PL195751B1 - Sposób otrzymywania monospecyficznego przeciwciała przeciwko cAMP oraz przeciwko cGMP i jego zastosowanie - Google Patents

Abstract

Sposób otrzymywania monospecyficznych przeciwciał przeciwko 3',5'-cyklicznemu monofosforanowi nukleozydu zasady purynowej, znamienny tym, że otrzymuje się koniugat wybranego 3',5'- -cyklicznego monofosforanu nukleozydu zasady purynowej z białkiem nośnikowym, prowadzi się immunizację zwierzęcia z wykorzystaniem tego koniugatu, następnie otrzymuje się surowicę zwierzęcia poddanego uprzednio immunizacji i oczyszcza się ją techniką chromatografii powinowactwa na absorbencie zawierającym immobilizowany koniugat białka nośnikowego z 3',5'-cyklicznym monofosforanem nukleozydu zasady purynowej innej niż zawarta w koniugacie zastosowanym do immunizacji, i uzyskuje się monospecyficzne przeciwciała przeciwko wybranemu 3',5'-cyklicznemu monofosforanowi nukleozydu zasady purynowej, które zawarte są we frakcji niezatrzymanej na absorbencie, przy czym korzystnie jako białko nośnikowe stosuje się albuminę surowicy ludzkiej albo HSA. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dla otrzymywania monospecyficznych przeciwciał przeciwko cAMP prowadzi się immunizację z wykorzystaniem koniugatu zawierającego cAMP i oczyszczanie chromatograficzne na nośniku zawierającym koniugat zawierający cGMP.

Description

Opis wynalazku

Dziedziną wynalazku jest immunobiochemia, oraz jej wykorzystanie w diagnostyce laboratoryjnej. Dokładniej, wynalazek dotyczy nowej metody otrzymywania monospecyficznych przeciwciał przeciwko cAMP albo przeciwko cGMP, oraz ich zastosowania do oznaczania poziomu cAMP albo cGMP, zwłaszcza techniką ELISA. Zaprezentowano także test służący do oznaczania aktywności enzymów biorących udział w metabolizmie cyklicznych nukleotydów, w szczególności cyklaz i fosfodiesteraz.

Cykliczny AMP (cAMP) i cykliczny GMP (cGMP) należą do grupy tzw. wtórnych przekaźników sygnału czyli cząsteczek, które są indukowane wewnątrz komórki w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Regulując aktywności rozmaitych białek efektorowych wpływają one na funkcje komórek. O ostatecznym efekcie komórkowym decyduje kinetyka zmian poziomu cyklicznych nukleotydów i dlatego rejestrowanie tych zmian staje się niezbędnym elementem w badaniach wewnątrzkomórkowych szlaków przenoszenia sygnałów. Stężenie cAMP i cGMP wewnątrz komórki zależy bezpośrednio od aktywności przeciwstawnie działających enzymów: syntetyzujących cyklaz i hydrolizujących fosfodiesteraz (PDE) (Houslay 1998; Lucas i współpr. 2000; Soderling i Beavo 2000). Formowanie cGMP z GTP katalizują cyklazy guanylanowe (GC), a cAMP z ATP cyklazy adenylanowe (AC).

Cyklazy adenylanowe tworzą rodzinę 9 podobnych strukturalnie błonowych izoenzymów, aktywowanych przez podjednostki a heterotrimerycznych białek Gs, podjednostki bg białek G, Ca²⁺ /kalmodulinę, bądź przez kinazę białkową C (Patel i współpr. 2001). Cyklazy guanylanowe występują w formie białek cytozolowych (tzw. cyklazy rozpuszczalne) bądź związanych z błonami komórkowymi (cyklazy błonowe) (Lucas i współpr. 2000). Cyklazy rozpuszczalne (GC-S) aktywowane są przez tlenek azotu (NO) oraz przez tlenek węgla (CO) (Lucas i współpr. 2000), natomiast aktywatorami poszczególnych izoform cyklaz błonowych są: peptydowe ligandy (peptydy natriuretyczne, enterotoksyny bakteryjne, guanylina, uroguanylina), ATP oraz białka wiążące wapń. (Kobiałka i Gorczyca 2000). W wyniku stymulacji cyklaz dochodzi do wzrostu stężenia cyklicznych nukleotydów w komórce i zmian aktywności regulowanych przez nie kinaz białkowych, kanałów jonowych oraz fosfodiesteraz cAMP icGMP (Houslay 1998; Lohman i współpr. 1997; Lucas i współpr. 2000).

