PL190645B1 - Zastosowanie dimeru lizozymu do wytwarzania środka leczniczego do stosowania w profilaktyce - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie dimeru lizozymu do wytwarzania środka leczniczego do stosowania w profilaktyce chorób typowo rozwijających się w związku ze stresem o podłożu fizjologicznym, infekcyjnym lub środowiskowym, zwłaszcza w profilaktyce chorób zwierząt hodowlanych i drobiu.

Description

Prace badawcze kontynuowane przez twórcę doprowadziły do rozwinięcia wachlarza terapeutycznych zastosowań dimeru lizozymu i opracowania nowego leczniczego wykorzystania tego środka. W szczególności ustalono, że dimer lizozymu oddziałując na ogniwa odpowiedzi immunologicznej organizmu zaatakowanego przez infekcje, których naturalny, nieleczony przebieg łączy się zazwyczaj z wystąpieniem zespołu sepsy, jest skutecznym środkiem do zwalczania objawów szoku septycznego i przeciwdziałania rozwinięciu się choroby aż do wystąpienia objawów sepsy groźnych dla życia zainfekowanego osobnika. Takie zastosowanie dimeru lizozymu opiera się na potwierdzonej badaniami zdolności moderowania poziomu czynnika nekrozy nowotworów (TNF) i obniżaniu nadmiernie wysokiego poziomu TNF do poziomu wywierającego dobroczynny wpływ na zwalczanie niepożądanej infekcji.

Celem dalszych prac nad medycznym wykorzystaniem dimeru lizozymu było znalezienie nowych i nieoczywistych zastosowań medycznych dimeru lizozymu.

Tak zakrojone badania prowadzone były pod kątem wykorzystania w praktyce weterynaryjnej, w stosunku do zwierząt hodowlanych i drobiu.

Choroby występujące u zwierząt gospodarskich są zjawiskiem wysoce niepożądanym i szkodliwym dla hodowców i producentów. Niosą za sobą dodatkowe nakłady finansowe na leczenie, powodują zmniejszenie efektów produkcyjnych (zmniejszenie przyrostów, zwiększenie zużycia paszy na przyrost i produkcję, zmniejszenie wydajności mlecznej bydła, nieśności kur, pogorszenie rozrodu). Szczególnie niekorzystne jest występowanie chorób epidemicznych, występujących w większych stadach zwierząt, wymagających objęcia leczeniem całego stada lub całej grupy technologicznej. Poważnym problemem są choroby dotykające matki w okresie okołoporodowym, gdyż zaburzenia w mleczności powodują straty wśród miotów. Dodatkowo, okres odsądzenia zwierząt hodowlanych i przejęcie na normalną pozamleczną dietę hodowlana młodziezy wiąże się ze stratami spowodowanymi zwiększoną podatnością zwierząt na infekcje w tym okresie hodowlanym.

Dotychczas nie opracowano w pełni skutecznych programów profilaktyki chorób zwierząt hodowlanych, omówionych wyżej. Stosowane obecnie preparaty takie jak szczepionki lub lewamizol nie zawsze dają w pełni zadowalające efekty profilaktyczne. Nie gwarantując skuteczności profilaktycznej mogąjednocześnie wywoływać niepożądane skutki uboczne.

Obecnie w medycynie tak weterynaryjnej jak i ludzkiej istotną rolę w terapii licznych jednostek chorobowych mają leki immunologiczne. Mechanizmy odpornościowe, decydujące o powodzeniu działań profilaktycznych skierowały badania w kierunku profilaktycznego zastosowania środków immunotropowych.

Dotychczas masowe praktyczne wykorzystanie środków immunotropowych w profilaktyce chorób o różnej, często złożonej etiologii nie było możliwe, głównie z uwagi na brak łatwo dostępnych substancji o łagodnym działaniu na układ immunologiczny, niskotoksycznych i nie wywołujących niepożądanych skutków ubocznych.

Celem wynalazku jest zapewnienie nowego zastosowania dimeru lizozymu do wytwarzania środka profilaktycznego zapobiegającego rozwijaniu się różnych jednostek chorobowych o złożonej etiologii, w szczególności w okresach stresu związanego ze stanami fizjologicznymi takimi jak poród, jak i środowiskowymi takimi jak oddzielenie młodych ssaków od matek i przejście na inny model żywieniowy, ze szczególnym uwzględnieniem możliwości jego stosowania u zwierząt hodowlanych i drobiu.

Cel ten osiągnięto przez opracowanie rozwiązania według wynalazku. Na podstawie prowadzonych intensywnych badań obecnie nieoczekiwanie okazało się, że dimer lizozymu podany w okresie poprzedzającym wzmozony stres powoduje wzmocnienie reakcji obronnych organizmu w stopniu ograniczającym podatność na infekcje w okresie trwania i w okresie następującym po ustąpieniu stresu..

Obserwacja ta ma oparcie w następujących podstawowych ustaleniach:

1. Dimer lizozymu inhibituje syntezę TNF,

2. Dimer lizozymu stymuluje syntezę IFN-a,

190 645

3. Dimer lizozymu pobudza aktywność fagocytamą.

Wynalazek dotyczy zatem, nowego zastosowania dimeru lizozymu do wytwarzania środka leczniczego do stosowania w profilaktyce chorób typowo rozwijających się w związku ze stresem o podłożu fizjologicznym, infekcyjnym lub środowiskowym, zwłaszcza w profilaktyce chorób zwierząt hodowlanych i drobiu.

Korzystnie dimer lizozymu znajduje zgodnie z wynalazkiem zastosowanie do wytwarzania środka leczniczego do stosowania w profilaktyce powikłań okołoporodowych macior i krów, w szczególności w profilaktyce bezmleczności tych zwierząt.

Innym korzystnym zastosowaniem dimeru lizozymu jest zgodnie z wynalazkiem zastosowanie do wytwarzania środka leczniczego do stosowania w profilaktyce zachorowalności w okresie odsądzenia młodych ssących od matek oraz po przerzucie technologicznym.

Dalszym korzystnym zastosowaniem dimeru lizozymu jest zgodnie z wynalazkiem zastosowanie do wytwarzania środka do stosowania w profilaktyce zachorowalności w okresie przeniesienia piskląt drobiu z warunków inkubatorowych do zwykłych warunków odchowu.

Zgodnie z wynalazkiem, wytwarzany środek leczniczy jest przystosowany do podawania w zastrzykach, zwłaszcza dożylnych lub domięśniowych.

Korzystnie, wytwarzany środek leczniczy jest formułowany w dawkach jednorazowych lub wielokrotnych.

W szczególnie korzystnym zastosowaniu dimeru według wynalazku do wytwarzania środka do stosowania w profilaktyce, wytwarzany środek leczniczy zawiera dimer lizozymu w dawce 0,2 mg/ml w roztworze wodnym, stabilizowanym dopuszczalnymi środkami konserwującymi dla preparatów białkowych, przystosowany do podawania w dawce 0,02 mg/kg masy ciała. Korzystnie, środek ten ma postać apyrogennej, sterylnej kompozycji zawierającej, co najmniej jeden fizjologicznie akceptowalny rozpuszczalnik i/lub, co najmniej jeden dopuszczalny farmaceutycznie środek konserwujący, korzystnie apyrogenną sterylizowaną wodę lub wodny roztwór PBS jako rozpuszczalnik i tiomersal jako środek konserwujący dopuszczalny do stosowania w farmaceutycznych środkach białkowych.

Korzystnym wodnym roztworem w środku leczniczym wytwarzanym zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest wodny roztwór soli dopuszczalnej fizjologicznie, zwłaszcza PBS.

Wyizolowany, oczyszczony dimer lizozymu znajdujący zastosowanie według wynalazku zawiera ewentualnie niewielkie ilości trimerów i wyższych oligomerów.

W profilaktyce niektórych chorób, środek leczniczy wytworzony zgodnie z wynalazkiem może być podawany w zastrzykach, domięśniowo lub podskórnie. Czasami, właściwe może być jednoczesne lub niezależne podawanie tej samej ciekłej kompozycji domacicznie lub dowymieniowo i ogólnoustrojowo lub lokalnie.

Wynalazek może być powszechnie wykorzystany z uwagi na praktyczny brak toksyczności oraz dostępność substancji aktywnej.

Uzyskane wyniki badań klinicznych przeprowadzonych na prosiętach w okresie około odsadzeniowym wykazały wysoką skuteczność preparatu w ograniczeniu występowania zespołów chorobowych u prosiąt po przerzucie technologicznym oraz w ograniczeniu strat w przyrostach masy ciała w tym okresie.

Podobnie, środek wytworzony zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, zastosowany u loch ciężarnych w okresie 10-14 dni przed porodem w postaci jednorazowej iniekcji domięśniowej 0,02 mg/kg masy ciała ogranicza występowanie zespołu CM (coliform mastitis), zmniejsza straty wśród prosiąt od loch z zespołem CM, wywiera korzystny wpływ na przebieg okresu poporodowego i podjęcie aktywności rozrodczej loch.

Zastosowany u krów cielnych zmniejsza nasilenie występowania zaburzeń poporodowych, skraca przestój poporodowy i ogranicza występowanie chorób opóźniających podjęcie aktywności rozrodczej krów.

Podanie środka leczniczego wytworzonego zgodnie z zastosowaniem według wynalazku w formie injekcji w 7-12 dniu życia kurcząt nieśnych i rzeźnych zmniejsza w stopniu statystycznie istotnym upadki w okresie odchowu, zwiększa przyrosty i zmniejsza zużycie pasz w stosunku do grup kontrolnych.

190 645

W weterynarii, środek leczniczy wytworzony zgodnie z zastosowaniem dimeru lizozymu według wynalazku ma ogromną przewagę nad podobnie stosowanymi antybiotykami, bowiem nie powoduje strat materiału zwierzęcego (mleka, mięsa) z powodu nadmiernego poziomu zawartości substancji antybiotykowych.

Wcześniej prowadzone badania przedkliniczne dimeru lizozymu nie ujawniły właściwości mutagennych ani teratogennych. Ujawniły natomiast bardzo dobrą tolerancję. Toksyczności oznaczonej dla pojedynczej dawki (toksyczność ostra) przy podaniu doustnym lub zewnętrznym - LD50, nie udało się ustalić (> 2000 mg/kg), a przy podawaniu dożylnym LD50 wyniosła > 1000 mg/kg.

Ujawnione obecnie nowe zastosowanie dimeru lizozymu ma solidne podstawy potwierdzone w klinicznych zastosowaniach in vitro.

Wynalazek bliżej objaśniają poniższe przykłady szczegółowo omawiające przeprowadzone badania kliniczne nad profilaktyką z wykorzystaniem dimeru lizozymu w zastosowaniu zgodnym z obecnym wynalazkiem.

Przykład I.

Wykonano dwa doświadczenia na zwierzętach.

W pierwszym eksperymencie materiał doświadczalny stanowiły jednodniowe kurki ASTRA P zakupione w ZWD Duszniki. ASTRA P to linia kur nieśnych przeznaczona przede wszystkim dla drobnych producentów. Łącznie w doświadczeniu brało udział 1118 kurek odchowanych do wieku sześciu tygodni. Średnia masa początkowa piskląt wynosiła 34 gramy. Wszystkie ptaki podzielono losowo na trzy grupy eksperymentalne, stąd w jednej grupie było 396 kurek.

