PL192572B1 - Sposób wytwarzania systemów dwufazowych na bazie pochodnych skrobi kopolimerów winylowych, przeznaczonych do oczyszczania białek, enzymów i wirusów - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania systemów dwufazowych na bazie pochodnych skrobi i kopolimerów winylowych, przeznaczonych do oczyszczania białek, enzymów i wirusów, znamienny tym, że jako polimery tworzące fazy stosuje się akryloamidowe pochodne skrobi otrzymane w wyniku degradacji skrobi za pomocą NaOH w ilości 5-25% wagowych w temperaturze 85-95°C i w czasie 2-6 godzin, a następnie produkt tej reakcji przereagowuje się z akryloamidem w ilości 5-50% wagowych w stosunku do skrobi, w temperaturze 45-55°C w ciągu 90-180 minut oraz kopolimer winyloimidazolu z winylokaprolaktamem.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania systemów dwufazowych na bazie pochodnych skrobi i kopolimerów winylowych, przeznaczonych do oczyszczania białek, enzymów i wirusów, zwłaszcza inhibitora a-amylazy i inhibitora trypsyny.

Burzliwy rozwój materiałów polimerowych w XX w. był jedną z ważniejszych przyczyn rozwoju wszystkich najnowocześniejszych gałęzi nauki i technologii takich jak: przemysł kosmiczny, jądrowy, nowoczesne środki transportu, mikroelektronika, budownictwo, gospodarstwo domowe itd. Negatywnym jednak aspektem produkcji tysięcy ton materiałów polimerowych stało się zanieczyszczenie przez nie środowiska naturalnego. Szczególnie uciążliwy stał się problem utylizacji odpadów tworzyw sztucznych.

Ta niekorzystna wada polimerów w połączeniu z efektem tzw. zielonej rewolucji spowodowała wzrost zainteresowania polimerami pochodzenia naturalnego.

Skrobia jest naturalnym, tanim, odnawialnym i przyjaznym dla środowiska polimerem.

Występuje ona w postaci ziaren zbudowanych z wielkocząsteczkowej substancji węglowodanowej. W skład ziaren wchodzi trudnopęczniejąca w wodzie otoczka amylopektyna -ok. 80%, wewnątrz której ułożona jest warstwami rozpuszczalna w wodzie amyloza -ok. 20%.

Skrobia znajduje szerokie zastosowanie w gospodarce narodowej oraz gospodarstwie domowym. Największe jej ilości zużywa przemysł papierniczy, spożywczy i tekstylny.

Jest ona składnikiem niektórych materiałów izolacyjnych w budownictwie, klejów, flokulantów, materiałów ceramicznych i wybuchowych, leków, kosmetyków itp.

W części zastosowań, wykorzystując jej naturalne właściwości tworzenia żeli i zagęszczania, jest używana w formie naturalnej, w większości jednak przypadków stosowana jest w postaci przetworzonej.

Niedawno odkryto możliwość zastosowania polimerów skrobiowych w biotechnologii do oczyszczania różnych substancji jak enzymów, białek, a także wirusów stosując technikę systemów dwufazowych.

Wodne systemy dwufazowe znalazły szerokie zastosowanie w biochemicznych badaniach naukowych dotyczących rozdziału i oczyszczania makromolekuł, komórek i cząstek komórek. W ostatnich latach znalazły one również zastosowania w różnych gałęziach biotechnologii. Powyższe systemy fazowe zostały użyte w dużej skali do oczyszczania enzymów, interferonu, oczyszczaniu koligacyjnym, zastosowaniach analitycznych i biokonwersji ekstrakcyjnej.

Wodne systemy dwufazowe otrzymuje się przez łączenie dwóch wodnych roztworów polimerów, różniących się ich strukturą chemiczną lub przez dodatek stężonych, wodnych roztworów soli nieorganicznych do roztworu polimeru. Małe różnice we właściwościach fizyko-chemicznych faz powodują preferencyjny rozdział oczyszczanych substancji między tymi fazami.