Fosfodiesterazy cyklicznych nukleotydów stanowią bardzo liczną i zróżnicowaną rodzinę. Do chwili obecnej wykryto ich ponad 40 i na podstawie podobieństw w strukturze genów zgrupowano w 11 głównych rodzin (Soderling i Beavo 2000, Wróblewska i Gorczyca 2001). Uważa się, że cykliczne nukleotydy mogą być również aktywnie wydalane na zewnątrz komórki, przypuszczalnie przez zależne od ATP transportery.

Biorąc pod uwagę, że wiele związków może wpływać bezpośrednio lub pośrednio na aktywność tak cyklaz, jak i fosfodiesteraz, monitorowanie poziomu cyklicznych nukleotydów w wybranych populacjach komórek byłoby pomocne przy określaniu modulatorowych właściwości danych związków. Punktem wyjścia do tego typu badań jest zatem precyzyjny pomiar stężenia obydwu nukleotydów w komórkach. Możliwość precyzyjnego pomiaru stężenia nukleotydów ma również znaczenie w niektórych stanach chorobowych. Doniesienia ostatnich lat wskazują bowiem, że zmiany stężenia cGMP w surowicy i/lub moczu towarzyszą np. różnym postaciom białaczki (Peracchi i współpr. 1983), rakowi szyjki macicy (Orbo i współpr. 1998), obserwowane są w ciężkim pierwotnym nadciśnieniu płucnym (Bogdan i współpr. 1998), w zastoinowej niewydolności serca (Tsutamoto i współpr. 1997), we wstrząsie septycznym (Hartemink i współpr. 2001) czy podczas terapii interferonowej (Kagaya i współpr. 1997). Tak więc monitorowanie zmian stężenia nukleotydów oprócz znaczenia czysto poznawczego może mieć również znaczenie praktyczne jako test uzupełniający przy diagnozowaniu rozmaitych schorzeń oraz prognozowaniu w trakcie terapii. Znane są liczne testy służące do pomiaru stężenia cyklicznych nukleotydów (Brown i współpr. 1971; Cailla i współpr. 1980; Harper i Brooker 1975; Horton i współpr. 1992; Steiner i współpr. 1972; Tsugawa i współpr. 1990), jednak ich swoistość, a zatem i czułość jest ograniczona. Kolejnym ograniczeniem stosowania dostępnych testów służących do oznaczania poziomu cyklicznych nukleotydów są stosunkowo wysokie koszty materiałowe.

W związku z powyższym, celem niniejszego wynalazku jest przedstawienie metody otrzymywania wysoce specyficznych przeciwciał anty cAMP albo anty cGMP (monospecyficzne przeciwciała poliklonalne). Kolejnym celem wynalazku jest przedstawienie zastosowania uzyskanych tym sposobem przeciwciał do otrzymywania wysoce swoistego testu umożliwiającego oznaczanie femtomolowych ilości obydwu nukleotydów. Pożądane jest także zwiększenie dostępności takiego testu m.in. poprzez obniżenie kosztów materiałowych.

PL 195 751 B1

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania monospecyflcznych przeciwciał przeciwko 3',5'-cyklicznemu monofosforanowi nukleozydu zasady purynowej, charakteryzujący się tym, że otrzymuje się koniugat 3',5'-cyklicznego monofosforanu nukleozydu zasady purynowej z białkiem nośnikowym, prowadzi się immunizację zwierzęcia z wykorzystaniem tego koniugatu, następnie z tego zwierzęcia otrzymuje się surowicę i oczyszcza się ją chromatograficznie na nośniku zawierającym immobilizowany koniugat białka nośnikowego z 3',5'-cyklicznym monofosforanem nukleozydu zasady purynowej innej niż zawarta w koniugacie zastosowanym do immunizacji.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie monospecyflcznych przeciwciał przeciwko 3',5'-cyklicznemu monofosforanowi nukleozydu zasady purynowej do otrzymywania testu do badania poziomu 3',5'-cyklicznego monofosforanu nukleozydu.

