PL197043B1 - Sposób modulowania cech nasion roślin, nasiono, roślina transgeniczna oraz wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego - Google Patents

Sposób modulowania cech nasion roślin, nasiono, roślina transgeniczna oraz wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego

Info

Publication number
PL197043B1
PL197043B1 PL344222A PL34422299A PL197043B1 PL 197043 B1 PL197043 B1 PL 197043B1 PL 344222 A PL344222 A PL 344222A PL 34422299 A PL34422299 A PL 34422299A PL 197043 B1 PL197043 B1 PL 197043B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
nucleic acid
adc
plant
seed
promoter
Prior art date
Application number
PL344222A
Other languages
English (en)
Other versions
PL344222A1 (en
Inventor
K.Diane Jofuku
Jack K. Okamuro
Original Assignee
Univ California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ California filed Critical Univ California
Publication of PL344222A1 publication Critical patent/PL344222A1/xx
Publication of PL197043B1 publication Critical patent/PL197043B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

1. Sposób modulowania cech nasion roslin, znamienny tym, ze dostarcza si e pierwsz a ro slin e zawieraj ac a zrekombinowan a kasetk e ekspresyjn a obejmuj ac a kwas nukleinowy ADC przy laczony do promotora ro slinnego, przy czym kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencj e polinukleotydow a hybrydyzuj ac a do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, w warunkach hybrydyzacji, które obejmuj a p lukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C, prowadzi si e samozapylenie pierwszej ro sliny lub skrzy zowanie pierwszej ro sliny z drug a ro sli- n a, dla wytworzenia wielo sci nasion; i selekcjonuje si e nasiona ze zmienion a mas a lub ze zmienion a zawarto scia w eglowodanów, bia lka lub olejów. PL PL PL PL

