PL192283B1

PL192283B1 - Method of obtaining a lysozyme salt preparation

Info

Publication number: PL192283B1
Application number: PL330853A
Authority: PL
Inventors: Wiesław Kopeć; Józefa Chrzanowska; Krystyna Karkoszka; Jolanta Lorenc; Antoni Polanowski; Teresa Szałak; Tadeusz Trziszka
Original assignee: Zaklady Jajczarskie Ovopol Sp
Priority date: 1999-01-13
Filing date: 1999-01-13
Publication date: 2006-09-29
Also published as: PL330853A1

Abstract

1. Sposób otrzymywania preparatu soli lizozymu z białka jaja, zwłaszcza kurzego w trakcie krystalizacji w stężonych roztworach NaCl, znamienny tym, że białko poddane jest adsorpcji prowadzonej na wymieniaczu jonowym o pH zbliżonym do pH białka, przy czym białko to może być rozcieńczone a proces adsorpcji przebiega przy utrzymaniu stosunku wagowego suchego wymieniacza jonowego do białka lub jego roztworu od 1 : 10 do 1 : 3 a po procesie adsorpcji białko jaja jest oddzielane od złoża wymieniacza i dalej prowadzony jest proces desorpcji roztworami soli o stężeniu od 0,2 M do 2,0 M przy zastosowaniu buforu fosforanowego o pH od 8,0 do 9,5 a następnie tak uzyskany roztwór jest zagęszczany przy ustaleniu pH w roztworze desorpcyjnym na poziomie od 3,5 do 7,0 a nadmiar soli jest usuwany do uzyskania jej stężenia co najwyżej 0,25 M.1. The method of obtaining lysozyme salt preparation from egg white, especially chicken in progress crystallization in concentrated NaCl solutions, characterized in that the protein is subjected to guided adsorption on an ion exchanger having a pH close to that of the protein, whereby the protein may be diluted and the adsorption process takes place while maintaining the weight ratio of dry exchanger ion to protein or its solution from 1: 10 to 1: 3 and after the adsorption process, the egg white is separated from the exchanger bed and further the desorption process is carried out with salt solutions with a concentration from 0.2 M to 2.0 M using a phosphate buffer with a pH of 8.0 to 9.5 and then so obtained the solution is concentrated by adjusting the pH in the desorption solution to a pH of 3.5 to 7.0 and excess salt is removed to a concentration of 0.25M or less.

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania preparatu soli lizozymu, szczególnie chlorku, z białka jaja, zwłaszcza kurzego, który ma zastosowanie w przemyśle spożywczym jako konserwant, np. w produkcji serów dojrzewających oraz przetworów mięsnych itp. oraz w przemyśle farmaceutycznym jako naturalny środek bakteriostatyczny.The subject of the invention is a method of obtaining a preparation of lysozyme salts, especially chloride, from egg white, especially chicken, which is used in the food industry as a preservative, e.g. in the production of ripened cheeses and meat preparations, etc., and in the pharmaceutical industry as a natural bacteriostatic agent.

Do chwili obecnej znane metody otrzymywania lizozymu polegają na jego krystalizacji w stężonych roztworach soli lub adsorpcji na nośnikach jonowo wymiennych, tak jak opisano to w patencie USA nr 3515643. Według tego patentu lizozym z białka jaja uzyskuje się w czasie kontaktu białka jaja ze złożem słabo kwaśnego wymieniacza jonowego, którego pH wynosi od 6,4 do 6,5. Proces ten przebiega w temperaturze pokojowej, to jest około 25°C, lecz najkorzystniejsze efekty uzyskiwane są w temperaturach od 0°C do 5°C. W dalszej kolejności złoże jest oddzielane od białka jaja, a następnie przemywane roztworem soli o stężeniu nie większym niż 0,2 M i pH nie wyższym niż 7,0, korzystnie od 6,2 do 6,8 w celu usunięcia ze złoża białek innych niż lizozym. Kolejny etap polega na desorpcji lizozymu ze złoża w wyniku przemywania roztworem soli o stężeniu większym niż w roztworze użytym do wymycia innych białek. Następnie przeprowadza się precypitację lizozymu poprzez dalsze zwiększenie stężenia soli w roztworze.Until now, known methods for the preparation of lysozyme consist of its crystallization in concentrated salt solutions or adsorption on ion exchange carriers, as described in US Patent No. 3,515,643. ion exchanger, the pH of which is from 6.4 to 6.5. This process takes place at room temperature, i.e. around 25 ° C, but the best results are obtained at temperatures between 0 ° C and 5 ° C. Thereafter, the bed is separated from the egg white, and then washed with a salt solution of no more than 0.2 M and a pH of no more than 7.0, preferably from 6.2 to 6.8, in order to remove proteins other than lysozyme. The next step consists in desorbing lysozyme from the bed as a result of washing with a salt solution with a concentration higher than in the solution used to wash out other proteins. The lysozyme is then precipitated by further increasing the salt concentration in the solution.