Wynalazek dostarcza czułego testu immunologicznego (typu RIA lub ELISA), który umożliwia pomiar pikomolowych ilości cAMP i cGMP w materiale komórkowym. Test ten został otrzymany dzięki uzyskaniu wysoce specyficznych przeciwciał rozpoznających cAMP albo cGMP i nie wykazujących międzynukleotydowej reaktywności krzyżowej.

Do immunizowania królików zastosowano koniugaty białka nośnikowego (albumina surowicy ludzkiej, HSA) z cyklicznymi nukleotydami (cAMP lub cGMP). Uzyskane surowice zostały następnie poddane krzyżowym absorpcjom. Surowicę anty cGMP-HSA absorbowano na immunoadsorbencie zawierającym cAMP-HSA i odwrotnie, surowica anty cAMP-HSA absorbowana była na immunoadsorbencie zawierającym cGMP-HSA. Dzięki takiemu zabiegowi otrzymano frakcje przeciwciał reagujące specyficznie wyłącznie z cAMP albo z cGMP (monospecyficzne przeciwciała poliklonalne). Nieoczekiwanie zastosowanie w trakcie oczyszczania populacji przeciwciał chromatografii powinowactwa do cząsteczki innej niż antygen dało zwiększenie specyficzności oczyszczanych przeciwciał. W znanych metodach oczyszczania przeciwciał poliklonalnych stosuje się podejście odwrotne.

W oparciu o uzyskane monospecyficzne przeciwciała poliklonalne opracowano test do ilościowego oznaczania cAMP i cGMP. Aby uniknąć kontaktu z materiałem radioaktywnym wybrano test immunoenzymatyczny (korzystnie ELISA). Wykorzystuje się w nim konkurencyjne hamowanie reakcji przeciwciała z antygenem immobilizowanym na płytce przez antygen rozpuszczalny (w tym przypadku hapten jakim jest cząsteczka cyklicznego nukleotydu). Dla uniknięcia niespecyficznej reakcji krzyżowej przeciwciał z białkiem nośnikowym służącym do immobilizowania haptenu na płytkach, do przygotowania płytek testowych wykorzystano koniugaty cyklicznych nukleotydów z tyroglobuliną. W standardowej wersji test umożliwia oznaczenie pikomolowych ilości cAMP, bądź cGMP. Acetylacja próbek zwiększa czułość testu ponad 10-krotnie (fig. 3). Obecność innych nukleotydów (ATP, GTP, ADP, GDP, AMP, GMP) w próbie, w stężeniach przekraczających nawet 1000-krotnie maksymalne stężenia cyklicznych nukleotydów, nie wpływa na pomiar.

Opracowany test może służyć do pomiarów zmian stężenia cAMP i cGMP w materiałach biologicznych. W poniższych przykładach został wykorzystany do pomiarów zmian poziomów cyklicznych nukleotydów będących wynikiem stymulowania komórek aktywatorami cyklaz adenylanowych i cyklaz guanylanowych. Prezentowany test został również wykorzystany w badaniu wpływu inhibitorów fosfodiesteraz na akumulację cyklicznych nukleotydów w komórkach. Uzyskane wyniki (przykład 6) świadczą o swoistości testu względem poszczególnych nukleotydów.

Opracowany test nadaje się zatem do pomiaru zmian poziomu cyklicznych nukleotydów wkomórkach (lub ich homogenatach), umożliwiając śledzenie wewnątrzkomórkowych dróg przekazywania sygnału. Wykorzystywany do oznaczania stężenia cyklicznych nukleotydów w płynach ustrojowych może stanowić uzupełnienie metod diagnozowania i monitorowania przebiegu niektórych chorób np. układu krążenia (Bogdan i wsp. 1998; Hartemink i wsp. 2001; Tsutamoto i wsp. 1997), czy nowotworowych (Orbo i wsp. 1998; Peracchi i wsp. 1983).

Dla lepszego zaprezentowania realizacji wynalazku jego opis został uzupełniony o figury.

Figura 1 przedstawia wyniki chromatografii jonowymiennej koniugatów cyklicznych nukleotydów z białkiem nośnikowym. (A) natywna HSA, (B) koniugat cAMP-HSA; (C) koniugat cGMP-HSA. Kolumna MonoQ HR 5/5; bufor 5 mM BTP pH 7,5; gradient NaCl od 0do 1 M, przepływ 1 ml/min.