Description

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 197043 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 344222 (13) (22) Data zgłoszenia: 17.02.1999 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
17.02.1999, PCT/US99/03429 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
26.08.1999, WO99/41974 PCT Gazette nr 34/99 (51) Int.Cl.
C12N 15/82 (2006.01) A01H 5/00 (2006.01) A01H 1/00 (2006.01) A01H 5/10 (2006.01) C12N 5/04 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) C12N 15/29 (2006.01)
Sposób modulowania cech nasion roślin, nasiono, roślina transgeniczna oraz wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego (30) Pierwszeństwo:
19.02.1998,US,09/026,039 (43) Zgłoszenie ogłoszono:
08.10.2001 BUP 21/01 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
29.02.2008 WUP 02/08 (73) Uprawniony z patentu:
THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA,Oakland,US (72) Twórca(y) wynalazku:
Diane Jofuku K.,Santa Cruz,US Jack K. Okamuro,Santa Cruz,US (74) Pełnomocnik:
Chlebicka Lidia,
KULIKOWSKA & KULIKOWSKI (57) 1. Sposób modulowania cech nasion roślin, znamienny tym, że dostarcza się pierwszą roślinę zawierającą zrekombinowaną kasetkę ekspresyjną obejmującą kwas nukleinowy ADC przyłączony do promotora roślinnego, przy czym kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową hybrydyzującą do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, w warunkach hybrydyzacji, które obejmują pł ukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C, prowadzi się samozapylenie pierwszej rośliny lub skrzyżowanie pierwszej rośliny z drugą rośliną, dla wytworzenia wielości nasion; i selekcjonuje się nasiona ze zmienioną masą lub ze zmienioną zawartością węglowodanów, białka lub olejów.
PL 197 043 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób modulowania cech nasion, w szczególności wpływania na masę i inne własności nasion, nasienie oraz roślina transgeniczna, uzyskane przy pomocy technik inżynierii genetycznej, oraz wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego.
Wzór rozwoju kwiatów kontrolowany jest przez merystem roślinny, złożoną tkankę której komórki dają początek różnorodnym systemom organów roślin. Badania genetyczne i ewolucyjne umożliwiły zdefiniowanie ewolucyjnie konserwowanych sieci genowych kontrolujących tożsamość merystemu roślinnego i rozwój organów roślinnych u Arabidopsis, wyżlinu i innych gatunków roślin (patrz np. Coen, Carpenter Plant Cell 5: 1175-1181 (1993) i Okamuro i wsp. Plant Cell 5: 1183-1193 (1993). U Arabidopsis roś linny gen homeotyczny APETALA2 (AP2) kontroluje trzy istotne aspekty ontogenezy rośliny - powstanie merystemu roślinnego (Irish, Sussex Plant Cell 2: 741-753 (1990); Huala, Sussex Plant Cell 4: 901-913 (1992); Bowman i wsp Development 119: 721-743 (1993); Schultz i Haughun Development 119: 745-765 (1993); Shannon, Meeks-Wagner Plant Cell 5 639-655 (1993), określenie tożsamości organu rośliny (Komaki i wsp Development 104: 195-203 (1988); Bowman i wsp Plant Cell 1: 37-52 (1989); Kunst i wsp. Plant Cell 1: 1195-1208 (1989) oraz regulację czasoprzestrzenną ekspresji roślinnego genu homeotycznego (Bowman i wsp Plant Cell 3: 749-758 (1991); Drews i wsp Cell 65: 91-102 (1991).
Wczesną funkcją genu AP2 w czasie rozwoju rośliny jest wywoływanie powstania merystemu roślinnego. AP2 wykonuje tę rolę we współdziałaniu z co najmniej trzema innymi genami związanymi z merystemem APETALA1 (AP1), LEAFY (LFY) i CAULIFLOWER (CAL) (Irish, Sussex (1990); Bowman Flowering Newsletter 14: 7-19 (1992); Huala, Sussex (1992); Bowman i wsp (1993); Schultz, Haughn (1993), Shannon, Meeks-Wagner (1993). Drugą funkcją AP2 jest regulowanie rozwoju organów rośliny. U Arabidopsis merystem roślinny wytwarza cztery koncentryczne kręgi lub obręcze organów roślinnych - listki kielicha, płatki, pręciki i owocolistki. Przy częściowym braku funkcji genu AP2 (mutant ap2), płatki korony przekształcane są homeotycznie w liście, a płatki kielicha w wytwarzające pyłek organy pręcikopodobne (Bowman i wsp Development 112: 1-20 (1991). Odmiennie zachowują się silne mutanty ap2, płatki korony przekształcane są w owocolistki niosące zalążki, rozwój płatków korony jest zahamowany, liczba pręcików jest zredukowana, a funkcje pylników są często defektywne (Bowman i wsp (1991)). Ostatecznie wpływ ap2 na rozwój organów rośliny wynika po części z trzeciej funkcji AP2, którą jest pośrednie lub bezpośrednie regulowanie ekspresji kilkunastu roślinnych genów homeotycznych kontrolujących kwitnienie (Bowman i wsp. Plant Cell 3: 749-758 (1991); Drews i wsp Cell 65: 91-102 (1991); Jack i wsp Cell 68: 683-697 (1992); Handel i wsp Cell 71: 133-143 (1992)).
Bez wątpienia Ap2 odgrywa istotną rolę w regulowaniu rozwoju Arabidopsis. Nadal mało wiadomo o tym, w jaki sposób gen ten działa na poziomie komórkowym i molekularnym. Zaproponowano modele przestrzenne i kombinatoryczne w celu wyjaśnienia roli AP2 i innych roślinnych genów homeotycznych w określaniu tożsamości organów rośliny patrz np. Coen, Carpenter dz. cyt.) Zasadniczą przesłanką wspomnianego modelu jest to, iż AP2 i drugi roślinny gen homeotyczny AGAMOUS (AG) są genami wzajemnie antagonistycznymi. Zatem AP2 reguluje w sposób negatywny ekspresję genu AG w płatkach korony i kielicha, i odwrotnie, AG reguluje negatywnie ekspresję genu AP2 w owocolistkach i pręcikach. Analiza z zastosowaniem techniki hybrydyzacji in situ wzoru ekspresji genu AG w roślinach dzikich i w mutantach ap2 wykazała iż AP2 jest w rzeczywistości negatywnym regulatorem ekspresji AG. Jednakże, nie wiadomo nadal w jaki sposób AP2 kontroluje AG. Nie wiadomo również w jaki sposób AG wpływa na aktywność genu AP2.
Gen AP2 Arabidopsis wyizolowano stosując mutagenezę insercyjną z T-DNA, tak jak opisał to Jofuku i wsp. The Plant cell 6: 1211-1225 (1994). Gen AP2 koduje domniemany czynnik jądrowy, niepodobny do żadnych znanych grzybowych czy zwierzęcych białek regulacyjnych. Wyniki wskazują iż aktywność genu AP2 i jego funkcja nie są ograniczone do roślin rozwijających się, co sugeruje, iż może on odgrywać znacznie szerszą rolę w regulowaniu rozwoju Arabidopsis, niż to wcześniej przypuszczano.
Niezależnie od postępu w definiowaniu czynników genetycznych kontrolujących rozwój rośliny, dokonano niewielkiego postępu w identyfikacji i analizie genów wpływających na agronomicznie istotne cechy rośliny, takie jak wielkość nasion, zawartość białka, zawartość tłuszczu i podobne. Poznanie takich genów umożliwiłoby konstruowanie technikami inżynierii genetycznej roślin o pożądanych cechach. Wynalazek jest odpowiedzią na te postulaty.
PL 197 043 B1
Sposób modulowania cech nasion roślin według wynalazku charakteryzuje się tym, że dostarcza się pierwszą roślinę zawierającą zrekombinowaną kasetkę ekspresyjną obejmującą kwas nukleinowy ADC przyłączony do promotora roślinnego, przy czym kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową hybrydyzującą do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C, prowadzi się samozapylenie pierwszej rośliny lub skrzyżowanie pierwszej rośliny z drugą rośliną, dla wytworzenia wielości nasion; i selekcjonuje się nasiona ze zmienioną masą lub ze zmienioną zawartością węglowodanów, białka lub olejów.
W korzystnym wykonaniu ekspresja kwasu nukleinowego ADC hamuje ekspresję endogennego genu ADC i etap selekcjonowania obejmuje selekcjonowanie nasienia ze zwiększoną masą, posiadającego zwiększoną zawartość białka, zawartość węglowodanów lub zawartość oleju.
W innym korzystnym wykonaniu kwas nukleinowy ADC przyłączony jest do promotora roś linnego w orientacji antysensownej.
Korzystnie, pierwsza i druga roślina mogą należeć do tego samego gatunku.
Promotor roślinny może być promotorem konstytutywnym, korzystnie promotorem 35S z CaMV.
Promotor może być promotorem tkankowo specyficznym, korzystnie specyficznym względem zalążka.
W innym korzystnym wykonaniu ekspresja kwasu nukleinowego ADC wzmaga ekspresję endogennego genu ADC i etap selekcjonowania obejmuje selekcjonowanie nasienia ze zmniejszoną masą, przy czym pierwsza i druga roślina mogą należeć do tego samego gatunku, a promotor roślinny może być promotorem konstytutywnym, korzystnie promotorem 35S z CaMV.
Promotor może być promotorem tkankowo specyficznym, korzystnie specyficznym względem zalążka.
Zgodnie ze sposobem według wynalazku kwas nukleinowy ADC może hybrydyzować do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C, przy czym korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1, a bardziej korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 1.
Zgodnie ze sposobem według wynalazku kwas nukleinowy ADC hybrydyzować może do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C, przy czym korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, a bardziej korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydow ą o Numerze Identyfikacyjnym 2.
Przedmiotem wynalazku jest także nasienie zawierające zrekombinowaną kasetkę ekspresyjną obejmującą kwas nukleinowy ADC, posiadający sekwencję polinukleotydową hybrydyzującą do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C, oraz moduluje masę nasienia, zawartość węglowodanów, zawartość białka lub zawartość olejów w nasieniu.
Korzystnie, nasienie zawiera kwas nukleinowy ADC przyłączony do promotora roślinnego w orientacji antysensownej i masa nasienia jest co najmniej okoł o 10% wię ksza od ś redniej masy nasion z tej samej odmiany roślin nie posiadających zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej.
Korzystnie, masa nasienia jest co najmniej około 20% większa od średniej masy nasion z tej samej odmiany roślin nie posiadających zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej, bardziej korzystnie co najmniej około 50% większa.
Korzystnie, w nasieniu jest proporcjonalnie zwiększona zawartość oleju lub zawartość białka.
W innym korzystnym wykonaniu wynalazku nasienie posiada kwas nukleinowy ADC przyłączony do promotora roślinnego w orientacji sensownej i masa nasienia jest co najmniej około 10% mniejsza od średniej masy nasion z tej samej odmiany roślin nie posiadających zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej.
Korzystnie, masa nasienia jest wówczas co najmniej około 20% mniejsza od średniej masy nasion z tej samej odmiany roślin nie posiadających zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej, bardziej korzystnie co najmniej około 50% mniejsza.
PL 197 043 B1
W przykł adzie wykonania wynalazku nasienie posiada kwas nukleinowy ADC, który hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C. Korzystnie, kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1, a bardziej korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 1.
W innym przykładzie wykonania wynalazku nasienie posiada kwas nukleinowy ADC, który hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C. Korzystnie, kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, a bardziej korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 2.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto roślina transgeniczna zawierająca kasetkę ekspresyjną obejmującą promotor roślinny przyłączony w sposób umożliwiający działanie do heterologicznego polinukleotydu ADC, przy czym polinukleotyd ADC zawiera sekwencję nukleotydową hybrydyzującą do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C i moduluje masę, zawartość węglowodanów, zawartość białka lub zawartość olejów w nasieniu rośliny. Korzystnie, heterologiczny polinukleotydy ADC w kasetce ekspresyjnej rośliny koduje polipeptyd ADC, przy czym heterologiczny polinukleotyd ADC przyłączony jest do promotora w orientacji antysensownej.
W korzystnym wykonaniu wynalazku ro ś lina transgeniczna posiada kwas nukleinowy ADC, który hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C, przy czym korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1, a bardziej korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 1.
W innym korzystnym wykonaniu wynalazku roś lina transgeniczna posiada kwas nukleinowy ADC, który hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C, przy czym korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, a bardziej korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 2.
Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca kasetkę ekspresyjną obejmującą roślinny promotor przyłączony w sposób umożliwiający działanie do heterologicznego polinukleotydu ADC, przy czym polinukleotyd ADC zawiera kwas nukleinowy hybrydyzujący do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, w warunkach hybrydyzacji, które obejmuj ą pł ukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C, i moduluje masę, zawartość węglowodanów, zawartość białka lub zawartość olejów w nasieniu rośliny.
W wyizolowanej czą steczce kwasu nukleinowego heterologiczny polinukleotyd ADC koduje polipeptyd ADC, przy czym korzystnie heterologiczny polinukleotyd ADC przyłączony jest do promotora w orientacji antysensownej.
W korzystnym wykonaniu wynalazku wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego posiada kwas nukleinowy ADC, który hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C, przy czym kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1, a bardziej korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 1.
W drugim korzystnym wykonaniu wynalazku wyizolowana czą steczka kwasu nukleinowego posiada kwas nukleinowy ADC, który hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C, przy czym korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, a bardziej korzystnie kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 2.
PL 197 043 B1
Wynalazek dostarcza zatem sposobu wpływania na masę nasienia i inne cechy roślin. Sposób obejmuje dostarczenie rośliny posiadającej zrekombinowaną kasetkę ekspresyjną zawierającą kwas nukleinowy ADC przyłączony do roślinnego promotora. Roślina jest albo samozapylana albo krzyżowana z drugą rośliną w celu wytworzenia wielości nasion. Nasiona z pożądaną cechą (np. zmienioną masą) są następnie selekcjonowane.
W niektórych zastosowaniach transkrypcja kwasu nukleinowego ADC hamuje ekspresję endogennego genu ADC lub aktywność kodowanego przezeń białka. W tych zastosowaniach etap wybierania obejmuje selekcjonowanie nasienia ze zwiększoną masą lub inną cechą. Nasienie może na przykład posiadać zwiększoną zawartość białka, zwiększoną zawartość węglowodanów lub oleju. W przypadku zwiększonej zawartości oleju, rodzaje kwasów tłuszczowych mogą być zmienione lub mogą pozostać takie same jak w linii rodzicielskiej. W tych zastosowaniach kwas nukleinowy ADC może być podłączony do roślinnego promotora w orientacji sensownej lub antysensownej. Alternatywnie, ekspresja kwasu nukleinowego ADC może wzmagać ekspresję endogennego genu ADC lub aktywność ADC i wtedy etap wybierania obejmuje selekcjonowanie nasion o zmniejszonej masie. Zastosowanie to jest szczególnie użyteczne do wytwarzania beznasiennych odmian roślin przemysłowych.
Jeżeli pierwsza roślina krzyżowana jest z rośliną drugą, wymienione dwie rośliny mogą należeć do tego samego lub innych gatunków. Rośliny mogą być dowolnymi roślinami wyższymi, na przykład mogą należeć do rodziny Brassicaceae lub Solanaceae. Do wytwarzania nasion według wynalazku, zarówno roślina męska jak żeńska mogą obejmować kasetkę ekspresyjną zawierającą kwas nukleinowy ADC. W korzystnym zastosowaniu obie rośliny rodzicielskie zawierają wspomnianą kasetkę ekspresyjną.
W obrębie wspomnianej kasetki ekspresyjnej promotor roś linny może być promotorem konstytutywnym, na przykład promotorem CaMV 355. Alternatywnie, promotor może być promotorem tkankowo-specyficznym. Przykłady tkankowo-specyficznej ekspresji użytecznej w wynalazku obejmują ekspresję specyficzną względem owoców, nasion (np. specyficzną względem zalążków, zarodka, endospermu, przegrody lub łupiny).
Wynalazek dostarcza również nasion wytworzonych sposobami opisanymi powyżej. Nasienie według wynalazku obejmuje zrekombinowaną kasetkę ekspresyjną zawierającą kwas nukleinowy ADC. Jeżeli kasetka ekspresyjna stosowana jest w celu zahamowania ekspresji endogennej ADC, nasienie będzie miało masę co najmniej 20% większą niż średnia masa nasienia rośliny tej samej odmiany, nie posiadającej zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej. Jeżeli zrekombinowaną kasetka ekspresyjna została włączona w celu wzmożenia ekspresji ADC, nasiona będą miały masę o co najmniej 20% mniejszą niż średnia masa nasienia rośliny tej samej odmiany, nie posiadającej wspomnianej zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej. W podobny sposób można zmieniać inne cechy rośliny, takie jak zawartość białka, węglowodanów i oleju.
Definicje
Termin „sekwencja kwasu nukleinowego odnosi się do jedno- lub dwuniciowego polimeru deoksyrybonukleinowego lub rybonukleinowego, odczytywanego od końca 5' do 3'. Sekwencja obejmuje chromosomalny DNA, samo-replikujące się plazmidy, infekcyjne DNA lub RNA i DNA lub RNA pełniące funkcje zasadniczo strukturalne.
Termin „promotor odnosi się do regionu lub sekwencji umiejscowionej w kierunku 5' lub 3' od miejsca startu transkrypcji i zaangażowanej w rozpoznawanie i wiązanie polimerazy RNA i innych czynników inicjacji transkrypcji. „Roślinny promotor jest promotorem zdolnym do inicjowania transkrypcji w komórkach roślinnych.
Termin „roślina obejmuje całe rośliny, organy roślin (np. liście, pędy, kwiaty, korzenie itp), nasiona lub komórki roślinne i ich potomstwo. Klasa roślin mogących być zmienianymi przy zastosowaniu sposobu według wynalazku, jest zasadniczo tak szeroka jak klasa roślin wyższych podatnych na transformowanie, włączając w to okrytonasienne (jedno- i dwuliścienne), jak również nagonasienne. Klasa ta obejmuje rośliny o różnym poziomie ploidii, włączając w to rośliny poliploidalne, diploidalne, haploidalne i hemizygotyczne.
Sekwencja polinukleotydowa jest „heterologiczna względem organizmu lub drugiej sekwencji polinukleotydowej jeśli pochodzi z obcego gatunku lub, jeśli pochodzi z tego samego gatunku, jest zmodyfikowana w stosunku do formy wyjściowej. Na przykład promotor przyłączony w sposób umożliwiający działanie do heterologicznej sekwencji kodującej dotyczy sekwencji kodującej z gatunku różnego od tej, z której pochodzi promotor lub, jeśli pochodzi z tego samego gatunku, to sekwencja kodująca jest odmienna od naturalnie występujących wariantów allelicznych. Jak zdefiniowano poniżej
PL 197 043 B1 sekwencja ADC będąca heterologiczna w stosunku do sekwencji ADC przyłączonej w sposób umożliwiający działanie do promotora, nie obejmuje mutantów insercyjnych T-DNA (np. ap2-10), jak opisano to przez Jofuku i wsp The Plant Cell 6: 1211-1225 (1994).
Polinukleotyd „egzogenny względem określonej rośliny jest polinukleotydem wprowadzanym do rośliny sposobami innymi niż krzyżowanie. Przykłady sposobów, które można w tym celu wykorzystać, podano poniżej i obejmują one transformację z udziałem Agrobacterium, metodę balistyczną, elektroporację i podobne. Rośliny takie, zawierające egzogenny kwas nukleinowy określone są tu jako pokolenie R1 rośliny transgenicznej. Rośliny transgeniczne powstałe w wyniku krzyżowania lub przez samozapylanie są potomstwem wspomnianej rośliny.
„Kwas nukleinowy ADC (zawierający domenę AP2) lub „sekwencja polinukleotydowa ADC według wynalazku jest podsekwencją lub pełną sekwencją polinukleotydową genu kodującego polipeptyd obejmujący domenę AP2 i która obecna w roślinie transgenicznej może być użyta do modulowania cech nasienia w roślinach wytwarzanych przez roślinę. Przykładową sekwencją kwasu nukleinowego według wynalazku jest sekwencja AP2 Arabidopsis według Jofuku i wsp The Plant Cell 6: 1211-1225 (1994). Numer w bazie sekwencji GeneBank U12546. Jak wyjaśniono to dokładnie poniżej, rodzina genów RAP2 (spokrewniona z AP2) została zidentyfikowana w roślinach Arabidopsis. Wspomniana klasa kwasów nukleinowych dzieli się co najmniej na dwie podklasy (AP2 -podobne i EREBP-podobne), które można rozróżnić w oparciu na przykład o ilość domen AP2 zawartych w obrębie każdego polipeptydu i przez sekwencje w obrębie sekwencji konserwowanych ewolucyjnie. Różnice pomiędzy wspomnianymi podklasami będą przedstawione poniżej dokładnie. Polinukleotydy ADC definiowane są w oparciu o ich zdolność do hybrydyzowania w określonych warunkach z przykładowym kwasem nukleinowym lub produktem PCR utworzonym w oparciu o wspomniane sekwencje. Polinukleotyd ADC np AP2 lub RAP2 liczy typowo około 30-40 nukleotydów to około 3000, zwykle mniej niż około 5000 nukleotydów. Zazwyczaj kwasy nukleinowe liczą od około 100 do około 2000 nukleotydów, często od około 500 do około 1700 nukleotydów.
Kwas nukleinowy ADC, jak wyjaśniono to szczegółowo poniżej, stanowi nową klasę roślinnych genów regulatorowych kodujących polipeptydy ADC, rozróżnialne na podstawie obecności jednego lub więcej motywu powtarzalnego o długości 56-68 aminokwasów, oznaczanego dalej jako „domena AP1. Sekwencja aminokwasowa przykładowego polipeptydu AP2 przedstawiona została przez Jofuku i wsp dz. cyt. Specjaliści wiedzą, iż w świetle wynalazku można dokonać wielu modyfikacji (np. substytucji, addycji, delecji) w obrębie sekwencji tam przedstawionych, bez zasadniczego wpływania na ich funkcje. Warianty te określane są zbiorczym terminem polipeptyd ADC lub polinukleotyd ADC.
W przypadku wspólnej ekspresji transgenów i inhibicji endogennych genów (np. poprzez strategię antysensów lub supresję sensowną) specjaliści wiedzą, iż wprowadzona sekwencja polinukleotydowa niekoniecznie musi być identyczna, lecz może być „zasadniczo identyczna z sekwencją genu z którego się wywodzi. Jak wyjaś niono to poniż ej, wspomniane zasadniczo identyczne, warianty określane są zbiorczym terminem kwas nukleinowy ADC.
W przypadku, gdy wprowadzana sekwencja polinukleotydowa ulega transkrypcji i translacji z wytworzeniem funkcjonalnego polipeptydu, specjaliś ci wiedzą , iż ze wzglę du na degenerację kodu genetycznego wiele różnych sekwencji polinukleotydowych kodować może ten sam polipeptyd. Wspomniane warianty określane są zbiorczym terminem „kwas nukleinowy ADC, „kwas nukleinowy AP2 i „kwas nukleinowy RAP2. Ponadto wspomniany termin obejmuje sekwencje o pe ł nej dł ugoś ci zasadniczo identyczne (co określono w sposób podany poniżej) z sekwencją polinukleotydową ADC i kodują one białka zachowujące funkcje polipeptydu ADC (np. sekwencje otrzymane w wyniku konserwatywnych podstawień aminokwasowych w polipeptydzie AP2). Ponadto, warianty te mogą kodować mutanty dominujące negatywnie, co przedstawiono poniżej.
Dwie sekwencje nukleinowe lub polipeptydy są „identyczne jeżeli odpowiednio sekwencja nukleotydów lub reszt aminokwasowych, we wspomnianych dwu sekwencjach jest taka sama po przyrównaniu zachowującym maksymalną odpowiedniość, jak przedstawiono to poniżej. Termin „komplementarny względem stosowany poniżej oznacza, że sekwencje komplementarne są identyczne w cał o ś ci lub części w stosunku do referencyjnej sekwencji polinukleotydowej.
Porównanie sekwencji pomiędzy dwoma lub więcej polinukleotydami lub polipeptydami prowadzone jest typowo przez porównanie sekwencji dwu wspomnianych sekwencji w obrębie „okienka porównywania w celu identyfikacji i porównania podobieństwa lokalnych regionów lub sekwencji. Termin „okienko porównywania stosowany poniżej dotyczy segmentu co najmniej 20 sąsiadujących pozycji, zwykle od około 50 do około 200, częściej od około 100 do około 150, w obrębie którego sePL 197 043 B1 kwencje można porównywać z sekwencją wzorcową o tej samej liczbie sąsiadujących pozycji, przyjmując optymalne ustawienie porównywalnych sekwencji.
Optymalne ustawienie (optimal alignment) sekwencji w celu ich porównywania można przeprowadzić stosując algorytm lokalnej homologii według Smitha i Watermana Adv Appl Math 2: 482 (1981), algorytm zestawienia homologicznego według Needlemana i Wunsha J Mol Biol 48: 443 (1970), metodę poszukiwania podobieństw Pearsona i Lipmana PNAS (USA) 85: 2444 (1988), komputerowe postaci wspomnianych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA, zawarte w handlowym zestawie Wisconsin Genetics Software Package, Genetic Computing Group (GCG), 575 Science Dr, Madison, USA) lub ręcznie.