Mając na względzie stosowanie środków technicznych w postaci prostych i stosunkowo tańszych urządzeń od ogólnie stosowanych do otrzymywania lizozymu oraz chcąc uniknąć konieczności zmiany kwasowości czynnej białka jaja przeznaczonego do dalszego przetwórstwa a także zwiększenie ilości aktywnego lizozymu odzyskiwanego z białka opracowano poniższy sposób.Taking into account the use of technical means in the form of simple and relatively cheaper devices than those generally used for the production of lysozyme, and in order to avoid the need to change the active acidity of the egg white intended for further processing, and to increase the amount of active lysozyme recovered from the protein, the following method was developed.

Istotę wynalazku stanowi sposób otrzymywania preparatu soli lizozymu z białka jaja. Polega on na tym, że białko jaja poddane jest adsorpcji, która prowadzona jest na wymieniaczu jonowym o pH zbliżonym do pH białka, czyli o pH 7,5 do 9,6, najkorzystniej od 8,5 do 9,2. Białko jaja przed procesem adsorpcji może być rozcieńczone wodą lub roztworem soli, korzystnie 0,15 M roztworem NaCl, przy czym stosunek białka do rozcieńczalnika wynosi maksymalnie 1:5. Proces ten powinien przebiegać przy utrzymaniu stosunku wagowego suchego wymieniacza jonowego do białka jaja lub jego roztworu od 1: 10 do 1 : 3. Po procesie adsorpcji lizozymu białko jaja jest oddzielane od złoża wymieniacza jonowego, który następnie jest przemywany wodą. Po zakończeniu przemywania przeprowadza się proces desorpcji lizozymu ze złoża roztworami soli o stężeniu od 0,2 M do 2,0 M, najlepiej od 1,0 M do 2,0 M, przy czym korzystnym jest stosowanie roztworu chlorku sodu w buforze fosforanowym o pH od 8,0 do 9,5. W procesie desorpcji lizozym przechodzi do roztworu soli, który jest zagęszczany metodą ultrafiltracji membranowej do uzyskania od 10% do 50% wyjściowej objętości. Nadmiar soli jest oddializowywany z zagęszczonego roztworu zawierającego lizozym do stężenia, co najwyżej 0,25 M, a najkorzystniej poniżej 0,05 M. Wartość pH w zagęszczonym roztworze ustalana jest na poziomie 3,5 do 7,0, korzystnie od 3,5 do 4,5.The essence of the invention is a method of obtaining a lysozyme salt preparation from egg white. It consists in the fact that the egg white is subjected to adsorption, which is carried out on an ion exchanger with a pH close to the protein's pH, i.e. at a pH of 7.5 to 9.6, most preferably from 8.5 to 9.2. The egg white before the adsorption process may be diluted with water or a saline solution, preferably 0.15 M NaCl solution, the ratio of protein to diluent being maximally 1: 5. This process should be carried out while maintaining the weight ratio of dry ion exchanger to egg white or its solution from 1: 10 to 1: 3. After the lysozyme adsorption process, the egg white is separated from the ion exchanger bed, which is then washed with water. After washing, the lysozyme desorption process from the bed is carried out with 0.2 M to 2.0 M salt solutions, preferably from 1.0 M to 2.0 M, with a preferred solution of sodium chloride in phosphate buffer at pH from 8.0 to 9.5. In the desorption process, lysozyme passes into the salt solution, which is concentrated by membrane ultrafiltration to obtain from 10% to 50% of the original volume. The excess salt is dialyzed from the lysozyme-containing concentrated solution to a concentration of 0.25M or less, most preferably less than 0.05M. The pH of the thickened solution is adjusted to 3.5 to 7.0, preferably 3.5 to 4.5.

