PL204151B1 - Środek do zwalczania grzybicy wapiennej u pszczół - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest środek do zwalczania grzybicy wapiennej u pszczół.

Grzybica wapienna, inaczej zwana grzybicą otorbielakową, jest chorobą, dziesiątkującą rodziny pszczele i powodującą znaczne straty w produkcji miodu, a wywoływaną przez szczep grzybów Ascosphaera apis. Atakuje głównie czerw i poraża nawet do 50% czerwia we wszystkich stadiach rozwoju.

Znane substancje o działaniu przeciwgrzybiczym stosowane dotychczas to sól cholinowa N-glukozylopolifunginy, amfoterycyna B, nystatyna, klotrimazol i inne. Stosowano je w różnych formach użytkowych, takich jak roztwór lub zawiesina wodna substancji przeciwgrzybiczej do opryskiwania ramek i wnętrza ula, lecznicze syropy dokarmiające zawierające substancję przeciwgrzybiczą oraz roztwory do odparowania wewnątrz ula. Żaden z tych środków nie zapewnia 100% skuteczności i każ dy z nich po pewnym okresie stosowania na danym terenie indukuje powstawanie opornych szczepów grzybów. Konieczne jest więc prowadzenie ciągłych badań nad znalezieniem nowych aktywnych czynników przeciwko Ascosphaera apis.

Z opisu patentowego RP nr P-338 838 znane jest stosowanie do zwalczania wywołującego grzybicę wapienną u pszczół szczepu Ascosphaera apis grupy pochodnych imidazolu o właściwościach przeciw-grzybiczych, takich jak tiokonazol, ketokonazol, mikonazol, flukonazol i inne.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że znane pochodne imidazolu o działaniu przeciwgrzybiczym, takie jak tiokonazol, ketokonazol, mikonazol, flukonazol, enilkonazol i inne zarówno w badaniach in vitro jak i w próbach pasiecznych charakteryzują się silnym synergizmem działania przeciwko grzybom ze szczepu Ascosphaera apis, gdy stosowane są łącznie ze słabym kwasem organicznym, takim jak, szczawiowy, cytrynowy, octowy, mlekowy i inne oraz słabym kwasem nieorganicznym.

Przedmiotem wynalazku jest środek do zwalczania grzybicy u pszczół w postaci syropu leczniczego, paska z tworzywa sztucznego z inkorporowaną substancją aktywną, paska z tektury lub drewna nasycanego substancją aktywną, powlekanego paska z tworzywa sztucznego z mikrowarstwą zawierającą substancję aktywną. Substancję aktywną stanowi mieszanina słabego kwasu nieorganicznego lub organicznego z imidazolowym czynnikiem przeciwgrzybowym, takim jak tiokonazol, ketokonazol, mikonazol, flukonazol, enilkonazol lub ich mieszanina.

Jako słaby kwas organiczny stosuje się, kwas cytrynowy, szczawiowy lub octowy, zaś jako słaby kwas nieorganiczny kwas fosforowy lub borowy. Środek według wynalazku można stosować w postaci roztworu wodnego lub w postaci innych zwykle stosowanych form przeznaczonych do leczenia pszczół.

Środek przeciwgrzybiczy w postaci syropu leczniczego to roztwór syropu dokarmiającego, zawierający cukier rozpuszczony w wodzie w stosunku od 1:10 do 5:1, w którym ilość imidazolowej pochodnej przeciwgrzybiczej wynosi od 0,01 do 10,0% wagowych oraz ilość kwasu wynosi od 0,01 do 40,00% wagowych.

Jeśli środek przeciwgrzybiczy jest w postaci paska z tworzywa sztucznego z inkorporowaną substancją aktywną to zawartość imidazolowej pochodnej przeciwgrzybiczej wynosi w nim od 50 do 500 mg, a ilość kwasu wynosi od 50 do 1000 mg w pasku o wymiarach 45 x 20 x 2 mm.