„Procent identyczności sekwencji określany jest przez porównanie dwu optymalnie zestawionych sekwencji w okienku porównywania, gdzie część sekwencji polinukleotydowej w okienku porównywania może obejmować addycje lub delecje (przerwy) w porównaniu do sekwencji wzorcowej (nie zawierającej addycji lub delecji), dla optymalnego zestawienia obu sekwencji. Procentowość wyliczana jest przez porównanie ilości pozycji, w których w obu sekwencjach występują identyczne zasady nukleinowe lub reszty aminokwasowe, dając liczbę pozycji całkowicie odpowiadających sobie, i podzielenie liczby pozycji całkowicie odpowiadających sobie przez liczbę całkowitą pozycji w okienku porównywania i pomnożenie uzyskanego wyniku przez 100, co daje procent identyczności sekwencji.
Termin „zasadnicza identyczność sekwencji polinukleotydowych oznacza, że polinukleotyd obejmuje sekwencję która wykazuje co najmniej 60% identyczności sekwencji, korzystnie co najmniej 80% identyczności sekwencji, bardziej korzystnie 90% identyczności sekwencji, najkorzystniej co najmniej 95% identyczności sekwencji, w porównaniu do sekwencji wzorcowej, z zastosowaniem programów przedstawionych powyżej (korzystnie programu BLAST), z zastosowaniem standardowych parametrów. Specjaliści wiedzą, iż wspomniane wartości można w sposób właściwy ustalić w celu określenia identyczności białek kodowanych przez dwie sekwencje nukleotydowe, biorąc pod uwagę degenerację kodu, podobieństwo aminokwasów, umiejscowienie ramki odczytu itp. Zasadnicza identyczność sekwencji aminokwasowych oznacza normalnie identyczność sekwencji co najmniej o wartości 35%, korzystnie co najmniej 60%, bardziej korzystnie co najmniej 90% i najkorzystniej co najmniej 95%. „Zasadniczo podobne polipeptydy posiadają wspólną sekwencję, jak podano to powyżej, za wyjątkiem tego, że pozycje nie identyczne mogą być zajmowane przez podobne (konserwowane ewolucyjnie) aminokwasy. Konserwowane ewolucyjnie podstawienia aminokwasowe dotyczą zamienności reszt aminokwasowych o podobnych właściwościach ich łańcuchów bocznych. Na przykład grupa aminokwasów z alifatycznym łańcuchem bocznym obejmuje glicynę, alaninę, walinę, leucynę i izoleucynę, grupa aminokwasów posiadających alifatyczno-hydroksylowy łańcuch boczny obejmuje serynę i treoninę, grupa aminokwasów posiadają ca aminowy łańcuch boczny obejmuje asparaginę i glutaminę, grupa aminokwasów posiadająca aromatyczny łańcuch boczny obejmuje fenyloalaninę, tyrozynę i tryptofan, grupa aminokwasów posiadają ca zasadowy ł a ń cuch boczny obejmuje lizynę , argininę i histydynę , i grupa aminokwasów posiadają ca ł a ń cuch zawierają cy siarkę obejmuje cysteinę i metioninę. Preferowane grupy konserwatywnych podstawień to: walina-leucyna-izoleucyna, fenyloalanina-tyrozyna, lizyna-arginina, alanina-walina i asparagina-glutamina.
Innym wskaźnikiem zasadniczego podobieństwa sekwencji nukleotydowych jest zdolność dwu sekwencji do wzajemnego hybrydyzowania ze sobą lub z trzecim kwasem nukleinowym w warunkach ścisłych. Warunki ścisłe zależą od sekwencji i są różne w różnych warunkach. Zasadniczo, warunki ścisłe dobrane są tak by temperatura hybrydyzacji była o około 5°C niższa niż temperatura topnienia helisy (Tm) o specyficznej sekwencji, przy określonej sile jonowej i pH. Wspomniana Tm to temperatura (w określonej sile jonowej i pH), przy której 50% docelowej sekwencji hybrydyzuje z w pełni komplementarną sondą. Zazwyczaj warunki ścisłe to takie, w których stężenie soli wynosi około 0.02 M przy pH 7 i temperaturze co najmniej 60°C.
W wynalazku genomowy DNA lub cDNA obejmują ce kwas nukleinowy ADC wedł ug wynalazku można zidentyfikować stosując standardową technikę hybrydyzacji Southerna w warunkach ścisłych z zastosowaniem ujawnionych w wynalazku sekwencji kwasów nukleinowych. Do celów wynalazku warunki ścisłe takiej hybrydyzacji obejmują co najmniej jedno płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze co najmniej około 50°C, zwykle około 55°C do około 60°C, przez co najmniej 20 minut, lub warunki równoważne. Inne sposoby identyfikowania kwasów nukleinowych według wynalazku zostały opisane w szczegółach w dalszej części opisu.
PL 197 043 B1
Wynalazek dostarcza genów ADC, takich jak AP2 i RAP2 Arabidopsis. Wynalazek dostarcza strategii molekularnych kontrolowania wielkości nasienia i całkowitej zawartości białka w nasieniu z zastosowaniem sposobu nadekspresji ADC i strategii antysensownych konstruktów. W szczególności dostarcza roślin transgenicznych obejmujących antysensowne konstrukty powodujące dramatyczne zwiększenie masy nasienia, zawartości białka lub oleju w nasieniu. Alternatywnie, nadekspresja ADC z zastosowaniem konstruktu według wynalazku prowadzi do zmniejszenia wielkości nasienia i cał kowitej zawartoś ci biał ka w nasieniu. Zaprezentowane dane wykazują , iż przy pomocy wynalazku można kontrolować wiele agronomicznie istotnych cech roślin, włączając w to masę nasienia, całkowita zawartość białka i zawartość oleju w gatunkach roślin o znaczeniu komercyjnym.
Przedmiot wynalazku w korzystnym przykładzie wykonania przedstawiony został na rysunku, na którym fig. 1A przedstawia zestawienie sekwencji aminokwasowych pomiędzy prostymi powtórzeniami AP2-R1 sekwencji AP2 (aa 129-195) i AP2-R2 (aa 221-288), fig. 1B to schematyczny diagram przypuszczalnych alifatycznych alfa-helis AP2-R1 (R1) i AP2-R2 (R2), fig. 2 przedstawia antysensowny konstrukt według wynalazku, fig. 3 przedstawia sensowny konstrukt według wynalazku, fig. 4A i 4B przedstawiają sekwencję i strukturę domeny AP2, fig. 4C to schematyczny diagram przypuszczalnych alfa-helis amfipatycznych RAP2.7-R1, AP2-R1 i ANT-R1, fig. 4D przedstawia schematyczny diagram przypuszczalnych alfa-helis amfipatycznych RAP2.2, RAP2.5, RAP12 i EREBP-3, fig. 4E przedstawia zestawienie sekwencji pomiędzy regionami linkera (pozycje aminokwasowe 25-26) w AP2, ANT i RAP2.7, fig. 5 przedstawia schematyczny diagram pAP2, który może być wykorzystany do skonstruowania wektora ekspresyjnego według wynalazku, fig. 6 przedstawia schematyczny diagram pBEL1, który może być wykorzystany do skonstruowania wektora ekspresyjnego według wynalazku, a fig. 7 przedstawia to schematyczny diagram ekspresji genu.
Na fig. 1A przedstawiającej zestawienie sekwencji aminokwasowych pomiędzy prostymi powtórzeniami AP2-R1 sekwencji AP2 (aa 129-195) i AP2-R2 (aa 221-288), linie proste i przerywane pomiędzy dwiema sekwencjami wskazują odpowiednio reszty identyczne i podobne. Strzałki wskazują pozycje mutacji ap2-1, ap2-5 i ap2-10 opisanych przez Jofuku i wsp (1994). Nawias powyżej AP2-R1 i AP2-R2 wskazuje reszty zdolne do tworzenia alifatycznej alfa-helisy przedstawionej figurą 1B.
Figura 1B to schematyczny diagram przypuszczalnych alifatycznych alfa-helis AP2-R1 (R1) i AP2-R2 (R2). Koniec N helis R1 i R2 rozpoczyna się odpowiednio pozycjami Phe-160 i Phe-253, i ulega obrotowi w kierunki ruchu wskazówek zegara (100°) na resztę aminokwasową Phe-177 i Cys-270. Strzałki skierowane w kierunku do lub od centrum osi helisy wskazują ujemne lub dodatnie wartości hydrofobowości definiowanej wg Jonesa i wsp J Lipid Res 33: 87-296 (1992).
Figura 2 przedstawia antysensowny konstrukt według wynalazku. pPW14.4 (identyczny z pPW15) przedstawia 13.41 kpz antysensowny konstrukt genu AP2 stosowany do transformacji roślin opisanej w wynalazku. pPW14.4 obejmuje gen AP2 kodujący region w połączeniu transkrypcyjnym z promotorem konstytutywnym 35S z wirusa mozaikowatoś ci kalafiora (P35S), przyłączony w orientacji antysensownej. Wektor plazmidowy Ti to zmodyfikowana wersja wektora pGSJ780A (Plant Genetic Systems, Gent, Belgia), do którego wprowadzono pojedyncze miejsce EcoRI w miejsce BamHI z użyciem adaptera Clal-EcoRI-BamHI. Zmodyfikowany wektor pGSJ780A zlinearyzowano enzymem EcoRI i wstawiono do niego sekwencję regionu kodującego AP2 w postaci fragmentu EcoRI o długości 1.68 kpz uzyskanego z plazmidu cAP2#1 zawierającego cDNA AP2 (Jofuku i wsp, 1994) w orientacji antysensownej w stosunku do promotora 35S. KmR to selekcyjny roślinny gen markerowy (NPTII) nadający oporność na kanamycynę stransformowanym komórkom niosącym zintegrowany gen antysensowny 35S-AP2. Prostokąty 1 i 5 oznaczają odpowiednio lewą i prawą sekwencję graniczną T-DNA, niezbędne do transferu genu 35S-AP2 zawartego w T-DNA do genomu roślinnego. Regiony 2 i 3 obejmują sekwencje T-DNA. Prostokąt 3 oznacza fragment 3' genu kodującego syntazę oktopinową, uczestniczący w terminacji transkrypcji. Region 6 oznacza bakteryjną sekwencję DNA funkcjonującą jako bakteryjne miejsce startu replikacji zarówno w komórkach E.coli, jak Agrobacterium, co umożliwia namnażanie i utrzymanie plazmidu pPW14.4 w obu bakteriach. Prostokąt 7 przedstawia bakteryjny marker selekcyjny, nadający oporność na streptomycynę i spektynomycynę, co umożliwia selekcję komórek Agrobacterium niosących zrekombinowany plazmid pPW14.4.
Figura 3 przedstawia sensowny konstrukt według wynalazku. pPW 12.4 (identyczny z pPW9) przedstawia 13.41 kpz sensowny konstrukt genu AP2 stosowany do transformacji roślin opisanej w wynalazku. pPW12.4 obejmuje gen AP2 kodują cy region w połączeniu transkrypcyjnym z promotorem konstytutywnym 35S z wirusa mozaikowatości kalafiora (P35S), przyłączony w orientacji antysensownej. Wektor plazmidowy Ti to zmodyfikowana wersja wektora pGSJ780A (Plant Genetic Systems,
PL 197 043 B1
Gent, Belgia), do którego wprowadzono pojedyncze miejsce EcoRI w miejsce BamHI z użyciem adaptora Clal-EcoRI-BamHI. Zmodyfikowany wektor pGSJ780A zlinearyzowano enzymem EcoRI i wstawiono do niego sekwencję regionu kodującego AP2 w postaci fragmentu EcoRI o długości 1.68 kpz uzyskanego z plazmidu cAP2#l zawierającego cDNA AP2 (Jofuku i wsp, 1994) w orientacji sensownej w stosunku do promotora 35S. KmR to selekcyjny roś linny gen markerowy (NPTII) nadają cy oporno ść na kanamycynę stransformowanym komórkom niosącym zintegrowany gen antysensowny 35S-AP2. Prostokąty 1 i 5 oznaczają odpowiednio lewą i prawą sekwencję graniczną T-DNA, niezbędne do transferu genu 35S-AP2 zawartego w T-DNA do genomu roślinnego. Regiony 2 i 3 obejmują sekwencje T-DNA. Prostokąt 3 oznacza fragment 3' genu kodującego syntazę oktopinową, uczestniczący w terminacji transkrypcji. Region 6 oznacza bakteryjną sekwencje DNA funkcjonującą jako bakteryjne miejsce startu replikacji zarówno w komórkach E.coli, jak Agrobacterium, co umożliwia namnażanie i utrzymanie plazmidu pPW12.4 w obu bakteriach. Prostokąt 7 przedstawia bakteryjny marker selekcyjny, nadający oporność na streptomycynę i spektynomycynę, co umożliwia selekcję komórek Agrobacterium niosących zrekombinowany plazmid pPW12.4.
Figury 4A i 4B przedstawiają sekwencję i strukturę domeny AP2. Pozycja reszty aminokwasowej w obrębie domeny AP2 przedstawiona jest po prawej stronie. Wprowadzono luki w celu najlepszego dopasowania sekwencji. Pozycja reszt aminokwasowych i luk w obrębie sekwencji przedstawiona jest numerami 1-77. Umiejscowienie konserwowanych ewolucyjnie elementów YRG i RAYD wskazane jest nawiasami. Zacieniowane prostokąty pokazują regiony podobieństwa sekwencyjnego. Dodatnio naładowane reszty aminokwasowe w obrębie elementu YRG zaznaczone są + nad resztami aminokwasowymi. Umiejscowienie 18 aminokwasowego rdzenia przewidziane jest w oparciu o umiejscowienie amfipatycznej alfa-helisy w AP2 (nawias). Reszty w obrębie elementu RAY każdej domen AP2 przewidziane w oparciu o występowania amfipatycznej alfa-helisy zaznaczone są przez podkreślenie. Figura 4a przedstawia członków podklasy AP2-podobnej. Przedstawione jest również zestawienie sekwencji aminokwasowych pomiędzy powtórzeniami R1 i R2 domeny AP2 w obrębie Ap2, ANT i RAP2.7. Nawiasy powyżej sekwencji oznaczają konserwowane bloki YRG i RAYD opisane powyżej. Pełne kółko i gwiazdka wskazuje odpowiednio pozycje mutacji ap2-1 i ap2-5. Reszty aminokwasowe tworzące zgodnościowy motyw domeny AP2 dla AP2, ANT i RAP2.7 wskazane są poniżej zestawionych sekwencji, a niezmienne reszty zaznaczone są dużymi literami. Figura 4B przedstawia członków podklasy EREBP-podobnej. Zestawienie sekwencji aminokwasowych pomiędzy domenami AP2 obejmuje ERBP z tytoniu i EREBP-podobną sekwencję Arabidopsis (numer w bazie GeneBank: EREBP-1, EREBP-2, EREBP-3, EREBP-4 odpowiednio D38123, D38126, D38124 i D38125).
Figura 4C to schematyczny diagram przypuszczalnych alfa-helis amfipatycznych RAP2.7-R1, AP2-R1 i ANT-R1. Reszty aminokwasowe w obrębie motywów RAP2.7-R1, AP2-R1 i ANT-R1 przedstawione są przez podkreślenie w A, które najprawdopodobniej tworzą amfipatyczne alfahelisy są zaznaczone schematycznie z resztami obracającymi się w kierunku ruchu wskazówek zegara (100° na resztę aminokwasową). Strzałki skierowane w kierunku do lub od centrum osi helisy wskazują ujemne lub dodatnie wartości hydrofobowości definiowanej wg Jonesa i wsp J Lipid Res 33: 87-296 (1992). Dodatnio lub ujemnie naładowane reszty aminokwasowe oznaczone są odpowiednio symbolami + lub -.
Figura 4D przedstawia schematyczny diagram przypuszczalnych alfa-helis amfipatycznych RAP2.2, RAP2.5, RAP12 i EREBP-3. Reszty aminokwasowe w obrębie motywów RAP2.2, RAP2.5, RAP12 i EREBP-3 przedstawione są przez podkreślenie na figurze 4B, które najprawdopodobniej tworzą amfipatyczne alfa-helisy są zaznaczone i opisane jak na figurze 4C.
Figura 4E przedstawia zestawienie sekwencji pomiędzy regionami Inkera (pozycje aminokwasowe 25-26) w AP2, ANT i RAP2.7. R1 i R2 oznaczają pozycje powtórzeń R1 i R2 w obrębie AP2, ANT i RAP2.7, w stosunku do sekwencji regionu linkera. Prostokąty oznaczają reszty niezmienne, w obrębie konserwowanych regionów linkera. Reszty aminokwasowe tworzące region zgodnościowy linkera AP2, ANT i RAP2.7 przedstawione są poniżej zestawienia sekwencji, a niezmienne reszty napisane są dużymi literami. Grot strzałki wskazuje pozycję mutacji ant-3 (Klucher i wsp Plant Cell 8: 137-153, 1996).
Figura 5 przedstawia schematyczny diagram pAP2, który może być wykorzystany do skonstruowania wektora ekspresyjnego według wynalazku.
Figura 6 przedstawia schematyczny diagram pBEL1, który może być wykorzystany do skonstruowania wektora ekspresyjnego według wynalazku.
Figura 7 to schematyczny diagram ekspresji genu.
Izolacja kwasów nukleinowych ADC
PL 197 043 B1
Ogólnie, nazewnictwo i stosowane procedury laboratoryjne z dziedziny inżynierii genetycznej przedstawione poniżej są dobrze znane specjalistom i są rutynowo stosowane. Standardowe techniki wykorzystywane są do klonowania, izolacji DNA i RNA, amplifikacji i oczyszczania. Ogólnie, reakcje enzymatyczne obejmują ligazę DNA, polimerazę DNA, endonukleazy restrykcyjne i podobne oraz są prowadzone zgodnie z zaleceniami producenta. Wspomniane techniki oraz wiele innych są zasadniczo wykonywane według Sambrooka i wsp, Molecular Cloning - A laboratory manual, CSHL, CSH, New York (1989).
Izolacja kwasów nukleinowych może być dokonana na wiele sposobów. Na przykład można wykorzystać sondy oligonukleotydowe o sekwencji ujawnionej tu do identyfikowania poszukiwanego genu w bibliotece cDNA lub bibliotece genomowego DNA. W celu utworzenia biblioteki genomowej duże segmenty DNA utworzone w wyniku przypadkowej fragmentacji np. z wykorzystaniem restryktaz i wprowadzone następnie do wektorowego DNA w formie konkatamerycznej moż na zapakować do użytecznego wektora. W celu przygotowania biblioteki cDNA, należy wpierw wyizolować mRNA z pożądanego organu, takiego jak kwiaty, i w oparciu o mRNA zawierający transkrypt genu ADC tworzy się bibliotekę cDNA. Alternatywnie cDNA można przygotować z mRNA wyizolowanego z innych tkanek, eksprymujących geny ADC lub geny homologiczne.
Bibliotekę cDNA lub genomową można przeszukiwać następnie z wykorzystaniem sondy opartej na sekwencji sklonowanego genu ADC według wynalazku. Sondy można zastosować do hybrydyzacji z genomowym DNA lub cDNA w celu wyizolowania genów homologicznych w tym samym lub innym gatunku rośliny. Alternatywnie, do przeszukiwania biblioteki ekspresyjnej zastosować można przeciwciała skierowane przeciw białku ADC.
Alternatywnie, pożądany kwas nukleinowy można amplifikować z próbek kwasów nukleinowych technikami powielania. Na przykład zastosować można technikę PCR do amplifikowania sekwencji genów ADC bezpośrednio z genomowego DNA, z cDNA, z bibliotek genomowych lub cDNA. PCR i inne techniki amplifikacji in vitro mogą być użyteczne na przykład do klonowania sekwencji kwasu nukleinowego kodującego mające ulegać ekspresji białko, do wytworzenia kwasu nukleinowego stosowanego jako sonda do wykrywania obecności użytecznego mRNA w próbce, do sekwencjonowania kwasu nukleinowego i do podobnych celów.
Użyteczne startery i sondy do identyfikowania sekwencji ADC z tkanek roślin utworzono w oparciu o sekwencje wedł ug Jofuku i wsp dz. cyt. Ogólny przeglą d techniki PCR znajduje się np. w PCR Protocols: A guide to methods and applications. Innis M, Gelfand D, Sninsky J, White T wyd. Academic Press, San Diego (1990).
Jak wskazano powyżej, kwasy nukleinowe według wynalazku charakteryzują się obecnością sekwencji kodującej domenę AP2. Zatem kwasy nukleinowe można zidentyfikować w oparciu o ich zdolność do specyficznej hybrydyzacji z sekwencjami kodującymi domenę AP2 według wynalazku. Startery amplifikujące specyficznie domeny AP2 wskazanych genów są szczególnie użyteczne do identyfikowania poszczególnych polinukleotydów ADC. Startery (primery) użyteczne w tym celu, opracowane w oparciu o sekwencje genu RAP2 przedstawiono poniżej.
Nazwa Numer w Banku Genów Primery
AP2 U12546 J0AP2U 5'-GTTGCCGCTGCCGTAGTG-3' J0AP2L 5'-GGTTCATCCTGAGCCGCATATC- 3'
RAP2.1 AF003094 J0RAP2.IU 5’-CTCAAGAAGAAGTGCCTAACCACG-3' J0RAP2.1L 5' -GCAGAAGCTAGAAGAGCGTCGA-3 '
PL 197 043 B1
RAP2.2 AF003095 JORAP2.2U 5'-GGAAAATG GGCTGCGGAG-3' JORAP2.2L 5'-GTTACCTCCAGCATCGAACGAG-3'
RAP2.4 AF003097 JORAP2. 4U 5 '-GCTGGATCTTGTTTCGCTTACG-3' JORAP2.4L 5'-GCTTCAAGCTTAGCGTCGACTG-3'
RAP2.5 AF003098 JORAP2. 5U 5 '-AGATGGGCTTGAAACCCGAC-3' JORAP2.5L 5'-CTGGCTAGGGCTACGCGC-3'
RAP2.6 AF003099 JORAP2.6U 5'-TTCTTTGCCTCCTCAACCATTG-3' JORAP2.6L 5'-TCTGAGTTCCAACATTTTCGGG-3'
RAP2.7 AF003100 JORAP2.7U 5'-GAAATTGGTAACTCCGGTTCCG-3' JORAP2.7L 5'-CCATTTTGCTTTGGCGCATTAC-3'
RAP2.8 AF003101 JORAP2.8U 5*-GGCGTTACGCCTCTACCGG-3' JORAP2.8L 51-CGCCGTCTTCCAGAACGTTC-3 '
RAP2.9 AF003102 JORAP2.9U 5'-ATCACGGATCTGGCTTGGTTC-3' JORAP2.9L 5'-GCCTTCTTCCGTATCAACGTCG-3'
RAP2.10 AF003103 JORAP2.10U 5'-GTCAACTCCGGCGGTTACG-3' JORAP2.10L 5'-TCTCCTTATATACGCCGCCGA-3·
RAP2.11 AF003104 JORAP2.11U 5 ' -GAGAAGAGCAAAGGCAACAAGAC-3 ' JORAP2.11L 5'-AGTTGTTAGGAAAATGGTTTGCG-3'
RAP2.12 AF003105 JORAP2.12U 5'-AAACCATTCGTTTTCACTTCGACTC-3' JORAP2.12L 5'-TCACAGAGCGTTTCTGAGAATTAGC-3
Startery do reakcji PCR stosowane były w standardowych warunkach PCR (opisanych np. przez Innisa i wsp dz. cyt.), z wykorzystaniem kwasów nukleinowych podanych powyżej (opisanych numerami GeneBank) jako matrycą. Utworzone produkty PCR można zastosować do identyfikowania kwasów nukleinowych według wynalazku (np. z biblioteki cDNA), ze względu na ich zdolność do hybrydyzowania ze wspomnianymi produktami. Szczególnie korzystne warunki hybrydyzacyjne to: bufor hybrydyzacyjny składający się z 0,25 M buforu fosforanowego pH 7,2, 1 mM EDTA, 1% BSA, 7% SDS. Płukania po hybrydyzacji: pierwsze płukanie 2,0xSSC+ 0,1% SDS lub 0,39 M Na + i kolejne płukania z 0,2xSSC + 0,1% SDS lub 0,042 M Na+. Temperatury hybrydyzacji wynoszą od około 45°C do około 78°C, zazwyczaj od około 50°C do około 70°C. Płukania prowadzono w 18°C.
Szczególnie korzystne warunki hybrydyzacji to:
Temperatura hybrydyzacji (°C) Czas hybrydyzacji (godziny) Bufor płukania A (°C) Bufor płukania B (°C)
78 48 18 18
70 48 18 18
65 48 18 18
60 72 18 18
55 96 18 18
45 200 18 bez płukania
PL 197 043 B1
Jeżeli jest to pożądane można zastosować startery amplifikujące regiony bardziej specyficzne dla konkretnych genów ADC. Utworzone produkty PCR można zastosować w podanych warunkach hybrydyzacyjnych do identyfikowania kwasów nukleinowych według wynalazku.
Nazwa Numer w Banku Genów Primery
AP2 U12546 AP2U 5'-ATGTGGGATCTAAACGACGCAC-3' AP2L 5'-GATCTTGGTCCACGCCGAC-3'
RAP2.1 AF003094 RAP2.1U 5'-AAG AGG ACC ATC TCT CAG-3' RAP2.1L 5'-AAC ACT CGC TAG CTT CTC-3'
RAP2.2 AF003095 RAP2.2U 5'-TGG TTC AGC AGC CAA CAC-3' RAP2.2L 5'-CAA TGC ATA GAG CTT GAG-3'
RAP2.4 AF003097 RAP2.4U 5'-ACG GAT TTC ACA TCG GAG-3' RAP2.4L 5'-CTA AGC TAG AAT CGA ATC C-3'
RAP2.5 AF003098 RAP2.5U 5'-TACCGGTTTCGCGCGTAG-3 ' RAP2,5L S'-CACCTTCGAAATCAACGACCG-3 '
RAP2.6 AF003099 RAP2. 6U 5 '-TTCCCCGAAAATGTTGGAACTC-3' RAP2.6L 5'-TGGGAGAGAAAAAATTGGTAGATCG-3'
RAP2.7 AF003100 RAP2.70 5'- CGA TGG AGA CGA AGA CTC-3' RAP2.7L 5'- GTC GGA ACC GGA GTT ACC-3'
RAP2.8 AF003101 RAP2.8U 5'-TCA CTC AAA GGC CGA GAT C-3' RAP2.8L 5'-TAA CAA CAT CAC CGG CTC G-3'
RAP2.9 AF003102 RAP2.9U 5'-GTG AAG GCT TAG GAG GAG-3' RAP2.9L 5'-TGC CTC ATA TGA GTC AGA G-3'
RAP2.10 AF003103 RAP2.10U 5'-TCCCGGAGCTTTTAGCCG-3' RAP2.10L 5'-CAACCCGTTCCAACGATCC- 3'
RAP2.11 AF003104 RAP2.11U 5'-TTCTTCACCAGAAGCAGAGCATG-3' RAP2.11L 5'-CTCCATTCATTGCATATAGGGACG-3'
RAP2.12 AF003105 RAP2.12U 5'-GCTTTGGTTCAGAACTCGAACATC-3' RAP2.12L 5'-AGGTTGATAAACGAACGATGCG-3'
Polinukleotydy można również syntezować dobrze znanymi technikami opisanymi w literaturze. Patrz np. Carruthers i wsp CSH Symp Quant Biol 47: 411-418 (1982), Adams i wsp J Am Chem Sci 105: 661 (1983). Dwuniciowe fragmenty DNA można otrzymać albo przez syntezę komplemenPL 197 043 B1 tarnego łańcucha i łączenie obu nici w odpowiednich warunkach lub przez dodanie nici komplementarnej przez polimerazę DNA z odpowiednimi sekwencjami starterów.
Alternatywnie, startery specyficznie hybrydyzujące z wysoce konserwatywnymi regionami domen AP2 można zastosować do amplifikacji sekwencji z szerokiego zakresu gatunków roślin takich jak Arabidopsis, kanola, soja, tytoń i wyżlin.
Przykłady takich starterów obejmują:
Starter RISZU 1: 5'-GGAYTGTGGGAAACAAGTTTA-3'
Starter RISZU 2: 5'-TGCAAAGTRACACCTCTATACTT-3'
Y = pirymidyna (T lub C)
R = puryna (A lub G)
Standardowa technika hybrydyzacji kwasów nukleinowych i zastosowanie warunków hybrydyzacji ujawnionych w wynalazku pozwala identyfikować cDNA pełnej długości lub klony genomowe.
Ponadto, następujące startery DNA, RISZU 3 i RISZU 4 można zastosować w odwróconej reakcji PCR aby specyficznie zamplifikować flankujące rejony genu AP2.
Starter RISZU 3: 5'GCATGWGCAGTGTCAAATCCA-3'
Starter RISZU 4: 5'-GAGGAAGTTCYAAGTATAGA-3'
W = A lub T
V = G, A lub C
Wymienione startery można zastosować w standardowej reakcji PCR w celu amplifikacji sekwencji genu ADC z kanoli (Sek Id Nr 1) i soi (Sek Id Nr 2).
Kontrola aktywności ADC lub ekspresji genu
Specjaliści wiedzą, iż na wiele sposobów można modulować aktywność ADC lub ekspresje genu. Aktywność ADC można modulować w komórkach rośliny na poziomie genu, transkrypcji, na poziomie potranskrypcyjnym, translacji lub po translacji, co przedstawia schematycznie fig. 7. Techniki modulowania aktywności ADC na każdym z wymienionych poziomów są ogólnie dobrze znane specjalistom i zostaną przedyskutowane skrótowo poniżej.
Sposoby wprowadzania mutacji genowych do genów roślinnych są dobrze znane. Na przykład nasiona lub inny materiał roślinny można traktować chemicznymi substancjami mutagennymi, zgodnie ze standardowymi procedurami. Takimi substancjami chemicznymi mogą być, w sposób nieograniczający: siarczek dietylowy, etylenoimina, etylometylosulfonian, N-nitrozo-N-etylomocznik. Alternatywnie, zastosować można promieniowanie radioaktywne ze źródeł takich jak na przykład promienie X lub promienie gamma. Pożądane mutacje powodujące np. zwiększoną masę nasion, zawartość oleju i inne cechy są nastę pnie selekcjonowane.
Alternatywnie zastosować można rekombinacje homologiczną, w celu indukowania docelowego niszczenia genu poprzez specyficzne deletowanie lub zmianę genu ADC in vivo (patrz ogólnie: Grewal, Klar Genetics 146: 1221-1238, 1997; Xu i wsp Genes Devel 10: 2411-2422, 1996. Rekombinacje homologiczną zademonstrowano u roślin (Puchta i wsp Experiertia 50: 277-284, 1994; Swoboda i wsp EMBO J 13: 484-489, 1994 i Offringa i wsp PNAS (USA) 90: 7346-7350, 1993.