Sposób według wynalazku pozwala na uzyskanie preparatu lizozymu z zastosowaniem prostych i tanich rozwiązań technicznych i urządzeń służących do tego celu. Preparat wytworzony według wynalazku ma zastosowanie w przemyśle spożywczym jako dodatek o działaniu bakteriostatycznym zapewniający utrzymanie cen produktów finalnych na znacznie niższym poziomie niż przy stosowaniu lizozymu o czystości wymaganej w przemyśle farmaceutycznym.The method according to the invention makes it possible to obtain a lysozyme preparation using simple and cheap technical solutions and devices for this purpose. The preparation produced according to the invention is used in the food industry as an additive with a bacteriostatic effect ensuring that the prices of final products are kept at a much lower level than when using lysozyme with the purity required in the pharmaceutical industry.

Sposób otrzymywania preparatu soli lizozymu z białka jaja pokazano w poniższych przykładach wykonania.The method of obtaining the lysozyme salt preparation from egg white is shown in the following examples.

Przykład 1Example 1

Białko jaja o objętości 100 cm³ i o aktywności lizozymu 120.000 w jedn./cm³ (jednostki aktywności wobec Micrococcus lysodeikticus) mieszano przy użyciu magnetycznego mieszadła laboratoryjnego przez 30 min. z wymieniaczem jonowym Amberlite IRC50 równoważonym uprzednio 0,05 M roztworem Na2HPO4 o pH 9,2 w ilości odpowiadającej 20 g suchego wymieniacza. Następnie białko zlewano znad złoża, które przemyto 100 cm³ wody. W dalszej kolejności prowadzono wymywanie lizozymu 100 cm³2,0 M roztworu NaCl w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 9,2, ciągle mieszając przez dalsze 30 min. Odzysk lizozymu w roztworze wyliczony na podstawie aktywności wyniósł 86% ±4%.Egg protein with a volume of 100 cm ³ and a lysozyme activity of 120,000 ^{units / cm 3} (units of activity against Micrococcus lysodeikticus) was mixed using a magnetic laboratory stirrer for 30 min. with Amberlite IRC50 ion exchanger previously equilibrated with 0.05 M Na2HPO4 solution at pH 9.2 in an amount corresponding to 20 g of dry exchanger. The protein was then decanted from above the bed, which was washed with 100 cm ^{3 of} water. Subsequently, the lysozyme was eluted with 100 cm ^{3 of a} 2.0 M NaCl solution in 0.1 M phosphate buffer, pH 9.2, with continuous stirring for a further 30 min. The recovery of lysozyme in the solution, calculated on the basis of activity, was 86% ± 4%.