Kurczęta odchowywano grupowo w metalowych klatkach po 12 sztuk w każdej, w jednej grupie doświadczalnej były 33 klatki traktowane jako powtórzenia [33 x 12 =396]. Podczas trwania eksperymentu [6 tygodni] kurki ze wszystkich grup żywione były identyczną pełnoporcjową mieszanką paszową typu DKM-1, w skład której wchodziła śruta pszenna, poekstrakcyjna śruta sojowa, mączka mięsna 58%, fosforan pastewny, NaCl i premiks DKM-1. Mieszanka w formie sypkiej skarmiana była do woli. Będący przedmiotem badań preparat Lydium-KLP zastosowano u kurek z grup II i m. Ptaki z grupy drugiej zaszczepiono jednorazowo (iniekcja podskórna) preparatem jako jednodniówki, jeszcze w zakładzie wylęgowym, natomiast kurki z grupy III zaszczepiono Lydium-KLP w siódmym dniu życia. W obu przypadkach badany preparat podano w ilości 0,02 mg/kg masy ciała. Kurki z grupy pierwszej nie otrzymały preparatu. Przyjęto następujące kryteria oceny przydatności testowanego preparatu: zdrowotność kurek określana liczbą upadków, cotygodniowa kontrola przyrostów masy ciała w ramach powtórzeń, cotygodniowy pomiar spożycia mieszanek paszowych, współczynnik wykorzystania paszy na jednostkę przyrostu. Istotność różnic międzygrupowych określano przy pomocy programu Statgraf przy poziomie istotności p < 0,05.

W drugim doświadczeniu określano przydatność preparatu Lydium-KLP w tuczu kurcząt rzeźnych (brojlerów). Materiałem doświadczalnym było 1200 jednodniowych piskląt (AYLAN), zakupionych w ZDM Wierzbno. Kurczęta przeseksowano metodą japońską dla uzyskania równego udziału obu płci. Ptaki podzielono losowo, lecz o równym udziale płci na dwie grupy eksperymentalne. Kurczęta utrzymywano grupowo w metalowych klatkach po 10 sztuk w każdej, stąd w jednej grupie było 60 klatek traktowanych jako powtórzenie (600 kurcząt). Brojlery z grupy II w ósmym dniu życia zostały zaszczepione podskórnie preparatem LydiumKLP w ilości 0,02 mg/kg masy ciała, natomiast kurczęta z grupy I (kontrolna) nie otrzymały badanego preparatu. Żywienie w obu grupach było identyczne; przez pierwsze trzy tygodnie kurczęta otrzymywały pełnoporcjową mieszankę typu DKA-STRATER, od czwartego do końca szóstego tygodnia pełnoporcjową mieszankę typu DKA-GROWER, a w ostatnim siódmym tygodniu pełnoporcjową mieszankę typu DKA-FINISZER. W skład mieszanek wchodziła śruta pszenna, poekstrakcyjna śruta sojowa, mączka mięsna 58%, tłuszcz paszowy, fosforan pastewny, NaCl i odpowiednie premiksy mineralno-witaminowe. Wszystkie mieszanki były granulowane i podawane brojlerom do woli. W doświadczeniu przyjęto następujące kryteria oceny: ocena zdrowotności kurcząt mierzona liczba upadków, cotygodniowe przyrosty masy ciała w ramach powtórzeń, cotygodniowe spożycie mieszanek paszowych

190 645 w ramach powtórzeń, współczynnik wykorzystania mieszanek paszowych na jednostkę przyrostu masy ciała. Uzyskane rezultaty poddano analizie statystycznej programem Statgraf, a istotność różnic określono przy poziomie istotności p < 0,05.

Wyniki

Wyniki uzyskane w pierwszym doświadczeniu (odchów kurek ASTRA P) przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

Średnie wyniki uzyskane w odchowie kurek ASTRA P

Grupa	Masa ciała po 6 tygodniach w g/szt.	Spożycie paszy na 1 kg przyrostu	Upadki w sztukach	Upadki w%
I	394,8 a 100%	2,75 1,00%	a	17	4,3
Π	403,1 ab	2,71	ab	9	2,3
102%	98%
III	405,9 b	2,68	b	6	1,5
103%	97%

Jak wynika z tabeli 1, najsłabsze wyniki odchowu były w grupie kontrolnej (I). Kurki z tej grupy po 6 tygodniach doświadczenia były najlżejsze i ważyły przeciętnie 394,8 gramów. Współczynnik wykorzystania paszy na jednostkę przyrostu był w grupie I najmniej korzystny i wyniósł 2,75. Zdrowotność kurcząt w grupie kontrolnej była najgorsza, bowiem łącznie padło 17 sztuk, czyli 4,3% ogółu. Ptaki z grupy II, które zostały zaszczepione preparatem Lydium-KLP jako jednodniówki ważyły po sześciu tygodniach życia średnio 403,1 gramów i były o 2% cięższe od kontrolnych. Stopień wykorzystania paszy był o 2% lepszy, a liczba padłych kurek wynosiła 9 sztuk, czyli 2,3%. Najefektywniej odchowały się kurki z grupy III, którym podano badany preparat w 7 dniu życia. Średnia masa ciała kurcząt z tej grupy wynosiła na końcu doświadczenia 405,9 gramów, a różnica z grupą kontrolną (I) była statystycznie istotna (p < 0,05). Także współczynnik wykorzystania paszy na jednostkę przyrostu (2,68) był o 3% niższy od uzyskanego w grupie kontrolnej. Zdrowotność kurek, mierzona liczbą upadków, była w grupie III najlepsza, bowiem podczas całego eksperymentu padło tylko 6 ptaków, czyli 1,5% stada.

Wyniki uzyskane w doświadczeniu drugim zamieszczono w tabeli 2.

Tabela 2

Średnie wyniki uzyskane po49 dniach tuczu kurcząt rzeźnych.

Grupa	Masa ciała w g	Zużycie paszy na 1 kg przyrostu	Upadki w sztukach	Upadki w %
I	1794,8 a	2,32	41	6,8
100%	100%
Π	1881,5 b	2,21	28	4,7
105%	95%

Jak wynika z tabeli 2, podobnie jak w przypadku odchowu kurek nieśnych zaznaczył się korzystny wpływ badanego preparatu Lydium-KLP na rezultaty tuczu brojlerów kurzych. Kurczęta zaszczepione w 8 dniu życia (grupa III) były po 49 dniach doświadczenia cięższe od

190 645 kontrolnych o 5% i ważyły przeciętnie 1881,5 gramów. Współczynnik wykorzystania paszy wyrażony zużyciem mieszanki, a jednostkę przyrostu masy ciała był średnio o 5% lepszy niż u ptaków kontrolnych. W grupie II padło zdecydowanie mniej kurcząt (4,7%) w porównaniu z grupą kontrolną (6,8%).

Omówienie

W wyniku przeprowadzonych dwóch doświadczeń zaobserwowano korzystny wpływ preparatu Lydium-KLP na niektóre parametry odchowu kurcząt nieśnych jak i rzeźnych (zmniejszenia upadków, większe przyrosty, mniejsze zużycie paszy). Jak się wydaje zaszczepienie kurcząt będących w wieku 7-8 dni jest okresem właściwszym niż podanie preparatu jednodniówkom. Fakt ten można, być może, tłumaczyć obecnością przeciwciał żółtkowych w organizmach kurcząt w pierwszych dniach życia, a jak wiadomo woreczek żółtkowy zostaje zresorbowany po pierwszych 6-7 dniach od wyklucia. Jednakże należy podkreślić, ze przeprowadzone badania miały charakter prac wstępnych, które nie upoważniają do wyciągania pewnych wniosków. Interesujące rezultaty zachęcają natomiast do dalszych bardziej precyzyjnych badań, które to powinny być kontynuowane.

Przykład II.

Celem badań było prześledzenie efektów profilaktycznego działania Lydium-KLP podawanego krowom przed porodem na występowanie zaburzeń poporodowych, a szczególnie zatrzymania łożyska.

Materiały i metody:

Zwierzęta doświadczalne: Badania wykonano na 120 krowach rasy ncb x hf, klinicznie zdrowych, będących w III trymetrze ciąży, losowo wybranych w dwóch oborach liczących 320 i 286 krów. Obory te określano jako problemowe, w których zaburzenia poporodowe u krów stanowiły istotny problem zdrowotny.

Stosowanie leku: Do badań użyto preparatu Lydium-KLP zawierającego jako substancję czynną dimer limozymu, dostarczony przez NIKA Health Products, LTD. Preparat podawano w iniekcji w dawce 0,02 mg dimeru limozynu/kg masy ciała jednorazowo między 10 a 7 dniem przed porodem, domięśniowo (intra muskularis).

Układ doświadczenia: Losowo wytypowane krowy z obór o dużej częstotliwości występowania zaburzeń poporodowych dzielono na 2 grupy - doświadczalną i kontrolną. Każda grupa - obejmowała po 60 krów, klinicznie zdrowych, będących w trzecim trymestrze ciąży. Zgodnie z protokołem badań krowy oznaczono numerami 1 do 60 (grupa doświadczalna) i 61 do 120 (grupa kontrolna). Krowy z grupy doświadczalnej otrzymały Lydium-KLP jednorazowo między 10 a 7 dniem przed porodem, domięśniowo w ilości odpowiadającej ich masie ciała. Krowy z grupy kontrolnej nie otrzymały Lydium-Kf.P. Krowy z obu grup przebywały w identycznych warunkach środowiskowych, porody odbywały się na stanowiskach porodowych wyodrębnionych w oborze. Dawka pokarmowa dla obu grup była jednakowa - krowy otrzymały kiszonkę z kukurydzy, pasze słomiaste - siano i słomę zbóż jarych, dodatki mineralno -witaminowe, a w okresie żywienia letniego dodatkowo zielonkę z traw. Koncentracja energii oraz wartość współczynnika białkowo - energetycznego w dawce była odpowiednia dla okresu fizjologicznego i wydajności mlecznej po porodzie. Obserwacje kliniczne krów w obu grupach prowadzone były od dnia podania preparatu do 4-tego miesiąca po porodzie.

Badania kliniczne obejmowały:

- rejestracje zdarzeń chorobowych przed i po porodzie

- przebieg porodu - czas trwania, odejście błon płodowych

- przebieg okresu poporodowego (puerperium) z uwzględnieniem komplikacji poporodowych

- kontrolę układu rozrodczego, oceniając proces zwijania się macicy (involutio utari), wypływy lochialne - nasilenie oraz charakter i termin ich zakończenia, aktywność poporodowąjajników - oceniając ich wielkość, kształt, spoistość i obecność pęcherzyków jajnikowych, ciałek żółtych i torbieli

- występowanie pierwszej rui poporodowej i terminy unasienień

Uzyskane dane z obserwacji klinicznych zostały zachowane i znajdują się w kartach indywidualnych krów.

197 645

Skuteczność profilaktyczną preparatu Lydium-KLP podanego krowom przed porodem na występowanie u nich zespołów chorobowych po porodzie, a szczególnie zatrzymanie łożyska (retentio secundinarum) określono wyliczając:

- wskaźnik zachorowalności krów tj. liczba krów, u których wystąpiło zatrzymanie łożyska lub inne zespoły chorobowe wyrażona w%

- wskaźnik płodności dla krów z obu grup

a) długość przestoju poporodowego

b) zapładnialność

c) wskaźnik ciąży

d) długość okresu międzyciążowego

- istotność różnic wyliczonych wskaźników między grupami

- efekty ekonomiczne obejmujące opóźnioną gotowość rozrodcztą zaburzony przebieg okresu poporodowego (puerperium) oraz straty w mleku wynikające z zastosowania w leczeniu zespołów poporodowych antybiotyków o określonej karencji dla mleka.