Jeśli środek przeciwgrzybiczy jest w postaci paska z drewna lub tektury nasyconego substancją aktywną to zawartość imidazolowej pochodnej przeciwgrzybiczej w pasku wynosi od 50 do 500 mg, a ilość kwasu wynosi od 50 do 1000 mg w pasku.

Jeśli środek przeciwgrzybiczy jest w postaci paska z tworzywa sztucznego powleczonego mikrowarstwą z tworzywa sztucznego to zawartość imidazolowej pochodnej przeciwgrzybiczej w mikrowarstwie wynosi od 20 do 200 mg w jednym pasku. Mikrowarstwa składa się z substancji aktywnej w iloś ci od 5 do 15%, kwasu w ilości od 5 do 30% oraz polimeru, takiego jak, polistyren, polietylen, polichlorek winylu, polipropylen i inne lub ich mieszaniny.

Badania in vitro przeprowadzono na szczepach Ascophera apis wyizolowanych z zakażonych padłych pszczół. Próby na zwalczanie zarodników prowadzono metodą krążków bibułowych, zaś na zahamowanie wzrostu grzybni metodą dyfuzji do agaru. Wyniki badania in vitro przedstawiono w tablicy 1, w przykładzie I. Przykładowo opisano je na kombinacji ketokonazolu lub enilkonazolu i kwasu cytrynowego.

Badania pasieczne przeprowadzono w okresie jesiennym. Porażenie grzybicą wapienną oznaczano licząc całkowitą powierzchnię czerwiu w rodzinie, ilość komórek ze zmumifikowanym czerwiem w plastrach, a nastę pnie obliczają c procentowy udzia ł czerwiu chorego.

P r z y k ł a d I

Badania in vitro

PL 204 151 B1

T a b l i c a 1

Oznaczanie aktywności kombinacji ketokonazolu lub enilkonazolu i kwasu cytrynowego wobec Ascophera apis w badaniu in vitro

Nr	Badana kombinacja	% zahamowania wzrostu
zarodniki	grzybnia
1.	2% ketokonazol w DMF	61,6	-
2.	2% enilkonazolu w DMF	72,3%	-
3.	4% ketokonazolu + 33% kwasu cytrynowego w glikolu propylenowym	96,9	100
4.	4% ketokonazolu + 5% kwasu cytrynowego w glikolu propylenowym	66,6	91,4
5.	4% ketokonazolu + 5% kwasu cytrynowego w wodzie	82,0	91,4
6.	3% enilkonazolu + 5% kwasu cytrynowego w wodzie	79,3	92,4
7.	5% kwasu cytrynowego w glikolu propylenowym	0,0	42,8
8.	5% kwasu cytrynowego w wodzie	0,0	28,6
9.	2% ketokonazolu + 5% kwasu szczawiowego w wodzie	92,4	98,2
10.	2% ketokonazolu + 5% kwasu fosforowego w wodzie	93,5	99,4
11.	2% ketokonazolu + 5% kwasu octowego w wodzie	88,4	90,2

P r z y k ł a d II

Przygotowanie syropu leczniczego z klotrimazolem.

2,0 g klotrimazolu i 2,0 g kwasy fosforowego rozpuszczono w 100 ml glikolu propylenowego i dodano do 0,9 litra syropu o stosunku cukru do wody wynoszącym 2:1. Całość dokładnie wymieszano i stosowano do dokarmiania rodziny pszczelej.

P r z y k ł a d III

Przygotowanie syropu leczniczego z flukonazolem.

2,0 g flukonazolu i 10,0 g kwasu octowego rozpuszczono w 100 ml glikolu propylenowego i dodano do 0,9 litra syropu o stosunku cukru do wody wynoszącym 2:1. Całość dokładnie wymieszano i stosowano do dokarmiania rodziny pszczelej.

P r z y k ł a d IV

Przygotowanie syropu leczniczego z ketokonazolem.