Przykład 2 ₃ Example 2 ₃

Białko jaja o objętości 2 dm³ poddano procesowi adsorpcji ciągłej przez pięciokrotną recyrkulacje przez 30 min. na złożu Duolite C-464 (200 g w przeliczeniu na suchy wymieniacz) równoważonym wcześniej 0,05 M buforem fosforanowym o pH 6,5. Proces adsorpcji prowadzono w zamkniętym reaktorze wyposażonym w mieszadło, którego konstrukcja umożliwiała utrzymanie złoża w komorze reakPL 192 283 B1 tora. Recyrkulacja białka była wywołana przez działanie pompy obiegowej lub obniżenie ciśnienia w układzie. Po absorpcji złoże było przemywanie w sposób ciągły 2 dm³ wody przez 15 min., a następnie prowadzony był proces desorpcji 2 M roztworem NaCl w 0,1 M roztworze Na2HPO4 o pH 9,2. Desorpcja trwała 30 min. Odzysk lizozymu po desorpcji wynosił 72%±6%.Egg white with a volume of 2 dm ³ was subjected to continuous adsorption process by recirculation five times for 30 minutes. on Duolite C-464 (200 g as dry exchanger) previously equilibrated with 0.05 M phosphate buffer at pH 6.5. The adsorption process was carried out in a closed reactor equipped with a stirrer, the structure of which allowed to keep the bed in the reactor chamber. Protein recirculation was triggered by the operation of the circulating pump or by depressurization of the system. After absorption, the bed was continuously washed with 2 dm ^{3 of} water for 15 minutes, and then the desorption process was carried out with 2 M NaCl solution in 0.1 M Na2HPO4 solution at pH 9.2. The desorption took 30 minutes. The recovery of lysozyme after desorption was 72% 6%.

Przykład 3Example 3

Proces izolacji lizozymu był prowadzony jak w przykładzie drugim, z tą różnicą, że adsorpcji było poddawane białko jaja rozcieńczone wodą w stosunku 1 :4 (obj. : obj.). Odzysk lizozymu w roztworze desorpcyjnym wynosił 84% ±3%.The lysozyme isolation process was carried out as in the second example, with the difference that the adsorption was carried out on egg white diluted with water in the ratio 1: 4 (v: v). The recovery of lysozyme in the desorption solution was 84% ± 3%.

Przykład 4 ₃ Example 4 ₃

Białko jaja o objętości 25 dm³ poddano procesowi adsorpcji ciągłej w reaktorze o kształcie cylindra wyposażonym w mieszadła, którego podstawy stanowią siatki metalowe. Adsorpcję prowadzono na złożu Duolite C-464 w ilości 3 kg (w przeliczeniu na suche złoże) przez 30 min. przy 30-krotnej cyrkulacji i zmianie kierunku przepływu białka co 5 min. Złoże było równoważone jak w przykładzie drugim, a po procesie adsorpcji przemywane wodą. Proces desorpcji prowadzono 2 M roztworem NaCl w 0,05 M buforze fosforanowym o pH 8,0. Odzysk lizozymu wynosił 80%±4 %.Egg white with a volume of 25 dm ³ was subjected to the continuous adsorption process in a cylinder-shaped reactor equipped with stirrers, the bases of which are made of metal grids. Adsorption was carried out on the Duolite C-464 bed in the amount of 3 kg (as calculated for the dry bed) for 30 minutes. with a 30-fold circulation and a change in the direction of protein flow every 5 min. The bed was equilibrated as in the second example, and washed with water after the adsorption process. The desorption process was carried out with 2 M NaCl solution in 0.05 M phosphate buffer at pH 8.0. Lysozyme recovery was 80% ± 4%.

Przykład 5 ₃ Example 5 ₃

Roztwór wodny białka jaja o objętości 200 dm³i stężeniu białka ogólnego 2% poddano chromatografii kolumnowej na wymieniaczu jonowym Amberlite IRC 50 (ilość odpowiadająca 20 kg suchego wymieniacza) równoważonym jak w przykładzie pierwszym. Proces adsorpcji prowadzono przez 2 godz. przy przepływie roztworu białka jaja 200 dm³/godz. Proces przemywania prowadzono jednokrotnie 200 dm³33 wody, a desorpcję 200 dm³1M roztworu NaCl o pH6,5 przy przepływie 200 dm³/godz.An aqueous solution of egg white with a volume of 200 dm ³ and a total protein concentration of 2% was subjected to column chromatography on an Amberlite IRC 50 ion exchanger (amount corresponding to 20 kg of dry exchanger) equilibrated as in the first example. The adsorption process was carried out for 2 hours. with the flow of egg white solution 200 dm ³ / hour. The process of washing was carried out once with 200 dm ^{3 of} 33 of water and desorption of 200 dm ³ of 1M NaCl pH 6.5 at a flow rate of 200 dm ³ / h.