Uzyskane dane z badań klinicznych i wyliczone wskaźniki poddano analizie statystycznej przy zastosowaniu testu t-Studenta. Otrzymane wyniki porównywano do wartości otrzymanych w równolegle prowadzonej grupie kontrolnej. W poniższych tabelach przedstawiono średnie arytmetyczne otrzymanych wyników (x) i odchylenie standardowe (SD ± ).

Wyniki badań:

Charakterystykę rozrodu w badanych stadach w okresie poprzedzającym obserwacje i zastosowanie profilaktyczne Lydium-KLP przedstawiono w tabeli 3. Przebieg okresu poporodowego u krów w grupie doświadczalnej i kontrolnej przedstawiono w tabeli 4. Schorzenia okołoporodowe występujące u krów w okresie doświadczalnym zawiera tabela 5. W tabeli 6 przedstawiono wartości wybranych wskaźników płodności krów z uwzględnieniem stanu zdrowotnego po porodzie. W tabeli 7 przedstawiono efekty profilaktycznego stosowania Lydium-KLP u krów przed porodem. Tabela 8 zawiera ocenę skuteczności terapeutycznej Lydium-KLP i antybiotyków.

Przedstawione w tabeli 3 wartości wybranych wskaźników u krów w stadach doświadczalnych odbiegają od przyjętych jako prawidłowe. Wydłużony okres przestoju poporodowego, niska zapładnialność, czyli skuteczność pokrycia po pierwszym unasiennieniu, wysoki wskaźnik ciąży, czyli liczba porcji nasienia potrzeba do skutecznego pokrycia, wydłużony okres międzyciążowy, wysoki odsetek brakowania krów przy dużej częstotliwości zdarzeń chorobowych pozwalają określić te stada jako problemowe, w których przyjęty schemat postępowania lekarsko - weterynaryjnego nie daje zadowalających efektów. Zastosowanie Lydium-KLP u losowo wybranych z tych stad krów ciężarnych - grupa doświadczalna - ograniczyło nasilenie występowania zespołów chorobowych do 13,3%. W grupie kontrolnej schorzenia okołoporodowe wystąpiły u 38,3% krów. W grupie doświadczalnej tylko u 8 krów (tabela 4) wystąpiły zespoły chorobowe, w grupie kontrolnej u 23 krów. U krów z tej grupy obserwowano wyraźne nasilenie przypadków zatrzymania łożyska oraz stanów zapalnych błony śluzowej macicy (tab. 3). Profilaktyczne podanie Lydium-KLP krowom przed porodem wywarło korzystny wpływ na przebieg okresu poporodowego zarówno u krów o prawidłowym przebiegu porodu i okresu poporodowego jak też u krów z zaburzeniami w tym okresie. U krów o prawidłowym przebiegu porodu i okresu poporodowego profilaktyczne działanie Lydium-KLP wywarło korzystny, statystycznie istotny (p < 0,05) wpływ na termin wydalania odchodów poporodowych. U krów z grupy doświadczalnej (tabela 2), do 15 dnia po porodzie, u 94,2% samic obserwowano zakończenie tego procesu. W grupie kontrolnej tylko u 83,8% krów. Wznowienie cyklu jajnikowego, o czym świadczy pojawienie się pęcherzyków jajnikowych, do 20 dnia po porodzie obserwowano u 65,4% krów z grupy doświadczalnej i 48,6% krów z grupy kontrolnej.

Ciałko żółte okresowe do 30 dnia po porodzie wystąpiło u 69,2% krów otrzymujących Lydium-KLP przed porodem i u 40,5% krów z grupy kontrolnej. Zakończenie inwolucji macicy do 30 dnia po porodzie obserwowano u 96,1% krów z grupy doświadczalnej i u 70,3% krów z grupy kontrolnej. Podanie krowom ciężarnym Lydium-KLP nie tylko istotnie ograniczyło występowanie zdarzeń chorobowych p porodzie, ale miał także korzystny wpływ na

190 645 przebieg okresu poporodowego. U krów z prawidłowym okresem poporodowym preparat ten powodował przyśpieszenie zakończenia wydzielania odchodów poporodowych o 12,4%, przyśpieszenie wznowienia cyklu jajnikowego o 34,6% szybsze pojawienie się ciałka żółtego okresowego do 30 dnia po porodzie o 70,9%, przyspieszenie inwolucji macicy do 30 dnia po porodzie o 36,7% w porównaniu do wartości jakie obserwowano u krów z prawidłowym okresem poporodowym w grupie kontrolnej. Niekorzystny wpływ zdarzeń chorobowych u krów po porodzie przedstawiono w tabelach 4, 6 i 7. U krów z zespołami chorobowymi po porodzie (tabela 3) stwierdzono statystycznie istotne (p < 0,05) wydłużenie czasu wydalania odchodów poporodowych (locha), opóźnienie wznowienia aktywności sekrecyjnej jajników, pojawienie się ciałka żółtego oraz opóźnienie inwolucji macicy, co znalazło odzwierciedlenie w wartości analizowanych wskaźników płodności krów (tabela 4). U krów z zaburzeniami poporodowymi przestój poporodowy był dłuższy o 34,4 do 38,1%, zapładnialność niższa o 38,7 do 43,2%, wskaźnik ciążowy wyższy o 88,9 do 105,3%, a okres między ciążowy dłuższy o 36,3 dni w porównaniu do wartości tych wskaźników u krów z nie zaburzonym okresem poporodowym.

Wartości przedstawione w tabelach 4, 6 i 7 wskazują na wysoką skuteczność profilaktyczną Lydium-KLP u krów. Preparat ten podany krowom ciężarnym na 10 - 7 dni przed porodem ograniczył u nich występowanie zespołów chorobowych po porodzie. Podanie tego preparatu miało korzystny, statystycznie istotny (p < 0,05) wpływ na przebieg okresu poporodowego i wskaźniki płodności, co w efekcie przyniosło wymierne korzyści ekonomiczne poprzez skrócenie przestoju poporodowego, zwiększenie zapładnialności, obniżenie składnika ciąży, skrócenie okresu międzyciążowego oraz zmniejszenie brakowania krów w następstwie schorzeń układu rodnego, a także nakładów finansowych na leczenie zespołów chorobowych u krów po porodzie. Preparat Lydium-KLP zastosowano w leczeniu zespołów chorobowych u krów po porodzie. Skuteczność terapeutyczna w grupie krów otrzymujących Lydium-KLP profilaktycznie (tabela 6) wyniosła od 80 do 100% w zależności od rodzaju schorzenia. Wyższą skuteczność tego preparatu obserwowano w leczeniu zapaleń błony śluzowej macicy (endometritys) niż przy terapii wspomagającej po ręcznym odklejeniu łożyska.

Efektywność terapeutyczna tego preparatu w grupie kontrolnej u krów z analogicznymi zaburzeniami była niższa i wynosiła od 60 do 87,8%. Jest to interesujące zjawisko, w przedstawionych danych trudne do wyjaśnienia.

Można jednak przypuszczać, że powtórne podanie Lydium-KLP w odstępie 14-21 dni mogłoby spowodować obserwowane efekty w terapii identycznych schorzeń u krów po porodzie. Skuteczność lecznicza antybiotyków w zaburzeniach poporodowych (endometritis retentio secundinarum) u krów wynosiło od 46 do 63,6%. Mniejszej skuteczności terapii antybiotykowej w omawianych zespołach chorobowych towarzyszyła karencja na sformułowanie następujących wniosków.

Tabela 3

Charakterystyka rozrodu w badanych stadach w okresie poprzedzającym zastosowanie Lydium-KLP profilaktycznie u krów ciężarnych.

Stado	Liczba krów	Zatrzymanie łożyska	Zapalenia błony śluzowej maciyy %	|- Poronienia %	Zaburzenia czynnościowe %	1- Przestój poporodowy dni	Zapładnialność %	Wskaźnik ciąży	Okres międzyciążowy dni	Brakowanie %
A	320	23,7	26,9	1,6	20,9	72,6 ±4,2	43,0	3,9	116,8 ±4,6	23,7
B	286	21,7	27,6	2,4	22,4	69,4 ± 3,6	39,2	3,8	121,6 ±4,5	25,9

190 645

Tabela 4

Przebieg okresu poporodowego u krów z grupy doświadczalnej i kontrolnej.

Grupa	Liczba krów	Lochia zakończona do 15 dnia po porodzie	Pęcherzyki jajnikowe do 20 dnia po porodzie	Ciałko żółte okresowe do 30 dnia po porodzie	Inwolucja macicy zakończona do 30 dnia po porodzie
		n	%	n %	n %	n	%
Zdrowe Doświadczalna 60	52	49*	94,2	34*	65,4	36*	69,	50*	96,1
Chore	8	2	25	1	12,5	3	37,5	6	75,0
Zdrowe Kontrolne 60	37	31	83,8	18	48,6	15	40,5	26	70,3
Chore	23	5	21,7	2	8,7	6	26,1	9	9,1

Objaśnienia, n - liczba osobników, % - procent, * - różnica statystycznie istotna p < 0,05 między grupami

Tabela 5

Rodzaje schorzeń około porodowych u krów z grupy doświadczalnej i kontrolnej

Schorzenia	Grupa
Doświadczalna	Kontrolna
Zatrzymanie łożyska	n %	n %
2 25,0	11 47,8
Zapalenie błony śluzowej macicy E1-E4	3 37,5	9 39,1
Zaburzenia czynnościowe jajników (dysfunkcja, torbiele)	1 12,5	2 8,7
Atonia macicy	2 25,0	1 4,4

Objaśnienia: n - liczba osobników % - procent

E| - E4- nasilenie zmian zapalnych

Tabela 6

Wskaźniki płodności krów z grupy doświadczalnej i kontrolnej.

Grupa	Doświadczalna	Kontrolna
zdrowe	chore	zdrowe	chore
1	2	3	4	5
Wskaźniki Przestój poporodowy (dni)	n = 52	n = 8	n = 37	n = 23
53,8 ±3,2	74,3 ± 6,2	61,6 ±8,5	82,8 ± 6,9
Oapłaanialność (%)	62,8 ±4,0	38,5 ± 7,6	57,6 ±3,5	32,7 ±5,2

190 645

c.d. tabeli 6

1	2	3	4	5
Wskaźniki ciąży	1,8	3,4	1,9	3,9
Okres międzyciązowy (dni)	76 ±5	112 ± 9	79,8 ± 7,0	116 ± 7
Brakowanie (%)	7,7	37,5	18,9	34,8

Objaśnienia: n - liczba osobników % - procent

Tabela 7

Efekty profilaktycznego stosowania Lydium-KLP u krów przed porodem

Grupa	Doświadczalna n = 60	Kontrolna n = 60
Badane wskaźniki
Skuteczność profilaktyczna	86,7%	-
Zachorowalność	13,3%	38,3
Przestój poporodowy (dni) - zdrowe	53,8*	61,6*
- chore	74,3	82,8
Zapładnialność (%) - zdrowe	62,8*	57,6*
- chore	38,5	32,7
Wskaźnik ciąży - zdrowe	1,8	1,9
- chore	3,4	3,9
Okres międzyciążowy (dni) - zdrowe	76,0*	79,8*
- chore	112,0	116,0
Brakowanie (%) - zdrowe	7,7*	18,9*
- chore	37,5	34,8

Objaśnienie: n - liczba osobników * - różnica statystycznie istotna przy p < 0,05 między grupami

190 645

Tabela 8

Skuteczność terapeutyczna Lydium-KLP i antybiotyków w zespołach chorobowych po porodzie u krów.

