PL202050B1 - Sposób wytwarzania roślin z rodziny Solanaceae, zwłaszcza ziemniaka, o ulepszonych cechach hodowlanych - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania nowej odmiany roślin z rodziny Solanaceae o ulepszonych cechach hodowlanych, przez, według wynalazku charakteryzuje się tym, że wbudowuje się dodatkowo gen, kodujący enzym hydrolityczny 1,3-β- -glukanazy, o nowej sekwencji nukleotydowej. Wprowadzenie tego genu do genomu gospodarza, rośliny, zwłaszcza Ziemniaka jadalnego (Solanum tuberosum L.) odmiany Desiree, w obrębie roślinnej kasety ekspresyjnej, wywołuje nadprodukcję nowego enzymy hydrolitycznego 1,3-e-glukanazy, co prowadzi do nabycia przez rośliny korzystnych cech hodowlanych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania roślin wybranych z grupy obejmującej ziemniaki, pomidory, paprykę, tytoń, czyli podstawowe rośliny uprawne rodziny Solanaceae, o ulepszonych cechach hodowlanych, przez wprowadzenie nieznanego dotychczas genu kodującego nowy enzym hydrolityczny 1,3-e-glukanazy i spowodowanie nadprodukcji tego enzymu w tkance rośliny, korzystnie ziemniaka, zwłaszcza Ziemniaka jadalnego (Solanum tuberosum L., odmiany Desiree).

Wiadomo, że odpowiedzią roślin na różnego rodzaju infekcje (wirusy, bakterie, grzyby) jest indukcja wielu klas białek, które noszą wspólną nazwę białka PR (od. Patogenesis-Related - Związane z Patogenezą). Klasę II białek PR tworzą 1,3-e-glukanazy. Enzymy te katalizują hydrolizę wiązania endo 1,3-e-glikozydowego, które jest częstym wiązaniem w związkach budujących ściany komórkowe roślin, grzybów i bakterii.

1,3-e-Glukanazy są enzymami powszechnie występującymi w świecie roślin nasiennych. Występują one w postaci wielu izoform (kwaśnych i zasadowych), które różnią się wielkością, punktem izoelektrycznym, strukturą pierwszorzędową, aktywnością, lokalizacją komórkową i wzorem ekspresji.

1,3-e-Glukanazy ulegają ekspresji, w różnych procesach fizjologicznych i rozwojowych takich jak: odpowiedź na infekcję zranienie czy chłód, traktowanie ozonem i promieniowaniem UV i X, jak również podczas dojrzewania ziaren pyłku, wzrostu łagiewki pyłkowej, embriogenezie, kiełkowaniu nasion w tym w mobilizacji rezerw w bielmie.

Większość genów kodujących białka o aktywności 1,3-β-glukanazowej wykazuje podobny schemat budowy. Składają się one z dwóch eksonów rozdzielonych intronem, gdzie miejsce splicingu znajduje się w przedostatnim kodonie peptydu sygnalnego. Syntetyzowane w procesie translacji białko ulega dalszej obróbce. Zarówno w przypadku form zasadowych, jak i kwaśnych ulega odcięciu peptyd sygnalny, jeszcze podczas translacji. Po zakończeniu translacji formy białek kwaśnych mają już dojrzałą postać. Natomiast, w przypadku białek zasadowych powstały po translacji peptyd ulega glikozylacji na C-końcu, a następnie zglikozylowany C-końcowy fragment jest odcinany. Białko wykrywane w wakuoli jest już nie zglikozylowane, nie posiada też C-końcowego fragmentu (Linthorst H. Crit. Rev. Plant Sci. [1991] 10, 123-150). Istnieje coraz więcej przesłanek ku temu, aby twierdzić, że właśnie ten C-koniec zawiera sygnał do lokalizacji komórkowej białka.

