PL201383B1 - Sposób immobilizacji antybiotyków zawierających I-rzędowe grupy aminowe ze stałymi matrycami pokrytymi białkiem - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób immobilizacji antybiotyków zawierających w swojej budowie I-rzędowe grupy aminowe ze stałymi matrycami, zwłaszcza nieorganicznymi lub polimerowymi, pokrytymi białkiem, stosowanymi w postaci biomateriałów w szczególności jako protezy naczyń krwionośnych w angioplastyce, czy też jako trwałe matryce antybakteryjne, między innymi jako cewniki w urologii, endoprotezy w ortopedii, a także jako implanty zębowe w stomatologii. Sposób immobilizacji antybiotyków zawierających I-rzędowe grupy aminowe np. gentamycyna, amikacyna, neomycyna itp. ze stałymi matrycami nieorganicznymi lub polimerowymi pokrytymi białkiem, z użyciem dwufunkcyjnego związku organicznego, według wynalazku, polega na aktywacji białkowanej powierzchni matrycy aldehydem glutarowym, którego jedna z dwóch reaktywnych grup aldehydowych tworzy kowalencyjne wiązanie z grupą aminową pochodzącą z aminokwasów zasadowych matrycy białkowej, redukowane wodorem „in statu nascendi”, a druga łączy się z I-rzędową grupą aminową antybiotyku. Dodatkowo, sześciowęglowy łańcuch aldehydu glutarowego staje się jednocześnie tzw. korzystnym odstępnikiem pomiędzy matrycą a lekiem, umożliwiającym lepszy kontakt osadzonego antybiotyku z komórką bakteryjną, co w efekcie pozwala na długotrwałe utrzymanie aktywności przeciwbakteryjnej utworzonego biomateriału. Zaletą wynalazku, jest prosty sposób otrzymywania antybakteryjnych matryc, a antybiotyki immobilizowane poprzez kowalencyjne wiązania i utrwalane wodorem, nie tracą swojej aktywności przez ponad 1 - 2 lata, co znacznie podnosi wartość implantów wszczepiennych

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób immobilizacji antybiotyków zawierających w swojej budowie I-rzędowe grupy aminowe ze stałymi matrycami, zwłaszcza nieorganicznymi lub polimerowymi, pokrytymi białkiem, stosowanymi w postaci biomateriałów, w szczególności jako protezy naczyń krwionośnych w angioplastyce, czy też jako trwałe matryce antybakteryjne, między innymi jako cewniki w urologii, endoprotezy w ortopedii, a takż e jako implanty zę bowe w stomatologii.

W chirurgii naczyniowej stosuje się powszechnie protezy naczyniowe nasą czane antybiotykami, które w krótkim czasie, około 5-7 dni, wypłukiwane są z implantów przez krew, co powoduje tym samym pozbawienie ich właściwości antybakteryjnych.

Dotychczasowe badania nad unieruchamianiem antybiotyków do protez naczyniowych ograniczają się do biernej adsorpcji antybiotyku, zachodzącej wskutek moczenia protez w roztworze leku lub do wiązania jonowego powstającego między antybiotykiem a matrycą. Inne znane sposoby osadzania antybiotyków na matrycach możliwe są dzięki wiązaniom wodorowym lub słabym siłom fizykochemicznym, np. oddziaływaniom elektrostatycznym pomiędzy przeciwnie naładowanymi grupami funkcyjnymi matryc i antybiotyków.