Figura 2 przedstawia wyniki analizy swoistości otrzymanych przeciwciał przeciwko cyklicznym nukleotydom. Stosując metodę dot-blot porównano swoistości przeciwciał obecnych w: (A) surowicach królików bezpośrednio po zakończeniu immunizacji, (B) tych samych surowicach po adsorpcji na kolumnie z immobilizowanymi koniugatami. Białe strzałki wskazują oddziaływania niespecyficzne, czarne oddziaływania specyficzne. Użyte skróty: HSA - albumina surowicy ludzkiej; TYR - tyroglobulina; TYR-cAMP - koniugat tyroglobuliny z cAMP; TYR-cGMP - koniugat tyroglobuliny z cGMP.

PL 195 751 B1

Figura 3 przedstawia uzyskane krzywe wzorcowe służące do oznaczania zawartości cyklicznych nukleotydów. (A) krzywe do oznaczania cAMP, (B) krzywe do oznaczania cGMP.

Figura 4 przedstawia wyniki analizy syntezy cyklicznych nukleotydów w otrzewnowych makrofagach świnki morskiej. (A) synteza cAMP, (B) synteza cGMP. Komórki stymulowano aktywatorami syntezy cAMP (forskolina) bądź cGMP (SNP) w obecności i nieobecności inhibitora fosfodiesteraz (IBMX). Po zakończeniu inkubacji oznaczano poziom cyklicznych nukleotydów.

Przykład 1. Otrzymywanie immunogenu. Przygotowywanie koniugatów HSA-cAMP, HSAcGMP, TYR-cAMP i TYR-cGMP.

2'-O-sukcynylo 3',5'-cykliczny adenozynomonofosforan (Sigma) i 2'-O-sukcynylo 3',5'-cykliczny guanozynomonofosforan (Sigma) sprzęgano z grupami aminowymi albuminy surowicy ludzkiej (HSA), tyroglobuliny (TYR) (Sigma) zgodnie z metodą opisaną przez Horton i współpr. 1992. Wydajność sprzęgania kontrolowano przez porównanie profilu elucji natywnej albuminy (HSA) i otrzymanych koniugatów w chromatografii jonowymiennej wykorzystując system HPLC firmy Waters. Chromatografię prowadzono w 5 mM BTP [1,3-bis[tris-(hydroksymetylo) metyloamino] propan] pH 7,5 na kolumnie MonoQ HR5/5 (Pharmacia), eluując liniowym gradientem NaCl od 0do 0,5 M. Profile elucji przedstawiono na figurze 1. O przyłączeniu cyklicznych nukleotydów do białka świadczą: (i) odmienne czasy retencji białka natywnego i koniugatów (przyłączenie haptenu do grup e-aminowych) oraz (ii) znaczny wzrost absorbancji koniugatów przy l = 260 nm w porównaniu z białkiem natywnym.

Stopień podstawienia białka przez cykliczne nukleotydy jest istotny dla immunogenności preparatu i dlatego poddany został wszechstronnej kontroli (pomiar spektrofotometryczny, oznaczenie ciężarów cząsteczkowych, chromatografia jonowymienna). Chromatografia z użyciem kolumny MonoQ HR5/5 wykazała, że koniugaty cAMP i cGMP z HSA posiadają dłuższe czasy retencji w porównaniu z białkiem niemodyfikowanym (figura 1). Świadczy to o wprowadzeniu do cząsteczek HSA dodatkowych ładunków ujemnych (np. grup fosforanowych nukleotydów). Znaczne podwyższenie absorbancji przy 260 nm w eluowanych frakcjach zawierających koniugaty dodatkowo potwierdza podstawienie cząsteczek HSA przez nukleotydy. Stopień podstawienia, wyliczony na podstawie pomiarów spektrofotometrycznych lub zmian w ruchliwości elektroforetycznej, zawiera się w granicach 5-20 cząsteczek nukleotydu na cząsteczkę białka. Do immunizacji zwierząt użyto koniugatów z HSA o podstawieniu rzędu 10 nukleotydów/cząsteczkę białka.