Do chwili, obecnej najwięcej informacji dotyczących sekwencji genów kodujących poszczególne izoformy uzyskano dla roślin tytoniu (Ward E.R., Payne G.B., Moyer M.B., Williams S.C., Dincher S.S., Sharkey K.C., Bec, J.J., Taylor H.T., Ahl-Goy P., Meins F. Jr., Ryals J.A. Plant Physiol. [1991] 96, 390-397). Sklonowano wiele genów kodujących białka o omawianej aktywności - zarówno kopie cDNA-owe, jak i genomowe. W oparciu o podobieństwo sekwencji aminokwasowych 1,3-e-glukanazy zostały podzielone na 5 klas (Li C-D., Langridge P., Lance R.C.M., Xu P., Fincher G.B. Theor. Appl. Genet. [1996] 92, 791-796). Białka zaliczone do klasy I i II 1,3-e-glukanaz są silnie aktywowane podczas procesu odpowiedzi roślin na infekcje. Przypisuje się im właściwości obronne i zalicza do grupy białek PR. Klasę II 1,3-e-glukanaz tworzą białka kwaśne, o lokalizacji pozakomórkowej. Masa poszczególnych białek wynosi od 34 do 36 kDa. Ulegają one znaczącej indukcji po potraktowaniu tkanki kwasem salicylowym oraz chemicznymi środkami ochrony roślin (np. BHT). Geny kodujące tę klasę β-glukanaz ulegają ponadto ekspresji w poszczególnych częściach kwiatu, jak i w kiełkujących nasionach (Delp G. i Palva T. A. Plant Mol. Biol. [1999] 39, 565-575).

Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest otrzymanie nowych odmian roślin z rodziny Solanacea o ulepszonych cechach hodowlanych, sposobem według wynalazku, poprzez wprowadzenie nowego konkretnego genu (sekwencji DNA) kodującego nowy enzym hydrolityczny 1,3-e-glukanazy opisany w równoległym opisie patentowym nr PL 200 176.

Otrzymane sposobem według wynalazku rośliny, nieoczekiwanie mają zwiększoną odporność na infekcje bakteryjne wirusowe i grzybicze, przy jednoczesnym fenotypie redukcji wzrostu i zachowaniu produktywności, zwłaszcza bulw.

Jest to tym bardziej nieoczekiwane, iż znacząca cześć, opisanych wcześniej roślin z podwyższonym poziomem znanych β-glukanaz nie wykazywała cech zwiększonej odporności na infekcje, a ponadto dotychczas nie opisano fenotypu redukcji wzrostu przy zachowaniu produktywności, zwłaszcza bulw.

Sposób wytwarzania nowej odmiany roślin o ulepszonych cechach hodowlanych, według wynalazku polega na tym, że genom roślin-gospodarza, korzystnie ziemniaka, transformuje się materiałem genetycznym, do którego wprowadzono gen o sekwencji nukleotydowej przedstawionej wzorem 1,

PL 202 050 B1 kodujący nowy enzym hydrolityczny 1,3-e-glukanazy, w obrębie roślinnej kasety ekspresyjnej, przy czym do transformacji roślin stosuje się plazmid w skład, którego oprócz wspomnianego genu, wchodzi promotor wybrany z grupy promotorów gwarantujących ekspresję w roślinach, korzystnie promotor wirusa mozaikowatości kalafiora CaMV 35S, lub promotor syntazy nopalinowej „promotor nos lub promotor syntazy oktopinowej „promotor ocs oraz dowolny znany terminator transkrypcji, korzystnie terminator genu syntazy nopalinowej „3' nos czy terminator genu 35S wirusa mozaikowatości kalafiora „3' 35S, funkcjonujący w komórkach roślinnych, zapewniający stabilne zakończenie transkryptu za wprowadzonym genem, do otrzymania materiału roślinnego o podwyższonej zawartości nowego enzymu hydrolitycznego 1,3-e-glukanazy o strukturze aminokwasowej przedstawionej wzorem 2.

W sposobie według wynalazku prowadzi się [I] rekombinację DNA w celu skonstruowania wektora zawierającego DNA genem kodującym enzym hydrolityczny (1,3-e-glukanazę), [II] przeniesienie fragmentu DNA z genem kodującym enzym hydrolityczny oraz sygnałami zapewniającymi jego rekombinację z DNA gospodarza-rośliny, korzystnie ziemniaka, oraz jego ekspresję w komórkach gospodarza (określana jako kaseta ekspresyjna) z wektora plazmidowego do genomu rośliny, (III) regenerację oraz selekcję transgenicznych roślin nadprodukujących enzym hydrolityczny (1,3-e-glukanazę).

W sposobie według wynalazku do transformacji roślin stosuje się materiał genetyczny (DNA plazmidu), korzystnie uzupełniony czynnikiem (markerem) umożliwiającym selekcję komórek zawierających wrekombinowaną do genomu kasetę ekspresyjną z genem kodującym enzym hydrolityczny. Marker ten warunkuje oporność selekcjonowanych roślin na antybiotyki, takie jak kanamycyna.

