie według wynalazku, zawierające odpowiednio skonstruowaną głowicę umożliwia dokładne opłaszczenie żywych komórek lub ich zbiorów (agregaty, fragmenty tkanek) wewnątrz kulistych matryc korzystnie polisacharydowych o niewielkich rozmiarach (od 10 do 3000 μm) tak, że wszystkie komórki w całości otoczone są materiałem matrycy, bez wystawania poza zewnętrzną krawędź mikrokapsułki.

2. Urządzeniem według wynalazku i opisaną procedurą całkowite opłaszczenie komórek lub innego materiału biologicznego uzyskuje się poprzez wytworzenie in situ podwójnej kropli typu: kropla cieczy zawierającej materiał biologiczny powstająca wewnątrz kropli materiału opłaszczającego, co powoduje dokładne otoczenie opłaszczanego materiału (komórek lub ich zbiorów) przez warstwę substancji opłaszczającej.

3. Wytworzenie podwójnej kropli uzyskuje się urządzeniem według wynalazku z wykorzystaniem dodatkowej siły zrywającej kroplę, korzystnie elektrostatycznej, wytworzonej za pomocą generatora elektrycznego o stałym, impulsowym lub zmiennym napięciu. Zastosowana dodatkowa siła zrywająca umożliwia wytworzenie kropel o średnicach znacznie mniejszych od zewnętrznej średnicy zewnętrznej dyszy zastosowanej w wynalazku głowicy.

4. Metoda według wynalazku umożliwia sterowanie wielkością średnicy zewnętrznej wytwarzanych mikrokapsułek w przedziale od 10 do 300 μτη oraz grubością warstw opłaszczających w przedziale od 3 do 600 μm, dzięki zastosowaniu odpowiednio dobranych parametrów procesu.

5. Wielkości i wzajemny stosunek średnic wytwarzanych za pomocą urządzenia kropel jest regulowany parametrami procesu, szczególnie wzajemnym stosunkiem przepływu cieczy zewnętrznej do przepływu cieczy wewnętrznej, korzystnie większym od 0,5.

6. Urządzenie i metoda według wynalazku zapewniają całkowitą przeżywalność opłaszczanych żywych komórek.

PL 208 384 B1

7. Opisane urządzenie zawierające odpowiednio skonstruowaną głowicę według wynalazku umożliwia wytworzenie mikrokapsułek hydrofilowo-hydrofilowych, korzystnie z polimerów polisacharydowych oraz hydrofobowo-hydrofilowych (olejowo-alginianowych) w jednym etapie.

Claims

1. Sposób jednoetapowego wytwarzania mikrokapsułek, zwłaszcza zawierających żywe komórki, ich zbiory lub naturalne, bądź syntetyczne substancje biologicznie aktywne, znamienny tym, że wytwarza się strumień podwójnych kropli, wewnątrz których znajduje się opłaszczany (enkapsulowany) materiał biologiczny, zawieszony lub rozpuszczony w cieczach hydrofilowych lub hydrofobowych, otoczony warstwą materiału błonotwórczego, za pomocą głowicy w postaci podwójnej dyszy, przykładając jednocześnie pole elektryczne, a wytworzony w ten sposób strumień kropel utwardza się, utrwalając strukturę półprzepuszczalnej błony, korzystnie poprzez umieszczenie ich w zawierającej kationy wielowartościowe (co najmniej dwuwartościowe) łaźni żelującej, do otrzymania gotowej mikrokapsułki.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarza się mikrokapsułki o rozmiarach od

10 do 3000 μm, zawierające żywe komórki ludzkie, zwierzęce lub roślinne oraz ich zbiory (agregaty lub fragmenty tkanek), a także mikrokapsułki hydrofobowo-hydrofilowe, zawierające hydrofobowy materiał biologicznie aktywny naturalny lub syntetyczny.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako materiał błonotwórczy stosuje się materiały znane ze stanu techniki, zwłaszcza polisacharydy żelujące przy udziale kationów wielowartościowych, co najmniej dwuwartościowych, takich jak sól sodowa alginianów oraz pektyny niskometoksylowane, oraz termoutwardzalne, utwardzane poprzez obniżenie temperatury roztworu, suszenie, takie jak skrobia i agaroza oraz białka, jak żelatyna, a także ich pochodne.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako materiał biologiczny stosuje się materiały znane ze stanu techniki, wybrane z grupy obejmującej żywe komórki ssaków, zwłaszcza WEHI-3B, ludzkie przytarczyce, drożdże lub ich zbiory, zwłaszcza ludzkie i zwierzęce wyspy trzustkowe, a także hydrofilowe i hydrofobowe substancje biologicznie czynne naturalne lub syntetyczne, zwłaszcza tran, witaminę D i A lub octan tokoferolu.

5. Urządzenie do jednoetapowego wytwarzania mikrokapsułek według wynalazku, znamienne tym, że zawiera specjalną głowicę, wyposażoną w dwie współosiowe dysze, wewnętrzną (1) i zewnętrzną (2), umożliwiające jednoczesne tłoczenie dwóch cieczy, generator pola elektrycznego (11) (stałego, impulsowego lub zmiennego), który podłączony jest przewodem wysokiego potencjału (12) do metalowej części dyszy, a przewodem niskiego potencjału (13) do łaźni żelującej (6), do kolekcjonowania gotowych mikrokapsułek.

6. Urządzenie według zastrz. 5, znamienne tym, że głowica wyposażona jest w dyszę wewnętrzną (1) i dyszę zewnętrzną (2), wlot cieczy wewnętrznej (3), wlot cieczy zewnętrznej (4) i kanalik (5) doprowadzający ciecz błonotwórczą do dyszy zewnętrznej.