W celu zastosowania rekombinacji homologicznej do genów według wynalazku, przygotowano in vitro mutacje w wybranych częściach genu ADC (włączając w to sekwencje 3' i 5' końców oraz introny), takie jak te ujawnione w wynalazku, a następnie wprowadzono je do pożądanych roślin standardowymi technikami. Ponieważ wydajność rekombinacji homologicznej zależy od stosowanego wektora, zwykle stosowane są wektory dwucistronowe, takie jak opisane przez Mountforda i wsp PNAS (USA) 91: 4303-4307, 1994; i Vaulounta i wsp Transgenic Res 4: 247-255, 1995 w celu zwiększenia wydajności procesu. Zmutowany gen oddziaływuje z docelowym, dzikim genem w taki sposób że dochodzi do rekombinacji homologicznej i zastąpienia genu typu dzikiego w roślinach transgenicznych, co prowadzi do zahamowania aktywności ADC.
Alternatywnie można zastosować oligonukleotydy zwartych reszt RNA lub DNA tworzące dupleks z podwójną strukturą szpilki do włosów na końcach. Sekwencja DNA/RNA zaprojektowana jest tak, by a przylegała do sekwencji docelowej w ADC i zawierała pożądane podstawienie nukleotydowe. Wprowadzenie chimerowego oligonukleotydu z pozachromosomalnym plazmidem T prowadzi do wydajnej i specyficznej konwersji genu ADC, kierowanej przez chimerowe cząsteczki w niewielkiej liczbie komórek roślinnych, metoda ta została opisana w Cole-Strauss et al Science 273: 1386-1389, 1996 i Yoon i wsp PNAS (USA) 93: 2071-2076, 1996.
Ekspresje genu można inaktywować z zastosowaniem technik rekombinacji DNA poprzez transformowanie komórek roślinnych konstruktami obejmującymi transpozony lub sekwencje T-DNA. Mu14
PL 197 043 B1 tanty ADC przygotowane tymi metodami zostały zidentyfikowane zgodnie ze standardowymi technikami. Na przykład mutacje można wykryć techniką PCR lub przez badanie obecności lub nieobecności ADC mRNA np. techniką Northerna. Mutanty można również selekcjonować poprzez badanie masy nasienia, zawartości oleju lub podobnych cech.
Wyizolowane sekwencje kwasu nukleinowego przygotowane jak podano to powyżej można zastosować w wielu technikach służących do kontrolowania ekspresji endogennej ADC na różnych poziomach. Do kontroli transkrypcji, akumulacji mRNA, translacji itp. można stosować podsekwencje sekwencji według wynalazku.
Wiele metod można zastosować do hamowania ekspresji genu w roślinach. Na przykład zastosować można korzystnie strategię antysensu. W tym celu należy segment kwasu nukleinowego z pożądanego genu sklonować i przyłączyć w sposób umożliwiający działanie do promotora takiego by transkrybowany był antysensowny RNA. Konstruktem takim są następnie transformowane rośliny i wytwarzany jest antysensowny RNA. W komórkach roś linnych najprawdopodobniej supresja antysensowna działa na poziomie regulacji genu, włączając w to supresję translacji (patrz: Bourque Plant Sci (Limerick) 105: 125-149, 1995; Pantopoulos Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology vol. 48, Cohn WE, Moldave K wyd. Acad Press, str 181-238; Heiser i wsp Plant Sci (Shannon) 127: 61069, 1997), oraz przez zapobieganie gromadzeniu mRNA kodującego pożądane białko. (patrz np: Baulcombe Plant Mol Biol 32: 79-88, 1996; Prins, Goldbach Arch Virol 141: 2259-2276, 1996; Metzlaff i wsp Cell 88: 845-854, 1997; Sheehy i wsp PNAS (USA) 85: 8805-8809, 1988; Hiatt i wsp USA Patent Nr 4,801,340).
Segment kwasu nukleinowego przeznaczony do wprowadzenia ogólnie będzie zasadniczo identyczny do co najmniej części endogennego genu ADC lub genów, które mają być hamowane. Sekwencja ta jednakże nie musi być całkowicie identyczna, by zahamować ekspresję. Wektory według wynalazku można zaprojektować w taki sposób, iż efekt hamowania stosować się będzie do innych genów w obrębie rodziny genów wykazujących homologię lub zasadniczą homologię z genem docelowym.
W przypadku supresji antysensownej wprowadzana sekwencja niekoniecznie musi być sekwencją pełnej długości w stosunku albo do pierwotnego transkryptu albo do dojrzałego mRNA. Ogólnie, wyższa homologia sekwencji może kompensować jej krótkość. Ponadto, wprowadzana sekwencja nie musi zachowywać tego samego układu eksonów i intronów, a także może być wystarczająca homologia segmentów nie kodujących. Normalnie stosować można sekwencję o długości około 30 lub 40 nukleotydów, choć sekwencja o długości co najmniej około 100 nukleotydów jest korzystna, bardziej korzystna jest sekwencja o długości około 200 nukleotydów, a szczególnie korzystna jest sekwencja od około 500 do około 1700 nukleotydów.
Wiele regionów genu może stanowić miejsce działania dla różnych supresorów ekspresji genu ADC. Obejmować one mogą regiony kodujące (np. regiony flankujące domeny PA2), introny, sekwencje złącz ekson/intron, 3' lub 5' UTR i podobne. W niektórych zastosowaniach konstrukt można zaprojektować tak, by wyeliminować możliwość przyłączania białek regulatorowych do sekwencji genu ADC niezbędnych do ekspresji komórkowo- lub tkankowo-specyficznej. Wspomniane sekwencje regulatorowe mogą być położone albo w regionie 3', albo 5' lub w obrębie sekwencji kodujących genu, i mogą być albo elementem regulacji pozytywnej albo negatywnej. Sekwencje te można zidentyfikować stosując standardowe techniki analizy delecyjnej, dobrze znane specjalistom. Po zidentyfikowaniu sekwencji do rośliny można wprowadzić antysensowny konstrukt kontrolujący transkrypcję genu AP2 w konkretnej tkance, na przykład w rozwijających się zalążkach i/lub nasionach.
W celu uniemoż liwienia ekspresji genu ADC moż na zastosować również oligonukleotydy tworzące potrójną helisę. Potrójna helisa DNA może hamować transkrypcję i replikację, tworzyć mutacje specyficzne względem miejsca, przecinać DNA i indukować rekombinacje homologiczną (patrz np. Havre, Glazer J Virol 67: 7324-7331, 1993; Scanlon i wsp FASEB J 9: 1288-1296, 1995; Giovannangli i wsp Biochemistry 35: 10539-10548, 1996; Chan, Glazer J Mol Med (Berlin) 75: 267-282, 1997. Oligonukleotydy tworzące potrójną helisę można skierować przeciw tym samym sekwencjom, co oligonukleotydy antysensowne.
Katalityczne cząsteczki RNA lub rybozymy można również zastosować do hamowania ekspresji genów ADC. Jest możliwe zaprojektowanie rybozymów specyficznie parujących z dowolną sekwencją docelową RNA, i przecinających rdzeń fosfocukrowy w konkretnym miejscu, co prowadzi do funkcjonalnej inaktywacji docelowego RNA. Rybozym nie ulega zmianie ani zużyciu we wspomnianej reakcji i może uczestniczyć w przecinaniu kolejnych cząsteczek RNA, tak jak czyni to prawdziwy enzym.
PL 197 043 B1
Wprowadzenie sekwencji rybozymu w obręb sekwencji antysensownego RNA nadaje im zdolność do przecinania RNA docelowego, zwiększając tym samym aktywność konstruktu. Rybozymy można zatem stosować względem tych samych sekwencji, co RNA antysensowne.
Wiele klas rybozymów zidentyfikowano do tej pory. Jedna z klas rybozymów jest pochodną niewielkich, kolistych RNA zdolnych do samodzielnej replikacji i samoprzecinania w komórkach roślinnych. Wspomniane RNA replikują się bądź samoistnie (wiroidy), bądź z pomocą wirusów pomocniczych (satelitarne RNA). Przykłady obejmują RNA następujących wiroidów: ASVd, satelitarne RNA TRV, LTSV, VTMV, SNMV i SCMV. Projektowanie i stosowanie specyficznych wobec sekwencji docelowych rybozymów opisano w: Zhao, Pick Nature 365: 448-451, 1993; Eastham, Ahlering J Urology 156: 1186-1188, 1996; Sokół, Murray Transgenic Res 5: 363-371, 1996; Sun i wsp Mol Biotechnol 7: 241-251, 1997; Haseloff i wsp Nature 334: 585-591, 1988.
Inną metodą supresji jest supresja sensowna. Wprowadzenie kwasu nukleinowego w orientacji sensownej jest jak niedawno wykazano efektywnym sposobem blokowania transkrypcji genów docelowych. Na przykład zastosowano tę metodę do modulowania ekspresji endogennych genów (patrz: Assaad i wsp Plant Mol Biol 22: 1067-1085, 1993; Flavell i wsp PNAS (USA) 91: 3490-3496, 1994; Stam i wsp Annals Bot 79: 3-12, 1997; Napoli i wsp The Plant Cell2: 279-289, 1990; USA Patent nr 5,034,323,020 i 5,283,184.
Efekt hamowania może również wystąpić po wprowadzeniu sekwencji obejmującej nie samą sekwencję kodującą, lecz tylko intron lub UTR homologiczne do sekwencji obecnych w pierwotnym transkrypcie endogennej sekwencji. Wprowadzona sekwencja zasadniczo nie musi być identyczna z sekwencją endogenną, która ma być hamowana. Minimalna identyczność typowo jest większa od 65%, lecz większa identyczność może być bardziej skuteczna w hamowaniu ekspresji endogennych sekwencji. Korzystna jest zasadniczo większa identyczność o wartości około 80%, choć około 95% identyczności jest najbardziej korzystne. Podobnie jak w przypadku regulacji antysensownej efekt stosuje się do dowolnego białka w obrębie rodziny genów wykazujących homologię lub zasadniczą homologię.
W przypadku supresji sensownej wprowadzana sekwencja niekoniecznie musi być całkowicie identyczna, nie musi być również oparta o sekwencje pełnej długości, w stosunku do pierwotnego transkryptu lub dojrzałego mRNA genu docelowego. Może być jednak preferowana w celu uniknięcia zjawiska przeciekania transkrypcji u roślin z nadekspresją niektórych białek. Wyższa identyczność krótszych sekwencji kompensuje niższą identyczność sekwencji dłuższych. Ponadto wprowadzane sekwencje nie muszą posiadać tego samego wzoru eksonów i intronów oraz ponadto identyczność obszarów nie kodujących może być wystarczająca. Normalnie do regulacji antysensownej stosuje się sekwencje o podanych wyżej długościach. Ponadto te same regiony genu, które reguluje się antysensownie, można też regulować kosupresyjnie.
Alternatywnie, aktywność ADC można modulować przez eliminacje białek niezbędnych do ekspresji komórkowo specyficznej ADC. Zatem ekspresja białek i/lub sekwencji regulatorowych kontrolujących ekspresję genu ADC można modyfikować stosując przedstawione wyżej metody.
Innym sposobem modulacji jest zastosowanie zmienionych tRNA hamujących translację mRNA ADC. Sposób ten obejmuje zastosowanie supresorowych tRNA w celu transaktywacji genów docelowych zawierających przedwczesny kodon stop (patrz: Betzner i wsp Plant J 11: 587-595, 1997; Choisne i wsp Plant J 11: 597-604, 1997. Wpierw tworzy się linie roślin zawierające konstytutywnie eksprymowany gen ADC obejmujący kodon stop AMBER. Tworzone są również linie roślin, każda obejmująca geny supresorowych tRNA, znajdujące się pod kontrolą komórkowo specyficznych promotorów. Konstrukt zawierający wspomniany gen tRNA krzyżowany jest z linią ADC w celu uzyskania aktywności ADC. Wspomniane linie supresorowe tRNA można stosować również do kierowania ekspresją dowolnego typu genów w tych samych komórkach lub tkankach.
Niektóre białka ADC (np. AP2) tworzą być może formy multimeryczne in vivo. W związku z tym można zastosować alternatywny model hamowania funkcji ADC, poprzez zastosowanie mutacji dominujących negatywnie. Metoda ta obejmuje transformowanie roślin konstruktem zawierającym zmutowane polipeptydy ADC tworzące defektywne multimery z endogennymi, dzikimi polipeptydami ADC, co prowadzi do inaktywacji białka ADC. Wspomniane zmutowane polipeptydy mogą różnić się od naturalnie występujących sekwencji swą sekwencją aminokwasową (addycje, delecje, substytucje itp). Modyfikacje te można stosować w wielu kombinacjach w celu utworzenia ostatecznego polipeptydu. Zastosowanie mutacji dominujących negatywnie w celu inaktywacji genów docelowych przedstawił Mizukami i wsp Plant Cell 8: 831-845, 1996. Analiza sekwencji DNA i badania nad wiązaniem DNA
PL 197 043 B1 sugerują iż APS (Jofuku i wsp Plant Cell 6: 1211-1225, 1995) i szereg RAP2 funkcjonują jako czynniki transkrypcyjne. Zatem można zastosować dominujące negatywne formy genów ADC o uszkodzonych funkcjach wiązania się z DNA.
Białko AP2 jak się wydaje istnieje w formie zarówno ufosforylowanej jak zdefosforylowanej. Zatem aktywność AP2 może być regulowana przez kaskadę sygnałową kinazy białkowej. Ponadto aktywność AP2 może być również regulowana przez i/lub pełnić rolę we wspomnianej kaskadzie (EREBP, Ohme-Takagi, Shinshi Plant Cell 7: 173-182, 1995; AtEBP, Buttner, Singh PNAS (USA) 94: 5961-5966, 1997; Pti4/5/6, Zhou i wsp EMBO J 16: 3207-3218, 1997. Można zatem użyć zmutowanych form białek ADC w strategii mutacji dominujących negatywnie, na przykład poprzez substytucje reszt aminokwasowych fosforylowanych, tak by poziom fosforylacji białka uległ zmniejszeniu. Alternatywnie, można zastosować formy ADC ulegające hiperfosforylacji.
Również glikozylacja wpływa na aktywność białek w sposób tkankowo i komórkowo specyficzny (patrz: Meshi, Iwabuchi Plant Cell Physiol 36: 1405-1420, 1995; Meynial-Salles, Combes J Biotechnol 46: 1-14, 1996. Można zatem użyć zmutowanych form białek ADC ze zmienionymi resztami aminokwasowymi ulegającymi glikozylacji, podobnie jak to można uczynić w przypadku zmutowanych form o zaburzonej fosforylacji.
AP2 może pełnić również swe niektóre funkcje w wyniku oddziaływań z innymi czynnikami transkrypcyjnymi/białkami (np. AINTEGUMENTA, Eliott i wsp Plant Cell 8: 155-168, 1996; Klucher i wsp Plant Cell 8: 137-154, 1996; CURLY LEAF, Goodrich i wsp Nature 386: 44-51, 1997; lub LEUNIG, Liu, Meyerowitz Development 121: 975-991, 1995. Zatem, jedną z prostych metod hamowania aktywności AP2 jest hamowanie aktywności białek regulujących aktywność AP2. Aktywność ADC można zatem kontrolować przez kontrolowanie ilości dostępnych czynników transkrypcyjnych/białek niezbędnych do aktywności ADC. Można tego dokonać przez nadekspresję domen ADC, uczestniczących w oddziaływaniach białko-białko w komórkach roślinnych (np. domeny AP2 lub przypuszczalna domena aktywacji transkrypcyjnej opisana przez Jofuku i wsp Plant Cell 6: 1211-1225, 1994. Strategie tę zastosowano do modulowania aktywności genu (Lee i wsp Exptl Cell Res 234: 270-276, 1997; Thiesen Gene Exprression 5: 229-0243, 1996; Waterman i wsp Cancer Res 56: 158-163, 1996).
Inna strategia wpływania na stabilność białka ADC polega na zastosowaniu przeciwciał specyficznych względem ADC. Ten sposób kontrolowania komórkowo specyficznej ekspresji AP2 stosuje się Abs w celu inaktywacji domen w wyniku rozpoznawania białka typu przeciwciało:antygen (Hupp i wsp Cell 83: 237-245, 1995).
Zastosowanie kwasów nukleinowych według wynalazku do wzmagania ekspresji genu ADC
Wyizolowane sekwencje przygotowane jak przedstawiono to powyżej można zastosować do wprowadzenia ekspresji konkretnego kwasu nukleinowego ADC w celu wzmożenia lub wzrostu endogennej ekspresji genu. Wzmożona ekspresja prowadzi zasadniczo do powstawania mniejszych nasion lub owoców beznasiennych. Gdy korzystna jest nadekspresja genu, pożądany gen z różnych gatunków roślin można zastosować w celu zmniejszenia potencjalnego efektu supresji sensownej.
Specjaliści wiedzą, iż polipeptydy kodowane przez geny według wynalazku, podobnie jak inne białka, posiadają różne domeny o różnych funkcjach. Zatem, sekwencje genu niekoniecznie muszą być pełnej długości, o tyle o ile domeny funkcjonalne białka ulegają ekspresji. Szczególne cechy polipeptydów ADC, włączając w to domenę AP2, przedyskutowane są poniżej.
Łatwo można zaprojektować zmodyfikowane łańcuchy białkowe przy pomocy różnych technik inżynierii genetycznej, co jest dobrze znane specjalistom i co zostanie przedstawione poniżej. Na przykład, łańcuchy mogą różnić się naturalnie występującymi sekwencjami (delecje, addycje, substytucje itp). Modyfikacje te można stosować w wielu różnych kombinacjach w celu wytworzenia ostatecznego, zmodyfikowanego łańcucha białkowego.
Przygotowanie zrekombinowanych wektorów
W celu zastosowania wyizolowanych sekwencji we wspomnianych wyż ej technikach przygotowano zrekombinowane wektory użyteczne do transformowania roślin. Techniki transformowania szerokiego zakresu gatunków roślin są znane i dobrze opisane w literaturze naukowej. Na przykład: Weising i wsp Ann Rev Genet 22: 421-477, 1988. Sekwencja DNA kodująca pożądany polipeptyd, na przykład sekwencja cDNA kodująca białko pełnej długości, korzystnie jest łączona z sekwencjami regulacyjnymi transkrypcję i translację, które kierować będą transkrypcją sekwencji genu w zamierzonej tkance transformowanej rośliny.
Przykładowo, w celu wywołania nadekspresji zastosować można roślinny promotor kierujący transkrypcją wspomnianego genu we wszystkich tkankach zregenerowanej rośliny. Promotory takie
PL 197 043 B1 określa się jako konstytutywne i są one aktywne w większości warunków zewnętrznych i stanów rozwojowych rośliny lub etapach różnicowania komórki. Przykłady promotorów konstytutywnych obejmują region inicjacji transkrypcji CaMV 35S, promotor 1' lub 2' z T-DNA Agrobacterium tumefaciens i inne regiony inicjacji transkrypcji z różnych genów roślinnych znanych specjalistom. Geny takie obejmują na przykład gen Ap2, ACT11 z Arabidopsis (Huang i wsp Plant ol Biol 33: 125-139, 1996), Cat3 z Arabidopsis GeneBank U43147, Zhong i wsp Mol gen genet 251: 196-203, 1996), gen kodujący białko przenośnikowe stearoilo-acyl/desaturazę z Brassica napus (GeneBank X74782, Solocombe i wsp Plant Physiol 104: 1167-1176, 1994), GPc1 z kukurydzy (GeneBank X15596, Martinez i wsp J Mol Biol 208 551-565, 1989), i Gpc2 z kukurydzy (GeneBank U45855, Majunath i wsp Plant Mol Biol 33: 97-112, 1997).
Alternatywnie, roślinny promotor może kierować ekspresją kwasu nukleinowego ADC w konkretnych tkankach lub może znajdować się pod bardziej dokładną kontrolą czynników zewnętrznych. Przykłady warunków zewnętrznych wpływających na promotory indukowalne obejmują warunki beztlenowe, podwyższoną temperaturę, lub obecność światła. Promotory takie zwie się indukowalnymi lub tkankowo specyficznymi. Specjaliści wiedzą, iż tkankowo specyficzne promotory kierować mogą ekspresją sekwencji przyłączonych w sposób umożliwiający działanie także w tkankach innych niż tkanki docelowe. Zatem, zastosowane tkankowo specyficzne promotory mogą kierować ekspresją preferencyjnie w tkance docelowej, lecz również mogą wywoływać pewną ekspresję w innych tkankach.
Przykłady promotorów znajdujących się pod kontrolą stanu rozwojowego obejmują promotory inicjujące transkrypcję tylko (lub zasadniczo tylko) w niektórych tkankach, takich jak owoce, nasiona lub kwiaty. Promotory kierujące ekspresją kwasów nukleinowych w zalążkach, kwiatach lub nasionach są według wynalazku szczególnie użyteczne. Promotor aktywny w nasieniu oznacza promotor kierujący ekspresją w tkankach nasienia, i taki promotor może być specyficzny względem zalążka, zarodka, endospermu, przegrody, okrywy nasiennej lub ich kombinacji. Przykłady obejmują promotor z genu H. eksprymowanego w zalążkach BEL1 (Reiser i wsp Cell 83: 135-742, 1995; GeneBank U39944). Inne użyteczne promotory specyficzne względem nasienia pochodzą z następujących genów: MAC1 z kukurydzy (Sheridan i wsp Genetics 142: 1009-1020, 1996, Cat3 z kukurydzy (GeneBank L05934, Abler i wsp Plant Mol Biol 22: 10131-1038, 1993, gen kodujący oleozynę 18kD z kukurydzy (GeneBank J05212, Lee i wsp Plant Mol Biol 26: 1981-1987, 1995), vivoparous-1 z Arabidopsis (Gene Bank U93215), gen kodujący oleozynę z Arabidopsis (GeneBank Z17657), Atmyc1 z Arabidopsis (Urao i wsp Plant Mol Biol 32: 571-576, 1996), biał ko zapasowe nasion 2s (rodzina genów) z Arabidopsis (Coceicao i wsp Plant 5: 493-505, 1994), gen kodujący oleozynę 20 kD z Brassica napus (Genebank M63985), napA z Brassica napus (GeneBank J02798, Josefsson i wsp JBL 26: 264-271, 1995), gen kodujący białko zapasowe 2S z Brassica napus (Dasgupta i wsp Gene 133: 301-302, 1993), gen kodujący oleozynę A (GeneBank U09118) i oleozynę B (GeneBank U09119) z soi i gen kodujący niskocząsteczkowe białko bogate w siarkę z soi (Choi i wsp Mol Gen Genet 246: 266-268, 1995).
Jeżeli pożądana jest właściwa ekspresja polipeptydu, do konstruktu powinien być włączony region poliadenylacji z 3' końca sekwencji kodującej. Region poliadenylacji pochodzić może z naturalnego genu, lub z wielu różnych genów, lub z T-DNA.
Wektor obejmujący wspomniane sekwencje (np. promotory lub regiony kodujące) z genów według wynalazku typowo obejmuje gen markerowy nadający fenotyp selekcyjny komórkom roślinnym. Na przykład, markerem może być oporność na czynnik roślinobójczy, hygromycynę, lub herbicyd np. chlorosulfuron lub Basta.
Wytwarzanie roślin transgenicznych
Konstrukty DNA według wynalazku można wprowadzić do genomu pożądanej rośliny wieloma sposobami. Przykładowo, konstrukt DNA można wprowadzić bezpośrednio do genomowego DNA komórki roślinnej z wykorzystaniem elektroporacji i mikroiniekcji protoplastów roślinnych lub bezpośrednio do tkanki roślinnej techniką balistyczną.
Techniki mikroiniekcji są dobrze znane specjalistom i dobrze opisane w literaturze naukowej i patentowej. Wprowadzenie konstruktu DNA z zastosowaniem PEG opisał Paszkowski i wsp EMBO J 3: 2727-2722, 1984. Techniki elektroporacji opisane są przez Fromma i wsp PNAS (USA) 82: 5824, 1985. Transformacja techniką balistyczną opisana została przez Kleina i wsp Nature 327: 70-73, 1987.
Alternatywnie konstrukt DNA można połączyć z użytecznymi regionami flankującymi T-DNA i wprowadzić do uż ytecznego wektora Agrobacterium tumefaciens. Funkcje wirulencji Agrobacterium tumefaciens prowadzą do insercji konstruktu i przylegającego markera do DNA komórki roślinnej zainfekowanej Agrobacterium. Techniki transformacji oparte na Agrobacterium tumefaciens, włączając
PL 197 043 B1 w to rozbrajanie i zastosowanie wektorów binarnych, jest równie dobrze przedstawione w literaturze naukowej, patrz np. Horsch i wsp Science 233: 496-498; Fraley i wsp PNAS (USA) 80: 4803, 1983.
Transformowane komórki roślinne otrzymane jedną z powyżej opisanych technik można hodować w celu zregenerowania całej rośliny posiadającej genotyp stransformowany i zatem pożądany fenotyp, taki jak zwiększona masa nasienia. Wspomniane techniki regeneracji polegają na manipulowaniu pewnymi fitohormonami w pożywce hodowlanej, zwykle wykorzystaniu markerów oporności na czynniki roślinobójcze, która to cecha wprowadzana jest wraz z pożądanymi sekwencjami nukleotydowymi. Regeneracja roślin z protoplastów została przedstawiona przez Evansa i wsp Protoplast isolation and culture. Handbook of plant cell culture, str 124-176, MacMillan Publ Comp, New York 1983 i Bindinga - Regeneration of plants, plant protoplasts, str 21-73, CRC Press, Boca Raton 1985. Regenerację prowadzić można również z kallusa, eksplantów, organów i ich części. Tego typu techniki regeneracji przedstawione są ogólnie przez Klee i wsp., Ann Rev of Plant Physiol 38: 467-486, 1987.
Kwas nukleinowy według wynalazku można zastosować do nadawania pożądanej cechy zasadniczo dowolnej roślinie. Zatem wynalazek ma zastosowanie względem szerokiego zestawu roślin włączając w to gatunki z rodzajów: Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthes, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Persea, Phaesolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapsis, Solanum, Sorghum, Teobromus, Trigonella, Tricium, Vicia, Vitis, Vigna i Zea.
Zwiększenie wielkości nasienia, zawartości białka, aminokwasu i oleju jest szczególnie pożądane w roślinach przemysłowych, których nasiona używane są bezpośrednio w żywieniu zwierząt i do celów spożywczych lub przemysłowych. Przykłady obejmują soję, kanolę i zboża takie jak ryż, jęczmień, proso, żyto i podobne. Zmniejszenie wielkości nasienia lub wytworzenie odmian beznasiennych jest szczególnie istotne w przypadku roślin hodowanych dla ich owoców, gdzie duże nasiona mogą być niepożądane. Przykłady obejmują ogórek, pomidor, melon i truskawki.
Specjaliści wiedzą, iż po stabilnej inkorporacji kasetki ekspresyjnej do rośliny transgenicznej i potwierdzeniu jej działania można ją przekazywać innym roślinom w wyniku krzyżowania. Można zastosować w tym celu dowolne techniki hodowlane, w zależności od krzyżowanych gatunków.