Do wprowadzenia DNA kasety ekspresyjnej zawierającej gen dla enzymu hydrolitycznego oraz marker selekcyjny stosuje się dowolną znaną metodę, taką jak bezpośrednie bombardowanie tkanki roślinnej DNA lub transformacji roślin z wykorzystaniem szczepów bakterii z rodzaju Agrobacterium i wektorów z rodziny Ti. Wybór metody wprowadzenia obcego DNA do materiału genetycznego komórek roślin zależy od tego, jaki gatunek roślin zostanie wybrany w celu transformacji. Podstawową metodą, gwarantującą stabilną integrację fragmentu DNA do genomu rośliny, zwłaszcza ziemniaka oraz zapewniającą dziedziczenie wprowadzonej modyfikacji oraz utrzymywanie się uzyskanych pożądanych cech w pokoleniach potomnych, jest transformacja z wykorzystaniem bakterii z rodzaju Agrobacterium. Istnieje szereg modyfikacji procesu transformacji roślin z wykorzystaniem różnych szczepów Agrobacterium, ponadto, można zastosować liczne strategie konstrukcji wektorów wykorzystywanych dla zapewnienia optymalnego poziomu ekspresji transgenu.

Gen wbudowywany dodatkowo w roślinę według wynalazku otrzymuje się przez zainfekowanie tkanki rośliny, korzystnie ziemniaka ziemniaczanym wirusem Y (PVY) i wyizolowanie z zainfekowanego materiału roślinnego techniką rt-PCR genu kodującego nowy enzym hydrolityczny 1,3-e-glukanazy przy wykorzystaniu jako matrycy całkowitego RNA tkanki tej rośliny metodą opisaną w opisie patentowym PL 200 176.

Enzym hydrolityczny 1,3-e-glukanazy ulegający ekspresji w komórkach roślin, według wynalazku, ma strukturę aminokwasową przedstawioną wzorem 2.

Porównując 338 aminokwasową, sekwencję białka z sekwencjami innych znanych białek o podobnej aktywności enzymatycznej stwierdzono, że peptyd sygnalny ma w nim długość 23 aminokwasów, a dojrzałe białko stanowi 315 aminokwasów. Z komputerowej analizy danych wynika, że masa dojrzałego białka wynosi 35,5 kDa, a punkt izoelektryczny jest w granicach obojętnego.

Zwiększona, dzięki wbudowanemu dodatkowo genowi, zawartość enzymu nadaje roślinom według wynalazku, zestaw korzystnych właściwości, a przede wszystkim zmianę wyglądu roślin. Rośliny są krępe, jak widać na rysunku (fig. 1), przy zachowaniu nie zmienionej produktywności, zwłaszcza bulw, co pokazano przykładowo na fig. 2, a ponadto charakteryzują się zmniejszoną podatnością na infekcje grzybowe, jak pokazano na rysunku (fig. 3). Na wszystkich załączonych rysunkach literą A oznaczono rośliny kontrolne, a literą B rośliny z podwyższonym poziomem enzymu hydrolitycznego

1,3-e-glukanazy.

Stwierdzono, że sposobem według wynalazku uzyskuje się rośliny, zwłaszcza ziemniaka, o (3-8 krotnie) zwiększonym w porównaniu z roślinami macierzystymi, poziomie enzymu hydrolitycznego (1,3-e-glukanazy).

Zwiększona, dzięki wbudowanemu dodatkowo genowi, zawartość enzymu powoduje, że rośliny według wynalazku, uzyskują zestaw korzystnych właściwości, a mianowicie zmianę wyglądu - rośliny są krępe, przy zachowaniu nie zmienionej produktywności i zmniejszonej podatności na infekcje grzybowe.

Najprawdopodobniej wszystkie te właściwości wynikają z zastosowania enzymu hydrolitycznego, kodowanego przez nowy gen. Konsekwencją podwyższonego poziomu enzymu hydrolitycznego,

PL 202 050 B1 skierowanego przeciwko elementom ściany komórkowej grzybów chorobotwórczych w stosunku do roślin może być podwyższona odporność na infekcje. Wytwarzanie linii roślin o zmniejszonej podatności na infekcje, według wynalazku polega na tym, że kodujący enzym gen wbudowuje się w strukturę materiału genetycznego roślin z rodziny Solanaceae, korzystnie Solanum tuberosum L. odmiany Desiree.

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku nie ograniczające jego zakresu.