Dla celów rozdziału substancji w laboratorium użyto z doskonałym skutkiem systemów typu polimer-polimer szczególnie tych zawierających frakcjonowany dextran i glikol polietylenowy (PEG). Do wyodrębniania enzymów w dużej skali używa się niedrogich systemów PEG-sól. Ten wybór został podyktowany czynnikami ekonomicznymi z powodu wysokich kosztów frakcjonowanego dextranu (produkowanego przez bakterie). Jednakże właściwości systemów PEG-sól silnie ograniczają ich użyteczność dla zastosowań w biotechnologii głównie z powodu dużego stężenia soli. Systemy polimer-polimer są generalnie dużo bardziej użyteczne i pozwalają na prowadzenie procesów przy niskim stężeniu soli.

Inhibitor a-amylazy ma ogromne znaczenie w medycynie, gdyż hamuje reakcję hydrolizy skrobi, zawartej w pożywieniu, do glukozy. Hydroliza ta następuje za pośrednictwem enzymu amylazy, którą inhibitor ma za zadanie zdezaktywować. Przyczynia się on więc do kontroli poziomu cukrów we krwi u osób chorych na cukrzycę i nie dopuszcza do zbyt wielkiego jego wzrostu. Problem cukrzycy dotyczy szerokich mas społeczeństwa na całym świecie, więc każde rozwiązanie zmierzające w kierunku obniżenia kosztów wytwarzania inhibitora a-amylazy wydaje się być niezwykle ważne.

Dotychczasowe rozwiązania zmierzające w kierunku otrzymywania systemów dwufazowych mogących znaleźć zastosowanie w biotechnologii opierają się na zastosowaniu dextranu - polimeru naturalnego powstającego przy udziale bakterii.

W pracach ujawnionych w publikacjach Albertsson P., Partition of Cell Particles and Macromolecules, 2nd Edn, Almqvist &Wiksell, Stockholm, (1971), Albertsson P., Andersson B., Larsson C., Akerlund H., Methods Biochem. Anal., 28, 115-150, (1981), Veide A., Smeds A., Enfors S., Biotechnol

PL 192 572 B1

Bioeng., 25, 1789-1800, (1983) dextran wraz z glikolem polietylenowym bądź podobnym polimerem używano do otrzymywania systemów dwufazowych do oczyszczania białek, enzymów i wirusów.

Wadą frakcjonowanego dextranu jest jego wysoki koszt, co uniemożliwia zastosowanie go w większej skali. Surowy dextran tworzy roztwory o zbyt dużej lepkości, których nie można użyć do tworzenia systemów dwufazowych ze względu na zbyt długi czas rozdziału faz takich systemów.

Okazało się, że powyższych wad można uniknąć i uzyskać nowego typu polimery naturalne na bazie modyfikowanej skrobi.

Sposób wytwarzania systemów dwufazowych na bazie pochodnych skrobi i kopolimerów winylowych, polega na tym, że jako polimery tworzące fazy stosuje się akryloamidowe pochodne skrobi oraz kopolimer winylowy. Jako polimer tworzący dolną fazę systemu stosuje się akryloamidową pochodną skrobi otrzymywaną w wyniku degradacji skrobi za pomocą NaOH w ilości 5-25% wagowych w temperaturze 85-95°C i w czasie 2-6 godzin, a następnie produkt tej reakcji przereagowuje się z akryloamidem w ilości 5-50% wagowych w stosunku do skrobi, w temperaturze 45-55°C w ciągu 90-180 minut. Jako polimer tworzący górną fazę systemu stosuje się korzystnie kopolimer winyloimidazolu z winylokaprolaktamem, ewentualnie wzbogacony w miedź przez przyłączenie 5-30 kropli (0,2784 g-1,6704 g) 0,1 M CuSO4 do 20 g 20% roztworu kopolimeru winyloimidazolu z winylokaprolaktamem. Systemy dwufazowe otrzymuje się mieszając 10-20% roztwory powyższych polimerów w różnych stosunkach wagowych w obecności 0,1-1% NaCl.