Ponieważ ekspresja transgeniczna kwasów nukleinowych według wynalazku prowadzi do zmian fenotypowych nasienia i owocu, rośliny obejmujące kasetkę ekspresyjną przedstawioną powyżej muszą być zdolne do krzyżowania z drugą rośliną w celu uzyskania produktu końcowego. Nasienie według wynalazku może pochodzić z krzyżówki pomiędzy dwiema roślinami transgenicznymi, lub krzyżówki pomiędzy rośliną według wynalazku i inną rośliną. Pożądany efekt (np. zwiększenie masy nasienia) ulega zasadniczo wzmożeniu przy krzyżówce dwu roślin rodzicielskich eksprymujących kasetkę ekspresyjną według wynalazku.
Nasiona uzyskane z roślin według wynalazku można analizować zgodnie z dobrze znanymi procedurami identyfikowania nasion z pożądanymi cechami. Zmniejszoną lub zwiększoną wielkość można określić ważąc nasiona lub stosując obserwację naoczną. Zawartość białka mierzy się zwykle metodą Bradforda i wsp Anal Biochem 72: 248, 1976. Zawartość oleju można mierzyć standardowymi technikami, na przykład chromatografią gazową. Procedury te można stosować także do oceny jakie rodzaje kwasów tłuszczowych i inne lipidy uległy zmianie w roślinach według wynalazku.
Stosując wspomniane metody specjalista może zidentyfikować nasiona według wynalazku, posiadające kasetkę ekspresyjną według wynalazku i zwiększoną masę nasienia. Zazwyczaj masa nasienia powinna być co najmniej około 10%m często około 20% większa niż średnia masa nasienia rośliny tej samej odmiany nie posiadającej kasetki ekspresyjnej. Masa powinna być o około 50% większa i korzystnie co najmniej około 75% do około 100% większa. Zwiększenie innych właściwości np. zawartości białka i oleju jest zazwyczaj proporcjonalne do przyrostu masy. Zatem w niektórych zastosowaniach wynalazku ilość białka lub oleju może wzrosnąć o około 10, 20, 30, 50, 75 lub 100%, lub w przybliżonej proporcji w stosunku do przyrostu masy.
Alternatywnie, nasiona według wynalazku, w których ekspresja AP2 ulega wzmożeniu, posiadają kasetkę ekspresyjną według wynalazku i ich masa ulega zmniejszeniu. Masa nasion jest co najmniej około 20% mniejsza niż średnia masa nasienia rośliny tej samej odmiany nie posiadającej kasetki ekspresyjnej. Często masa jest mniejsza o około 50%, korzystniej o około 75% lub nasiona są
PL 197 043 B1 nieobecne. Jak powyżej, zmniejszenie innych własności np. zawartości białka lub oleju jest proporcjonalny do zmniejszenia masy.
Poniższe przykłady służą ilustracji wynalazku w sposób nieograniczający.
P r z y k ł a d 1
Izolacja genu AP2
Izolacja i charakterystyka genu AP2 z Arabidopsis została opisana przez Jofuku i wsp dz. cyt. W skrócie, zastosowano T-DNA z Agrobacterium do mutagenezy insercyjnej w celu zidentyfikowania i izolowania genów kontrolują cych tworzenie kwiatów u Arabidopsis. Jedna z transformowanych linii, oznaczona jako T10, segregowała z częstością 3:1 pod względem kwiatów zmutowanych, przypominających fenotypowo wiele form allelicznych zmutowanego genu homeotycznego ap2. Linię T10 przebadano i potwierdzono technikami genetycznymi iż T10 jest alleliczną formą ąp2. Mutanta oznaczono jako ap2-10.
Określono iż ap2-10 jest produktem mutacji insercyjnej T-DNA, stosując analizę sprzężeń z zastosowaniem kodowanego przez T-DNA genu NPTII, jako genetycznym markerem. Wyizolowano zestaw nakładających się zrekombinowanych fagów zawierających T-DNA z biblioteki genomowej ap2-10, i roślinną sekwencję DNA flankującą element insercyjny T-DNA zastosowano jako sondę hybrydyzacyjną do izolacji faga zawierającego odpowiedni region z biblioteki genomowej uzyskanej z Arabidopsis typu dzikiego. Miejsce insercji T-DNA w ap2-10 zmapowano w 7.2 kpz fragmencie EcoRI, zlokalizowanym centralnie w genie AP2.
Wyizolowano 5 klonów cDNA z kwiatów Arabidopsis odpowiadających wyizolowanemu fragmentowi 7.2 kpz genu AP2. Wszystkie 5 klonów niosło sekwencje odpowiadającą transkryptowi AP2, co dowiedziono stosując technikę antysensu, w celu indukowania fenotypu mutanta ap2 u roślin typu dzikiego.
W celu określenia struktury genu AP2 porównano sekwencję wstawki cDNA z fragmentem genomowego DNA o wielkości 7.2 kpz genu AP2. Wyniki pokazują iż gen AP2 liczy 2.5 kpz długości, zawiera 10 eksonów i 9 intronów o wielkości od 85 do 110 pz. Gen AP2 koduje teoretycznie polipeptyd o długości 432 aminokwasów i masie 48kD. Sekwencje nukleotydową AP2 i przewidywaną sekwencję aminokwasową porównano z istniejącymi sekwencjami w niepowtarzalnych bazach danych. Okazało się, iż AP2 nie wykazuje ogólnego podobieństwa do znanych białek regulatorowych.
Analiza sekwencyjna wykazała jednakże obecność kilkunastu cech sekwencji mogących być istotnymi dla struktury i funkcji białka AP2. Po pierwsze AP2 zawiera domenę o długości 37 aa bogatą w reszty serynowe (pozycje 14-50), która jest analogiczna do regionów funkcjonujących jako domena aktywacji w wielu czynnikach transkrypcyjnych polimeraz II RNA. Po drugie, AP2 posiada wysoce zasadową 10 aminokwasową domenę (pozycje 119-128) obejmującą przypuszczalną sekwencję lokalizacji jądrowej KKSR, sugerującą iż AP2 może funkcjonować w jądrze komórkowym. Ostatecznie, centralny region AP2 (pozycje 129-288) obejmuje dwie kopie 68 aminokwasowego prostego powtórzenia, oznaczonego jako domena AP2. Dwie kopie wspomnianego powtórzenia oznaczono jako AP2-R1 i AP2-R2 i okazało się, że niosą one odpowiednio 53% i 69% podobieństwa aminokwasowego. Figura 1A pokazuje iż każde powtórzenie AP2 zawiera 18 aa konserwowany region rdzeniowy, o 83% podobieństwa aminokwasowego. Figura 1B pokazuje iż obie kopie regionu centralnego są teoretycznie zdolne do tworzenia struktur alfa-helis amfipatycznych, które mogą uczestniczyć w oddziaływaniach białko:białko. Sek Id Nr 3 przedstawia sekwencje genomową pełnej długości AP2.
P r z y k ł a d 2
Przygotowanie konstruktu AP2
Przygotowano konstrukty zawierające region kodujący AP2 z konstytutywnym promotorem CaMV 35S, zarówno w orientacji sensownej, jak antysensownej. Wyjściowy wektor zawierający promotor 5S pGSJ780A pochodził z Plant Genetic Systems (Belgia). Wektor pGSJ780A zmodyfikowano wprowadzając w miejsce BamHI wektora adaptor Cla1-BamH1, obejmujący miejsce EcoRI. Zmodyfikowany plazmid pGSJ780A linearyzowano EcoRI i wprowadzano region kodujący genu AP2 w postaci wstawki EcoRI o wielkości 1.68 kpz w obu orientacjach względem promotora 35S (patrz figury 2 i 3).
Uzyskanym DNA transformowano komórki E.coli i selekcjonowano transformanty spektynomycyno-oporne. Plazmidowe DNA izolowano z poszczególnych transformantów i sprawdzano orientację wstawki względem promotora techniką sekwencjonowania. Bakterie zawierające konstrukt sensowny 35s/AP2 (pPW12.4 i pPW9) oraz konstrukt antysensowny (pPW14.4 i pPW15) konjugowano z Agro20
PL 197 043 B1 bacterium tumefaciens i selekcjonowano transformanty oporne na rifampicynę i spektynomycynę i uż ywano nastę pnie do transformacji roś lin.
Konstrukt 35S/AP2 sensowny i antysensowny wprowadzano do Arabidopsis szczepu dzikiego i roślin tytoniu metodami standardowymi. Selekcjonowano stabilne transformanty stosując roślinny marker selekcyjny NPTII (nadający oporność na kanamycynę) obecny w zmodyfikowanym wektorze plazmidowym PGSJ780A.
P r z y k ł a d 3
Modyfikacja nasion z zastosowaniem sekwencji AP2
Przykład ten pokazuje że rośliny niosące mutację ap2 i rośliny transgeniczne zawierające antysensowny konstrukt 35S/AP2 wytwarzają nasiona o zwiększonej masie i całkowitej zawartości białka. Natomiast rośliny zawierające konstrukt sensowny 35S/AP2 wytwarzały nasiona o mniejszej masie i zawartości białka. Dane te wskazują iż masa nasienia i zawartość nasienia w roślinach transgenicznych może być modyfikowana przez aktywność AP2.
Nasiona z 30 linii analizowano pod względem zmienionej wielkości i zawartości białka, włączając w to mutanty Arabidopsis ap2 (ap2-1, ap2-3, ap2-4, ap2-5, ap2-6, ap2-9 i ap2-10) oraz transgeniczne rośliny Arabidopsis i transgeniczne rośliny tytoniu zawierające antysensowny konstrukt 35S/AP2, sensowny konstrukt 35S/AP2 lub sam wektor pGSJ780A. Mutant ap2 stosowany w doświadczeniu opisany został przez Komaki i wsp Development 104: 195-203, 1988; Kunsta i wsp Plant Cell 1: 1195-1208, 1989, Bowmana i wsp Development 112: 1-20, 1991 i Jofuku i wsp dz. cyt.
Ze względu na małą wielkość nasion Arabidopsis i tytoniu średnią masę nasion określano ważąc nasiona w porcjach po 100 dla Arabidopsis i po 50 dla tytoniu. Następnie wyliczano średnią zmianę masy nasion związaną z różnicami w aktywności genu AP2.
Nasiona z trzech ekotypów Arabidopsis typu dzikiego: C24, Landsberg-er i Columbia, i jednego ekotypu tytoniu SR1 stosowano jako kontrole. Nasiona Arabidopsis typu dzikiego charakteryzuje zmienność sezonowa masy (od 1.6-2.3 mg/100 nasion, co pokazano w tabeli I).Zatem nasiona transgenicznych roślin Arabidopsis porównywano z nasionami kontrolnymi zebranymi mniej więcej w tej samej porze roku. Okazało się to istotne przy porównywaniu wpływu słabych mutacji ap2 na masę nasienia.
Tabela I pokazuje, iż wszystkie badane, zmutowane nasiona: ap2-1, ap2-3, ap2-4, ap2-5, ap2-6, ap2-9 i ap2-10 wykazują znaczący wzrost średniej masy nasienia, od +27 do +104% w porównaniu z dziką kontrolą. W przypadku mutacji słabych (ap2-1 i ap2-3) oznaczono najmniejsze zwiększenie średniej masy (odpowiednio +27 do +40%). Natomiast silne mutacje ap2, takie jak ap2-6 i ap2-10 wykazywały największy przyrost masy, od +69 do +104% w porównaniu z dziką kontrolą. Zatem zredukowanie aktywności genu AP2 prowadzi do zwiększenia masy nasion Arabidopsis.
Strategia antysensowna i sensowna kosupresja, opisane powyżej, zastosowane do zmniejszenia aktywności AP2 w roślinach dowiodły, iż można manipulować masą nasion w transgenicznych roślinach. Utworzono 29 niezależnych linii transgenicznych roślin Arabidopsis zawierających antysensowny konstrukt 35S/AP2 (pPW14.4 i pPW15 (figura 2). Każdą linię testowano względem oporności na kanamycynę i obecności jednej lub więcej kopii T-DNA.
Tabela I pokazuje iż nasiona z 9 transgenicznych roślin Arabidopsis AP2 linii antysensownej wykazywało znaczący wzrost masy nasienia w porównaniu z kontrolą, od +22% dla linii C24 15-542 do +89% dla linii C24 15-566. Oba ekotypy C24 i Landsberger zastosowano z sukcesem. Zwiększoną masę nasienia obserwowano dla pokoleń F1, F2 i F3.
Osiem linii zawierających sensowny konstrukt S35/AP2 stanowiło fenotypowo mutanty kusupresyjne. W tabeli I pokazano dwie kosupresyjne linie, które posiadały nasiona większe od +26% do +86%. Natomiast rośliny transformowane wektorem pGSJ780A wykazywały normalną masę średnią nasion (-0.5 do +13% w porównaniu z dziką kontrolą, tabela I). Wyniki zacytowane wskazują że sekwencja genu AP2 może zostać zastosowana do znaczącego zwiększania masy nasienia Arabidopsis, przy zastosowaniu strategii antysensownej i kosupresyjnej.
T a b e l a I
Kontrola genetyczna masy nasienia Arabidopsis z zastosowaniem AP2
Średnia masa nasienia w mg na 100 nasion1,2 Procentowa zmiana masy nasienia w porównaniu z typem dzikim
1 2 3
nasienie zmutowane na ap2 2.1 (0.2) +27%
PL 197 043 B1 cd. tabeli I
1 2 3
1.ap2-1 2.2 (0.1) + 33%
2.1 (0.2) + 31%
2.8 (0.2) + 33%
2. ap2-3 2.6 (0.1) + 27%
3. ap2-4 3.5 (0.3) + 69%
3.5 (0.2) + 69%
4. ap2-5 2.9 (0.1) + 39%
5. ap2-6 3.5 (0.2) + 69%
6. ap2-9 2.9 (0.1) + 40%
7. ap2-10 3.7 (0.4) + 79%
3.9 (0.3) + 90%
4.2 (0.5) + 104%
Nasiona wyprodukowane przez linię niosącą antysensowny konstrukt CaMV35S/AP2 (roślina rodzicielska odporna na kanamycynę)
1. C24 14.4E(F1-15) F2 sd +35%
C24 14.4E(F1-15) F3 sd 3.1 +47%
2. C24 14.4S (F1-1) 3.4 (0.3) +29%
3. C24 14.4AA (F1-24) 2.8 (0.2) +30%
4. C24 14.4DD (F1-2) 2.9 (0.1) +30%
5. C24 15-522 2.8 (0.3) +76%
6. C24 15-542 (F1-2) 3.6 (0.1) +25%
C24 15-542 (F1-7) 2.6 (0.1) +22%
7. C24 15-566 2.5 (0.2) +89%
8. LE 15-9992-3 (F1-1) F2sd 3.9 (0.1) +42%
9. LE 15.83192-3 (F1-3) 2.4 (0.1) +33%
LE 15-83192-3 (F1-17) 2.8(0.0) +28%
2.7 (0.0)
Nasiona wyprodukowane przez linię niosącą kosupresyjny konstrukt CaMV35S/AP2 (roślina rodzicielska odporna na kanamycynę)
1. C24 9-5 (F1-5) 3.8 (0.0) +86%
2. LE 9-83192-2 (F1-19) 2.7 (0.2) +26%
LE 9-83192-2 (F1-24) 2.7 (0.1) +26%
Nasiona wyprodukowane przez linię niosącą wektor PGSJ780A (roślina rodzicielska odporna na kanamycynę)
1. C24 3-107 (F1-1) 2.2 (0.1) +9%
2. C24 3-109 (F1-1) 2.3 (0.3) + 13%
3. LE 3-83192-1 (F1-2) 2.3 (0.1) +7%
4. LE 3-83192-3 (F1-2) 2.4 (0.1) + 11%
5. LE 3-9992-4 (F1-4) 2.4 (0.2) + 12%
LE 3-9992-4 (F1-6) 2.3 (0.0) +9%
LE 3-9992-4 (F1-8) 2.1 (0.0) -0.5%
PL 197 043 B1 cd. tabeli I
1 2 3
6. LE 3-9992-9 (F1-3) 2.3 (0.1) +7%
Nasiona wyprodukowane przez rośliny Arabidopsis typu dzikiego
1. C24 2.0 (0 1)
2.3 (0.1)
2.2
2. Landsberg-er 1.6 (0.1)
2.1 (0.1)
2.1
2.3 (0.1)
3. Columbia 1.8 (0.1)
2.1 (0.1)
1 W nawiasach podano średnie odchylenia standardowe 2 Nasiona typu dzikiego stosowane jako kontrola wybrano w oparciu o ekotyp i o datę zbioru
Sekwencje genu AP2 Arabidopsis stosowano również jako kontrolę negatywną do badania masy nasienia roślin tytoniu (gatunku heterologicznego). Tabela II pokazuje że w 5 transgenicznych liniach tytoniu nadekspresja konstruktu 35S/AP2 powodowała zmniejszenie masy nasion transgenicznych od -27% do -38% w porównaniu z nasieniem typu dzikiego. Wyniki te pokazują ewolucyjne konserwowanie funkcji genu AP2 na poziomie białka w kontrolowaniu masy nasienia w układzie heterologicznym.
T a b e l a II
Genetyczna kontrola masy nasion tytoniu genem AP2 z Arabidopsis
Średnia masa nasienia w mg na 100 nasion1 Procentowa zmiana masy nasienia w porównaniu z typem dzikim
1 2 3
Nasiona wyprodukowane przez linię niosącą sensowny konstrukt CaMV35S/AP2 (roślina rodzicielska odporna na kanamycynę)
1. SR1 9-110 To 3.1 (0.0) -27%
SR19-110 (F1-5) 3.0(0.2) -29%
2.8 (0.3) -34%
2. SRI-202 (F1-G) 3.1 (0.2) -27%
SRI 9-202 (F1-I) 3.2 (0.1) -24%
3. SRI-103 (F1-2) 3.9 (0.0) -8%
4. SRI-413-1 2.8 (0.0) -34%
3.0 (0.2) -29%
5. SR1 9-418-1 To 3.5 (0.1) -18%
Nasiona wyprodukowane przez linię niosącą antysensowny konstrukt CaMV35S/AP2 (roślina rodzicielska odporna na kanamycynę)
1. SRI 15-111 5.1 (0.4) +20%
SRI 15-111 (F1) 5.0 (0.4) + 19%
2. SRI 15-116 To 4.1 (0.4) -3%
SRI 15-116 (F1-2) 4.0 (0.1) -5%
SRI 15-116 (F1-1) 4.5 (0.1) +5%
PL 197 043 B1 cd. tabeli II
1 2 3
3. SRI 15-407 (F1) 4.8 (0.5) + 10%
4.7 (0.3) + 10%
4. SRI 15-102 (F1) 4.5 (0.2) +6%
5. SRI 15-413 (F1-3) 4.2 (0.0) . +0%
6. SRI 15-410 (F1-2) 4.4 (0.0) +4%
7. SRI 15-210 (F1-4) 3.6 (0.1) -15%
Nasiona wyprodukowane przez linię niosącą wektor pGSJ780A (roślina rodzicielska odporna na kanamycynę)
1. SRI 3-402 (F1) 5.0 (0.1) + 17%
2. SRI 3-401 (F1) 4.6 (0.1) +8%
3. SRI 3-405 (F1) 4.4 (0.1) +4%
Nasiona z tytoniu typu dzikiego
1. SR1 4.2 (0.3)
4.0 (0.1)
1 W nawiasach podano średnie odchylenia standardowe
Zastosowanie konstruktu AP2 do kontrolowania zawartości białka w nasieniu
Całkowite białko nasienia ekstrahowano i szacowano ilość białka, dla nasion wytworzonych przez rośliny typu dzikiego, mutant ap2, konstrukty sensowne i sensowne kosupresyjne AP2, według Naito i wsp Plant Mol Biol 11: 109-123, 1988. Białko nasienia izolowano w trzech powtórzeniach z porcji 100 wysuszonych nasion Arabidopsis lub 50 wysuszonych nasion tytoniu. Całkowitą zawartość białka określano metodą Bradforda Anal Biochem 72: 248, 1976. Wyniki analizy zebrano w tabeli III.
W przypadku mutanta ap2 cał kowita zawartość białka wzrosła od 20 do 78% w porównaniu z kontrolą (nasiona typu dzikiego). W przypadku konstruktu transgenicznego AP2 antysensownego zawartość białka wzrosła od +31 do +97% w porównaniu z kontrolą (nasiona typu dzikiego). W przypadku konstruktu transgenicznego AP2 kosupresyjnego zawartość biał ka wzrosła od +13 do +17% w porównaniu z kontrolą (nasiona typu dzikiego). Zarówno rośliny transgeniczne antysensowne jak kosupresyjne wytwarzały nasiona o zwiększonej zawartości białka w przeliczeniu na nasienie w porównaniu z dziką kontrolą lub roślinami transgenicznymi obejmującymi wektor pGSJ780A (tabela III).
T a b e l a III
Kontrola genetyczna całkowitej zawartości białka w roślinach Arabidopsis z zastosowaniem AP2
Całkowita zawartość białka w nasieniu w mg na 100 nasion1 Procentowa zmiana zawartości białka w porównaniu z typem dzikim
1 2 3
nasiona rośliny niosącej mutację ap2
1. ap2-1 652 (17) +20% względem nasion typu dzikiego
615 (30) + 11%
2. ap2-3 705 (47) +27%
3. ap2-4 729 (107) +33%
4. ap2-5 617 (24) + 13%
5. ap2-6 836 (14) +52%
6. ap2-9 798 (11) +46%
7. ap2-10 836 (15) +78%
PL 197 043 B1 cd. tabeli III
1 2 3
nasiona wytwarzane przez linię niosącą antysensowny konstrukt CaMV35S/AP2 (roślina rodzicielska oporna na kanamycynę)
1. C24 14.4E (F1-1) 615 (60) +31%
2. C24 15-522 (F1-1) 790 (23) +68%
3. C24 15-566 925(173) +97%
nasiona wytwarzane przez linię niosącą kosupresyjny konstrukt CaMV35S/AP2 (roślina rodzicielska oporna na kanamycynę)
1. LE 9-83192-2 (F1-19) 616 + 13%
LE 9-83192-2 (F1-24) 637 + 17%
Nasienie typu dzikiego
1. C24 469 (19)
2. LE 545 (22)
555
3. Col 548 (42)
1 W nawiasach podano średnie odchylenia standardowe
Rośliny transgenicznego tytoniu obejmujące konstrukt sensowny 35S/AP2 wykazały iż nadekspresja AP2 może zmniejszyć zawartość białka od 27 do 45% w porównaniu z nasionami typu dzikiego. Wyniki dla Arabidopsis i tytoniu wskazują, iż masa nasienia i wytwarzanie białka nasienia może być kontrolowane przez regulowanie aktywności genu AP2.
T a b e l a IV
Kontrola negatywna wytwarzania białka nasienia przez transgeniczne rośliny tytoniu (ekspresja genu AP2 Arabidopsis)
Średnia zawartość białka na 50 nasion Procentowa zmiana zawartości białka w porównaniu z typem dzikim
Nasiona wytwarzane przez linię niosącą sensowny konstrukt CaMV35S/AP2
1. SRI 9-110 242 (11) -45%
2. SRI 9-202 (F1-G) 271 (11) -38%
3. SRI 9-413 362 (8) -18%
4. SRI 9-418-1 319 (16) 27%
Kontrola typu dzikiego SRI (typ dziki) 440 (8) (JO) NA
1 W nawiasach podano średnie odchylenia standardowe
Analiza białek roślin transgenicznych z zastosowaniem elektroforezy żelowej
Arabidopsis wytwarza dwie główne klasy białek zapasowych nasion: 12S krucyferyny i 2S napiny, strukturalnie zbliżone do głównych białek zapasowych Brassicaceae i Leguminoceae. Skład białek nasion w roślinach Arabidopsis typu dzikiego, mutantach ap2 i transgenicznych roślinach Arabidopsis sprawdzano stosując SDS-PAGE (Naito i wsp Plant Mol Biol 11: 109-123, 1988). Całkowite białko nasienia ekstrahowano jak opisano powyżej. Próbki 50 mg rozdzielano techniką SDS-PAGE i barwiono błękitem Coomassiego. Wyniki pokazują iż zakres identyfikowanych białek w roślinach typu dzikiego i ap2 nie różni się jakoś ciowo. Nie stwierdzono wykrywalnych róż nic w białkach 12S i 2S pomiędzy ekstraktami z nasion typu dzikiego i mutantów ap2. Oznacza to iż zmniejszenie aktywności AP2 ogólnie nie powoduje zmiany profilu białek zapasowych syntezowanych przez dojrzewające nasiona. Również profile białek syntezowanych w roślinach transgenicznych z konstruktami antysensownym i kosupresyjnym AP2 były nierozróżnialne od profilu typu dzikiego. W szczególności nie zaobserwowano różnic w reprezentacji 12S krucyferyn i 2S napin w większych nasionach.
PL 197 043 B1
Ostatecznie, rośliny transgeniczne tytoniu zawierające ulegający nadekspresji konstrukt 35S/AP2 wytwarzały znacząco mniejsze nasiona. Pomimo zmniejszenia masy nasienia roślin transgenicznych tytoniu, nie wykryto obserwowalnych zmian w profilach białek zapasowych pomiędzy transformantami S35/AP2 i roślinami typu dzikiego SR1.
P r z y k ł a d 4
Izolacja innych członków rodziny genowej AP2 z Arabidopsis
Przykład ten opisuje izolację członka rodziny AP2 z Arabidopsis. Kwas nukleinowy określony tutaj jako RAP2 (spokrewniony z AP2) zidentyfikowano z zastosowaniem starterów specyficznych wobec sekwencji kwasu nukleinowego z domen AP2 przedstawionej powyżej.
Materiały i metody
Materiał roślinny. Arabidopsis thaliana ekotyp Landsberg-er erecta (L-er) i C24 stosowano jako kontrolę typu dzikiego. Rośliny hodowano w 22°C przy fotoperiodzie 18h światło/8h ciemność, w mieszaninie 1:1:1 vermikulit:perlit:torf. Rośliny zasilano 0.25x roztworem Peter'a (Grace-Sierra, Milpitas, CA). Tkankę korzeni zbierano z roślin rosnących w uprawie hydroponicznej w sterylnych naczyńkach zawierających 1x sole Murashig'a i Skoog'a (GIBCO), 1 mg/L tiaminy, 0.5 mg/L pirydoksyny, 0.5 mg/L kwasu nikotynowego, 0.5 g/L MES i 3% sacharoza, hodowlę prowadzono stosując umiarkowane wstrząsanie i ś wiatło o natężeniu 70 mol/m2/sek.
Analiza klonów cDNA Arabidopsis. Klony cDNA EST Arabidopsis reprezentujące RAP2.1 i RAP2.9 przygotowano wg Cooka i wsp Plany J 9: 101-124, 1996. Klony cDNA EST Arabidopsis reprezentujące RAP2.2 i RAP2.8 przygotowano wg Hoefte i wsp Plant J 4: 1051-1061, 1993. Klony cDNA EST Arabidopsis reprezentujące wszystkie geny RAP2 przygotowano wg Newmana i wsp Plant Physiol 106: 1241-1255, 1994 i otrzymano z Arabidopsis Biological Resources Center (Ohio State University). Plazmidowe DNA izolowano i oczyszczano stosując anionowymienną chromatografię (Qiagene). Sekwencjonowanie wykonano stosując fluorescencyjne terminatory wg wskazań producenta (PE Biosystems).
Porównanie sekwencji aminokwasowych. Stosowano program TBLASTN (Altschul i wsp J Mol Biol 215: 403-410, 1990) przy domyślnych parametrach w celu przeszukiwania bazy danych sekwencji EST Arabidopsis (AatDB 4-7) pod względem genów kodujących białka zawierające domenę AP2. Zestawienie sekwencji aminokwasowych dokonano stosując program CLUSTAL W (Thompson i wsp NAR 22: 4673-4680, 1994). Modelowanie struktury drugorzędowej prowadzono w oparciu o zasady i program opisany przez Rosta Methods Enzymol 266: 525-539, 1996 i Rosta i Sandera J Mol Biol 232: 589-599, 1993 oraz Proteins 19: 55-77, 1994.
Sondy molekularne specyficzne względem genu RAP2.
Fragmenty DNA specyficzne względem genu RAP2 tworzono stosując technikę PCR z sterterami specyficznymi względem genu RAP2 oraz plazmidowego DNA z wstawką genu RAP2, zgodnie z zaleceniami producenta (Perkin Elmer). Stosowano nastę pują ce startery:
RAP2.1 5'-AAGAGGACCATCTCTCAG-3', 5'-AACATCGCTAGCTTCTC-3'
RAP2.2 5'-TGGTTCAGCAGCCAACAC-3' 5'-CAATGCATAGAGCTTGAGG-3'
RAP2.3 5'-TCATCGCCACGATCAACC-3' 5'-AGCAGTCCAATGCGGACGG-3'
RAP2.4 5'-ACGGATTTCACATCGGAG-3' 5'-CTAAGCTAGAATCGAATCC-3'
RAP2.7 5'-CGATGGAGACGAAGACTC-3' 5'-GTCGGAACCGGAGTTACC-3'
RAP2.8 5'-TCACTCAAAGGCCGAGATC-3' 5'-TAACAACATCACCGGCTCG-3'
RAP2.9 5'-GTGAAGGCTTAGGAGGAG-3' 5'-TGCCTCATATGAGTCAGAG-3'
Amplikony oczyszczono na żelu i wyznakowano radioaktywnie z zastosowaniem przypadkowych oligonukleotydów (Amersham) i zastosowano jako sondy w mapowaniu genów i wykrywaniu RNA na żelu techniką Northerna.
Mapowanie genu. Geny RAP2 umieszczono na mapie genetycznej Arabidopsis stosując analizę segregacji RFLP z zastosowaniem zrekombinowanych linii wsobnych jak przedstawił to Reiter i wsp PNAS (USA) 89: 1477-481, 1992 lub z zastosowaniem macierzowej analizy DNA z Arabidopsis stosując genomowe biblioteki YAC yUP lub CIC (Ecker Methods 1, 186-194, 1990; Creusot i wsp Plant J 8: 762-770, 1995), stosując technikę PCR (Green i wsp PNAS (USA) 87: 1213-1217, 1990; Kwiatkowski i wsp NAR 18: 7191-7192, 1990). Mapowanie macierzowe potwierdzono z zastosowaniem techniki PCR z poszczególnymi klonami YAC.
Izolacja mRNA. Polisomalny poli(A) mRNA z kwiatów Arabidopsis, listków rozetkowych, międzywęźli i korzeni z uprawy hydroponicznej izolowano wg Coxa i Goldberga (Plant Molecular Biology. A Practical Approach. wyd. Shaw, IRL, Oxfors, str. 1-35, 1988).
PL 197 043 B1
Analiza Northerna. Hybrydyzacje RNA typu Northerna w blotach żelowych prowadzono zgodnie z zaleceniami producenta (Amersham). Wielkość badanego mRNA oceniano przez porównanie ze znanymi standardami mRNA (BRL). Transkrypty AP2 wykrywano stosując wyznakowane fragmenty DNA obejmujące pozycje 1-1371 cDNA AP2 z plazmidu pAP2c1 (Jofuku i wsp Plant Cell 6: 1211-1225, 1994).
Wyniki
Domena AP2 określa dużą rodzinę białek roślinnych.