P r z y k ł a d I

1. Izolacja fragmentu DNA zawierającego nowy gen dla enzymu hydrolitycznego.

DNA zawierający sekwencję kodującą (gluB20) enzym hydrolityczny namnożono z wykorzystaniem techniki PCR na matrycy całkowitego RNA wyizolowanego z tkanki liści roślin Ziemniaka jadalnego (Solanum tuberosum L.) odmiany Desiree. infekowanych wirusem PVY⁰, szczep Epoka, w dwa tygodnie po infekcji. W reakcji PCR wykorzystano następującą parę primerów ([20-2L]

5'-GGATCCATTAATTAAAATTGAGTTGATAC-3' [20-2U] 5'-GGATCCAATTTTGCCATGGCTTTTCTAAG-3')

Primery te wprowadziły dodatkowo miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne BamHl i Ncol: w górę od miejsca startu translacji oraz miejsce dla enzymu BamHl poniżej kodonu STOP translacji. Produkt reakcji PCR został wstawiony do wektora pCRII-TOPO (Invitrogen Corp.) zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta. Dla powielenia DNA plazmidu stosowano transformację komórek Escherichia coli, szczep TOP10 (TOPO TA Cloning Version. C, Invitrogen Corp., CA USA) przeprowadzoną zgodnie ze standardową metodą, z użyciem CaCI2 alkalicznej (Sambrook J., E.F. and T. Maniatis. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Transformanty selekcjonowano na podłożu pełnym Luria-Bertani (LB) [Merck GmbH, Niemcy] z dodatkiem ampicyliny o stężeniu 50 μg/ml. Izolację DNA plazmidowego prowadzono z wykorzystaniem metody tzw. lizy alkalicznej (Sambrook J., E.F. and T. Maniatis. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)

2. Ustalenie sekwencji nukleotydowej genu dla badanego fragmentu DNA.

Strukturę sekwencji nukleotydowej nowego genu oraz sekwencji aminokwasowej nowego wariantu enzymu hydrolitycznego kodowanego przez gen, według wynalazku stwierdzono poprzez określenie sekwencji 1.040 kb DNA wstawki pochodzenia roślinnego w wektorze pCRII-TOPO (Invitrogen Corp.). Wektor wraz ze wstawką posłużył do ustalenia sekwencji obu nici DNA wstawki zawierającej nowy gen. Dla powielenia DNA plazmidu stosowano transformację komórek Escherichia coli K12, szczep DH5a przeprowadzoną zgodnie ze standardową metodą, z użyciem CaCI₂ oraz izolację DNA plazmidowego z wykorzystaniem lizy alkalicznej (Sambrook J., E.F. and T. Maniatis. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Kompletną sekwencję nukleotydową wstawki obejmująca region kodujący genu (gluB20) dla enzymu hydrolitycznego otrzymano, stosując sekwencjonowanie metodą tzw. „Primer Walking. Do prowadzenia reakcji sekwencjonowania DNA używano zestaw BigDye Terminator (Promega, WI USA), aparat do aplifikacji DNA firmy Perkin Elmer, (USA) model 2400 oraz sekwenator model ABI377 (Applied Biosystem, USA). Uzyskane sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe analizowano przy pomocy programów z pakietu GCG wersja 7.0, 1991 (Genetics Computer Group, Madison, Wi., USA) oraz BLAST (Altschul S.F., W. Gish, W. Miller E.W. Myers and DJ. Lipman [1990], J. Mol Biol. 215, 403).

3. Konstrukcja wektora i transformacja szczepu Agrobacterium tumefaciens.

Region kodujący genu gluB20 został wytrawiony z wektora pCRII-TOPO przy pomocy enzymu BamHl i wstawiony do wektora pFF19 (Timmermans M.C.P, Maliga P., Vieira J. i Messing J. [1990] J. of Biotech. 14, 333-344). Zrekombinowany plazmid pFF19/gluB20 selekcjonowano w bakteriach na podłożu LB z dodatkiem ampicyliny o stężeniu 50 μg/ml. Kolonie bakterii zawierające pożądaną wstawkę DNA identyfikowano izolując DNA i trawiąc enzymem restrykcyjnym BamHl. Wyselekcjonowany klon (p20-2) niosący 1017 nukleotydową wstawkę z genem gluB20 w orientacji zapewniającej: inicjację transkrypcji ze znajdującego się w wektorze pFF19 sekwencji promotora „CaMV 35S oraz właściwą terminację i stabilność powstających transkryptów (35S poly A). Klon ten p20-2 posłużył do izolacji kasety ekspresyjnej, gwarantującej wydajną ekspresję w komórkach roślinnych, poprzez trawienia DNA klonu p20-2 enzymami Hindlll i EcoRl. Odnośny fragment DNA, o wielkości 2.1 kb został wstawiony do wektora pGA482 (An G. [1986], Plant Physiol. 81, 86-91) umożliwiającego transformację roślin. Finalny wektor pGA482/20-2 przenoszono do komórek Agrobacterium tumefaciens zgodnie z metodą opisaną przez Ditta G., Stanfield S., Corbin, D. i Helinski, D.R. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, 77, 7347-351) z wykorzystaniem oporności na tetracyklinę (2.5 μg/ml).