Nowe akryloamidowe pochodne skrobi są tanie, dobrze rozpuszczalne w wodzie (20-40%) i tworzą roztwory o niskiej lepkości. Stosunkowo łatwo tworzą systemy dwufazowe, szczególnie w obecności NaCl, z wieloma polimerami m.in. glikolem polietylenowym, kopolimerami winyloimidazolu (VI) z winylokaprolaktamem (VCL). Czas rozdziału obu faz takich systemów jest idealny i wynosi od 0,5 do 6 godz.

Określenie S/AA - oznacza stosunek wagowy skrobi do akryloamidu.

Przedmiot wynalazku jest zilustrowany na przykładach jego wykonania, które jednak nie ograniczają jego zakresu.

Przykład I.

- Synteza kopolimeru Cu(Il)-VI/VCL=10/90

Do 20 g 20% roztworu kopolimeru VI/VCL=10/90 dodano, podczas intensywnego mieszania w temp. pokojowej, 20 kropli (1,1136 g) 0,1 M CuSO4. Po 30 minutach, nie związany CuSO4 usunięto metodą dializy. W ten sposób otrzymano 18% roztwór kopolimeru Cu(II)-VI/VCL=10/90, który użyto do tworzenia systemów dwufazowych z APS.

- Synteza akryloamidowych pochodnych skrobi (APS).

W kolbie trójszyjnej o poj. 250 ml z mieszadłem, chłodnicą zwrotną i termometrem zmieszano 20 g skrobi i 180 g wody. Mieszaninę ogrzano do temp. 85°C, w której nastąpiło jej spęcznienie i zżelowanie. Następnie w trakcie silnego mieszania, wkroplono wodny 40% roztwór NaOH (3,75 g NaOH w 5,6 g wody). Temperaturę mieszaniny reakcyjnej podniesiono do 90°C i mieszaninę tę utrzymywano w tej temperaturze jeszcze przez 4 godz. Po tym czasie, zawartość kolby ochłodzono do temp. 48°C i wprowadzono do niej 50% wodny roztwór akryloamidu (3,75 g akryloamidu w 3,75 g wody dla próbki S/AA=80/15 lub 15 g akryloamidu w 15 g wody dla próbki S/AA=80/60). Całość utrzymywano w temp. 48°C w ciągu 2 godz. Po tym czasie produkt reakcji zneutralizowano przy pomocy 10-15% HCldo pH 7 i oczyszczono przez wytrącenie w 4000 ml metanolu. Wytrącony a następnie wysuszony polimer ponownie rozpuszczono w 180 g wody, dodano 3 g NaCl i jeszcze raz wytrącono w 4000 ml metanolu. Tak oczyszczony produkt wysuszono w temp. 80°C. Następnie sporządzono z niego 20% roztwór wodny, który użyto do otrzymywania systemów dwufazowych.

- Przygotowanie systemu dwufazowego do rozdziału białek.

Jeden gram 18% wodnego roztworu kopolimeru Cu(II)-VI/VCL=10/90 zmieszano z 1g 10% roztworu kopolimeru S/AA=80/60, zawierającego 1% NaCl. Do tak otrzymanej mieszaniny dodano 100 ml próbki ekstraktu inhibitora a-amylazy z mąki pszennej oraz 200 ml 0,5% roztworu NaCl. Całość intensywnie zmieszano i pozostawiono do rozdziału faz na okres ok. 4 godz.

Przykład II.