Grupa	Stosowany preparat	Skuteczność wyleczeń %
Doświadczalna n= 8	Lydium-KLP **	80-100*
	Lydum-KL? ** n=12	60 - 87,8 *
Kontrolna n = 23	Antybiotyki (oksytetracykliny) n=11	46 - 63,6

Objaśnienia: * - skuteczność wyleczeń przy endometritis post puerperalis ** - preparat stosowano w leczeniu zespołów chorobowych (endometritis, retentio secundinarum) u krów z grupy doświadczalnej otrzymującej profilaktycznie przed porodem ten preparat i kontrolnej nie otrzymującej tego preparatu przed porodem..

PrzykładO.

Celem niniejszej pracy była kliniczna i laboratoryjna ocena wpływu preparatu LydiumKLP na przebieg doświadczalnego zakażenia wirusem grypy.

Materiał i metody

Materiał do badań stanowiło 150 myszy szczepu BALB/c samców, w wieku 6 miesięcy, żywionych standardowo, zakażonych donosowo, wirusem grypy (szczep Miami) w ilości 0,1 ml dawki zakaźnej ID50 = 10-⁵'⁵ i poddanych działaniu preparatu Lydium-KLP. Preparat podawano w jednorazowej iniekcji podskórnej w ilości 20 (podgrupa A) i 40 (podgrupa B) pg/kg masy ciała (m.c.). Myszy oddzielono na następujące grapy:

I. zakażone wirusem 24 godziny prw.ed podaniem Lydium-KLP (podgrupa A -00 i podgrupa B - 40 μ/kg m.c.), zabijane po 1 dniu trwania doświadczenia.

II. mysy j<k wyżej, zabjj^iee po 3 dniach trwama doświadczema.

III. mysy jk wyzj, , zabjj^ree po 5 dniach trwania doświadczenia.

IV. zakażone wirusem łązenie z podaniem preparatu myszy jak wyżej, zabijane po 5 dniach trwania doświadczenia.

V. mysy a ak wyżej , zabjj^ne po 3 dniach trwania doświadczenia.

VI. mysy ćak wyzj, , zabjj^ne po 5 dniach trwania doświadczenia.

VII. ztkaażtnee wrrasem w 24 godziny po podam u Lydium-KLP, ;-^rbijjmee po 5 dniach trwania doświadczenia.

VIII. mysy aiki wyżej , zabjj^ee po 3 dniach trwania doświadccenia.

IX. mysy aikc wyżej , zabjj^ee po 5 dniach trwania

X. myszy konrrohee (:;dkjażeme i podanie juh^c^i^l^o).

XI. myszy kontrole (nie Zjkjażeme i podanie pjaceboi- materiai z grap X i XI pobierano każdorazowo jak w grupach doświadczalnych.

Bd0dnid histopatologiczne - z wycinków płuc sporządzono skrawki parafinowe barwione hematoksylinąDelafield'a i eozyna wodna.

Badania zytoenzymatyczne - w płucach oznaczono aktywność enzymów markerowych struktur lizosomalnych komórek fagozytujązyzh, t.j. fosfatazy kwaśnej (FK - EC 3.1.3.2) metoda Gomoriego [12], beta - glukuronodazy (beta - GU - EC 3.2.1.31) metodą Hayashi i wsp. [12] oraz esterazy niespecyficznej alfa (alfa - EN - EC 3.1.11.) metoda Nachlasa i Seligmana [12]. Preparaty kontrolne: tzw. kontrolę ujemną stanowiły wycinki płuc inkubowane bez użycia odpowiednich substratów.

Badania ultrastrukturalne - wycinki płuc oceniono w transmisyjnym mikroskopie elektronowym Philips 301 EM.

190 645

Badania aktywności fagocytarnej neutrofili - wykonano metodą chemiluminiscencyjną (ChL) oraz przy użyciu NBT.

Wszystkie wyniki liczbowe poddano analizie statystycznej z zastosowaniem testu Schaffe'a, przy < 0,01 i p > 0,05.

Wyniki badań

W kilka godzin po inokulacji myszom wirusa grypy obserwowano osowienie, nastroszenie włosów, przyspieszony oddech, niekiedy drgawki i chowanie się w ściółkę. Objawy te były bardziej nasilone i utrzymywały się dłużej u myszy otrzymujących placebo (grupa X), t.j. około 48 godzin, aniżeli u zwierząt poddanych działaniu preparatu Lydium-KLP, u których ustępowały po kilku godzinach, Nie notowano w czasie całego doświadczenia żadnych upadków myszy.

Badanie histopatologiczne - u myszy otrzymujących preparat Lydium-KLP w ilości 20 μ/kg m.c. (grupa I podgrupa A) obserwowano obrzęk i złuszczanie się nabłonka oddechowego do światła oskrzeli i oskrzelików (bronchitis i peribronchitis desquamativa), a także do światła pęcherzyków płucnych (alveolitisj, co miejscami prowadziło do zupełnego obnażania się przegrody z nabłonka. Ponadto notowano obecność erytrocytów w świetle pęcherzyków płucnych oraz wylewy krwi do tkanki śródmiąższowej pneumonia gripposa haemorrhagicaj. Zmiany te dotyczyły niewielkich obszarów płuc, a w obok leżących pęcherzykach obserwowano płyn obrzękowy. W niektórych przewodach pęcherzykowych były widoczne słabo wybarwione błony szkliste. W tkance miedzy- i śródrazikowej stwierdzono obfite nacieki komórkowe złożone z licznych limfocytów, fibrocytów i pojedynczych granulocytów obojętnochłonnych z płatowatym jądrem pneumonia interstitialis). Podobne nacieki zapalne spotykano w tkance okołooskrzelikowej i dookoła naczyń krwionośnych tętniczych, którym czasem towarzyszyła poliferencja śródpłucnych grudek chłonnych. Podobne zmiany morfologiczne notowano u myszy otrzymujących Lydium-KLP w ilości 40 μ/kg m.c. (grapa I - podgrupa B).

W grupie X (zakażonej wirusem i otrzymującej placebo) stwierdzono najbardziej zaawansowane stany bronchitis i peribronchitis oraz alveolitis, a ponadto obecność erytrocytów w świetle pęcherzyków płucnych i krwawe wylewy do tkanki śródmiąższowej, ze zmieniającym się nasileniem do 5 dnia obserwacji.

W grupie zwierząt kontrolnych (grapa XI) nie stwierdzono zmian patologicznych.

W obu podgrupach (A i B) w trzecim dniu trwania doświadczenia (grupa II) obserwowano nasilenie i rozprzestrzenienie się zmian zapalnych w płucach.

Zmiany morfologiczne w grupie III (5 dni trwania doświadczenia), w obu podgrupach myszy, było zbliżone do opisanych w poprzedniej grupie (II), ale notowano dodatkowe drobne skupiska ziaren hemosyderyny w obrębie ognisk wynaczynionej krwi.

U myszy grupy IV spotykano w obu podgrupach (A i B) podobny obraz morfologiczny, przy czym odczyn zapalny w postaci śródmiąższowego zapalenia płuc był wyrażony słabiej niż w grupie I; nasilała się natomiast krwotoczność w narządzie.

Śródmiąższowe zapalenie płuc po 3 dniach trwania doświadczenia (grupa V), a zwłaszcza po 5 dniach (grupa VI) nasilało się w obu podgrupach (A i B) z towarzyszącym mu gromadzeniem się ziaren hemosyderyny w tkance, jako wyraz rozpadu hemoglobiny krwi.

U myszy grupy VII występowało śródmiąższowe zapalenie płuc i wylewy krwi jak w grupie II, ale odczyn zapalny w obrębie oskrzeli i oskrzelików był wyraźnie słabszy.

Obraz morfologiczny w trzecim dniu trwania doświadczenia (grupa VIII) był podobny jak w obu podgrupach z grupy VII, ale pojawiły się w obrębie wylewów krwi obfite skupiska ziaren hemosyderyny.

Po pięciu dniach eksperymentu (grupa IX) zmiany były zbliżone (obie podgrupy - A i B) jak w grupie poprzedniej.

Badania cytoenzymatyczne - aktywność cytoenzymatyczną w makro fagach (histiocytach) oraz fibroblastach tkanki płucnej w kierunku na fosfatazę kwaśną (FK), beta-glukuronidazę (beta- GU) i esterazę niespecyficzną alfa (alfa- EN) przedstawiono na ryć. 1-18. Ze względu na podobną aktywność enzymatyczną obie podgrupy t.j. A - 20 i B - 40 μ/kg m.c. Lydium-KLP, przedstawiono na rycinach łącznie.

190 645

Fosfotaza kwaśna i beta-glukuronidaza lokalizowały się w strukturach lizosomalnych komórek fagocytujących, zaś esteraza niespecyficzna alfa dodatkowo w ich catoplazmiz i z reguły notowano wyraźny wzrost aktywności wymienionych enzymów u myszy, u których stosowano preparat Lydium-KLP. W przypadku rozpadu lizosomów spotykano odczyn dyfuzyjny na wymienione enzymy.

Aktywność fegncatemιa neutrofili - w grupie II obserwowano wzrost aktywności (podgrupa A - 1991, podgrupa B - 2520 i kontrolna K - 1029) w porównaniu do grupy I (A - 570, B - 891, K - 1451), a także grupy III (A - 2677, B - 2714, K -1657) - ryć. 19-21. Natomiast w grupach IV, V i VI (jednoczesne zakażenie wirusem i indukcja Lyaium-KLP), jak również w grupie VII, VIX i IX (ierapid I^^dwL^- KLp zypraedzająca zzkażenie wiru smy) z^yńae: wartości aktywności żernej notowano już od pierwszego dnia trwania obserwacji u zwierząt poddanych terapii w/w preparatem w porównaniu z grupą, która otrzymała placebo (grupa X) - ryć. 22-24.

Badanie ultrastrukturelnz - w grupie myszy zakażonych wirusem grypy, które po 24 godzinach od momentu innCuSecji zarazka otrzymały Lydium-KLP (grupa I), obserwowano zmiany azgznzracajne na poziomie bariery krew - powietrze (ryć. 25, 26). Pnzumocyty I typu (komórki odpowiadające za proces wymiany gazowej) ulegały rozwarstwieniu, czyli oderwaniu od błony podstawowej, a więc następowała de leminecje nabłonka oddechowego. Komórki te pozbawione były błonki wyściółkowzj pęcherzyków płucnych, czyli surfaktantu. Ponadto pnzumocyta wykazywały daleko posunięte zmiany degznzrecyjnz, t.j. CariopyCtozę, rozdęcie i fregmzntację siateczki śróaplazmetycznzj oraz wakuoliozę cytopOazma podstawowej. W sąsiedztwie tak zmienionych komórek stwierdzono makrofagi, które wwędrowały z obszaru naczyń włosowatych pęcherzyków płucnych. Zmianom azgznerecajnam ulegały także pnzumocata II typu (ziarniste) Podobne zmiany morfologiczne obserwowano po 3 (grupa II) i po 5 (grupa III) dniach trwania doświadczenia - ryć. 27, 28.

W grupie myszy, którym inokulnweno wirus grypy równocześnie z podawaniem Lydium-KLP (grupa IV), stwierdzono słabiej wyrażone zmiany degznerecajnz komórek nabłonka oddechowego. Po 24 godzinach trwania doświadczenia (ryć., 29, 30) notowano mniejszego stopnia zwieny degeneracyjne, szczególnie pneumocytów II typu. Zostały zachowane w nich ciałka bleizkowete, natomiast mitochonarie i siateczka śródplazmatyczna były w ιϊ^ΙζΙ^ζ stopniu zwϊeninne. Komórki te były więc w stanie odtworzyć błonę wyściółkową, która zwykli ulega zerwaniu wraz zz złuszczającywi się pnzumncytemi I typu. Podobni zmiany obserwowano po 3 (grupa V) i po 5 (grupa VI) dniach trwania doświadczenia - ryć. 31,32.