Według H. Belta i współautorów, korzystnymi matrycami dla tego typu wiązań są: polimery syntetyczne, żele krzemionkowe, szkło porowate, celuloza (Biomaterials, 2001, 22, 1697-1611). Po raz pierwszy jonowy sposób wiązania rifampicyny do sukcynylowanej formy żelatyny na protezie dakronowej podał T. R. Ashton i współautorzy w 1990 r. (Proc. 16 Soc. Biomaterials, 13, 235-239). W podobny sposób unieruchamiano gentamycynę - A. Haverich i współautorzy (J. Vasc. Surg., 1998, 15, 187-193). Natomiast E. V. Kinney i współautorzy wiązali jonowo ciprofloksacynę do protezy politereftalanoetylenowej z użyciem chlorku tridodecylo-metylo-amonowego (J. Surg. Res., 1991, 50, 430-435). Z kolei V. Gahtan i współautorzy wiązali jonowo rifampicynę wykorzystując jej właściwości hydrofobowe. Ci sami autorzy oraz J. J. Earnshaw stosując bierną adsorpcję impregnowali rifampicynę na włóknach dakronowych powlekanych żelatyną lub kolagenem (J. Surg. Res., 1995, 58, 105-110; J. Vasc. Endovasc. Surg., 2000, 20, 409-412).

Według cytowanych autorów implanty takie charakteryzowały się działaniem bakteriobójczym ograniczonym do 7 dni. Według M. D. Phaneuf i współautorów (Biomaterials, 2001, 22, 463-469), antybiotyki można również unieruchamiać działając na nie dwu- lub wielofunkcyjnymi związkami typu aldehyd glutarowy, formaldehyd czy diazobenzydyna, bądź jej pochodne. Następuje wówczas nietrwałe osadzanie antybiotyku poprzez sieciowanie, co prowadzi do silnej modyfikacji antybiotyków, a więc niskiej aktywności implantów wobec bakterii i małej ich stabilności.

Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wiązania antybiotyków ze stałymi matrycami pokrytymi białkiem za pomocą trwałych połączeń i zachowujących jednocześnie aktywność przeciwbakteryjną antybiotyku przez wiele tygodni.

Cel ten osiągnięto nieoczekiwanie, opracowując nowy sposób immobilizacji antybiotyków zawierających I-rzędowe grupy aminowe, np. gentamycyna, amikacyna, neomycyna itp., ze stałymi matrycami nieorganicznymi lub polimerowymi pokrytymi białkiem, za sprawą aktywacji białkowanej powierzchni matrycy dwufunkcyjnym związkiem organicznym, zawierającym dwie reaktywne grupy aldehydowe, z których jedna tworzy kowalencyjne wiązanie z grupą aminową pochodzącą z aminokwasów zasadowych matrycy białkowej, a druga z I-rzędową grupą aminową antybiotyku.

Dodatkowo, sześciowęglowy łańcuch aldehydu glutarowego staje się jednocześnie tzw. korzystnym odstępnikiem pomiędzy matrycą a lekiem, umożliwiającym lepszy kontakt osadzonego antybiotyku z komórką bakteryjną, co w efekcie pozwala na długotrwałe utrzymanie aktywności przeciwbakteryjnej utworzonego biomateriału.

Sposób immobilizacji antybiotyków zawierających I-rzędowe grupy aminowe, zwłaszcza gentamycyny, amikacyny, neomycyny, streptomycyny, teikoplaniny, aktynomycyny lub daunomycyny, ze stałymi matrycami zwłaszcza nieorganicznymi lub polimerowymi, pokrytymi białkiem, korzystnie keratyną lub żelatyną, z użyciem dwufunkcyjnego związku organicznego, według wynalazku polega na tym, że matrycę z białkową powierzchnią poddaje się inkubacji w temperaturze pokojowej, pod próżnią przez 30 do 60 minut z podanym w nadmiarze 5 do 15% roztworem aldehydu glutarowego, nowo powstałe wiązania redukuje się wodorem „in statu nascendi”, po czym nadmiar aldehydu odsącza się i matrycę opłukuje wodą . Tak uaktywnioną matrycę ponownie poddaje się inkubacji z roztworem antybiotyku o stężeniu wagowym 0,3 do 0,4%, w buforowanym roztworze o pH w granicach 7,0-7,5, korzystnie w 0,1 M buforze fosforanowym, najpierw w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, a potem

PL 201 383 B1 w temperaturze 4°C przez 24 godziny. Tak otrzymany biomateriał odmywa się od pozostał o ś ci leku buforem o pH 7,0, korzystnie 0,01 M buforem fosforanowym.