2,0 g ketokonazolu + 15,0 g kwasu szczawiowego rozpuszczono w 100 ml glikolu propylenowego i dodano do 0,9 litra syropu o stosunku cukru do wody wynoszącym 2:1. Całość dokładnie wymieszano i stosowano do dokarmiania rodziny pszczelej.

P r z y k ł a d V

Przygotowanie syropu leczniczego z tiokonazolem.

2,0 g tiokonazolu i 3,0 g kwasu octowego rozpuszczono w 100 ml glikolu propylenowego i dodano do 0,9 litra syropu o stosunku cukru do wody wynoszącym 2:1. Całość dokładnie wymieszano i stosowano do dokarmiania rodziny pszczelej.

P r z y k ł a d VI

Przygotowanie syropu leczniczego z enilkonazolem.

2,0 g enilkonazolu + 15,0 g kwasu szczawiowego rozpuszczono w 100 ml glikolu propylenowego i dodano do 0,9 litra syropu o stosunku cukru do wody wynoszącym 2:1. Całość dokładnie wymieszano i stosowano do dokarmiania rodziny pszczelej.

P r z y k ł a d VII

Przygotowanie syropu leczniczego z ketokonazolem i tiokonazolem.

1,0 g ketokonazolu, 0,5 g tiokonazolu i 5,0 g kwasu fosforowego rozpuszczono w 100 ml glikolu propylenowego i dodano do 0,9 litra syropu o stosunku cukru do wody wynoszącym 2:1. Całość dokładnie wymieszano i stosowano do dokarmiania rodziny pszczelej.

P r z y k ł a d VIII

Przygotowanie syropu leczniczego z ketokonazolem.

PL 204 151 B1

1,0 g ketokonazolu i 25,0 g kwasu szczawiowego rozpuszczono w 100 ml glikolu propylenowego i dodano do 0,9 litra syropu o stosunku cukru do wody wynoszącym 2:1. Całość dokładnie wymieszano i stosowano do dokarmiania rodziny pszczelej.

P r z y k ł a d IX

Przygotowanie syropu leczniczego z tiokonazolem.

2,0 g tiokonazolu i 35,0 g kwasu szczawiowego rozpuszczono w 100 ml glikolu propylenowego i dodano do 0,9 litra syropu o stosunku cukru do wody wynoszącym 2:1. Całość dokładnie wymieszano i stosowano do dokarmiania rodziny pszczelej.

P r z y k ł a d X

Przygotowanie syropu leczniczego z ketokonazolem.

2,0 g ketokonazolu i 35,0 g kwasu cytrynowego rozpuszczono w 100 ml glikolu propylenowego i dodano do 0,9 litra syropu o stosunku cukru do wody wynoszą cym 2:1. Cał o ść dokł adnie wymieszano i stosowano do dokarmiania rodziny pszczelej.

P r z y k ł a d XI

Badanie skuteczności syropów leczniczych uzyskanych według sposobów opisanych w przykładach II-VII.

Ocenę porażenia pszczół grzybicą wapienną przeprowadzono przed i po 14 dniach dokarmiania w okresie jesiennym oceniają c ilość mumii na 1 dm². Skuteczność zabiegu jako wartoś ci ilorazu wielkości porażenia przed i po zabiegu przedstawiono w tablicy 2.

T a b l i c a 2

Badania pasieczne środków przeciwgrzybiczych w postaci syropu leczniczego.

Środek przeciwgrzybowy wg przykładu nr :	Porażenie przed zabiegiem (liczba mumii w dm2)	Porażenie po zabiegu (liczba mumii w dm2)	Skuteczność zabiegu w %
II	5,3	0,4	92,4
III	5,8	0,4	93,1
IV	4,8	0,2	95,8
V	4,9	0,7	85,7
VI	4,9	0,4	91,8
VII	5,9	0,3	94,9
VIII	5,2	0,3	94,2
IX	5,7	0,9	84,2
X	5,2	0,2	96,1
XI	4,9	0,4	91,8
Kontrola	4,8	6,0	-

W próbie kontrolnej 100 ml glikolu propylenowego dodano do 0,9 litra syropu zawierają cego cukier i wodę w ilości 2:1 i tym roztworem dokarmiano pszczoły.