W grupie mysz, którym podanie Lydum-KLP poprzedzało o 24 godziny zakażenie wirusem grypy (grupa VII) obserwowano wyraźni ochronne działanie badanego preparatu (ryć. 33-36). Elementy strukturalne stanowiące barierę krew - powiztrzz były tylko w niewiIlCim stopniu zmienione. Niektóre pnzumocyty I typu wykazywały rozdęcie siateczki śródplazmatycznij, przejaśnieniz cytoplazmy podstawowej oraz przerwy w ciągłości błonki wyściółkowzj. Przedstawiony obraz ultrastrukturalny był podobny równizż w grupie VIII i IX.

Omówiznie

Zmiany morfologiczne w obrębie tkanki płucnej u myszy spowodowane inokulacją donosową wirusa grypy szczepu Miami, były wz wszystkich grupach doświadczalnych jakościowo takie sami, różniły się natomiast ilościowo. Preparat Lydium-KLP podany takim zwierzętom w 24 godziny po zakażeniu wirusem grypy niz wpływał moailującn na obraz zmian zapalnych w płucach. Natomiast pewizn hamujący wpływ w/w preparatu na proces grypowego śródmiąższowego zapalznia płuc notowano u wyszy, którym preparat podawano w tym samym czasie, co wirus. Jeszcze lepiej było to widoczni u zwizrząt, które wpierw otrzawawały aaaiuw-κap, a następnie zostały zakażone wirusie grypy. Jednocześnie należy zaznaczyć, że obraz zmian morfologicznych w płucach masza był z reguły podobny lub taki sam w obu obserwowanych podgrupach (podgrupa A - 20 i podgrupa B - 40 (μ/kg w.c.), a więc dawka Lyaiuw-KaP niz wiała w tyw wypadku specjalnego wpływu na obraz mikroskopowy narządu.

Na poziomiz ultraitrukturaOnyw obserwowano wówczas dzlawinację nabłonka oddechowego ipneuwoca^Γtów I typu) z następowym zniizczzniew surfaktantu oraz istotne zmiany wsteczni, wanifeitująci się karipyknozą, rozdęcizw i fragwentacją siateczki śródplazmatycznej

190 645 oraz wakuolizacją cytoplazmy. Procesom degeneracyjnym podlegały także pneumocyty II typu. Opisywane zmiany były wyraźnie słabsze u myszy otrzymujących preparat Lydium-KLP jednocześnie z wirusem, co szczególnie dotyczyło pneumocytów II typu. Najlepsze, ochronne działanie w/w preparatu notowano jednak u myszy, gdzie terapia wyprzedziła inokulację wirusa.

Obserwowane u badanych myszy komórki fagocytarne, zwane także komórkami MPS (mononuklear phagocytes system) lub PMN (komórkami polimorfonuklearnymi), ulegały wyraźnemu pobudzeniu, co wyrażało się wzrostem aktywności enzymatycznej na fosfotazę kwaśną, betaglukuronidazę i esterazę niespecyficzną alfa. Stymulacja tych komórek jest podstawowym mechanizmem obrony immunologicznej i przeciwwirusowej, w następstwie której wytwarzane są różne cytokliny (interferon, interleukiny) i pobudzona aktywacja swoistych i nieswoistych procesów odpornościowych kontrolowanych przez limfocyty B i T i komórki NK (natural killers) - (2.4.6-8.11.14). Aktywowane fagocyty zwane „gniewnymi makro fagami” mogą niszczyć wirusy w drodze cytolitycznej i cytotoksycznej, produkcji defektowych wirionów oraz syntezę interferonu (7.9.13). Makrofagi wykazują bezpośrednią cytotoksyczność wobec zakażonych wirusami komórek, niezależnie od specyficznych przeciwciał ani obecności składników dopełniacza, a także hamują replikację wirusów wydzielających argininazę, interferującą z wykorzystaniem argininy przez cząsteczki wirusa [4,10,11]. Kontakt z pewnymi antygenami, np. glikoproteidem D wirusa Herpes simplex, powoduje gwałtowną syntezę interferonów przez makrofagi, co chroni sąsiednie komórki gospodarza przed zakażeniem.

Po infekcji wirusem grypy większość białek produkowanych w cytoplazmie i prezentowanych na powierzchni komórki, stanowią peptydy wirusa, stąd przyjmuje się, że ich antygeny stymulują głównie limfocyty CDg⁺[2], Także limfocyty CD4+ wykazują bezpośrednie zdolności cytotoksyczne i tym sposobem przyczyniają się do usuwania komórek zakażonych wirusem. Komórki te produkują interferon i interleukinę 2 [13]. Udział limfocytów; wprawdzie w niewielkiej ilości, zaobserwowano także w badaniach własnych u myszy zakażonych wirusem grypy.

Komórki T cytotoksyczne reagują nie tylko ze szczepem wirusa, na który były uczulone, ale również w przypadku jego modyfikacji antygenowej, co występuje w zakażeniach wirusem grypy [13]. Najbardziej skutecznym mechanizmem zwalczania wirusów są komórki, które działają przez receptor Fc, który wiąże fragment immunoglobuliny, opłaszczając komórkę zakażoną wirusem. Dowodem na znaczenie limfocytów T dla powstawania odporności przeciwko wirusom są chorzy z defektem produkcji przeciwciał (hipogammaglobulinemia), u których zachowana jest zdolność do zwalczania infekcji wirusowych, np. grypy [13]. Po przechorowaniu grypy pozostają cytotoksyczne limfocyty T pamięci, które rozpoznają główne białka kapsydu wirusa (nukleoproteiny).

Do nieswoistych elementów odporności komórkowej należą także neutrofile, które mogą m.in. fagocytować wirusy lub niszczyć je na drodze zewnątrzkomórkowej lizy. Jednakże w zakażeniu wirusem grypy najczęściej dochodzi do neutropenii.

W badaniach własnych obserwowano wzrost aktywności tych komórek, zwłaszcza u myszy, u których podanie preparatu Lydnim-KLP poprzedzało zakażenie lub następowało równocześnie z inokulacją wirusów grypy. Supresyjne działanie wirusa było najprawdopodobniej kompesowane immunostymulacyjnym działaniem w/w preparatu na produkcję neutrofilów.

Wnioski:

1. Preparat Lydium-KLP podany myszom w iniekcji w ilości 20 i 40 μ/kg m.c. hamuje rozległość 1 nasilanie śródmiąższowego zapalenia płuc, wywołanego wirusem grypy szczepu Miami.

2. Najsilniejsze działanie wywiera Lydium-KLP podany na 24 godziny przed inokulacją wirusa, słabsze u myszy jednocześnie zakażonych i leczonych, nie zmienia obrazu morfologicznego u zwierząt wcześniej zakażonych, a następnie poddanych terapii.

3. Preparat Lydium-KLP wzmaga niespecyficzne mechanizmy odporności komórkowej organizmu myszy - zakażonych wirusem grypy przez:

a) Pobudzenie aktywności enzymatycznej (FK, beta- GU i EN-alfa) fagocytów płucnych (makrofagi i fibroblasty) oraz

b) Uaktywnienie fagocytarności neutrofilów.

190 645

Przykład IV.

Celem badań było prześledzenie skuteczności profilaktycznej Lydium-KLP loch ciężarnych zagrozonych wystąpieniem objawów zespołu CM.

Materiały i metody

Zwierzęta doświadczalne: Badania wykonano na 120 lochach ciężarnych, losowo wybranych z grup liczących 360 i 400 samic, rasy pbz (polskiej białej zwisłouchej) o średniej masie ciała w dniu rozpoczęcia doświadczenia 208 ± 15 kg.

Stosowanie leku: Do badań użyto preparatu Lydium-KLP dostarczonego przez firmę NIKA Health Products, LTD. Preparat podawano w iniekcji w dawce 0,02 mg dimeru lizozymu (kg masy ciała, jednorazowo w 10 dniu lub dwukrotnie - w 10 i 3 dniu przed porodem, domięśniowo (intra muscularis).

Układ doświadczenia: Losowo wytypowane samice z obiektów o dużej częstotliwości występowania u loch zespołu CM (coliform mastitis) dzielono na 2 grupy - doświadczalną i kontrolną. Badania przeprowadzono w 3 powtórzeniach liczących po 20 samic w każdej grupie. Łącznie każda grupa - doświadczalna i kontrolna obejmowała po 60 loch. Lochy zgodnie z protokołem badań oznaczone numerami 1 do 69 - grupa doświadczalna i 61 - 120 grupa kontrolna. Lochy z grupy doświadczalnej oznaczono numerami 41 do 60 otrzymały LydiumKLP dwukrotnie tj. w 10 i 3 dniu przed porodem, domięśniowo w ilości odpowiadającej ich masie ciała. Lochy z grupy kontrolnej nie otrzymały Lydium-KLP Lochy z obu grup przebywały w identycznych warunkach środowiskowych - indywidualnych kojcach porodowych, i żywieniowych - otrzymywały paszę pełnoporcjową pokrywającą ich zapotrzebowanie bytowe i na rozwijający się płód. Obserwacje kliniczne loch w obu grupach prowadzone były od dnia podania preparatu do podjęcia przez lochy nowego cyklu rozrodczego po odsądzeniu prosiąt tj. przez 3 miesiące.

Badania kliniczne obejmowały:

- rejestracje objawów ogólnych - apetyt, osowiałość

- wewnętrznie w ciągu dnia mierzenie wewnętrznej ciepłoty loch od 2 dnia przed porodem do 5 dnia po porodzie

- przebieg porodu - czas trwania, odejście błon płodowych

- przebieg okresu poporodowego (puerperium) i zdarzenia chorobowe.

Samice, u których stwierdzono objawy ogólne lub objawy ze strony dróg rodnych i gruczołu mlekowego, wzrost ciepłoty wewnętrznej do 39,5°C lub wyższy zaliczano do grupy samic chorych i poddawanych leczeniu.

Rejestrowano także zdarzenia chorobowe u prosiąt do 7 dnia życia..

Badania laboratoryjne krwi 40 samic z każdej grupy przeprowadzono dwukrotnie: w 10 dniu przed podaniem Lydium-KLP przed porodem iw 10 dniu po porodzie oznaczając wybrane wskaźniki odporności komórkowej ihimioralnej. Wskaźniki odporności komórkowej oznaczono przy pomocy uznanych i stosowanych testów:

- test transformacji blastycznej pod wpływem mitogenu fitohemaglutininy (LF-7) wg Angusa i Yungs

- testu fagocytamego wg metody Wrighta w modyfikacji Doleżala, określając liczbę Hamburgera oraz indeks Wrighta i Daviesa

- testu redukcji błękitu nitrotetrazolinowego (NBT) wg Romana i Polanda

- testu estrazowego wg Muellera.

Wskaźniki odporności humoralnej oznaczono poprzez:

- oznaczenie poziomu białka całkowitego i jego frakcji w surowicy metodą biuretową wg Gomalla w modyfikacji Tomaszewskiego i rozdziału elektroforetycznego na octanie celulozy

- oznaczenie obrazu białkokrwinkowego

Uzyskane dane z obserwacji klinicznych zostały zachowane i znajdują się w kartach indywidualnych loch i stanowią załącznik do sprawozdania końcowego.