PL 202 050 B1

4. Transformacja, regeneracja i warunki hodowli roślin.

Do transformacji użyto roślin Ziemniaka jadalnego (Solanum tuberosum L.) odmiany Desiree, pochodzącej z kolekcji Zakładu Doświadczalnego w Młochowie, Instytutu Hodowli Aklimatyzacji Roślin w Radzikowie. Rośliny były propagowane in vitro, w podłożu Murashige i Skoog (Murashige T. i Skoog F. [1962] Plant Physiol. 15, 473-493) w kontrolowanych warunkach wzrostu, w fitotronie przy 16 godzinnym dniu i temperaturze 22°C oraz 8 godzinnej nocy i temperaturze 18°C. Stosowano oświetlenie jarzeniowe o natężeniu 5000 to 6000 lux. W fitotronie wilgotność wahała się w zakresie 65-85%. Transformację wykonywano według procedury opisanej przez Horsch R.B., Fry J.E., Hoffmann N.L., Eichholtz D., Rogers S.G. i Fraley R.T. (Science [1985], 227, 1229-1231), z wykorzystaniem komórek Agrobacterium tumefaciens szczep LBA 4404, zawierającego wektor pGA 482/20-2. Zregenerowano około 40 transformantów opornych na kanamycynę, które dalej badano. Obecność oraz ekspresję transgenu gwarantującego podwyższony poziom enzymu hydrolitycznego (1,3-e-glukanazę) potwierdzono: na poziomie RNA metodą Notherna i na poziomie białka z wykorzystaniem specyficznych przeciwciał. W testach tych stosowano standardowe metody opisane przez Sambrooka J. i Maniatisa T. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd Edition [1989], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Wybrane linie transgeniczne przenoszono do podłoża torfowego i hodowano w kontrolowanych warunkach świetlno-temperaturowych (jak powyżej) w fitotronie.

5. Oznaczenie aktywności enzymatycznej 1,3-e-glukanazy.

Aktywność enzymu oznaczano w ekstrakcie białkowym uzyskanym poprzez roztarcie 200-300 mg tkanki liści w 0,5 M buforze cytrynianowym o pH 5,2. Ekstrakt sedymentowano poprzez wirowanie 104 x g w temp. 4°C przez 20 min. Zawartość białka w próbie wyznaczano metodą Bradforda przy pomocy zestawu firmy BioRad Laboratories, Inc. CA USA. Aktywność 1,3-e-glukanazy wyznaczano spektrofotometryczne (przy OD410) poprzez pomiar ilości uwalnianej glukozy z laminaryny jak opisano wcześniej przez Kombrinka E. i Hahlbrocka K. Plant Physiol. (1986) 81, 216-221.