Zaletą wynalazku jest prosty sposób otrzymywania antybakteryjnych matryc, a antybiotyki immobilizowane poprzez kowalencyjne wiązania i utrwalane wodorem, nie tracą swojej aktywności przez ponad 1-2 lata, co znacznie podnosi wartość implantów wszczepiennych.

Przedmiot wynalazku ilustrują przedstawione poniżej przykłady.

P r z y k ł a d I

Dla pokrycia białkiem ok. 10 g matrycy w postaci szklanych kulek CPG o granulacji 0,125-0,177 mm użyto 5 ml roztworu keratyny rozpuszczonej w DMSO i wytrącano ją dodając 15 ml zmrożonego do minus 20°C acetonu. Po inkubacji w temperaturze 4°C przez 12 godzin, zdekantowano aceton, a matrycę osuszono pod próżnią w temperaturze 20°C.

Do 10 g tak keratynowanej matrycy dodano 50 ml 5% aldehydu glutarowego i mieszano pod próżnią przez 60 minut. Nowo utworzone kowalencyjne wiązania poddano redukcji wodorem z roztworu NaBH4 (50 mg/ml H2O), nadmiar aldehydu odsączono i aktywną matrycę opłukano wodą. 10 g tak przygotowanej matrycy ponownie poddano inkubacji z 40 ml roztworu gentamycyny o stężeniu wagowym 0,3%, w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,0, najpierw w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, a następnie przez 24 godziny w temperaturze 4°C.

Po zakończeniu procesu inkubacji matrycę oddzielono od roztworu gentamycyny i przemyto 200 ml 0,01 M buforu fosforanowego o pH 7,0. Otrzymany tym sposobem produkt zawierał 12 mg gentamycyny na 1 g matrycy.

P r z y k ł a d II

Do immobilizacji amikacyny użyto protezę naczyniową z przędzy sporządzonej z politereftalanu etylenu pokrytej żelatyną wieprzową. Proteza ta znana jest pod nazwą handlową TRICOGEL^® i stosowana jest przez oddziały chirurgii naczyniowej jako implant tętniczy.

Do 10 kawałków protez naczyniowych o masie 0,05 g i powierzchni 1 cm² każda, dodano 50 ml 15% aldehydu glutarowego i mieszano pod próżnią przez ok. 30 minut. Po zakończeniu aktywacji nowe połączenie poddano redukcji wodorem z roztworu NaBH4 (50 mg/ml H2O), a nadmiar aldehydu nie związanego z protezami odsączono i biomateriał opłukano wodą.

Tak uzyskane aktywne protezy naczyniowe ponownie poddano inkubacji z 40 ml roztworu amikacyny o stężeniu wagowym 0,4%, w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,5 w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, a następnie przez 24 godziny w temperaturze 4°C, po czym oddzielono od roztworu amikacyny i odmyto 200 ml 0,01 M buforu fosforanowego o pH 7,0. Otrzymany tym sposobem produkt zawierał 10 mg amikacyny na 1 g protezy.

P r z y k ł a d III

Do immobilizacji neomycyny wykorzystano matrycę ze szkła porowatego CPG o granulacji 0,125-0,177 mm. Granulat poddano białkowaniu keratyną według sposobu opisanego w przykładzie I.