Stosując domenę AP2 jako sondę znaleziono 34 klonów cDNA kodujących przypuszczalne białka RAP2 z bazy danych EST Arabidopsis (Materiały i Metody). Kilkanaście z tych częściowych sekwencji poznano już wcześniej (Ohme-Takagi i wsp Plant Cell 7: 173-182, 1995; Elliot i wsp Plant Cell 8: 155-168, 1996; Klucher i wsp Plant Cell 8: 137-153, 1996; Wilson i wsp Plant Cell 8: 659-671, 1996; Ecker Science 268: 667-675, 1995; Weigel Plant Cell 7: 388-389, 1995). W oparciu o porównanie sekwencji nukleotydowych wywnioskowano ż e około poł owa z 34 sekwencji cDNA RAP2 reprezentuje prawdopodobnie klony powtarzalne. Sekwencja 17 klonów cDNA RAP2 wydaje się reprezentować unikalne geny. Z grupy tej wybrano najdłuższe klony cDNA. Z wyprowadzonych sekwencji aminokwasowych wspomnianych klonów wywnioskowano iż EST Arabidopsis reprezentują co najmniej 12 genów oznaczonych RAP2.1-Rap2.12. W tabeli V przedstawiono wyniki wstępnego mapowania genów z zastosowaniem analizy polimorfizmu RFLP i przeszukiwania techniką PCR bibliotek Arabidopsis yUP i CIC sklonowanych w wektorze YAK, wykazując istnienie co najmniej 7 członków rodziny genów RAP2 zlokalizowanych na 4 różnych chromosomach. Ponadto kilkunastu członków rodziny wykazywało wysoki stopień sprzężenia. Na przykład RAP2.10 znajduje się w odległości jedynie 10 kpz od AP2, który z kolei jest ściśle sprzężony z genem ANT w chromosomie 4 (Eliot i wsp Plant Cell 8: 155-168, 1996; Klucher i wsp Plant Cell 8: 137-153, 1996).
Analiza sekwencyjna wykazała również że białka kodowane przez geny RAP2 charakteryzują się wszystkie obecnością domen AP2. Figura 4 przedstawia porównanie sekwencji 21 domen AP2 z 19 róż nych polipeptydów włączają c w to RAP2.1-RAP2.12, AP2, ANT, TINY i EREBP z roś lin tytoniu. Z porównania wynika że istnieją 2 konserwowane ewolucyjnie bloki sekwencji, każdy zlokalizowany w obrębie każdej domeny AP2.
Pierwszy blok, oznaczony jako element YRG, składa się z 19-22 aminokwasów, jest wysoce zasadowy i obejmuje konserwowany motyw YRG (figura 4A i B). Drugi blok, określony jako RAYD, składa się z 42-43 aminokwasów i obejmuje wysoce konserwatywny region centralny o długości 18 aminokwasów, który najprawdopodobniej tworzy amfipatyczną alfa-helisę w domenie AP2 z AP2, ANT, TINY i EREBP. Ponadto zidentyfikowano kilkanaście niezmiennych reszt aminokwasowych w obrębie elementów YRG i RAYD, mogących peł nić istotną rolę strukturalną lub funkcjonalną . Na przykład reszta glicynowa w pozycji 40 w obrębie elementu RAYD występuje we wszystkich domenach AP2 wspomnianych białek (figura 4A i B) i wydaje się być istotna dla funkcjonowania AP2 (Jofuku i wsp Plant Cell 6: 1211-1225, 1994).
T a b e l a V Geny RAP2 Arabidopsis
Gen Klony YAC zawierające gen RAP2* Pozycja na mapie chromosomalnej+
1 2 3
AINTEGUMENTA ND 4-73
TINY ND 5-32 do 5-45
RAP2.1 yUP18H2,CI11D10 ND±
RAP2.2 yUP6C1 38§
YUP12G6, yUP24B8
yUP23E11, CIC4H5
RAP2.3 CIC12C2 3-21
RAP2.4 CIC7D2,CIC10C4 ND±
RAP2.7 YUP10E1 ND±
RAP2.8 CIC10G7 1-94 to 1-103§
PL 197 043 B1 cd. tabeli V
1 2 3
RAP2.9 CIC9E12 1-117§
RAP2-101 ND 4-73
* Stwierdzono, że klony YAC zawierają specyficzne geny RAP2 stosując technikę PCR z wykorzystaniem starterów specyficznych względem genu (Green i wsp. PNAS (USA) 87: 1213-1217; Kwiatkowski i wsp NAR 18: 7191-7192, 1990) + Pozycje na mapie chromosomalnej odnoszą się do ujednoliconej mapy genomu Arabidopsis (AatDB, 4-7) ± Pozycja na mapie YAC jest niepewna § Wstępnie określona pozycja w oparciu o pojedyncze mapowanie
Numery sekwencji EST genów RAP2 i innych genów są następujące: AINTEGUMENTA (U40256/U41339); TINY (X94598), RAP2.(AF003094), RAP2.2 (AF003095), RAP2.3 (AF003096), RAP2.4 (AF003097), RAP2.5 (AF003098), RAP2.6 (AF003099), RAP2.7 (AF003100), RAP2.8 (AF003101), RAP2.9 (AF003102), RAP2.10 (AF003103), RAP2.11 (AF003104), RAP2.12 (AF003105). Wszystkie klony RAP2 zostały zgłoszone pierwotnie w postaci częściowych sekwencji i uzyskały numery w GeneBank: RAP2.1 (Z27045), RAP2.2 (Z26440), RAP2.3 (T04320), RAP2.4 (T13774), RAP2.5 (T45365), RAP2.6 (T45770), RAP2.7 (T20443), RAP2.8 (Z33865), RAP2.9 (Z37270), RAP2.10 (T76017), RAP2.11 (T42962) i RAP2.12 (T42544). Ze względu na wstępne dane dotyczące sekwencji EST wyprowadzone sekwencje aminokwasowe dotyczące EST Z27045, T04320, T13774 i T42544 zawierają kilkanaście błędów i zostały w niewłaściwy sposób opublikowane (OhmeTakagi i wsp Plant Cell 7: 173-182, 1995; Klucher i wsp Plant Cell 8: 137-153, 1996; Wilson i wsp Plant Cell 8: 659-671, 1996; Ecker Science 268: 667-675, 1995; Weigel Plant Cell 7: 388-389, 1995). Sekwencje zostały poprawione i można je znaleźć w GeneBank pod podanymi wyżej numerami.
Porównanie sekwencji cDNA RAP2 wykazało również że istnieją co najmniej dwa odgałęzienia rodziny RAP2. AP2-podobne i EREBP-podobne podrodziny rozróżnialne na podstawie ilości domen AP2 zawartych w każdym polipeptydzie i na podstawie sekwencji w obrębie elementów YRG. Podrodzina AP2-podobna rodziny genów RAP2 tworzona jest przez geny AP2, ANT i RAP2.7, każdy kodujący białko zawierające dwie domeny AP2 (figura 4A). Ponadto białka te posiadają konserwowany motyw aminokwasowy WEAR/WESH umiejscowiony w obrębie elementy YRG dwu domen AP2 (figura 4A). Natomiast geny należące do podrodziny EREBP-podobnej kodują białka zawierające tylko jedną domenę AP2. Podrodzina ta obejmuje geny RA)2.1-RAP2.6, RAP2.8-RAP2.12 i TINY (figura 4B). Białka należące do tej klasy posiadają ponadto siedmio aminokwasowy motyw określany mianem WAAEIRD-box (figura 4B) zamiast motywu WEAR/WESH umiejscowiony w obrębie YRG (figura 4A). W oparciu o to porównanie, opracowano dwie sekwencje zgodnościowe, ró żne dla dwu rodzajów domen AP2 (figura $A i B). Sugeruje to iż domena AP2 i specyficzne motywy w jej obrębie pełnia istotne funkcje białkach RAP2.
Podklasa AP2-podobna białek RAP2 charakteryzuje się również obecnością wysoce konserwatywnego 25-26 aminokwasowego odcinka łącznikowego, leżącego pomiędzy dwiema domenami Ap2 (Klucher i wsp Plant Cell 8: 137-153, 1996). Region ten jest w 40% identyczny i w 48% podobny pomiędzy Ap2, ANT i RAP2.7 i nie jest znajdowany w białkach należących do podrodziny EREBP-podobnej. Analiza molekularna mutanta ant-3 wykazała iż niezmienna C końcowa reszta glicyny w obrębie odcinka łącznikowego jest istotna dla funkcji ANT in vivo (Klucher i wsp Plant Cell 8: 137-153, 1996), co sugeruje iż rejon łącznikowy może pełnić równie ważne funkcje w AP2 i RAP2.7.
Sekwencje w obrębie elementu RAYD prawdopodobnie tworzą amfipatyczną alfa-helisę. Jak wskazano to powyżej 18 aminokwasowy region centralny w obrębie elementu RAYD domeny AP2 tworzy prawdopodobnie amfipatyczną alfa-helisę, mogącą być istotną dla struktury i funkcji AP2. Analiza możliwych struktur drugorzędowych wykazała że region ten jest konserwowany ewolucyjnie w biał kach RAP2. Jak przedstawiono to na figurze 4 region centralny reprezentuje najbardziej konserwowany blok sekwencji elementu RAYD AP2 i białka RAP2. Analiza struktur drugorzędowych wykazała że wszystkie białka RAP2 zawierają sekwencję w obrębie elementu RAYD, która przypuszczalnie tworzy amfipatyczną alfa-helisę (figura 4A i B). Figura 4C przedstawia sekwencję RAP2.7-R1, która również obejmuje amfipatyczną alfa-helisę w 100% identyczną z odpowiednią sekwencją AP2-R1 i w 63% podobną do ANT-R1. Sekwencje w obrębie domen AP2 białek podrodziny EREBP-podobnej posiadają również podobne struktury alfa-helikalne. Figura 4D przedstawia alfa-helisy z RAP2.2, RAP2.5 i RAP2.12 odpowiednio w 81, 100 i 81% podobne do EREBP-3. Wyniki te silnie sugerują że przypuszczalna alfa-helisa amfipatyczna w obrębie elementu RAYD jest elementem konserwowanym ewolucyjnie, dlatego że jest istotna dla funkcjonowania domeny AP2 we wszystkich białkach RAP2.
PL 197 043 B1
Geny RAP2 eksprymowane w tkankach kwiatów i tkankach wegetatywnych. Poprzednie badania wykazały iż geny AP2 i ANT ulegają zróżnicowanej ekspresji na poziomie RNA w czasie rozwoju rośliny (Jofuku i wsp Plant Cell 6: 1211-1225, 1994; Elliot i wsp Plant Cell 8: 155-168, 1996; Klucher i wsp Plant Cell 8: 137-153, 1996). AP2 ulega ekspresji na różnym poziomie na różnych etapach różnicowania się kwiatów, liści, łodygi i korzeni. W celu określenia kiedy w czasie rozwoju rośliny podklasa EREBP-podobna genów RAP2 ulega ekspresji zastosowano sondy specyficzne względem RAP2.1, RAP2.2, RAP2.3 i RAP2.4 do przeszukiwania blotów mRNA z rozdzielonym poli(A) mRNA z liś ci, kwiatów, ł odygi i korzeni. Wykazano iż każ dy z produktów genów RAP2 wytwarza mRNA o unikalnej wielkości i wykazuje odrębny wzór ekspresji w kwiatach, liściach, pędach i korzeniach. Na przykład gen RAP2.1 ulega ekspresji na niskim poziomie w kwiatach typu dzikiego, liściach, pędach i korzeniach. Ekspresja genu RAP2.2 wydaje się być konstytutywna, poniewa ż jego transkrypty znajdowane były w podobnych ilościach w kwiatach typu dzikiego, liściach, pędach i korzeniach. Natomiast RAP2.3 ulega ekspresji na niskim poziomie w kwiatach typu dzikiego, z nieco wyższą wydajnością w liściach, i zdecydowanie wyższą wydajnością w pędach i korzeniach. Gen RAP2.4 ulega ekspresji na w kwiatach typu dzikiego, liściach, pędach i korzeniach, a najbardziej w korzeniach i liściach. Dane te wskazują że poszczególni członkowie podrodziny EREBP-podobnej genów RAP2 eksprymują mRNA zarówno w tkankach wegetatywnych, jak w kwiatach i że ekspresja ta wykazuje ilościowe różnice.
Na wzór ekspresji RAP2 wpływa ap2. Ekspresję genu RAP2 analizowano w roślinach niosących mutację ap2-10 stosując analizę Northerna, w celu określenia czy AP2 jest niezbędny do ekspresji genu RAP2. Na ekspresję trzech genów RAP2 w różny sposób wpływa utrata funkcji AP2. Na przykład ekspresja genu RAP2.2 nie jest dramatycznie zmieniona w zmutowanych kwiatach, liściach i korzeniach w porównaniu z dziką roś liną Landsberger, lecz jego ekspresja ulega zmniejszeniu w pę dach. Natomiast ekspresja genu RAP2.4 wydaje się zasadniczo niezmieniona w zmutowanych pędach i korzeniach, lecz jest nieznacznie podwyższona w zmutowanych kwiatach i liściach. W celu skontrolowania możliwych efektów ubocznych ekotypu na ekspresję genu RAP2, poziomy ekspresji genu RAP2 porównana dla rośliny dzikiego typu C24 i zmutowanej rośliny ap2-10. Wyniki pokazują że różnice w ekspresji genów RAP2.2, RAP2.3 i RAP2.4 w pędach C24 i ap2-10 są podobne do tych, obserwowanych pomiędzy pędami roślin typu dzikiego Landsberger i zmutowanej ap2-10. Wyniki te łącznie sugerują że AP2 bezpośrednio lub pośrednio reguluje ekspresję co najmniej trzech genów RAP2. Co ważniejsze, wyniki te sugerują że AP2 kontroluje ekspresje genu w czasie różnicowania zarówno części wegetatywnych i generatywnych.
Dyskusja
Geny RAP2 kodują nową rodzinę przypuszczalnych białek wiążących się z DNA. Jedną ważną konkluzją z charakterystyki wspomnianych klonów jest ta, że domena AP2 jest konserwowana ewolucyjnie co najmniej u Arabidopsis i tytoniu. Ponadto istnieją dwie podrodziny białek zawierających domenę AP2 u Arabidopsis oznaczone powyżej jako podrodzina AP2-podobna i EREBP-podobna. Badania in vitro wykazały że zarówno EREBP jak AP2 wiążą się z DNA w sposób zależny od sekwencji i że domena AP2 wystarcza do nadania zdolności wiązania z DNA typu EREBP (Ohme-Takagi i wsp Plant Cell 7: 173-182, 1995). Z wyników tych oraz z wysokiej homologii pomiędzy motywami w obrębie domeny AP2 białek AP2, EREBP i RAP2 wyciągnięto wniosek iż białka RAP2 funkcjonują jako roślinne białka wiążące się z DNA. Choć dokładna sekwencja aminokwasowa w obrębie domeny AP2 niezbędna do wiązania z DNA nie została jeszcze określona, porównanie sekwencji wykazało istnienie dwu wysoce konserwowanych motywów oznaczonych jako YRG I RAYD w obrę bie domeny AP2.
Wspomniany element RAYD został znaleziony we wszystkich znanych domenach AP2 i zawiera konserwowany region centralny który najprawdopodobniej tworzy amfipatyczną alfa-helisę (figura 4). Jedna z hipotez dotyczących funkcji takich helikalnych struktur mówi, że są one zaangażowane w wiązanie z DNA, prawdopodobnie poprzez oddziaływania jej powierzchni hydrofobowej z rowkiem większym DNA (Zubay i wsp J Mol Biol 1: 1-20, 1959). Inna hipoteza mówi, ż e struktura taka może pośredniczyć w oddziaływaniach białko:białko niezbędnych do funkcjonowania RAP2. Oddziaływania te mogą obejmować zdolność do tworzenia homo- i heterodimerów podobnych do tych, obserwowanych w przypadku rodziny roślinnych białek regulatorowych MADS (Huang i wsp Plant Cell 8: 81-94, 1996; Reichmann i wsp PNAS (USA) 93: 4793-4798, 1996) i ssaczej rodziny czynników transkrypcyjnych ATF/CREB (Hai i wsp PNAS (USA) 88: 3720-3724, 1991; 0'Shea i wsp Cell 68: 699-708, 1992).
PL 197 043 B1
Konserwowany ewolucyjnie element YRG może również uczestniczyć w wiązaniu DNA ze względu na wysoce zasadowy charakter tego regionu we wszystkich białkach RAP2 (figura 4). Jednakże element YRG zawiera również sekwencje specyficzne dla każdej klasy białka RAP2 i może być funkcjonalnie istotny do wiązania DNA. Konkretnie, motyw WAAIERD jest wysoce konserwowany w białkach EREBP i EREBP-podobnych tytoniu. Odmiennie, motyw WEAR/WESH zastępuje motyw WAAIERD w białkach AP2-podobnych RAP2 (figura 4). Badnia in vitro sugerują iż białka EREBP i AP2 rozpoznają różne sekwencje DNA (Ohme-Takagi i wsp Plant Cell 7: 173-182, 1995). Jest możliwe że motywy WAAIERD i WEAR/WESH mogą być odpowiedzialne za specyficzność wiązania sekwencji DNA. Obecność dwu domen AP2 w AP2 może przyczyniać się również do różnic w specyficzności sekwencyjnej. Choć molekularne znaczenie posiadania jednej lub dwu domen AP2 nie jest jasne, badania genetyczne i molekularne wykazały że mutacje dowolnej z domen AP2 wpływają na funkcjonowanie AP2, co sugeruje że obie są niezbędne do aktywności normalnego białka AP2 (Jofuku i wsp Plant Cell 6: 1211-1225, 1994).
Oprócz Arabidopsis i tytoniu cDNA kodujący różnorodne białka zawierające domeny AP2 znaleziono u kukurydzy, ryżu, fasoli, i kilkunastu członków rodziny Brassicaceae włączając w to kanolę (OhmeTakagi i wsp Plant Cell 7: 173-182, 1995; Elliot i wsp Plant Cell 8: 155-168, 1996; Klucher i wsp Plant Cell 8: 137-153, 1996; Wilson i wsp Plant Cell 8: 659-671, 1996; Ecker Science 268: 667-675, 1995; Weigel Plant Cell 7: 388-389, 1995). Sugeruje to silnie że domena AP2 jest ważnym i ewolucyjnie konserwowanym elementem niezbędnym do utrzymania struktury i funkcji wspomnianych białek.
Ekspresja genu RAP2 w tkankach kwiatu i tkankach wegetatywnych. Geny AP2, RAP2.1, RAP2.2, RAP2.3 i RAP2.4 wykazują nakładający się wzór ekspresji na poziomie mRNA w kwiatach, liściach, pędach i korzeniach. Jednakże każdy z wspomnianych genów wydaje się regulowany w zróżnicowany sposób, ze względu na ilości wytwarzanego mRNA. Nakładająca się aktywność genów RAP2 może wpływać na analizę genetyczną funkcji genów AP2 i RAP2, jeżeli geny te są również funkcjonalnie redundantne. Na przykład podczas różnicowania się kwiatów geny AP2 i ANT wykazują częściowo nakładający się wzór ekspresji na poziomie organów i tkanek (Jofuku i wsp Plant Cell 6: 1211-1225, 1994; Elliot i wsp Plant Cell 8: 155-168, 1996; Klucher i wsp Plant Cell 8: 137-153, 1996; W. Szeto). Z analizy mutantów podwójnych i pojedynczych wynika iż AP2 może częściowo dublować funkcję ANT (Elliot i wsp Plant Cell 8: 155-168, 1996). Zjawisko nadmiarowości genetycznej i jej zdolności do maskowania efektu mutacji genowych można łatwiej wykazać na przykładzie domeny MADS występującej w genach związanych z rozwojem kwiatów: APETALA1 (AP1) i CAULIFLOWER (CAL). Badania genetyczne wykazały iż mutacje w cal nie wywierają widocznego wpływu na fenotyp kwiatów, chyba że występują łącznie z mutacją ap1 (Bowman i wsp Development Gam. UK 119: 721-743, 1993), co wskazuje że AP1 jest całkowicie dublowany pod względem funkcjonalnym przez CAL. Hipoteza iż geny RAP2 mogą być funkcjonalnie redundantne zyskuje poparcie w fakcie że dominująca mutacja utraty funkcji tiny jest jedyną znaną dotychczas mutacją u Arabidopsis w genie RAP2 EREBP-podobnym (Wilson i wsp Plant Cell 8: 659-671, 1996).
Aktywność AP2 wykrywana jest w czasie rozwoju wegetatywnego. Zaprezentowana analiza ekspresji genu RAP2 w roślinach typu dzikiego i mutantach ap2-10 sugeruje że AP2 przyczynia się do regulacji aktywności genu RAP2 w czasie rozwoju i różnicowania Arabidopsis. Na ekspresję genu RAP2 wpływa w sposób negatywny i pozytywny zarazem brak aktywności AP2 w czasie różnicowania. Zaobserwowane różnice we wzorze ekspresji i poziomach ekspresji RAP2.2, RAP2.3 i RAP2.4 w kwiatach i tkankach wegetatywnych roślin typu dzikiego i mutancie ap2-10 nie jest zależna od różnic ekotypu ponieważ podobne zmiany w poziomach ekspresji genu zaobserwowano dla wszystkich trzech genów RAP2 w łodydze gdy kontrolowano badane ekotypy. Regulacja ekspresji genu RAP2 przez AP2 w łodydze wskazuje wyraźnie że odmiennie od innych roślinnych genów homeotycznych geny AP2 uczestniczą zarówno w procesach różnicowania zarówno wegetatywnego jak generatywnego.
P r z y k ł a d 5
Przykład ten pokazuje że rośliny transgeniczne według wynalazku posiadają nasiona o zmienionej zawartości i składzie kwasów tłuszczowych.
Antysensowne rośliny transgeniczne przygotowano stosując AP2, RAP2.8 i RAP2.1 (dwie niezależne rośliny) stosując metody podane powyżej. Skład i zawartość kwasów tłuszczowych oznaczano stosując chromatografię gazową wg Brouna i Somervillea Plant Physiol 113: 933-942, 1997. Rezultaty zebrano w tabeli VI (dla AP2) i tabeli VII (dla genów RAP2). Jak widać transgeniczne rośliny według wynalazku posiadają zwiększoną zawartość kwasów tłuszczowych w porównaniu z roślinami typu dzikiego. Ponadto profil kwasów tłuszczowych jest zmieniony.
PL 197 043 B1
Rezultaty przedstawione w tabeli VIII wykazują że w nasieniu Arabidopsis typu dzikiego znajduje się 7 mg oleju. W mutantach ap2-4 i ap2-5 znajduje się około 9 mg i około 14-15 mg w nasionach mutanta ap2-10. Ponadto profil kwasów tłuszczowych w roślinach typu dzikiego i mutantach ap2 pozostaje nierozróżnialny ilościowo. Zatem utrata aktywności AP2 powoduje zwiększenie całkowitej zawartości kwasów tłuszczowych bez wyraźnych zmian składu kwasów tłuszczowych.
PL 197 043 B1
PL 197 043 B1
linia mutanta ap2 na podłożu C24
Tabela VIII. Kontrola genetyczna całkowitej zawartości kwasów tłuszczowych w Arabidosis thaliana
PL 197 043 B1
P r z y k ł a d 6
Poniższy przykład opisuje przygotowanie konstruktu promotora, który jest stosowany do przygotowania kasetki ekspresyjnej użytecznej w tworzeniu roślin transgenicznych według wynalazku. W szczególności przykład pokazuje wykorzystanie dwu korzystnych promotorów, promotora z genu AP2 i promotora z genu Be11.
Figura 5 przedstawia konstrukt z promotorem AP2. Plazmid pAP2 reprezentuje 16.3 kpz kasetkę ekspresyjną z promotorem AP2 stosowną do tworzenia genów chimerowych stosowanych w transformacji roślin przedstawionej powyżej. pAP2 złożony jest z 4.0 kpz regionu promotorowego genu AP2 Arabidopsis. Zastosowany wektor Ti jest wektorem pDE1000 (Plant Genetic Systems, Belgia). DNA wektora pDE1000 zlinearyzowano enzymem BamHI i region promotorowy AP2 wprowadzono jako fragment BamHI, subklonując go z plazmidu pLE7.2. Na końcu 3' wprowadzonego regionu promotorowego AP2 (oznaczonego AP2) leżą trzy miejsca restrykcyjne (EcoRI, Smal i SnaB1) do których można wprowadzać różne sekwencje kodujące, tak by utworzyć chimerowe kasetki AP2. NOS::NTPII oznacza roślinny marker selekcyjny, gen NPTII znajdujący się pod kontrolą promotora syntazy nopalinowej, nadający oporność na kanamycynę transformowanym komórkom roślinnym, niosącym zintegrowaną kasetkę ekspresyjną AP2. LB i RB to sekwencje graniczne T-DNA: lewa i prawa, niezbędne do transferu kasetki ekspresyjnej AP2 zawierającej T-DNA do genomu rośliny. PVS1 oznacza sekwencje bakteryjnego DNA funkcjonującą jako miejsce startu replikacji w E.coli i Agrobacterium tumefaciens, umożliwiającą replikację plazmidu pAP2 w obu bakteriach. AmpR i Sm/SpR oznaczają bakteryjne markery selekcyjne, nadające odpowiednio oporność na ampicylinę i streptomycynę/spektynomycynę, i umożliwiające selekcjonowanie szczepów Agrobacterium niosących zrekombinowany plazmid pAP2.
Figura 6 przedstawia konstrukt z promotorem BEL1. Plazmid pBEL reprezentuje 16.8 kasetkę ekspresyjną z promotorem BEL1 stosowną do tworzenia genów chimerowych używanych w transformacji roślin przedstawionej powyżej. pBEL1 złożony jest z 4.5 kpz regionu promotorowego genu BEL1 Arabidopsis. Zastosowany wektor Ti jest wektorem pDE1000 (Plant Genetic Systems, Belgia). DNA wektora pDE1000 zlinearyzowano enzymem BamHI i region promotorowy BEL1 wprowadzono jako fragment BamHI-Bg12, subklonując go z plazmidu μλ,1Ο9Ρ (L.Reiser, niepublikowane). Na końcu 3' wprowadzonego regionu promotorowego BEL1 (oznaczonego BEL1) leżą trzy miejsca restrykcyjne (EcoRI, Smal i SnaB1) do których można wprowadzać różne sekwencje kodujące, tak by utworzyć chimerowe kasetki BEL1. NOS::NTPII oznacza roślinny marker selekcyjny, gen NPTII znajdujący się pod kontrolą promotora syntazy nopalinowej, nadający oporność na kanamycynę transformowanym komórkom roślinnym, niosącym zintegrowaną kasetkę ekspresyjną BEL. LB i RB to sekwencje graniczne T-DNA: lewa i prawa, niezbędne do transferu kasetki ekspresyjnej AP2 zawierającej T-DNA do genomu rośliny. PVS1 oznacza sekwencje bakteryjnego DNA funkcjonującą jako miejsce startu replikacji w E.coli i Agrobacterium tumefaciens, umożliwiającą replikację plazmidu pBEL w obu bakteriach. AmpR i Sm/SpR oznaczają bakteryjne markery selekcyjne, nadające odpowiednio oporność na ampicylinę i streptomycynę/spektynomycynę, i umożliwiające selekcjonowanie szczepów Agrobacterium niosących zrekombinowany plazmid pBEL.
P r z y k ł a d 7
Przykład ten pokazuje że rośliny transgeniczne według wynalazku dają zwiększoną wydajność nasienną.
Dobrze wiadomo że wypełnienie nasion i rozmieszczenie całkowitej zawartości nasion, określone jest w części przez dostępność i zasilanie rozwijających się nasion związkami zawierającymi węgiel i azot lub związkami asymilowanymi przez roślinę. Zatem zwiększenie wielkości nasienia i zawartości nasienia zwykle wynika ze zmniejszenia całkowitej liczby nasion w obecności stałego dowozu fotoasymilatów. Ponieważ całkowita ilość nasion zależy od wielu czynników włączając w to płodność męską i żeńską, i ponieważ mutacje ap2 wpływają zarówno na rozwój zalążków i pręcików, całkowita liczba nasion i całkowity plon nasion można mierzyć w roślinach transgenicznych według wynalazku i w roślinach typu dzikiego w celu określenia czy wzrost wielkości nasienia nie odbywa się kosztem zmniejszenia całkowitej liczby nasion lub wydajności nasiennej.
W celu przetestowania tej hipotezy mierzono całkowitą wydajność nasienną roślin ap2-10 (+/-). Jak przedstawiono to w tabeli IX całkowity plon nasion na roślinę ap2-10 (+/-) jest zwiększony o około +35% w porównaniu z rośliną typu dzikiego C24, ze względu częściowo na przyrost średniej masy nasienia (tabela IX). Ponadto, wzrost całkowitego plonu nasion transgenicznych roślin ap2-10 może wynikać ze wzrostu całkowitej liczby wytworzonych kwiatów. Tabela X przedstawia że średnio rośliny
PL 197 043 B1 ap2-10 (-/-) wytwarzają co najmniej 80% więcej kwiatów w porównaniu z rośliną typu dzikiego. Zatem genetyczna manipulację aktywnością AP2 w roślinach transgenicznych pozwala na uzyskanie agronomicznie pożądanego zwiększenia całkowitego plonu nasion przez zwiększenie masy nasienia, zawartości nasienia i wytworzonych kwiatów.
T a b e l a IX
Kontrola genetyczna plonu nasion Arabidopsis z zastosowaniem AP2
średnia masa nasienia (mg/100 nasion) całkowity plon nasion (g)1 procentowa zmiana masy nasienia w porównaniu z typem dzikim
1. ap2-10 (+/-) 2.9 2.61 (0.39) + 35%
2. C24 2.1 1.94 (0.27)
1n = 10 - wartości odchylenia standardowego podane są w nawiasach
T a b e l a X
Kontrola genetyczna ilości kwiatów Arabidopsis z zastosowaniem AP2
całkowita liczba kwiatostanów w przeliczeniu na roślinę1 średnia liczba kwiatów na pierwotnych kwiatostanach (w przeliczeniu na roślinę)1
1. ap2-10 14.7 (3.9) 78.7 (6.0)
2. C24 11.0 (3.6) 42.9 (7.6)
1n = 7 - wartości odchylenia standardowego podane są w nawiasach
Powyższe przykłady stanowią jedynie ilustrację wynalazku w sposób nieograniczający. Możliwe są inne warianty wynalazku, oczywiste dla specjalistów i są one objęte zastrzeżeniami. Wszystkie publikacje, patenty i zgłoszenia patentowe zacytowane powyżej włączone są jedynie na zasadzie odniesienia.