Przykład 2. Immunizacja królików

Króliki immunizowano podając podskórnie pierwszą dawkę antygenu w kompletnym adiuwancie Freunda (200 mg antygenu w 250 ml emulsji), następne zaś w odstępach 4 tygodniowych, w niekompletnym adiuwancie Freunda (100 mg antygenu w 250 ml emulsji). Immunizację zakończono po upływie 14 tygodni i podaniu 5 dawek immunogenu.

Przykład 3. Otrzymywanie immunoadsorbentu

Koniugaty HSA-cAMP i HSA-cGMP, otrzymane jak w przykładzie 1, immobilizowano na komercyjnie dostępnym złożu Sepharose 4B aktywowanym CNBr (Pharmacia) zgodnie z zaleceniami producenta. Złoże (0,4 g) zawieszano w 5 ml 10 mM HCl, a następnie przemywano 180 ml 10 mM HCl. Do tak przygotowanego żelu (objętość 1ml po osadzeniu) dodawano 5 ml 0,1 M buforu węglanowego pH 8,3 zawierającego 0,5 M NaCl oraz 0,6 mg koniugatu HSA z cyklicznym nukleotydem. Mieszaninę łagodnie wytrząsano przez noc w temperaturze 4°C. Po odsączeniu żel przemywano 0,1 M buforem węglanowym pH 8,3. Wolne grupy reaktywne blokowano przy użyciu 1M roztworu etanolaminy przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po blokowaniu złoże przemywano 10 ml 0,1 M buforu octanowego pH 4,0 i zawierającego 0,5 M NaCl, a następnie 10 ml 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 również zawierającego 0,5 M NaCl. Płukania powtarzano czterokrotnie. Wydajność sprzęgania (odsetek koniugatu przyłączonego do złoża) wynosiła 99%.

Przykład 4. Otrzymywanie monospecyficznych przeciwciał poliklonalnych

Po zakończeniu immunizacji (przykład 2) zbierano krew obwodową immunizowanych zwierząt i otrzymywano surowice powszechnie znanymi metodami. Uzyskane surowice rozcieńczano 1:1 w10mM Hepes pH 7,5 i nanoszono na zrównoważoną tym samym buforem kolumnę, wypełnioną Sepharose 4B z immobilizowanym koniugatem HSA-cAMP (surowica anty-cGMP) lub HSA-cGMP (surowica anty-cAMP). Specyficzność przeciwciał niewiążących się ze złożem, obecnych we frakcjach wypływających z kolumny, sprawdzano metodą dot-blot. Na paski nitrocelulozy nanoszono po 2 ml roztworów HSA, tyroglobuliny, koniugatu tyroglobuliny z cAMP (TYR-cAMP) i tyroglobuliny z cGMP (TYR-cGMP), każdy o stężeniu 0,1 mg/ml. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących 1% roztworem

PL 195 751 B1 kazeiny (BDH), paski inkubowano z badanymi frakcjami (rozcieńczonymi 1:1000 i 1:5000), a następnie ze sprzężonymi z alkaliczną fosfatazą przeciwciałami drugorzędowymi skierowanymi przeciwko immunoglobulinom królika (Promega). Reakcję barwną prowadzono 2 min, zgodnie z zaleceniami producenta koniugatu. Wyniki analizy przedstawiono na figurze 2.

Przykład 5. Test ELISA do oznaczania poziomu cAMP albo cGMP

a. przygotowanie płytek

Płytki polistyrenowe, 96-dołkowe (MaxiSorp, Nunc) opłaszczano TYR-cAMP albo TYR-cGMP inkubując na płytce roztwór koniugatu (0,5 mg/ml) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Pozostałe miejsca wiążące blokowano przy pomocy 0,2% roztworu kazeiny. W kontroli wiązania niespecyficznego dołki na płytce opłaszczano niemodyfikowaną nukleotydami tyroglobuliną. Wszystkie pomiary przeprowadzano w dwóch powtórzeniach,