Skuteczność profilaktyczną preparatu Lydium-KLP podanego lochom przed porodem na wystąpienie u nich zespołu CM określono wyliczając:

- wskaźnik zachorowalności loch tj. liczba loch, u których wystąpił zespół CM wyrażona w%

190 645

- wartość badanych wskaźników immunologicznych przed i po porodzie

- śmiertelność prosiąt w okresie występowania zespołu CM u loch tj. liczba padłych prosiąt w następstwie wystąpienia zespołu CM u lochy

- efekty ekonomiczne obejmujące padłe prosięta, opóźnioną gotowość rozrodczą, zaburzony przebieg okresu poporodowego (puerperium).

Analiza statystyczna: Otrzymane wyniki statystyczne poddano analizie statystycznej przy użyciu testu t-Studenta. Uzyskane wyniki porównywano do wartości otrzymanych w równolegle prowadzonej grupie kontrolnej. W tabelach przedstawiono średnie arytmetyczne otrzymanych wyników (x) i odchylenia standardowego (SD ±).

Wyniki badań

Zachorowalność loch po porodzie w poszczególnych grupach i występujące u nich zespoły chorobowe przedstawiono w tab. 9 i 10. Straty wśród prosiąt w pierwszych dniach ich życia z uwzględnieniem zdrowotności loch przedstawiono w tab. 9 i 10. Straty wśród prosiąt w pierwszych dniach ich życia z uwzględnieniem zdrowotności loch przedstawiono w tab. 11 i 12. W tabeli 13 przedstawiono efekty profilaktycznego stosowania Lydium-KLP u loch. W tabeli 13a przedstawiono skuteczność terapeutyczną Lydium-KLP i antybiotyków. Stan immunologiczny loch przed i po podaniu preparatu przedstawiono w tab. 14 - 17. W grupie doświadczalnej u 7 loch (11,7%) wystąpiły objawy kliniczne zespołu CM (tabela 107. W grupie kontrolnej zespół CM stwierdzono u 25 loch (41,7%). W grupie doświadczalnej zespół CM z pełnymi objawami klinicznymi wystąpił u 1,7% loch, w grupie kontrolnej u 10%. Wyraźne zmiany zapalne błony śluzowej macicy wystąpiły u 3,40% loch w grupie doświadczalnej i u 13,30% loch w grupie kontrolnej. Zmiany kliniczne w obrębie gruczołu mlekowego u 5,1% populacji loch z grupy doświadczalnej i u 10% populacji loch z grupy kontrolnej. Nasilenie objawów klinicznych u loch z grupy kontrolnej było widoczne i utrzymywały się one dłużej niż u loch z grupy doświadczalnej. Zróżnicowane nasilenie objawów klinicznych u loch w poszczególnych grupach znalazło odzwierciedlenie w stratach spowodowanych padnięciami prosiąt (tabele 11 i 12). W grupie doświadczalnej w pierwszych 7 dniach po porodzie padło 4,9% prosiąt. Wśród nich 3,6% prosiąt pochodziło od loch zdrowych i 14,5% od loch, u których wystąpił zespół CM. W grupie kontrolnej w analogicznym okresie padło 12,2% urodzonych prosiąt, z których 3,5% pochodziło od loch zdrowych i 24,8% od loch chorych (tabela 12). Obserwowane różnice w padnięciach prosiąt między grupami były statystycznie istotne (p < 0,01). Obserwowany odsetek upadków wśród prosiąt pochodzących od loch zdrowych jest wartością akceptowaną przez wielu autorów w kraju i za granicą. Stwierdzone różnice w odsetku upadków wśród prosiąt pochodzących od loch z objawami klinicznymi zespołu CM można łączyć z nasileniem objawów chorobowych u samic. U samic z grupy doświadczalnej, u których wystąpiły objawy zespołu CM mimo podania preparatu Lydium-KLP, miały one słabsze nasilenie, łagodniejszy przebieg oraz wyraźnie był krótszy ich czas trwania, niż u loch z grupy kontrolnej po zastosowanym leczeniu. U samic z grupy doświadczalnej zastosowano w terapii Lydium-KLP. Jednorazowe podanie tego preparatu zastosowano u 5 loch i dwukrotnie u 2 loch - u jednej z pełnymi objawami klinicznymi zespołu cm oraz u lochy z wyraźnymi zmianami zapalnymi gruczołu mlekowego - uzyskując zadowalające efekty terapeutyczne. W terapii zespołu CM u 12 loch zastosowano Lydium-KLP, u 13 loch antybiotyki z grupy oksytetracyklin z oksytocyną. Podanie Lydium-KLP lochom z grupy kontrolnej powodowało po 24 - 36 godzinach obniżenie ciepłoty wewnętrznej samic, korzystne zmiany w ilości, charakterze i zapachu wypływów z dróg rodnych. W drugim dniu po podaniu preparatu ciepłota wewnętrzna samic wahała się od 39,2 do 39,4°C, wzrosło zainteresowanie potomstwem oraz chęć przyjmowania paszy. U loch z tej grupy otrzymujących antybiotyki z grupy oksytetracyklin obniżenie ciepłoty wewnętrznej następowało wolniej i dopiero po 5 dniu po podjęciu leczenia ciepłota wewnętrzna wracała do normy. Wolniej też cofały się zmiany zapalne w gruczole mlekowym i drogach rodnych, proces chorobowy przebiegał wolno, okres rekonwalescencji był o 10 do 14 dni dłuższy, lecz w podobnych przypadkach u loch leczonych

197 645

Lydium-KLP, a skuteczność terapeutyczna określona zdolnością podjęcia funkcji rozrodczych przez samice - niższa. Skuteczność terapeutyczna w grupie loch otrzymujących się przed porodem Lydium-KLP wynosiła 100% natomiast u loch z grupy kontrolnej leczonych Lydium-KLP 91,7% i 76,9% leczonych antybiotykami. Zachorowalność loch, nasilenie objawów klinicznych, przebieg okresu poporodowego puerperium.) i rekonwalescencji, straty wśród prosiąt były odzwierciedleniem stanu immunologicznego loch. Średnie wartości analizowanych wskaźników odporności u loch z obu grup w ostatniej dekadzie ciąży w badaniu populacji samic mieściły się w przedziale wartości określanych przez wielu autorów jako poprawne. Wartości tych wskaźników przed porodem przedstawiono w tab. 6 - 9. Po porodzie u loch z grupy kontrolnej wystąpił spadek aktywności fagocytarnej leukocytów o 38%, spadek aktywności granulocytów obojętnochłonnych o 13% oraz transformujących pod wpływem LE-7 o 8,5%, a także zmniejszyła się ilość leukocytów w obrazie białokrwinkowym o 4,7%, globulin alfa o 0,9%, gammaglobulin o 2,6% przy wzroście białka ogólnego o 3,5%. Stan ten wskazuje na poporodową niszę immunologiczną w jakiej znalazł się organizm samic po porodzie i wywarł wpływ na wartość analizowanych parametrów klinicznych, a szczególnie zachorowalność loch, nasilenie objawów klinicznych, śmiertelność prosiąt. U loch z grupy doświadczalnej po porodzie obserwowano wzrost stanu immunologicznego wyrażający się wzrostem aktywności fagocytarnej wyrażonej liczbą Hamburgera o 65,2%, wskaźnikiem Wrighta o 44% oraz aktywnością granulocytów obojętnochłonnych (NBT) o 37,2%, w porównaniu a aktywnością tych wskaźników u loch z grupy kontrolnej. Nastąpił także statystycznie istotny p < 0,01 wzrost odsetka limfocytów esterazododatnich i transformujących pod wpływem LF-7 o 11,0% i 82,0% w porównaniu z wartościami tych wskaźników u loch z grupy kontrolnej. Obserwowano również statystycznie istotny p < 0,01 wzrost poziomu białka całkowitego, albumin i globulin alfa, beta i gamma. Szczególnie wyraźny wzrost obserwowano we frakcji gamma tych białek (tabela 16). W obrazie białkowinkowym wystąpiły korzystne zmiany ilościowe we frakcji granulocytów obojętnochłonnych - wzrost o 17,8% i kwasochłonnych o 21,2%. Status immunologiczny loch po porodzie otrzymujących przed porodem Lydium-KLP znalazł odzwierciedlenie w nasileniu zaburzeń chorobowych i potwierdził założenie przedstawionej pracy, że stosując immunomodulator jakim jest Lydium-KLP u loch może ograniczyć zachorowalność loch na CM, zmniejszyć straty wśród prosiąt i osiągnąć wymierne korzyści ekonomiczne mierzone padnięciami prosiąt, zaburzeniami cyklu rozrodczego i schorzeniami występującymi u loch. Potwierdzeniem tego są wyniki badań klinicznych zawartych w tabelach 9-13, immunologicznych zawartych w tabelach 14-17 oraz kartach klinicznych loch.

Wnioski:

1. Lydium-KLP (czynnik aktywny - dimer limozynu) podane lochom w ostatniej dekadzie ciąży wykazuje działanie profilaktyczne w stosunku do zespołu chorobowego CM (coliform mastitis).

2. Lydium-KLP zastosowane profilaktycznie u loch ciężarnych ogranicza straty wśród prosiąt pochodzących od matek z zespołem CM.

3. Lydium-KLP zastosowane profilaktycznie u loch ciężarnych wywiera korzystny wpływ na przebieg okresu poporodowego i podjęcia aktywności rozrodczej po odłączeniu prosiąt

4. Lydium-KLP zastosowane profilaktycznie u loch ciężarnych przynosi wymierne korzyści ekonomiczne poprzez zmniejszenie zachorowalności loch, strat wśród prosiąt i skrócenia okresu przestoju poporodowego.

190 645

Tabela 9

Zachorowalność loch po porodzie.

Grupa	Doświadczalna N = 60	Kontrolna N = 60
I	II	III	I	II	III
Samice sztuk	16	18	19	10	12	13
Zdrowe %	80,0	90,0	95,5	50,0	60,0	65,0
X%	88,3*	58,5
Samice sztuk	4	2	1	10	8	7
Chore %	20,0	10,0	5,0	50,0	40,0	35,0
X%	11,7*	41,7

Objaśnienie: I, II, III - powtórzenia o n = 20 samic * - różnica statystycznie istotna przy p < 0,01

Tabela 10

Zespoły chorobowe u loch po porodzie

Grupa	Doświadczalna n = 60	Kontrolna n = 60
n = 7/11,7%	%	n = 25/41,7%%	%
Z pełnymi objawami CM	1	1,70*	6	10,00
Z objawami metritis	2	3,40*	8	13,30
Z objawami mastitis	3	5,10*	6	10,00
Z objawami mieszanymi	1	1,70*	5	8,30

Objaśnienie' * - różnica statystycznie istotna przy p < 0,01

Tabela 11

Straty wśród prosiąt w okresie okołoporodowym

Grupa loch	n	Prosięta
Urodzone	Padłe do 7 dnia życia	Odsetek upadków
Doświadczalna	60 X	590 9,8 ± 1,2	29*	4,9%*
Kontrolna	60 X	588 9,8 ± 1,4	72	12,2%

Objaśnienie * - różnica statystycznie istotna przy p < 0,01 n - liczebność grupy x - średnia liczebność miotu

190 645

Tabela 12

Straty wśród prosiąt w zależności od zdrowotności loch

	Grupa
Samice % Zdrowe (a) Chore (b)	Doświadczalna n = 60	Kontrolna n = 60
88,3*			58,3
	11,7*			41,7
Prosięta urodzone
Sztuk	590,0			588,0
(a)	521,0			346,0
(b)	69,0			246,0
Padłe do 7 dnia %
(a)	3,6			3,5
(b)	14,5%			24,8

Objaśnienie: * - różnica statystycznie istotna przy p < 0,01

Tabela 13

Efekty profilaktycznego stosowania Lydium-KLP u loch przed porodem.