- Synteza kopolimeru Cu(II)-VI/VCL=10/90

Do 20 g 20% roztworu kopolimeru Vl/VCL=10/90 dodano, podczas intensywnego mieszania w temp. pokojowej, 30 kropli (1,6704 g) 0,1 M CuSO4. Po 30 minutach, nie związany CuSO4 usunięto metodą dializy. W ten sposób otrzymano 18% roztwór kopolimeru Cu(II)-VI/VCL=10/90, który użyto do tworzenia systemów dwufazowych z APS.

PL 192 572 B1

- Synteza akryloamidowych pochodnych skrobi (APS).

W kolbie trójszyjnej o poj. 250 ml z mieszadłem, chłodnicą zwrotną i termometrem zmieszano 20 g skrobi i 180 g wody. Mieszaninę ogrzano do temp. 85°C, w której nastąpiło jej spęcznienie i zżelowanie. Następnie w trakcie silnego mieszania, wkroplono wodny 40% roztwór NaOH (3,75 g NaOH w 5,6 g wody). Temperaturę mieszaniny reakcyjnej podniesiono do 90 °C i mieszaninę tę utrzymywano w tej temperaturze jeszcze przez 3 godz. Po tym czasie, zawartość kolby ochłodzono do temp. 50°C i wprowadzono do niej 50% wodny roztwór akryloamidu (3,75 g akryloamidu w 3,75 g wody dla próbki S/AA=80/15 lub 15 g akryloamidu w 15 g wody dla próbki S/AA=80/60). Całość utrzymywano w temp. 50°C w ciągu 1,5 godz. Po tym czasie produkt reakcji zneutralizowano przy pomocy 10-15% HCl do pH 7 i oczyszczono przez wytrącenie w 4000 ml metanolu. Wytrącony a następnie wysuszony polimer ponownie rozpuszczono w 180 g wody, dodano 3 g NaCl i jeszcze raz wytrącono w 4000 ml metanolu. Tak oczyszczony produkt wysuszono w temp. 80°C. Następnie sporządzono z niego 20% roztwór wodny, który użyto do otrzymywania systemów dwufazowych.

- Przygotowanie systemu dwufazowego do rozdziału białek.

Dwa gramy 18% wodnego roztworu kopolimeru Cu(II)-VT/VCL=10/90 zmieszano z 1 g 10% roztworu kopolimeru S/AA=80/60, zawierającego 1,5% NaCl. Do tak otrzymanej mieszaniny dodano 200 ml próbki ekstraktu inhibitora a-amylazy z mąki pszennej oraz 100 ml 0,5% roztworu NaCl.

Całość intensywnie zmieszano i pozostawiono do rozdziału faz na okres ok. 4 godz.

P r z y k ł a d III.

- Synteza kopolimeru Cu(II)-VI/VCL=10/90

Do 20 g 20% roztworu kopolimeru VI/VCL=10/90 dodano, podczas intensywnego mieszania w temp. pokojowej, 20 kropli (1,1136 g) 0,1 M CuSO4. Po 30 minutach, nie związany CuSO4 usunięto metodą dializy. W ten sposób otrzymano 18% roztwór kopolimeru Cu(II)-VI/VCL=10/90, który użyto do tworzenia systemów dwufazowych z APS.

- Synteza akryloamidowych pochodnych skrobi (APS).

W kolbie trójszyjnej o poj. 250 ml z mieszadłem, chłodnicą zwrotną i termometrem zmieszano 20 g skrobi i 180 g wody. Mieszaninę ogrzano do temp. 85°C, w której nastąpiło jej spęcznienie i zżelowanie. Następnie w trakcie silnego mieszania, wkroplono wodny 40% roztwór NaOH (3,75 g NaOH w 5,6 g wody). Temperaturę mieszaniny reakcyjnej utrzymywano w tej temperaturze jeszcze przez 6 godz.