P r z y k ł a d II

1. Izolacja fragmentu DNA zawierającego nowy gen dla enzymu hydrolitycznego.

DNA zawierający sekwencję kodującą (gluB20) enzym hydrolityczny namnożono z wykorzystaniem techniki PCR na matrycy całkowitego RNA wyizolowanego z tkanki liści roślin Ziemniaka jadalnego (Solanum tuberosum L.) odmiany Desiree. infekowanych wirusem PVY⁰, szczep Epoka, w dwa tygodnie po infekcji. W reakcji PCR wykorzystano następującą parę primerów ([20-2L] 5'-GGATCCATTAATTAAAATTGAGTTGATAC-3' [20-2U] 5'-GGATCCAATTTTGCCATGGCTTTTCTAAG-3') Primery te wprowadziły dodatkowo miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne BamHl i Ncol: w górę od miejsca startu translacji oraz miejsce dla enzymu BamHl poniżej kodonu STOP translacji. Produkt reakcji PCR został wstawiony do wektora pCRII-TOPO (Invitrogen Corp.) zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta. Dla powielenia DNA plazmidu stosowano transformację komórek Escherichia coli, szczep TOP10 (TOPO TA Cloning Version. C, Invitrogen Corp., CA USA) przeprowadzoną zgodnie ze standardową metodą, z użyciem CaCI2 alkalicznej (Sambrook J., E.F. and T. Maniatis. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Transformanty selekcjonowano na podłożu pełnym Luria-Bertani (LB) [Merck GmbH, Niemcy] z dodatkiem ampicyliny o stężeniu 50 μg/ml. Izolację DNA plazmidowego prowadzono z wykorzystaniem metody tzw. lizy alkalicznej (Sambrook J., E.F. and T. Maniatis. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)

2. Ustalenie sekwencji nukleotydowej genu dla badanego fragmentu DNA.

Strukturę sekwencji nukleotydowej nowego genu oraz sekwencji aminokwasowej nowego wariantu enzymu hydrolitycznego kodowanego przez gen, według wynalazku stwierdzono poprzez określenie sekwencji 1.040 kb DNA wstawki pochodzenia roślinnego w wektorze pCRII-TOPO (Invitrogen Corp.). Wektor wraz ze wstawką posłużył do ustalenia sekwencji obu nici DNA wstawki zawierającej nowy gen. Dla powielenia DNA plazmidu stosowano transformację komórek Escherichia coli K12, szczep DH5a przeprowadzoną zgodnie ze standardową metodą, z użyciem CaCI₂ oraz izolację DNA plazmidowego z wykorzystaniem lizy alkalicznej (Sambrook J., E.F. and T. Maniatis. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Kompletną sekwencję nukleotydową wstawki obejmująca region kodujący genu (gluB20) dla enzymu hydrolitycznego otrzymano, stosując sekwencjonowanie metodą tzw. „Primer Walking. Do prowadzenia reakcji sekwencjonowania DNA używano zestaw BigDye Terminator (Promega, WI USA), aparat do aplifikacji DNA firmy Perkin Elmer, (USA) model 2400 oraz sekwenator model ABI377 (Applied Biosystem, USA). Uzyskane sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe analizowano przy pomocy

PL 202 050 B1 programów z pakietu GCG wersja 7.0, 1991 (Genetics Computer Group, Madison, Wi., USA) oraz

BLAST (Altschul S.F., W. Gish, W. Miller E.W. Myers and DJ. Lipman [1990], J. Mol Biol. 215, 403).

3. Konstrukcja wektora i transformacja szczepu Agrobacterium tumefaciens.

Region kodujący genu gluB20 został wytrawiony z wektora pCRU-TOPO przy pomocy enzymu

BamHl i wstawiony do wektora pFF19 (Timmermans M.C.P, Maliga P., Vieira J. i Messing J. [1990]

J. of Biotech. 14, 333-344). Zrekombinowany plazmid pFF19/gluB20 selekcjonowano w bakteriach na podłożu LB z dodatkiem ampicyliny o stężeniu 50 μg/ml. Kolonie bakterii zawierające pożądaną wstawkę DNA identyfikowano izolując DNA i trawiąc enzymem restrykcyjnym BamHl. Wyselekcjonowany klon (p20-2) niosący 1017 nukleotydową wstawkę z genem gluB20 w orientacji zapewniającej: inicjację transkrypcji ze znajdującego się w wektorze pFF19 sekwencji promotora „CaMV 35S oraz właściwą terminację i stabilność powstających transkryptów (35S poły A). Klon ten p20-2 posłużył do izolacji kasety ekspresyjnej, gwarantującej wydajną ekspresję w komórkach roślinnych, poprzez trawienia DNA klonu p20-2 enzymami Hindlll i EcoRl. Odnośny fragment DNA, o wielkości 2.1 kb został wstawiony do wektora pGA482 (An G. [1986], Plant Physiol. 81, 86-91) umożliwiającego transformację roślin. Finalny wektor pGA482/20-2 przenoszono do komórek Agrobacterium tumefaciens zgodnie z metodą opisaną przez Ditta G., Stanfield S., Corbin, D. i Helinski, D.R. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, 77, 7347-351) z wykorzystaniem oporności na tetracyklinę (2.5 μg/ml).