Grupa	Doświadczalna	Kontrolna
Badane wskaźniki	n = 60	n = 60
Skuteczność profilaktyczna	88,30% 80,0-95,0	0
Zachorowalność	11,70%	41,70%
Padnięcia prosiąt do 7 dnia życia	4,90%	12,20%
Aktywność płciowa po odsądzeniu . prosiąt (dni)	7-10	16-25

Tabela 13a

Skuteczność terapeutyczna Lydium-KLP i antybiotyków w zespołach chorobowych u loch.

Grupa	Stosowany preparat	Skuteczność wyleczeń%
Doświadczalna	Lydium-KLP	100,0
Kontrolna	Lydium-KLP Oksytetracykliny	91,7 76,9

190 645

Tabela 14

Aktywność polimorfonuklearnych leukocytów u loch w okresie okołoporodowym.

Test	N = 40	Przed porodem	Po porodzie
Bez stymulacji	Po stymulacji
		X	42,00	25,90	69,38*
	Liczba Hamburgera	S±	20,20	8,58	14,32
<		Δ %	-	- 38,33	+ 65,19
N
o
H (j	Wskaźnik Wright'a	X	12,00	17,40	25,08*
o		S±	5,85	4,48	6,75
<
U-					109, 0
		Δ %	-	+ 45,00
					44. 14
	% komórek	X	39,10	34,00	53,63*
	NBT	S ±	9,69	12,20	7,79
	dodatnich	Δ %		- 13,04	+ 37,16

Objaśnienia Δ % - procentowy wzrost lub spadek wartości * - różnica statystycznie istotna przy p < 0,01

Tabela 15

Profil odporności komórkowej u loch w okresie okołoporodowym.

Test	N = 40	Przed porodem	Po porodzie
Bez stymulacji	Po stymulacji
	X	59,90	68,20	75,75*
% limfocytów esterazododatmch	S±	5,67	3,77	6,58 26. 46
	Δ %		+ 13,86	+ \ 11, 07
Transformacja blastyczna limfocytów	X	18,40	18,40	36,58
S±	4,38	4,38	10,43
pod wpływem LF -7	Δ %	-8,46	- 8,46	+ 82,00

Objaśnienia. Δ% - procentowy wzrost lub spadek wartości * - różnica statystycznie istotna przy p < 0,01

190 645

Tabela 16

Poziom białka i jego frakcji u loch w okresie okołoporodowym.

Parametry	N = 40	Przed porodem	Po porodzie
Bez stymulacji	Po stymulacji
Białko całkowite	X S±	49,95 5,51	Δ %	51,70 3,25	+ 3,50	69,13* 17,74	+	38,40 33,71
		X	18,02		19,37		29,25 *		62,32
Albuminy		S±	2,12	Δ %	1,04	+ 7,49	9,03	+	51,01
		X	11,25		11,15		12,58*		11,8
	Alfa	S±	2,47	Δ %	1,71	-0,89	5,20	+	12,8
		X	8,35		9,11		9,67		15,81
Globuliny Frakcje	Beta			+
		S ±	1,61	Δ %	2,36	+ 9,1	2,87		6,15
		X	12,34		12,02		17,82*		44,41
	Gamma	s±	2,58	Δ %	1,97	-2,59	5,31	+	48,25

Objaśnienia' Δ% - procentowy wzrost lub spadek wartości * - różnica statystycznie istotna przy p < 0,01

Tabela 17

Obraz białkokrwinkowy u loch w okresie okołoporodowym

Parametry	N = 40	Przed porodem	Po porodzie
Bez stymulacji	Po stymulacji
1	2	3	4	5
		X	72,10	68,70	70,63
Limfocyty		S±	4,51	4,81	3,03
		Δ %		-4,72	- 2,04
		X	7,40	7,60	7,92
Monocyty		S±	2,50	3,37	2,10 + 7,03
		Δ %		+ 2,70	+ 4,21
		X	16,5	20,20	23,8*
Granulocyty	O			Δ% + 22,40	+ 44,24 + 17,82
		S±	4,95	4,24	1,86

197 645

1	2	J	4	5
		X
	z		1,20	1,00	1,30
			0,45	-	0,46
Granulocyty		S±
	X	4,00	3,00	4,85*
	K				+ 21,25
			Δ% + 25,00	+ 61,67
		S±	1,30	1,15	1,81

Objaśnienia' O - obojęnochlonne, Z - zasadochłonne, K - kwasochłonne * - różnica statystycznie istotna przy p < 0,01

Przykład V.

Celem badań było prześledzenie skuteczności profilaktycznej Lydium-KLP na występowanie zespołów chorobowych u prosiąt w okresie odsadzeniowym.

Materiały i metody

Zwierzęta doświadczalne: Badania wykonano na 586 prosiętach 6 tygodniowych, pochodzących z 52 miotów, klinicznie zdrowych, o masie ciała 11,6 do 12,8 kg.

Stosowanie leku: Do badań użyto preparatu Lydium-KLP - czynnik aktywny dimer lizozymu, dostarczony przez NIKA Health Products, LTD. Preparat podawano w iniekcji, w dawce 0,02 mg substancji aktywnej/kg masy ciała, jednorazowo, domięśniowo w dniu odsadzenia prosiąt od lochy.

Układ doświadczenia: Losowo wytypowane mioty podzielono na 2 grupy - doświadczalną obejmującą 26 miotów z 290 prosiętami i kontrolną obejmującą 26 miotów z 296 prosiętami. Mioty zgodnie z protokołem badań oznaczono numerami 1 do 26 - grupa doświadczalna i 27 do 52 - grupa kontrolna. Prosięta w poszczególnych miotach oznaczone były tym samym numerem miotu. Prosięta z miotów tworzących grupę doświadczalną otrzymały w dniu odsadzenia od lochy Lydium-KLP, jednorazowo, w dawce 0,02 mg/kg dimeru lizozymu domięśniowo w ilości odpowiadającej ich masie ciała. Prosięta z miotów tworzących grupę kontrolną nie otrzymały Lydium-KLP ani placebo. Prosięta z obu grup przebywały w identycznych warunkach środowiskowych i żywieniowych - otrzymywały paszę pełnoporcjową pokrywającą ich zapotrzebowanie na składniki odżywcze. Obserwacje kliniczne prowadzono przez 4 tygodnie po podaniu preparatu, w obu grupach.

Obserwacje kliniczne obejmowały:

- dwukrotnie w ciągu dnia lustracje miotów

- rejestrację zdarzeń chorobowych

- terapie zespołów chorobowych

- kontrole zużycia paszy

- kontrole przyrostów ciała

- dokumentację padnięć prosiąt

Uzyskane dane z obserwacji klinicznych znajdują się w tabelach i na załączonych rysunkach fig. 1 do fig. 32.

Skuteczność profilaktyczną preparatu Lydium-KLP podanego prosiętom w dniu ich odłączenia od lochy pa wystąpienie u nich zespołów chorobowych po odsądzeniu określono wyliczając:

- wskaźnik zachorowalności prosiąt w miocie - tj. liczba prosiąt w miocie, u których wystąpiły zespoły chorobowe, wyrażona w %

- wskaźnik zachorowalności prosiąt w grupie - tj. liczba prosiąt w grupie doświadczalnej lub kontrolnej, u których wystąpiły zespoły chorobowe, wyrażona w %

- skuteczność profilaktyczną tj. liczba prosiąt, u których nie wystąpiły zespoły chorobowe w stosunku do liczby zwierząt, które otrzymały lydium-klp

- padnięcia prosiąt - liczba zwierząt padłych w poszczególnych miotach i grupach w następstwie wystąpienia zespołów chorobowych po ich odsądzeniu

- zużycie paszy i przyrost ciała w okresie doświadczalnym w poszczególnych miotach i grupach.

190 645

Analiza statystyczna: Otrzymane wyniki badań poddano analizie statystycznej przy użyciu testu t-Studenta. Uzyskane wyniki porównano do wartości otrzymanych w równolegle przeprowadzonej grupie kontrolnej. W tabelach przedstawiono średnie arytmetyczne otrzymanych składników (x) i odchylenia standardowe (Sd ±).

Wyniki badań:

Średnią masę ciała prosiąt oraz liczebność miotów w dniu przerzutu technologicznego w obu grupach przedstawiono w tabelach 18 i 19. Masa ciała w obu grupach mieściła się w przedziale wartości przyjmowanych jako odpowiednie dla danego wieku, tj. 42 dnia życia. Wg wielu autorów masa ciała prosiąt w dniu odłączenia od lochy ma istotny wpływ na intensywność występowania zespołów chorobowych w dalszym etapie chowu. Zachorowalność oraz padnięcia prosiąt w miotach w obu grupach przedstawiono w tabelach 20 i 21 i na wykresie fig. 1. W 11 miotach u prosiąt z grupy doświadczalnej nie wystąpiły zespoły chorobowe manifestujące się biegunką.. W pozostałych 15 miotach grupy doświadczalnej, liczących od 10 do 12 prosiąt każda, zespoły chorobowe manifestujące się biegunką wystąpiły u 1 do 3 prosiąt w miocie. Zachorowalność prosiąt w grupie doświadczalnej wynosiła 10,34% i nie wystąpiły upadki prosiąt. W poszczególnych miotach w tej grupie (tabela 20 3) zachorowalność prosiąt wahała się od 0 do 30%.

W grupie kontrolnej tylko w jednym miocie u prosiąt nie wystąpiły zespoły chorobowe manifestujące się biegunką. W pozostałych miotach zachorowalność prosiąt wahała się od 9,1 do 60%, padło 5,74% prosiąt z tej grupy. Zachorowalność prosiąt w grupie kontrolnej wynosiła 32,43% i była statystycznie istotna (p < 0,01) wyższa niż w grupie doświadczalnej.

Skuteczność profilaktyczna (ochronna) preparatu Lydium-KLP (czynnik aktywny dimeru limozynu) wynosiła 89,7% i wahała się od 70 do 100% w poszczególnych miotach. W grupie doświadczalnej u prosiąt z objawami biegunki zastosowano jednorazowo preparat Lydium-KLP w dawce przyjętej w doświadczeniu uzyskując zadowalający efekt terapeutyczny.

Potwierdzeniem skuteczności profilaktycznej i terapeutycznej preparatu jest brak padnięć prosiąt oraz wartość wskaźników zootechnicznych - przyrosty masy ciała i zużycie paszy w okresie doświadczalnym. W grupie kontrolnej u 50 prosiąt z objawami biegunki zastosowano terapię antybiotykową zgodnie z przyjętymi schematami leczenia opartymi na oxytetracyklinach, u 46 prosiąt zastosowano Lydium-KLP bez antybiotyków, w tym u 32 prosiąt jednorazowo i 14 prosiąt dwukrotnie. Zastosowanie Lydium-KLP w terapii biegunek w grupie kontrolnej okazało się bardziej efektywne terapeutycznie niż terapia antybiotykowa.

Obserwowano w grupie prosiąt leczonych Lydium-KLP krótszy okres rekonwalescencji, szybsze ustępowanie objawów biegunki, szybsze przyjmowanie karmy i mniejsze straty masy ciała w okresie leczenia niż w grupie prosiąt leczonych wyłącznie antybiotykami.