P r z y k ł a d XII

Paski z tworzywa sztucznego z inkorporowaną substancją przeciwgrzybiczą.

Przygotowano taśmę o grubości 2 mm z polietylenu zawierającego ketokonazol i kwas szczawiowy w stosunku wagowym 1:5. Z taśmy tej wycięto paski o wymiarach 20 x 4,5 x 2 mm. Po pocięciu pasków na kawałki o wymiarach 5 x mm kawałki te mieszano w 50 ml acetonu w ciągu 4 godzin i następnie metodą HPLC oznaczono zawartość ketokonazolu. Paski zawierały średnio po 345 mg substancji aktywnej.

paski zawieszono w ulu i przetrzymywano w czasie 6 tygodni. Poraż enie grzybicą wapienną z 6,0 mumii/dm² zmniejszył o się do 0,8 mumii/dm² - tzn skuteczność zabiegu wyniosł a 86,6%.

PL 204 151 B1

P r z y k ł a d XIII

Paski z tektury nasycane substancją przeciwgrzybiczą.

Flukonazol (2,0 g) i kwas szczawiowy (10,0 g) rozpuszczono w 50 ml glikolu propylenowego i 50 ml wody i do roztworu dodano 50 g cukru. Po rozpuszczeniu, uzyskanym roztworem nasycano paski z tektury o wymiarach 200 x 45 x 2 mm. Po rozdrobnieniu i ekstrakcji acetonem zawartość flukonazolu w pasku oznaczano metodą HPLC. W każdym pasku znajdowało się 280 mg flukonazolu. 4 paski zawieszono w ulu i przetrzymywano w czasie 6 tygodni. Poraż enie grzybicą wapienną z 5,4 mumii/dm² zmniejszył o się do 0,5 mumii/dm² co daje skuteczność zabiegu w wysokoś ci 90,7%.

P r z y k ł a d XIV

Paski powlekane mikrowarstwą zawierającą substancję przeciwgrzybiczą.

W mieszaninie 1 litra octanu etylu rozpuszcza się 10 g flukonazolu i 10 g kwasu cytrynowego, po czym mieszając dodaje 100 g polistyrenu. Osobno przygotowuje się roztwór 100 g polichlorku winylu w 1 litrze octanu etylu. Oba roztwory łączy się. Następnie roztworem tym powleka paski z polietylenu o wymiarach 200 x 45 x 2 mm. Paski suszy się i oznacza w nich flukonazol za pomocą HPLC.

Każdy z pasków zawierał flukonazol w zakresie 180-190 mg, przy grubości mikrowarstwy ok. 7μ.

paski zawieszono w ulu i przetrzymywano w czasie 6 tygodni. Poraż enie grzybicą wapienną z 5,1 mumii/dm² zmniejszył o się do 0,7 mumii/dm², co stanowi skuteczność wynoszą c ą 86,2%.

Claims (3)

1. Środek do zwalczania grzybicy u pszczół zawierający imidazolowy środek przeciwgrzybiczy, taki jak, tiokonazol, ketokonazol, mikonazol, flukonazol, enilkonazol lub ich mieszaniny, w postaci syropu leczniczego, paska z tworzywa sztucznego z inkorporowaną substancją aktywną, paska z tektury lub drewna nasycanego substancją aktywną, paska z tworzywa sztucznego powleczonego mikrowarstwą zawierającą substancję aktywną, znamienny tym, że ponadto zawiera słaby kwas nieorganiczny lub organiczny w ilości wagowej wynoszącej od 1 do 50 części wagowych w odniesieniu do 1 części wagowej imidazolowego środka przeciwgrzybiczego.

2. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako kwas nieorganiczny stosuje się kwas fosforowy lub borowy.

3. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako kwas organiczny stosuje się kwas octowy, cytrynowy, mlekowy lub szczawiowy.