4. Transformacja, regeneracja i warunki hodowli roślin.

Do transformacji użyto roślin Tytoniu (Nicotiana tabaccum L.) odmiany Xanthinc, pochodzącej z kolekcji Zakładu Biochemii Roślin, Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie. Rośliny były propagowane in vitro, w podłożu Murashige i Skoog (Murashige T. i Skoog F. [1962] Plant Physiol. 15, 473-493) w kontrolowanych warunkach wzrostu, w fitotronie przy 16 godzinnym dniu i temperaturze 22°C oraz 8 godzinnej nocy i temperaturze 18°C. Stosowano oświetlenie jarzeniowe o natężeniu 5000 to 6000 lux. W fitotronie wilgotność wahała się w zakresie 65-85%. Transformację wykonywano według procedury opisanej przez Horsch R.B., Fry J.E., Hoffmann N.L., Eichholtz D., Rogers S.G. i Fraley R.T. (Science [1985], 227, 1229-1231), z wykorzystaniem komórek Agrobacterium tumefaciens szczep LBA 4404, zawierającego wektor pGA 482/20-2. Zregenerowano około 20 stransformowanych roślin tytoniu, opornych na kanamycynę, które dalej badano. Obecność oraz ekspresję transgenu gwarantującego podwyższony poziom enzymu hydrolitycznego (1,3-e-glukanazę) potwierdzono: na poziomie RNA metodą Notherna i na poziomie białka z wykorzystaniem specyficznych przeciwciał. W testach tych stosowano standardowe metody opisane przez Sambrooka J. i Maniatisa T. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd Edition [1989], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Wybrane linie transgeniczne przenoszono do podłoża torfowego i hodowano w kontrolowanych warunkach świetlno-temperaturowych (jak powyżej) w fitotronie.

5. Oznaczenie aktywności enzymatycznej 1,3-e-glukanazy.

Aktywność enzymu oznaczano w ekstrakcie białkowym uzyskanym poprzez roztarcie 200-300 mg tkanki liści tytoniu w 0,5 M buforze cytrnianowym o pH 5,2. Ekstrakt sedymentowano poprzez wirowanie 10⁴ x g w temp. 4°C przez 20 min. Zawartość białka w próbie wyznaczano metodą Bradforda przy pomocy zestawu firmy BioRad Laboratories, Inc. CA USA. Aktywność 1,3-e-glukanazy wyznaczano spektrofotometryczne (przy OD410) poprzez pomiar ilości uwalnianej glukozy z laminaryny jak opisano wcześniej przez Kombrinka E. i Hahlbrocka K. Plant Physiol. (1986) 81, 216-221.

PL 202 050 B1

5'

ATGGCTTTTC TAAGTTCTCT TGTAGTTTCC CTTTTACTTG TTGGGCTGCT AATCCAAATT ACAGGAGCGC AGCCTATCGG 80

AGTATGCTAT GGAAAAATTG CCAATAATTT ACCATCAGAT CAAGATGTCA TAAAATTATA TAATGCTAAT AATATCAAGA 160

161 AAATGAGAAT TTACTATCCA CATACAAATG TCTTTAATGC CCTCAAAGGA AGTAACATTG AAATAATTCT TGATGTCCCA 240

241 AATCAAGATC TTGAAGCCCT AGCCAATCCT TCAAATGCCA ATGGTTGGGT TCAAGATAAT ATAAGAAATC ATTTTCCCGA 320

321 TGTTAAATTC AAATATATAG CCGTTGGAAA TGAAGTTGAT CCTGGTAGAG AGAGTGGTAA ATATGCACGA TTTGTTGGTC 400

401 CAGCAATGGA AAATATTAAC AACGCATTAT CATCAGCAGG ATTGCAAAAT CAAATCAAGG TCTCAACATC GACATATTCA 480

481 GGGCTCTTAA CCAACACCTA CCCACCTAGA GATAGCATTT TTCGCGAAGA ATATAAAAGT TTCATTAATC CTATAATTGG 560

561 ATTTCTAGCA CGACATAATC TTCCACTCTT AGCCAATATT TACCCTTATT TTGGCCATAT TGATAACACT AACGCCGTTC 640

641 CTCTTTCTTA TGCTCTTTTC AATCAACAAA GGAGAAATGA CACAGGATAT CAAAATCTTT TCGATGCCCT TGTGGATTCA 720

721 ATGTAI I I IG CTACGGAGAA ACTTGGAGGA CAAAATATTG AAATTATTGT ATCGGAAAGT GGTTGGCCTT CTGAGGGACA 800 801 CCCTGCAGCA ACTTTGAAAAA TGCAAGGAC TTATTATACG AATTTGATTA ATCATGTGAA AAGAGGGGCT GGAACACCAA 880 881 AAAAACCTGG AAAAACCATA GAAACTTATT TATTCGCCAT GTTTGATGAA AATGAAAAGA AGGGAGAAGC AAGTGAGAAA 960 961 CACTTTGGAC TCTTTAATCC TGATCAGAGG CCAAAGTATC AACTCAATTT TAATTAA 1017