Po tym czasie, zawartość kolby ochłodzono do temp. 45°C i wprowadzono do niej 50% wodny roztwór akryloamidu (3,75 g akryloamidu w 3,75 g wody dla próbki S/AA=80/15 lub 15 g akryloamidu w 15 g wody dla próbki S/AA=80/60). Całość utrzymywano w temp. 45°C w ciągu 2 godz. Po tym czasie produkt reakcji zneutralizowano przy pomocy 10-15% HCl do pH 7 i oczyszczono przez wytrącenie w 4000 ml metanolu. Wytrącony a następnie wysuszony polimer ponownie rozpuszczono w 180 g wody, dodano 3 g NaCl i jeszcze raz wytrącono w 4000 ml metanolu. Tak oczyszczony produkt wysuszono w temp. 80°C. Następnie sporządzono z niego 20% roztwór wodny, który użyto do otrzymywania systemów dwufazowych.

- Przygotowanie systemu dwufazowego do rozdziału białek.

Jeden gram 18% wodnego roztworu kopolimeru Cu(II)-VI/VCL=10/90 zmieszano z 2 g 10% roztworu kopolimeru S/AA=80/60, zawierającego 0,67% NaCl. Do tak otrzymanej mieszaniny dodano 100 ml próbki ekstraktu inhibitora trypsyny oraz 200 ml 0,5% roztworu NaCl.

Całość intensywnie zmieszano i pozostawiono do rozdziału faz na okres ok. 5 godz.

P r z y k ł a d IV.

- Synteza kopolimeru Cu(II)-VI/VCL=10/90

Do 20 g 20% roztworu kopolimeru VI/VCL=10/90 dodano, podczas intensywnego mieszania w temp. pokojowej, 25 kropli (1,392 g) 0,1 M CuSO4. Po 30 minutach, nie związany CuSO4 usunięto metodą dializy. W ten sposób otrzymano 18% roztwór kopolimeru Cu(II)-VI/VCL=10/90, który użyto do tworzenia systemów dwufazowych z APS.

- Synteza akryloamidowych pochodnych skrobi (APS).

W kolbie trójszyjnej o poj. 250 ml z mieszadłem, chłodnicą zwrotną i termometrem zmieszano 20 g skrobi i 180 g wody. Mieszaninę ogrzano do temp. 85°C, w której nastąpiło jej spęcznienie i zżelowanie. Następnie w trakcie silnego mieszania, wkroplono wodny 40% roztwór NaOH (3,75 g NaOH w 5,6 g wody). Temperaturę mieszaniny reakcyjnej podniesiono do 90°C i mieszaninę tę utrzymywano w tej temperaturze jeszcze przez 4 godz. Po tym czasie, zawartość kolby ochłodzono do temp. 50°C i wprowadzono do niej 50% wodny roztwór akryloamidu (3,75 g akryloamidu w 3,75 g wody dla

PL 192 572 B1 próbki S/AA=80/15 lub 15 g akryloamidu w 15 g wody dla próbki S/AA=80/60). Całość utrzymywano w temp. 50°C w ciągu 2 godz. Po tym czasie produkt reakcji zneutralizowano przy pomocy 10-15% HCl do pH 7 i oczyszczono przez wytrącenie w 4000 ml metanolu. Wytrącony, a następnie wysuszony polimer ponownie rozpuszczono w 180 g wody, dodano 3 g NaCl i jeszcze raz wytrącono w 4000 ml metanolu. Tak oczyszczony produkt wysuszono w temp. 80°C. Następnie sporządzono z niego 20% roztwór wodny, który użyto do otrzymywania systemów dwufazowych.

- Przygotowanie systemu dwufazowego do rozdziału białek.

Jeden gram 18% wodnego roztworu kopolimeru Cu(II)-VI/VCL=10/90 zmieszano z 1g 10% roztworu kopolimeru S/AA=80/15, zawierającego 1% NaCl. Do tak otrzymanej mieszaniny dodano 100 ml próbki ekstraktu inhibitora a-amylazy z mąki pszennej oraz 200 ml 0,5% roztworu NaCl. Całość intensywnie zmieszano i pozostawiono do rozdziału faz na okres ok. 4 godz.