b. test ELISA - procedura standardowa

Próbki i standardowe roztwory cyklicznych nukleotydów w 0,2 M Tris-HCl pH 7,4; 50 mM EDTA oraz bufor (próba niehamowana) inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 4°C z roztworem przeciwciał anty-cAMP albo przez 18 godzin w temperaturze 4°C z roztworem przeciwciał anty-cGMP, a następnie nanoszono na opłaszczone płytki i inkubowano w temperaturze 4°C odpowiednio przez 1 godzinę (test cAMP) albo przez 3 godziny (test cGMP). Następnie płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w obecności przeciwciał przeciwko immunoglobulinom królika sprzężonych z peroksydazą chrzanową (Promega). Reakcję barwną, w której substratem była o-fenylenodiamina, prowadzono przez 15 minut, przerywano dodając 1 M H2SO4 i odczytywano absorbancję przy l = 490 nm w czytniku Dynatech MR 5000 (Dynatech Laboratories)

c. test ELISA - procedura z próbkami acetylowanymi

W celu zwiększenia czułości testu, próbki poddawano acetylacji (Harper i Brooker 1975). Do próbek, standardowych roztworów cyklicznych nukleotydów w 0,2 M Tris-HCl pH 7,4; 50 mM EDTA oraz buforu (próba niehamowana) dodawano mieszaniny 2:1 trietyloaminy (Sigma) z bezwodnikiem octowym (POCh) i pozostawiono przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Tak przygotowany materiał inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 4°C z roztworem przeciwciał anty-cAMP lub anty-cGMP, a następnie nanoszono na opłaszczone płytki i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 4°C. Inkubację z przeciwciałem anty-immunoglobuliny królika i reakcję barwną prowadzono jak w procedurze standardowej,

d. analiza wyników

Wyniki pomiarów (średnia arytmetyczna z powtórzeń) wyrażano w formie znormalizowanej jako wartości względnego zahamowania wiązania (BA) zgodnie ze wzorem: BA = (BX-Bn)/(B0-Bn) gdzie:

BX - absorbancja próby badanej

B0- absorbancja próby niehamowanej

Bn - absorbancja próby z oddziaływaniami niespecyficznymi

Zawartość cyklicznego nukleotydu w próbie odczytywana była z krzywej standardowej sporządzonej na podstawie roztworów cAMP i cGMP o znanych stężeniach. Wzorcowe stężenia nukleotydów wyznaczano spektrofotometrycznie odczytując absorbancję przy 260 nm i przyjmując, że molarny współczynnik absorbancji przy tej długości fali wynosi 15400 dla cAMP, a 13700 dla cGMP. Uzyskane krzywe standardowe przedstawiono na figurze 3.

Przykład 6. Pomiar zawartości cAMP icGMP w wysiękowych makrofagach otrzewnowych

Opracowany test został wykorzystany w badaniu wpływu inhibitorów fosfodiesteraz na akumulację cyklicznych nukleotydów w komórkach. Jako komórki modelowe wybrano makrofagi otrzewnowe świnki morskiej. Aktywność cyklaz adenylanowych stymulowano niespecyficznym aktywatorem jakim jest forskolina, która aktywuje 8 z 9 znanych izoform cyklazy adenylanowej u ssaków (Patel i współpr. 2001). Do stymulacji rozpuszczalnych form cyklaz guanylanowych użyto nitroprusydku sodowego (SNP), który jest powszechnie stosowanym w badaniach donorem tlenku azotu. We wszystkich przebadanych przypadkach zastosowanie niespecyficznego inhibitora fosfodiesteraz, jakim jest IBMX, powodowało wzrost mierzonej ilości nukleotydów. Forskolina indukowała wzrost cAMP, nie wpływając na poziom cGMP (fig. 4a). Induktory cGMP powodowały wzrost ilości cGMP, nie powodując wzrostu poziomu cAMP w komórkach (fig. 4b).

Makrofagi otrzewnowe świnki morskiej otrzymywano wg metody opisanej wcześniej przez Gorczycę i współpr. (1989). Izolowane komórki wysiewano na 24-dołkowe płytki hodowlane (5 x 10⁵ ko6

PL 195 751 B1 mórek na 1 ml) i inkubowano przez 2 godziny w RPMI 1640 z dodatkiem 2% surowicy autologicznej. Po zmianie medium na RPMI 1640 bez dodatku surowicy, komórki preinkubowano przez 10 minut w nieobecności lub w obecności 0,5 mM IBMX (niespecyficzny inhibitor fosfodiesteraz cyklicznych nukleotydów) (Sigma), a następnie traktowano aktywatorami cyklaz. Aktywatorem rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej był SNP (Sigma), a aktywatorem cyklazy adenylanowej forskolina (Sigma). Po 30 minutach inkubacji, komórki przemywano PBS i rozbijano roztworem 10% etanolu w 0,1 M HCl. Po odwirowaniu lizatu i liofilzacji supernatantu, próbki rozpuszczano w 0,2 M Tris-HCl pH 7,4; 50 mM EDTA i oznaczano w nich poziom cyklicznych nukleotydów. Uzyskane wyniki przedstawiono na figurze 4.