3' wzór 1

MAFLSSLWS LLLVGLLIQI TGAQPIGVCY GKIANNLPSD QDVIKLYNAN 50

NIKKMRIYYP HTIMVFNALKG SNIEIILDVP NQDLEALANP SNANGWVQDN 100

101 IRNHFPDVKF KYIAVGNEVD PGRESGKYAR FVGPAMENIN NALSSAGLQN 150

151 QIKVSTSTYS GLLTNTYPPR DSIFREEYKS FINPIIGFLA RHNLPLLANI 200

201 YPYFGHIDNT NAVPLSYALF NQQRRNDTGY QNLFDALVDS MYFATEKLGG 250

251 QNIEIIVSES GWPSEGHPAA TLKNARTYYT NLINHVKRGA GTPKKPGKTI 300

301 ETYLFAMFDE NEKKGEASEK HFGLFNPDQR PKYQLNFN 338 wzór 2

Claims (5)

1. Sposób wytwarzania nowej odmiany roślin z rodziny Solanaceae, zwłaszcza ziemniaka, o ulepszonych cechach hodowlanych, znamienny tym, że genom rośliny-gospodarza transformuje się materiałem genetycznym, do którego wprowadzono gen o sekwencji nukleotydowej przedstawionej wzorem 1, kodujący nowy enzym hydrolityczny 1,3-e-glukanazy, w obrębie roślinnej kasety ekspresyjnej, przy czym do transformacji roślin stosuje się plazmid w skład, którego oprócz wspomnianego genu, wchodzi promotor wybrany z grupy promotorów wyizolowanych z roślin lub wirusów roślinnych, korzystnie promotor wirusa mozaikowatości kalafiora CaMV 35S, promotor syntazy nopalinowej „promotor nos lub promotor syntazy oktopinowej „promotor ocs oraz dowolny znany terminator transkrypcji korzystnie termniator genu syntazy nopalinowej „3' nos lub terminator genu 35S wirusa mozaikowatości kalafiora „3' 35S, funkcjonujący w komórkach roślinnych, zapewniający stabilne zakończenie za wprowadzonym genem, do otrzymania materiału roślinnego o podwyższonym poziomie enzymu hydrolitycznego 1,3-e-glukanazy.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się [I] rekombinację DNA w celu skonstruowania wektora zawierającego DNA genem kodującym enzym hydrolityczny (1,3-β-glukanazę), [II] przeniesienie fragmentu DNA z genem kodującym enzym hydrolityczny oraz sygnałami zapewniającymi jego rekombinację z DNA gospodarza-rośliny, korzystnie ziemniaka, oraz jego ekspresję w komórkach gospodarza (określana jako kaseta ekspresyjna) z wektora plazmidowego do

PL 202 050 B1 genomu rośliny, (III) regenerację oraz selekcję transgenicznych roślin nad produkujących enzym hydrolityczny (1,3-e-glukanazę).

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do transformacji roślin stosuje się materiał genetyczny (DNA plazmidu), korzystnie uzupełniony czynnikiem (markerem) umożliwiającym selekcję komórek zawierających wrekombinowaną do genomu kasetę ekspresyjną z genem kodującym enzym hydrolityczny, warunkującym oporność selekcjonowanych roślin na antybiotyki, takie jak kanamycyna.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do wprowadzenia DNA kasety ekspresyjnej zawierającej gen kodujący enzym hydrolityczny oraz marker selekcyjny stosuje się dowolną znaną metodę, korzystnie taką jak bezpośrednie bombardowanie tkanki roślinnej DNA lub transformacji roślin z wykorzystaniem szczepów bakterii z rodzaju Agrobacterium i wektorów z rodziny Ti, w zależności od gatunku rośliny.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako podstawową metodę, stosuje się transformację z wykorzystaniem bakterii z rodzaju Agrobacterium.