Przykład 6 ₃ Example 6 ₃

Białko jaja o objętości 125 dm³ mieszano z 30 kg Amberlite IRC-50 (w przeliczeniu na suchy wymieniacz) o pH 6,5 przez czas od 20 min. do 60 min. w zbiorniku wyposażonym w mieszadło. Następnie złoże przemywano 125 dm³ wody przez czas od 10 do 40 min. i dalej prowadzono proces desorpcji 125 dm³ roztworu NaCl o stężeniu 4% do 10% wagowych. Uzyskany eluent zawierający około 0,5% białka zagęszczono pięciokrotnie techniką ultrafiltracji membranowej. W dalszej kolejności obniżono wartość pH roztworu do 3,5 przy użyciu 2% roztworu HCl,a następnie prowadzono proces dializy do osiągnięcia stężenia NaCl w zagęszczonym roztworze poniżej 0,05 M. W czasie dializy następowało dalsze zagęszczanie roztworu lizozymu aż do osiągnięcia objętości 12% objętości początkowej.Egg white with a volume of 125 dm ³ was mixed with 30 kg of Amberlite IRC-50 (as calculated for a dry exchanger) at pH 6.5 for 20 minutes. up to 60 min. in a tank equipped with an agitator. Then the bed was washed with 125 dm ^{3 of} water for 10 to 40 minutes. and further carrying out the process of desorption of 125 dm ³ solution of NaCl having a concentration of 4% to 10% by weight. The obtained eluent containing about 0.5% of protein was concentrated five times with the technique of membrane ultrafiltration. Subsequently, the pH of the solution was lowered to 3.5 with a 2% HCl solution, and then the dialysis process was carried out until the concentration of NaCl in the concentrated solution was below 0.05 M. During the dialysis, the lysozyme solution was further concentrated to a volume of 12%. initial volume.

Claims

Patent claims

1. The method of obtaining the preparation of lysozyme salt from egg white, especially chicken during crystallization in concentrated NaCl solutions, characterized in that the protein is subjected to adsorption on an ion exchanger with a pH close to the protein's pH, where the protein can be diluted and the adsorption process takes place while maintaining the weight ratio of dry ion exchanger to protein or its solution from 1: 10 to 1: 3, and after the adsorption process, the egg white is separated from the exchanger bed and the desorption process is continued with salt solutions with a concentration of 0.2 M to 2, 0 M using a phosphate buffer with a pH of 8.0 to 9.5, and then the solution obtained in this way is concentrated by adjusting the pH in the desorption solution at a level of 3.5 to 7.0 and the excess salt is removed to its concentration at most 0.25 M.

2. A method of obtaining a lysozyme salt preparation according to claim 1, The process of claim 1, wherein the ratio of protein to diluent, which may be water or saline, preferably 0.15 M NaCl solution, is maximally 1: 5.

3. A method of obtaining a lysozyme salt preparation according to claim 1, The method of claim 1, characterized in that the ion exchanger has a pH of 7.5 to 9.6, preferably 8.5 to 9.2.

4. A method of obtaining a lysozyme salt preparation according to claim 1; The process of claim 1, wherein a saline solution is used in the desorption process, preferably with a concentration of 1.0 M to 2.0 M.

5. The method of obtaining a lysozyme salt preparation according to claim 1, characterized in that the lysozyme salt solution is concentrated by ultrafiltration to obtain the initial volume in the range of 10% to 50%.

6. A method of obtaining a lysozyme salt preparation according to claim 1, A method as claimed in claim 1, characterized in that excess salt is dialyzed from the lysozyme-containing concentrated solution, preferably to a concentration below 0.05 M.

PL 192 283 B1

The method of obtaining a lysozyme salt preparation according to claim 1, The process of claim 1, wherein the pH in the desorption solution is preferably from 3.5 to 4.5.

8. A method of obtaining a lysozyme salt preparation according to claim 1, The method of claim 1, characterized in that the ion exchanger bed is washed with water after the egg white has been separated therefrom after the adsorption process.