PL204826B1 - Sposób immobilizacji lipazy Mucor circinelloides - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób immobilizacji lipazy Mucor circinelloides.

Z czasopisma Biotechnologia PI 44 (1999) s. 172 jest znany sposób kapsułkowania immobilizowanych in situ endolipaz Mucor w żelu alginianowym i karagenowym

W czasopiś mie Biotechnology Techniques 11 (1997) s. 9 opisano sposób pułapkowania immobilizowanej in situ endolipazy Mucor javanicus w żelu krzemionkowym.

Natomiast w czasopiśmie Journal Molecular Catalysis B: Enzymatic 19-20 (2002) s. 261 opisano sposób pułapkowania związanych z membranami komórkowymi lipaz Mucor w alkoholu poliwinylowym.

Sposób immobilizacji lipazy Mucor circinelloides, w drodze zmieszania immobilizowanej in situ w strukturach komórkowych lipazy z roztworem polimeru, korzystnie chitozanu, ż elatyny, alkoholu poliwinylowego lub ich mieszaniny, w buforze oraz umieszczenia mieszaniny polimeru i lipazy w roztworze koagulującym, według wynalazku polega na tym, że immobilizacji poddaje się lipazę w postaci odwodnionego i rozdrobnionego do wielkości drobin 3-10 μm mycelium, którą miesza się z roztworem polimeru w kwasie octowym lub mlekowym, wzbogaconym korzystnie gliceryną lub poliwinylopirolidonem dodanymi w ilości 1-12% w stosunku do masy całej mieszaniny, ewentualnie zawierającym zagęszczacz, stosując 1-10% lipazy w stosunku do masy polimeru, po czym otrzymaną, jednorodną mieszaninę odpowietrza się pod próżnią w czasie 15-45 minut, wkrapla się do roztworu koagulującego i inkubuje w temperaturze pokojowej w czasie 60-360 minut. Otrzymany w wyniku inkubacji preparat lipazy, w postaci kulek o wymiarach 1-4 mm lub nitek o średnicy 1-5 mm, odwadnia się acetonem lub liofilizuje i przechowuje w zamkniętych naczyniach w temperaturze 4°C. Stosuje się chitozan o masie cząsteczkowej 10000-70000 kD, stopniu deacetylacji 20-90% i wilgotności 9-14% oraz alkohol poliwinylowy o masie cząsteczkowej 20000-80000 kD. Jako roztwór koagulujący stosuje się 1-10% roztwór tripolifosforanu lub heksametapolifosforanu w buforze o pH 5-8 lub 0,1-5% roztwór aldehydu glutarowego w buforze o pH 5-8, zawierający 0,05-5% CaCl2. Jako zagęszczacz używa się poliwinylopirolidon lub alginian sodowy.

Sposób immobilizacji lipazy Mucor circinelloides, w drodze zmieszania immobilizowanej in situ w strukturach komórkowych lipazy z roztworem polimeru, korzystnie chitozanu, żelatyny, alkoholu poliwinylowego lub ich mieszaniny, w buforze oraz umieszczenia mieszaniny polimeru i lipazy w roztworze koagulującym w postaci oleju rzepakowego, według wynalazku polega również na tym, że odpowietrzoną mieszaninę lipazy z polimerem wkrapla się do oleju rzepakowego schłodzonego do temperatury od -40°C do -15°C i inkubuje w czasie 5-48 godzin, po czym otrzymany preparat ogrzewa do temperatury 25°C i ponownie zamraża do temperatury od -40°C do -15°C, powtarzając czynności zamrażania i ogrzewania 2-5-krotnie, następnie preparat przemywa się, odwadnia acetonem lub liofilizuje i przechowuje w zamkniętych naczyniach w temperaturze 4°C.

Sposób według wynalazku zezwala na otrzymanie aktywnych i stabilnych preparatów lipazy Mucor circinelloides o rozkładzie objętości porów umożliwiającym efektywny transport substratów i produktów. Preparaty lipaz wytworzone sposobem według wynalazku są przeznaczone do katalizy reakcji estryfikacji w środowisku rozpuszczalników organicznych, korzystnie sacharydów i kwasów tłuszczowych, alkoholi i kwasów tłuszczowych oraz do hydrolizy estrów w środowisku wodnym. Sposób według wynalazku ilustrują bliżej podane niżej przykłady.

P r z y k ł a d I.