Do 10 g tak przygotowanej matrycy dodano 50 ml 15% aldehydu glutarowego i mieszano pod próżnią przez 30 minut. Nowo powstałe wiązanie redukowano wodorem z roztworu NaBH4 (50 mg/ml H2O), nadmiar aldehydu odsączono i matrycę opłukano wodą.

g aktywnej matrycy ponownie poddano inkubacji z 40 ml roztworu neomycyny o stężeniu wagowym 0,4%, w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,5 w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, a nastę pnie przez 24 godziny w temperaturze 4°C, po czym matrycę oddzielono od roztworu neomycyny i odmyto 200 ml 0,01 M buforu fosforanowego o pH 7. Otrzymany tym sposobem produkt zawierał 9 mg neomycyny na 1 g matrycy.

P r z y k ł a d IV

Do immobilizacji streptomycyny zastosowano żel krzemionkowy o granulacji 0,1-0,2 mm, który pokryto keratyną sposobem podanym w przykładzie I.

Do 10 g takiego granulatu krzemionkowego dodano 50 ml 5% aldehydu glutarowego, po czym redukowano wodorem z roztworu NaBH4 (50 mg/ml H2O). Nadmiar aldehydu odsączono, a aktywną matrycę opłukano wodą. Ponownie poddano ją inkubacji z 40 ml roztworu streptomycyny o stężeniu wagowym 0,4%, w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,5 w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, a nastę pnie przez 24 godziny w temperaturze 4°C. Po zakoń czeniu procesu inkubacji, matrycę oddzielono od roztworu i odmyto 200 ml 0,01 M buforu fosforanowego o pH 7. Otrzymany tym sposobem produkt zawierał 10 mg streptomycyny na 1 g matrycy.

Immobilizowane według wymienionych przykładów biomateriały poddawano ocenie właściwości przeciwbakteryjnych wobec bakterii Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC

PL 201 383 B1

25923) i Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), badając strefy zahamowania wzrostu szczepów bakteryjnych na podłożu stałym Mueller-Hinton. W porównaniu z próbką kontrolną, strefa zahamowania wzrostu murawy bakteryjnej wokół biomateriału wynosiła: dla E. coli 11-16 mm, dla S. aureus

12-17 mm, dla P. aeruginosa 10-16 mm.

Poddając otrzymane według wynalazku, immobilizowane preparaty ocenie trwałości i stabilności stwierdzono, że przechowywane w temperaturze pokojowej przez 1 rok i 2 lata, zachowywały 80-90% ilości antybiotyków w porównaniu z próbkami kontrolnymi, co tym samym wpływało na ich wysoką aktywność przeciwbakteryjną wobec testowanych szczepów bakteryjnych.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób immobilizacji antybiotyków zawierających I-rzędowe grupy aminowe ze stałymi matrycami pokrytymi białkiem, z użyciem dwufunkcyjnego związku organicznego, znamienny tym, że matrycę aktywuje się poddając ją inkubacji w temperaturze pokojowej, pod próżnią przez 30 do 60 minut z podanym w nadmiarze 5 do 15% roztworem aldehydu glutarowego, nowo powstałe wiązania redukuje się wodorem „in statu nascendi”, a nie związany aldehyd odsącza się i wypłukuje wodą, po czym ponownie matrycę poddaje się inkubacji z roztworem antybiotyku o stężeniu wagowym 0,3 do 0,4%, w buforowanym roztworze o pH w granicach 7,0-7,5, najpierw w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, potem w temperaturze 4°C przez 24 godziny, a otrzymany biomateriał odmywa się od pozostałości leku buforem o pH 7,0.
2. 2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że jako antybiotyki zawierające I-rzędowe grupy aminowe stosuje się gentamycynę, amikacynę, neomycynę, streptomycynę, teikoplaninę, aktynomycynę lub daunomycynę.
3. 3. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że białkową powierzchnię stałych matryc, zwłaszcza nieorganicznych lub polimerowych stanowi keratyna lub żelatyna.
4. 4. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że jako bufor stosuje się bufor fosforanowy o stężeniu 0,1 M w procesie inkubacji aktywnej matrycy z antybiotykiem i o stężeniu 0,01 M dla odmywania leku.