Claims (54)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób modulowania cech nasion roślin, znamienny tym, że dostarcza się pierwszą roślinę zawierającą zrekombinowaną kasetkę ekspresyjną obejmującą kwas nukleinowy ADC przyłączony do promotora roślinnego, przy czym kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową hybrydyzującą do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C, prowadzi się samozapylenie pierwszej rośliny lub skrzyżowanie pierwszej rośliny z drugą rośliną, dla wytworzenia wielości nasion; i selekcjonuje się nasiona ze zmienioną masą lub ze zmienioną zawartością węglowodanów, białka lub olejów.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekspresja kwasu nukleinowego ADC hamuje ekspresję endogennego genu ADC i etap selekcjonowania obejmuje selekcjonowanie nasienia ze zwiększoną masą.
  3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że nasienie posiada zwiększoną zawartość białka, zawartość węglowodanów lub zawartość oleju.
  4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że kwas nukleinowy ADC przyłączony jest do promotora roślinnego w orientacji antysensownej.
  5. 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że pierwsza i druga roślina należą do tego samego gatunku.
  6. 6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że promotor roślinny jest promotorem konstytutywnym.
  7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że promotor jest promotorem 35S z CaMV.
  8. 8. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że promotor jest promotorem tkankowo specyficznym.
  9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że promotor jest specyficzny względem zalążka.
    PL 197 043 B1
  10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ekspresja kwasu nukleinowego ADC wzmaga ekspresję endogennego genu ADC i etap selekcjonowania obejmuje selekcjonowanie nasienia ze zmniejszoną masą.
  11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że pierwsza i druga roślina należą do tego samego gatunku.
  12. 12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że promotor roślinny jest promotorem konstytutywnym.
  13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że promotor jest promotorem 35S z CaMV.
  14. 14. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że promotor jest promotorem tkankowe specyficznym.
  15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że promotor jest specyficzny względem zalążka.
  16. 16. Sposób według zastrz. 1 albo 10, znamienny tym, że kwas nukleinowy ADC hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C.
  17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1.
  18. 18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 1.
  19. 19. Sposób według zastrz. 1 albo 10, znamienny tym, że kwas nukleinowy ADC hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C.
  20. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2.
  21. 21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 2.
  22. 22. Nasiono zawierające zrekombinowaną kasetkę ekspresyjną obejmującą kwas nukleinowy ADC, znamienne tym, że kwas nukleinowy ADC posiada sekwencję polinukleotydową hybrydyzującą do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C, oraz moduluje masę nasienia, zawartość węglowodanów, zawartość białka lub zawartość olejów w nasieniu.
  23. 23. Nasiono według zastrz. 22, znamienne tym, że kwas nukleinowy ADC przyłączony jest do promotora roślinnego w orientacji antysensownej i masa nasienia jest co najmniej około 10% większa od średniej masy nasion z tej samej odmiany roślin nie posiadających zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej.
  24. 24. Nasiono według zastrz. 23, znamienne tym, że masa nasienia jest co najmniej około 20% większa od średniej masy nasion z tej samej odmiany roślin nie posiadających zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej.
  25. 25. Nasiono według zastrz. 23, znamienne tym, że masa nasienia jest co najmniej około 50% większa od średniej masy nasion z tej samej odmiany roślin nie posiadających zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej.
  26. 26. Nasiono według zastrz. 23, znamienne tym, że zawartość oleju jest proporcjonalnie zwiększona.
  27. 27. Nasiono według zastrz. 23, znamienne tym, że zawartość białka jest proporcjonalnie zwiększona.
  28. 28. Nasiono, według zastrz. 22, znamienne tym, że kwas nukleinowy ADC przyłączony jest do promotora roślinnego w orientacji sensownej i masa nasienia jest co najmniej około 10% mniejsza od średniej masy nasion z tej samej odmiany roślin nie posiadających zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej.
  29. 29. Nasiono według zastrz. 28, znamienne tym, że masa nasienia jest co najmniej około 20% mniejsza od średniej masy nasion z tej samej odmiany roślin nie posiadających zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej.
  30. 30. Nasiono według zastrz. 28, znamienne tym, że masa nasienia jest co najmniej około 50% mniejsza od średniej masy nasion z tej samej odmiany roślin nie posiadających zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej.
  31. 31. Nasiono według zastrz. 22, znamienne tym, że kwas nukleinowy ADC hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C.
    PL 197 043 B1
  32. 32. Nasiono według zastrz. 31, znamienne tym, że kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1.
  33. 33. Nasiono według zastrz. 32, znamienne tym, że kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 1.
  34. 34. Nasiono według zastrz. 22, znamienne tym, że kwas nukleinowy ADC hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C.
  35. 35. Nasiono według zastrz. 34, znamienne tym, że kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2.
  36. 36. Nasienie według zastrz. 35, znamienne tym, że kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 2.
  37. 37. Roślina transgeniczna zawierająca kasetkę ekspresyjną obejmującą promotor roślinny przyłączony w sposób umożliwiający działanie do heterologicznego polinukleotydu ADC, przy czym polinukleotyd ADC zawiera sekwencję nukleotydową hybrydyzującą do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C i moduluje masę, zawartość węglowodanów, zawartość białka lub zawartość olejów w nasieniu rośliny.
  38. 38. Roślina transgeniczna według zastrz. 37, znamienna tym, że heterologiczny polinukleotyd ADC koduje polipeptyd ADC.
  39. 39. Roślina transgeniczna według zastrz. 37, znamienna tym, że heterologiczny polinukleotyd ADC przyłączony jest do promotora w orientacji antysensownej.
  40. 40. Roślina transgeniczna według zastrz. 37, znamienna tym, że kwas nukleinowy ADC hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C.
  41. 41. Roślina transgeniczna według zastrz. 40, znamienna tym, że kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1.
  42. 42. Roślina transgeniczna według zastrz. 41, znamienna tym, że kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 1.
  43. 43. Roślina transgeniczna według zastrz. 37, znamienna tym, że kwas nukleinowy ADC hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C.
  44. 44. Roślina transgeniczna według zastrz. 43, znamienna tym, że kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2.
  45. 45. Roślina transgeniczna według zastrz. 44, znamienna tym, że kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 2.
  46. 46. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca kasetkę ekspresyjną obejmującą roślinny promotor przyłączony w sposób umożliwiający działanie do heterologicznego polinukleotydu ADC, przy czym polinukleotyd ADC zawiera kwas nukleinowy hybrydyzujący do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 lub sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2, w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C, i moduluje masę, zawartość węglowodanów, zawartość białka lub zawartość olejów w nasieniu rośliny.
  47. 47. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 46, znamienna tym, że heterologiczny polinukleotyd ADC koduje polipeptyd ADC.
  48. 48. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 46, znamienna tym, że heterologiczny polinukleotyd ADC przyłączony jest do promotora w orientacji antysensownej.
  49. 49. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 46, znamienna tym, że kwas nukleinowy ADC hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C.
  50. 50. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 49, znamienna tym, że kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 1.
  51. 51. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 49, znamienna tym, że kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 1.
    PL 197 043 B1
  52. 52. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 46, znamienna tym, że kwas nukleinowy ADC hybrydyzuje do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2 w warunkach hybrydyzacji, które obejmują płukanie w 0,2 x SSC w temperaturze 50°C.
  53. 53. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 52, znamienna tym, że kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową posiadającą przynajmniej 90% identyczności do sekwencji o Numerze Identyfikacyjnym 2.
  54. 54. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 53, znamienna tym, że kwas nukleinowy ADC zawiera sekwencję polinukleotydową o Numerze Identyfikacyjnym 2.
PL344222A 1998-02-19 1999-02-17 Sposób modulowania cech nasion roślin, nasiono, roślina transgeniczna oraz wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego PL197043B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/026,039 US6329567B1 (en) 1996-08-20 1998-02-19 Methods for improving seeds
PCT/US1999/003429 WO1999041974A1 (en) 1998-02-19 1999-02-17 Methods for improving seeds