Przykład V.

- Synteza kopolimeru Cu(II)-Vl/VCL=10/90

Do 20 g 20% roztworu kopolimeru VI/VCL=10/90 dodano, podczas intensywnego mieszania w temp. pokojowej, 20 kropli (1,1136 g) 0,1 M CuSO4. Po 30 minutach, nie związany CuSO4 usunięto metodą dializy. W ten sposób otrzymano 18% roztwór kopolimeru Cu(II)-VI/VCL=10/90, który użyto do tworzenia systemów dwufazowych z APS.

- Synteza akryloamidowych pochodnych skrobi (APS).

W kolbie trójszyjnej o poj. 250 ml z mieszadłem, chłodnicą zwrotną i termometrem zmieszano 20 g skrobi i 180 g wody. Mieszaninę ogrzano do temp. 85°C, w której nastąpiło jej spęcznienie i zżelowanie. Następnie w trakcie silnego mieszania, wkroplono wodny 40% roztwór NaOH (3,75 g NaOH w 5,6 g wody). Temperaturę mieszaniny reakcyjnej podniesiono do 90°C i mieszaninę tę utrzymywano w tej temperaturze jeszcze przez 4 godz. Po tym czasie, zawartość kolby ochłodzono do temp. 48°C i wprowadzono do niej 50% wodny roztwór akryloamidu (3,75 g akryloamidu w 3,75 g wody dla próbki S/AA=80/15 lub 15 g akryloamidu w 15 g wody dla próbki S/AA=80/60). Całość utrzymywano w temp. 48°C w ciągu 2 godz. Po tym czasie produkt reakcji zneutralizowano przy pomocy 10-15% HCldo pH 7 i oczyszczono przez wytrącenie w 4000 ml metanolu. Wytrącony, a następnie wysuszony polimer ponownie rozpuszczono w 180 g wody, dodano 3 g NaCl i jeszcze raz wytrącono w 4000 ml metanolu. Tak oczyszczony produkt wysuszono w temp. 80°C. Następnie sporządzono z niego 20% roztwór wodny, który użyto do otrzymywania systemów dwufazowych.

- Przygotowanie systemu dwufazowego do rozdziału białek.

Jeden gram 18% wodnego roztworu kopolimeru Cu(lT)-VI/VCL=10/90 zmieszano z 1 g 10% roztworu kopolimeru S/AA=80/15, zawierającego 1% NaCl. Do tak otrzymanej mieszaniny dodano 100 ml próbki ekstraktu inhibitora trypsyny oraz 200 ml 0,5% roztworu NaCl. Całość intensywnie zmieszano i pozostawiono do rozdziału faz na okres ok. 5 godz.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania systemów dwufazowych na bazie pochodnych skrobi i kopolimerów winylowych, przeznaczonych do oczyszczania białek, enzymów i wirusów, znamienny tym, że jako polimery tworzące fazy stosuje się akryloamidowe pochodne skrobi otrzymane w wyniku degradacji skrobi za pomocą NaOH w ilości 5-25% wagowych w temperaturze 85-95°C i w czasie 2-6 godzin, a następnie produkt tej reakcji przereagowuje się z akryloamidem w ilości 5-50% wagowych w stosunku do skrobi, w temperaturze 45-55°C w ciągu 90-180 minut oraz kopolimer winyloimidazolu z winylokaprolaktamem.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako polimer tworzący górną fazę systemu stosuje się kopolimer winyloimidazolu z winylokaprolaktamem wzbogacony w miedź otrzymywany przez przyłączenie 5-30 kropli (0,2784 g-1,6704g) 0,1 M CuSO4 do 20 g 20% roztworu kopolimeru winyloimidazolu z winylokaprolaktamem.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że systemy dwufazowe otrzymuje się mieszając 10-20% roztwory powyższych polimerów w różnych stosunkach wagowych w obecności 0,1-1% NaCl.