Dodatkowo test został zweryfikowany w pomiarach aktywności siatkówkowej cyklazy guanylanowej (RetGC) w homogenatach bydlęcych komórek fotoreceptorowych. Aktywność tej cyklazy jest wysoka i jest negatywnie regulowana przez jony wapniowe za pośrednictwem białkowego regulatora. RetGC wykazuje wysoką aktywność w obecności niskiego stężenia Ca²⁺ (50 nM) i traci ją, gdy stężenie to rośnie powyżej 500 nM (Gorczyca 2000). Uzyskane wyniki były zgodne z danymi uzyskanymi przy użyciu innych testów do oznaczania aktywności RetGC (Gorczyca 2000).

PIŚMIENNICTWO

1. Bogdan M., Humbert M., Francoual J., Claise C., Duroux P., Simonneau Lindenbaum A. 1998. Urinary cGMP concentrations in severe primary pulmonary hypertension. Thorcax, 53: 1059-1062

2. Brown B.L., Albano J.D.M., Ekins R.P., Sgherzi A.M. 1971. A simple and sensitive saturation assay method for the measurement of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate. Biochem.J.

121:561-562

3. Cailla H.L. Roux D., Kuntziger H., Delaage M.A. 1980. Antibodies against cyclic AMP, cyclic GMP and cyclic CMP. Their use in high performance radioimmunoassays. Hormones Cell. Reg.; 4:1-25

4. Gorczyca W.A. 2000. Use of nucleoside a-phosphorothioates in studies of photoreceptor guanylylcyclase: Purification of guanylyl cyclase-activating proteins. Meth Enzymol; 315: 689-707

5. Gorczyca W., Wieczorek Z., Lisowski J. 1989. Cell surface sialic acid affects immunoglobulin binding to macrophages. FEBS Lett; 259(1): 99-102

6. Harper J.F., Brooker G. (1975): Femtomole sensitive radioimmunoassay for cyclic AMP and cyclic GMP after 2'-O-acetylation by acetic anhydride in aqueous solution. J Cyclic Nucleotide Res.;1: 207-218.

7. Hartemink K.J., Groeneveld A.B., de Groot M.C., Strack van Schijndel R.J., van Kamp G., Thijs L.G.: (2001) Alpha-atrial natriuretic peptide, cyclic guanosine monophosphate, and endothelin in plasma as markers of myocardial depression in human septic shock. Crit Care Med. 29(1):80-7

8. Horton J.K., Martin R.C., Kalinka S., Cushing A., Kitcher J.P., O'Sullivan M.J., Baxendale P.M. 1992. Enzyme immunoassays for the estimation of adenosine 3',5' cyclic monophosphate and guanosine 3',5' cyclic monophosphate in biological fluids. J. Immunol. Methods 155, 31-40

9. Houslay M.D. 1998. Adaptation in cyclic AMP signalling processes: A central role for cyclic AMP phosphodiesterases. Seminars Cell. Develop. Biol, 9, 161-167

10. Kagaya A., Uchitomi Y., Takezaki E., Fukue M., Tsukano K., Kugaya A., Minagawa H., Takebayashi M., Zensho H., Oyamada T., Yamawaki S. 1997. Plasma levels of cyclic GMP, Immune parameters and depressive status during interferon therapy. Neuropsychobiology, 35: 128-131

11. Kobiałka M., Gorczyca W.A. 2000. Particulate guanylyl cyclases: multiple mechanisms of activation. Acta Biochim. Pol. 47:517-528

12. Lohmann S., Vaandrager A.B., Smolenski A., Walter U., De Jonge H.R. 1997. Distinct and specific functions of cGMP-dependent protein kinases. Trends Biochem. Sci., 22, 307-312