Do 100 ml 2,7% roztworu chitozanu o masie cząsteczkowej 45800 kD, stopniu deacetylacji 77,6% i wilgotności 12,8%, w 1,2% kwasie octowym dodano 2,5 g lipazy Mucor circinelloides immobilizowanej in situ w strukturach komórkowych, w postaci odwodnionego i rozdrobnionego mycelium i całość mieszano do osiągnięcia jednorodnej mieszaniny, którą następnie odpowietrzano pod próżnią w czasie 25 minut. Otrzymaną mieszaninę lipaza-chitozan wkroplono do 5% roztworu heksametapolifosforanu w buforze Tris-HCl o pH 7,0 i inkubowano w czasie 75 minut. Wytworzony preparat lipazy w postaci kulek przemyto 3-razy acetonem i pozostawiano do wysuszenia w temperaturze pokojowej. Preparat immobilizowanej lipazy przechowywano w zamkniętych naczyniach w temperaturze 4°C.

P r z y k ł a d II.

Do 100 ml 4,5% roztworu chitozanu o masie cząsteczkowej 45800 kD, stopniu deacetylacji 77,6% i wilgotności 12,8%, w 1,8% kwasie octowym dodano dodawano 5% poliwinylopirolidonu i 4,5 g lipazy Mucor circinelloides immobilizowanej in situ w strukturach komórkowych, w postaci odwodnionego i rozdrobnionego mycelium. Całość mieszano do osiągnięcia jednorodnej mieszaniny, którą następnie odpowietrzano pod próżnią w czasie 45 minut. Wytworzoną mieszaninę lipaza-chitozan wkraplano do

PL 204 826 B1

5% roztworu heksametapolifosforanu w buforze Tris-HCl o pH 7,0 i inkubowano w czasie 75 minut. Otrzymano preparat lipazy w postaci kulek. Dalej postępowano jak w przykładzie 1.

P r z y k ł a d III.

Do 100 ml 4,5% roztworu chitozanu o masie cząsteczkowej 45800, stopniu deacetylacji 77,6% i wilgotno ś ci 12,8%, w 1,8% kwasie mlekowym dodano 1,2 g alkoholu poliwinylowego o masie czą steczkowej 72000 kD, stopniu polimeryzacji 1600 i stopniu deacetylacji 97,5-99,5% oraz 4,5 g lipazy Mucor circinelloides immobilizowanej in situ w strukturach komórkowych, w postaci odwodnionego i rozdrobnionego mycelium. Całość mieszano do osiągnięcia jednorodnej mieszaniny, którą następnie odpowietrzano pod próżnią w czasie 45 minut. Wytworzoną mieszaninę lipaza-chitozan wkraplano do 5% roztworu tripolifosforanu w buforze Tris-HCl o pH 7,0 i inkubowano w czasie 240 minut. Otrzymano preparat lipazy w postaci kulek. Dalej postępowano jak w przykładzie 1.

P r z y k ł a d IV.

Do 40 ml 25% roztworu żelatyny w buforze octanowym o pH 5 dodano 2,5 g alginianu sodu, 60 ml glicerolu i 2 g lipazy w postaci odwodnionego i rozdrobnionego mycelium lipazy Mucor circinelloides immobilizowanej in situ w strukturach komórkowych. Całość mieszano do osiągnięcia jednorodnej mieszaniny, którą odpowietrzano pod próżnią w czasie 15 minut. Wytworzoną mieszaninę wstrzykiwano do 250 ml 1% aldehydu glutarowego, zawierającego 20 mM CaCl2 i inkubowano w czasie 1 godziny w temperaturze 25°C. Wytworzony preparat lipazy, w postaci nitek o średnicy 3 mm, przemyto wodą, liofilizowano i przechowywano w temperaturze 4°C.

P r z y k ł a d V.

Do 100 ml 14% roztworu alkoholu poliwinylowego o masie cząsteczkowej 72000 kD, stopniu polimeryzacji 1600 i stopniu deacetylacji 97,5-99,5%, w wodzie destylowanej dodano 2 g lipazy Mucor circinelloides immobilizowanej in situ w strukturach komórkowych, w postaci odwodnionego i rozdrobnionego mycelium i całość mieszano do osiągnięcia jednorodnej mieszaniny. Wytworzoną mieszaninę odpowietrzano pod próżnią w czasie 45 minut, wkraplano do oleju rzepakowego schłodzonego do temperatury 0°C i inkubowano w temperaturze -20°C w czasie 10 godzin. Następnie uformowany w postaci kulek preparat lipazy ogrzewano do temperatury 25°C i ponownie zamraż ano do temperatury -20°C. Czynność tę powtarzano trzykrotnie. Kuleczki preparatu przemyto następnie wodą z dodatkiem 0,1% tritonu X-100 i dalej postępowano jak w przykładzie 1.