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL344222A1 PL344222A1 (en) 2001-10-08
PL197043B1 true PL197043B1 (pl) 2008-02-29

Family

ID=21829540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL344222A PL197043B1 (pl) 1998-02-19 1999-02-17 Sposób modulowania cech nasion roślin, nasiono, roślina transgeniczna oraz wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego

Country Status (7)

Country Link
US (1) US6329567B1 (pl)
EP (1) EP1061793A4 (pl)
AU (1) AU759027B2 (pl)
CA (1) CA2321138A1 (pl)
HU (1) HUP0100706A3 (pl)
PL (1) PL197043B1 (pl)
WO (1) WO1999041974A1 (pl)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7888558B2 (en) * 1999-11-17 2011-02-15 Mendel Biotechnology, Inc. Conferring biotic and abiotic stress tolerance in plants
US7598429B2 (en) 2001-04-18 2009-10-06 Mendel Biotechnology, Inc. Transcription factor sequences for conferring advantageous properties to plants
US7897843B2 (en) 1999-03-23 2011-03-01 Mendel Biotechnology, Inc. Transcriptional regulation of plant biomass and abiotic stress tolerance
US7663025B2 (en) * 1999-03-23 2010-02-16 Mendel Biotechnology, Inc. Plant Transcriptional Regulators
US8912394B2 (en) * 2001-04-18 2014-12-16 Mendel Biotechnology Inc. Transcriptional regulation of plant disease tolerance
US7858848B2 (en) * 1999-11-17 2010-12-28 Mendel Biotechnology Inc. Transcription factors for increasing yield
US8030546B2 (en) * 1998-09-22 2011-10-04 Mendel Biotechnology, Inc. Biotic and abiotic stress tolerance in plants
US7126043B1 (en) * 1999-02-25 2006-10-24 Ceres, Inc. ADC polynucleotides and polypeptides, uses thereof including methods for improving seeds
EP1155123A4 (en) * 1999-02-25 2005-12-21 Ceres Inc ADC POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES AND THEIR USES, INCLUDING PROCESSES FOR IMPROVING SEED
US6835540B2 (en) * 2001-03-16 2004-12-28 Mendel Biotechnology, Inc. Biosynthetic pathway transcription factors
GB9918061D0 (en) * 1999-07-30 1999-10-06 Univ Bath Modified plants
BR0015631A (pt) * 1999-11-17 2002-07-09 Mendel Biotechnology Inc Planta, polinucleotìdeo, vetor, célula, composição, polipeptìdeo, métodos para produzir uma planta e para identificar um fator que é modulado por, ou interage com, um polipetìdeo codificado por um polinucleotìdeo, uma molécula que module a atividade ou a expressão de um polinucleotìdeo ou polipetìdeo de interesse, e uma sequência similar ou homóloga a um ou mais polinucleotìdeos, e, sistema integrado, meio computadorizado ou legìvel em computador
US6831205B2 (en) * 1999-11-29 2004-12-14 Clozex Medical, Llc Bandage for wound or incision closure
US20070094750A1 (en) * 2000-02-25 2007-04-26 Ceres, Inc. Novel ADC polynucleotides and polypeptides, uses thereof including methods for improving seeds
AU2001255797A1 (en) * 2000-05-02 2001-11-12 Applied Phytologics, Inc. Enhanced gene expression in plants using transcription factors
BR122015007037B1 (pt) 2000-12-21 2017-04-04 Monsanto Technology Llc moléculas de dna associadas com proliferação e desenvolvimento de células de plantas e métodos de produzir plantas com tamanho de órgão aumentado
EP1373311B1 (en) 2001-03-28 2012-08-01 Consejo Superior Investigaciones Cientificas (Csic) Method for improving plant tolerance to environmental stress
US7294759B2 (en) * 2001-06-29 2007-11-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alteration of oil traits in plants
EP1293572A1 (en) * 2001-09-17 2003-03-19 Syngenta Participations AG Method of altering plant secondary metobolite biosynthesis in plant cells
US7176027B2 (en) 2001-12-20 2007-02-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes and regulatory DNA sequences associated with stress-related gene expression in plants and methods of using the same
US20050034188A1 (en) * 2002-03-20 2005-02-10 J. R. Simplot Company Refined plant transformation
CA2479739C (en) * 2002-03-20 2013-02-19 J.R. Simplot Company Refined plant transformation
CA2492544A1 (en) 2002-08-02 2004-02-12 Basf Plant Science Gmbh Modification of seed oil by the expression of a putative cytidyltransferase in transgenic plants
US7208654B2 (en) * 2003-05-07 2007-04-24 Monsanto Technology Llc Plant regulatory sequences for selective control of gene expression
US20050081261A1 (en) * 2003-10-14 2005-04-14 Pennell Roger I. Methods and compositions for altering seed phenotypes
CA2554644C (en) 2004-02-02 2015-06-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ap2 domain transcription factor odp2 (ovule development protein 2) and methods of use
US7820881B2 (en) * 2004-03-01 2010-10-26 Cropdesign N.V. Plants having increased yield and method for making the same
US7429692B2 (en) * 2004-10-14 2008-09-30 Ceres, Inc. Sucrose synthase 3 promoter from rice and uses thereof
EP1836307A2 (en) * 2004-12-20 2007-09-26 Mendel Biotechnology, Inc. Plant stress tolerance from modified ap2 transcription factors
US7795503B2 (en) * 2005-02-22 2010-09-14 Ceres, Inc. Modulating plant alkaloids
US8124839B2 (en) 2005-06-08 2012-02-28 Ceres, Inc. Identification of terpenoid-biosynthesis related regulatory protein-regulatory region associations
US20070199090A1 (en) * 2006-02-22 2007-08-23 Nestor Apuya Modulating alkaloid biosynthesis
US20080301836A1 (en) * 2007-05-17 2008-12-04 Mendel Biotechnology, Inc. Selection of transcription factor variants
CN102939383B (zh) 2009-12-30 2015-04-29 先锋国际良种公司 用于靶向多核苷酸修饰的方法和组合物
CN102892888A (zh) 2009-12-30 2013-01-23 先锋国际良种公司 在植物中导入并调节表达基因的方法和组合物
MX2016008991A (es) 2016-07-08 2018-01-08 Centro De Investig Cientifica De Yucatan A C Factores de transcripcion aislados de carica papaya y su aplicacion para obtener plantas tolerantes a temperaturas extremas.

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5773697A (en) 1996-04-23 1998-06-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic constructs and methods for producing fruits with very little or diminished seed
US6846669B1 (en) * 1996-08-20 2005-01-25 The Regents Of The University Of California Methods for improving seeds

Also Published As

Publication number Publication date
EP1061793A1 (en) 2000-12-27
AU2684599A (en) 1999-09-06
WO1999041974A1 (en) 1999-08-26
CA2321138A1 (en) 1999-08-26
HUP0100706A2 (hu) 2002-04-29
PL344222A1 (en) 2001-10-08
EP1061793A4 (en) 2004-12-01
US6329567B1 (en) 2001-12-11
HUP0100706A3 (en) 2002-12-28
AU759027B2 (en) 2003-04-03
WO1999041974A9 (en) 2000-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL197043B1 (pl) Sposób modulowania cech nasion roślin, nasiono, roślina transgeniczna oraz wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego
US6846669B1 (en) Methods for improving seeds
US6235975B1 (en) Leafy cotyledon1 genes and methods of modulating embryo development in transgenic plants
US6320102B1 (en) Leafy cotyledon1 genes and their uses
US6781035B1 (en) Leafy cotyledon1 genes and their uses
WO1998037184A9 (en) Leafy cotyledon1 genes and their uses
US6559357B1 (en) Methods for altering mass and fertility in plants
CA2402380A1 (en) Leafy cotyledon2 genes and their uses
WO1999057247A1 (en) Nucleic acids that control seed and fruit development in plants
US6545201B1 (en) Leafy cotyledon1 genes and their uses
AU2001241600B2 (en) Leafy cotyledon1 genes and their uses
AU2001241600A1 (en) Leafy cotyledon1 genes and their uses
WO2002008432A2 (en) Composition and method for increased meiotic recombination in plants
ES2312812T3 (es) Procedimientos para la modulacion de procesos relacionados con citoquininas en una planta mediante el uso de proteinas con dominio b3.
US20070094750A1 (en) Novel ADC polynucleotides and polypeptides, uses thereof including methods for improving seeds
US6376751B1 (en) Nucleic acids encoding EMF1 that control reproductive development in plants
US7164006B1 (en) Alteration of plant meristem function by manipulation of the Retinoblastoma-like plant RRB gene
US7126043B1 (en) ADC polynucleotides and polypeptides, uses thereof including methods for improving seeds
EP1155123A1 (en) Novel adc polynucleotides and polypeptides, uses thereof including methods for improving seeds

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20100217