13. Lucas K.A., Pitari G.M., Kazerounian S., Ruiz-Stewart I, Park J., Schulz S., Chepenik K.P., Waldman S.A. (2000): Guanylyl cyclases and signaling by cyclic GMP. Pharmacol. Rev., 52:375-413

14. Orbo A., Jaeger R., Sager G. 1998. Urinary levels of cyclic guanosine monophosphate (cGMP) in patients with cancer of the uterine cervix: a valuable prognostic factor in clinical outcome? Eur. J. Caner, 34: 1460-1462

15. Patel T.B., Du Z., Pierre S., Cartin L., Scholich K. 2001. Molecular biological approaches to unraveal adenylyl cyclase signaling and function. Gene, 269: 13-25

16. Peracchi M., Lombardi L., Maiolo A.T., Bamonti-Catena F., Tschi V., Chiorboli O., Mozzana R, Polli E.E. 1983. Plasma and urine cyclic nucleotide levels in patients with acute and chronic leukemia. Blood, 61: 429-433

PL 195 751 B1

17. Soderling S.H., Beavo J. A. (2000): Regulation of cAMP and cGMP signaling: new phosphodiesterase and new functions. Curr. Opinion Cell Biol., 12: 174-179

18. Steiner A.L., Parker C.W., Kipnis D.M. 1972. Radioimmunoassay for cyclic nucleotides. I. Preparation of antibodies and iodinated cyclic nucleotides. J. Biol. Chem., 217: 1106- 1113

19. Tsutamoto T., Wada A., Maeda K., Hisanaga T., Maeda Y., Fukai D., Ohnishi M., Sugimoto Y., Kinoshita M. (1997): Attenuation of compensation of endogenous cardiac natriuretic peptide system in chronic heart failure: prognostic role of plasma brain natriuretic peptide concentration in patients with chronic symptomatic left ventricular dysfunction. Circulation 15, 96:509-516

20. Tsugawa M., lida S., Fujii H., Moriwaki K., Tarui S. 1990. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for adenosine 3',5'-cyclic monophosphate (cAMP) in human plasma and urine using monoclonal antibody. J. Immunoassay, 11: 49-61

21. Wróblewska H., Gorczyca W.A. 2001. Fosfodiesterazy cGMP. Post. Hig. Med. Dośw., 55:611-627.

Claims (4)

1. Sposób otrzymywania monospecyficznych przeciwciał przeciwko 3',5'-cyklicznemu monofosforanowi nukleozydu zasady purynowej, znamienny tym, że otrzymuje się koniugat wybranego 3',5'cyklicznego monofosforanu nukleozydu zasady purynowej z białkiem nośnikowym, prowadzi się immunizację zwierzęcia z wykorzystaniem tego koniugatu, następnie otrzymuje się surowicę zwierzęcia poddanego uprzednio immunizacji i oczyszcza się ją techniką chromatografii powinowactwa na absorbencie zawierającym immobilizowany koniugat białka nośnikowego z 3',5'-cyklicznym monofosforanem nukleozydu zasady purynowej innej niż zawarta w koniugacie zastosowanym do immunizacji, i uzyskuje się monospecyficzne przeciwciała przeciwko wybranemu 3',5'-cyklicznemu monofosforanowi nukleozydu zasady purynowej, które zawarte są we frakcji niezatrzymanej na absorbencie, przy czym korzystnie jako białko nośnikowe stosuje się albuminę surowicy ludzkiej albo HSA.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dla otrzymywania monospecyficznych przeciwciał przeciwko cAMP prowadzi się immunizację z wykorzystaniem koniugatu zawierającego cAMP i oczyszczanie chromatograficzne na nośniku zawierającym koniugat zawierający cGMP.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dla otrzymywania monospecyficznych przeciwciał przeciwko cGMP prowadzi się immunizację z wykorzystaniem koniugatu zawierającego cGMP i oczyszczanie chromatograficzne na nośniku zawierającym koniugat zawierający cAMP.

4. Zastosowanie monospecyficznych przeciwciał przeciwko 3',5'-cyklicznemu monofosforanowi nukleozydu zasady purynowej do otrzymywania testu do badania poziomu 3',5'-cyklicznego monofosforanu nukleozydu.