P r z y k ł a d VI.

ml 4,5% roztworu chitozanu o masie cząsteczkowej 45800 kD, stopniu deacetylacji 77,6% i wilgotności 12,8%, w 1,8% kwasie octowym zmieszano z 20 ml 25% roztworu ż elatyny napęczniałej w wodzie i dodano 4,5 g lipazy Mucor circinelloides immobilizowanej in situ w strukturach komórkowych, w postaci odwodnionego i rozdrobnionego mycelium. Całość mieszano do osiągnięcia jednorodnej mieszaniny, którą następnie odpowietrzano pod próżnią w czasie 45 minut. Otrzymaną mieszaninę lipaza-chitozan-żelatyna wkraplano do 5% roztworu heksametapolifosforanu w buforze Tris-HCl o pH 7,0 i inkubowano w czasie 75 minut. Wytworzony preparat lipazy, w postaci kulek, sieciowano 1% roztworem aldehydu glutarowego, przemyto 1% glicyną, odwodniono przemywając 3-razy acetonem i liofilizowano. Preparat immobilizowanej lipazy przechowywano w zamkniętych naczyniach w temperaturze 4°C.

Claims (10)

1. Sposób immobilizacji lipazy Mucor circinelloides, w drodze zmieszania immobilizowanej in situ w strukturach komórkowych lipazy z roztworem polimeru, korzystnie chitozanu, żelatyny, alkoholu poliwinylowego lub ich mieszaniny, w buforze oraz umieszczenia mieszaniny polimeru i lipazy w roztworze koagulującym, znamienny tym, że immobilizacji poddaje się lipazę w postaci odwodnionego i rozdrobnionego do wielko ś ci drobin 3-10 μ m mycelium, którą miesza się z roztworem polimeru w kwasie octowym lub mlekowym, wzbogaconym korzystnie gliceryną lub poliwinylopirolidonem dodanymi w ilości 1-12% w stosunku do masy całej mieszaniny, ewentualnie zawierającym zagęszczacz, stosując 1-10% lipazy w stosunku do masy polimeru, po czym otrzymaną, jednorodną mieszaninę odpowietrza się pod próżnią w czasie 15-45 minut, wkrapla się do roztworu koagulującego i inkubuje w temperaturze pokojowej w czasie 60-360 minut, po czym otrzymany w wyniku inkubacji preparat lipazy, w postaci kulek o wymiarach 1-4 mm lub nitek o średnicy 1-5 mm, odwadnia się acetonem lub liofilizuje i przechowuje w zamkniętych naczyniach w temperaturze 4°C.

PL 204 826 B1

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się chitozan o masie cząsteczkowej 10000-70000 kD, stopniu deacetylacji 20-90% i wilgotności 9-14%.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ż e stosuje się alkohol poliwinylowy o masie cząsteczkowej 20000-80000 kD.

4. Sposób wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e jako roztwór koagulują cy stosuje się 1-10% roztwór tripolifosforanu lub heksametapolifosforanu w buforze o pH 5-8.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako roztwór koagulujący stosuje się 0,1-5% roztwór aldehydu glutarowego w buforze o pH 5-8, zawierający 0,05-5% CaCl2.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ż e jako zagęszczacz używa się poliwinylopirolidon lub alginian sodowy.

7. Sposób immobilizacji lipazy Mucor circinelloides, w drodze zmieszania immobilizowanej in situ w strukturach komórkowych lipazy z roztworem polimeru, korzystnie chitozanu, żelatyny, alkoholu poliwinylowego lub ich mieszaniny, w buforze oraz umieszczenia mieszaniny polimeru i lipazy w roztworze koagulującym w postaci oleju rzepakowego, znamienny tym, że immobilizacji poddaje się lipazę w postaci odwodnionego i rozdrobnionego do wielkości drobin 3-10 μm mycelium, którą miesza się z roztworem polimeru w kwasie octowym lub mlekowym, wzbogaconymi korzystnie gliceryną lub poliwinylopirolidonem dodanymi w ilości 1-12% w stosunku do masy całej mieszaniny, ewentualnie zawierającym zagęszczacz, stosując 1-10% lipazy w stosunku do masy polimeru, po czym otrzymaną, jednorodną mieszaninę odpowietrza się pod próżnią w czasie 15-45 minut, odpowietrzoną mieszaninę wkrapla się do oleju rzepakowego schłodzonego do temperatury od -40°C do -15°C i inkubuje w czasie 5-48 godzin, po czym otrzymany preparat ogrzewa do temperatury 25°C i ponownie zamraża do temperatury od -40°C do -15°C, powtarzając czynności zamrażania i ogrzewania 2-5-krotnie, następnie preparat przemywa się, odwadnia acetonem lub liofilizuje i przechowuje w zamkniętych naczyniach w temperaturze 4°C.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się chitozan o masie cząsteczkowej 10000-70000 kD, stopniu deacetylacji 20-90% i wilgotności 9-14%.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się alkohol poliwinylowy o masie cząsteczkowej 20000-80000 kD.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako zagęszczacz używa się poliwinylopirolidon lub alginian sodowy.