Korzystne efekty terapeutyczne preparatu Lydium-KLP u prosiąt znalazły odzwierciedlenie w przyrostach masy ciała i zużyciu paszy. W grupie doświadczalnej średnie dzienne przyrosty masy ciała prosiąt w okresie doświadczalnym były wyższe o 13,2% przy mniejszym o 11,0% zużyciu paszy na przyrost 1 kg masy ciała niż w grupie kontrolnej.

Przedstawione wyniki badań pozwalają stwierdzić, że preparat Lydium-KLP zastosowany u prosiąt w dniu przerzutu technologicznego (odsadzanie od lochy) wykazał korzystne działanie profilaktyczne manifestujące się ograniczeniem zachorowań prosiąt w okresie poodsadzeniowym - do 4 tygodni po translokacji, zmniejszył zużycie paszy oraz zwiększył przyrosty dzienne masy ciała prosiąt w porównaniu z prosiętami nie otrzymującymi tego preparatu.

Wnioski:

1. Lydium-KLP (substancja aktywna - dimer limozynu) podane prosiętom w dniu przerzutu technologicznego wykazuje działanie profilaktyczne w odniesieniu do zespołów chorobowych okresu odsadzeniewego.

2. Lydium-KLP zastosowane profilaktycznie u prosiąt ogranicza ich zachorowalność i padnięcia, zwiększa przyrosty dzienne masy ciała i zmniejsza zużycie paszy.

3. Profilaktyczne stosowanie Lydium-KLP łagodzi przebieg zespołów chorobowych u prosiąt manifestujących się biegunkami.

4. Lydium-KLP (substancja aktywna - dimer limozynu) ma korzystny wpływ na efekty ekonomiczne w odchowie prosiąt.

190 645

Tabela 18

Średnia masa prosiąt w dniu przerzutu technologicznego (odłączenie od lochy) w miotach grupy doświadczalnej.

Grupa	Doświadczalna
Nr miotu	Liczebność miotu w dniu przerzutu technologicznego	Średnia masa ciała w dniu przerzutu technologicznego
sztuk	kg
1.	11	10,5 + 0,8
2.	10	11,0 ±0,5
3.	12	10,2 ± 0,6
4	10	11,2 + 0,8
5.	10	11,0 ±0,6
6.	11	11,3 + 0,7
7.	12	10,8 ±0,5
8.	12	10, 8 ±0,7
9.	11	10,5 ±0,8
10.	11	10,8 ± 0,7
11.	12	10,5 ± 0,6
12.	11	11,6 ± 0,5
13.	11	10,8 ±0,6
14.	12	10,9 ±0,8
15.	11	10,7 ± 0,9
16.	12	10,8 + 0,7
17	10	11,8 + 0,8
18.	11	10,6 ± 1,0
19.	11	10,9 ±0,8
20.	12	11,0 ±0,6
21.	12	11,8 ±0,7
22.	11	12,4 ± 0,5
23.	11	12,5 ± 0,7
24.	11	11,5± 0,9
25.	12	10,8 ±0,8
26	10	12,8 ±0,7

190 645

Tabela 19

Średnia masa ciała prosiąt (x ± SD) w dniu przerzutu technologicznego (odłączenia od lochy) w miotach grupy kontrolnej

Grupa	Kontrolna
Nr miotu	Liczebność miotu w dniu przerzutu technologicznego	Średnia masa ciała w dniu przerzutu technologicznego
sztuk	kg
27.	10	11,5 ±0,8
28.	12	11,0 ±0,6
29.	12	11,2 ±0,6
30.	11	10,8 ±0,6
31	10	11,5 ± 0,8
32.	11	10,7 ±0,6
33.	12	10,8 ±0,7
34	11	11,0 ±0,9
35.	11	11,5 ±0,7
36.	12	10,9 ±0,8
37	10	11,2 ±0,6
38.	12	11,0 ± 1,0
39.	11	10,9 ± 0,8
40	12	11,0 ± 0,7
41.	10	11,8 ±0,8
42	12	10,8 ± 0,7
43.	11	11,0 ±0,9
44.	10	12,0 ±0,5
45.	11	10,6 ± 0,9
46.	12	11,0 ± 0,6
47	12	11,5 ±0,7
48.	11	10,8 ± 0,9
49.	12	11,8 ±1,0
50.	13	12,0 ± 0,8
51	12	11,5 ± 1,0
52	13	11,0 ± 0,8

190 645

Tabela 20

Zachorowalność prosiąt w miocie grupy doświadczalnej.

Grupa	Doświadczalna
Nr miotu	Liczebność miotu	Zachorowalność w miocie	Padnięcia
Sztuki	%
1.	11	2	18,20	-
2.	10	1	10,00	-
-» J.	12	-	-	' -
4.	10	2	20,00	-
5.	10	3	30,00	-
6.	11	-	-	-
7.	12	2	16,70	-
8.	12	-	-	-
9.	11	1	9,10	-
10.	11	-	-	-
11.	12	3	25,00	-
12.	11	-	-	-
13.	11	2	18,20	-
14.	12	-	-	-
15.	11	-	-	-
16.	12	2	16,70	-
17.	10	-	-	-
18.	11	1	9,10	-
19.	11	2	18,20	-
20.	12	-	-	-
21.	12	2	16,70	-
22.	11	2	18,20	-
23.	11	-	-	-
24.	11	2	18,20	-
25.	12	3	25,00	-
26.	10	-	-	-
Ogółem	290	30	10,34	0

190 645

Tabela 21

Zachorowalność prosiąt w miocie grupy kontrolnej

Grupa	Kontrolna
Nr miotu	Liczebność miotu	Zachorowalność w miocie	Padnięcia
sztuki	%	sztuki	%
27.	10	4	40,00	1	10,00
28.	12	4	33,30	0	0,00
29.	12	5	41,70	2	16,70
30.	11	2	18,20	0	0,00
31	10	5	50,00	2	20,00
32.	11	3	27,30	0	0,00
3 3»	12	7	58,30	2	16,70
34.	11	1	9,10	0	0,00
35.	11	6	54,50	0	0,00
36.	12	2	16,70	0	0,00
37	10	4	40,00	1	10,00
38.	12	3	25,00	0	0,00
39.	11	0	0,00	0	0,00
40.	12	4	33,30	1	8,30
41.	10	6	60,00	2	20,00
42.	12	3	25,00	0	0,00
43	11	2	18,20	0	0,00
44.	10	4	40,00	0	0,00
45.	11	5	45,50	2	18,20
46.	12	2	16,70	0	0,00
47.	12	6	50,00	2	16,70
48.	11	5	45,50	0	0,00
49.	12	3	25,50	0	0,00
50.	13	5	38,50	2	15,40
51.	12	2	16,70	0	0,00
52.	13	3	23,00	0	0,00
Ogółem	293	96	32,43	17	5,74

190 645

Tabela 22

Średnie przyrosty masy ciała i zużycie paszy w poszczególnych miotach.

Grupa	Doświadczalna
Nr miotu	Średnia masa ciała (kg) prosiąt	Średni przyrost dzienny (g)	Średnie zuzycie na przyrost 1 kg masy ciała
W dniu rozpoczęcia doświadczenia tj 42 dnia życia	W dniu zakończenia eksperymentu tj. 70 dniu życia
1.	10,5 ±0,8	23,8 ± 1,0	475,0	2,90
2.	11,0 ±0,5	24,5 ± 1,0	482,0	3,10
3 J.	10,2 ±0,6	22,8 ± 1,5	450,0	3,20
4.	11,2 ±0,8	23,5 ± 1,0	439,0	3,10
5.	11,0 ±0,6	22,0 ± 1,8	393,0	3,30
6.	11,3 ±0,7	24,7 ± 1,0	479,0	3,00
7.	10,8 ±0,5	23,0 ± 0,8	436,0	3,00
8	10,8 ±0,7	24,6 ± 1,0	493,0	3,00
9.	10,5 ±0,8	24,5 ± 1,0	500,0	2,90
10.	10,8 ±0,7	24,5 ± 1,0	489,0	2,90
11.	10,5 ± 0,6	22,8 ± 1,5	439,0	3,30
12.	11,6 ± 0,5	24,8 ± 1,0	471,0	3,00
13.	10,8 ±0,6	23,8 ± 1,5	464,0	3,20
14	10,9 ±0,8	24,8 ± 1,0	496,0	3,00
15.	10,7 ±0,9	25,2 ± 1,0	518,0	2,90
16.	10,8 ±0,7	24,0 ± 1,0	471,0	3,10
17.	11,8 ±0,8	25,8 ± 1,0	500,0	3,00
18.	10,6 ± 1,0	24,5 ± 1,0	496,0	3,10
19.	10,9 ±0,8	24,0 ± 1,5	468,0	3,30
20.	11,0 ±0,6	24,8 ± 1,0	493,0	3,00
21.	11,8 ±0,7	24,0 ± 1,5	436,0	3,20
22.	12,4 ± 0,5	25,5 ± 1,0	468,0	3,10
23.	12,5 ±0,7	26,0 ± 1,0	482,0	3,00
24.	11,5 ±0,9	24,8 ± 1,0	475,0	3,20
25.	10,8 ±0,8	24,6 ± 1,5	493,0	3,30
26.	12,8 ±0,7	26,7 ± 1,0	496,0	3,00
X w gr.	11,13	24,38	473,0	3,08

190 645

Tabela 23

Średnie przyrosty zas- ciała i zuzycie paszy w poszczególnych wiotach.

Grupa	Kontrolna
Nr wiotu	Średnia wasa ciała (kg) prosiąt	Średni przyrost dziinn- (g)	Śrzdniz zużycie na przyrost 1 kg was- ciała
W dniu rozpoczęcia doświadczenia tj 42 dnia ż-cia	W dniu zakończenia eksperymentu tj. 70 dniu życia
1	2	3	4	5
27.	11,5 ±0,8	22,8 ± 1,5	403,0	3,50
28.	11,0 ±0,6	23,0 ± 1,0	429,0	3,30
29.	11,2 ±0,6	23,0 ± 1,5	421,0	3,40
30.	10,8 ±0,6	23,5 ± 1,5	454,0	3,40
31.	11,5 ±0,8	22,0 ± 1,8	375,0	3,60
32.	10,7 ±0,6	22,8 ± 1,5	432,0	3,50
33.	10,8 ±0,7	21,0 ± 1,8	364,0	3,60
34.	11,0 ±0,9	23,5 ± 1,0	446,0	3,30
35.	11,5 ±0,7	22,0 ± 1,5	375,0	3,50
36.	10,9 ±0,8	23,8 ± 1,0	461,0	3,20
37.	11,2 ±0,6	23,5 ± 1,0	439,0	3,50
38.	11,0 ± 1,0	22,8 ± 1,5	421,0	3,50
39.	10,9 ±0,8	24,5 ± 1,0	486,0	3,10
40.	11,0 ±0,7	23,0 ± 1,0	428,0	3,30
41.	11,8 ±0,8	20,9 ± 2,0	325,0	3,70
42.	10,8 ±0,7	22,8 ± 1,5	428,0	3,50
43.	11,0 ±0,9	23,0 ± 1,0	428,0	3,40
44.	12,0 ±0,5	23,8 ± 1,5	421,0	3,40
45.	10,6 ±0,9	22,0 ± 1,5	407,0	3,50
46.	11,0 ± 0,6	23,5 ± 1,0	446,0	3,40
47.	11,5 ±0,7	22,0 ±2,0	375,0	3,60
48.	10,8 ±0,9	22,5 ± 2,0	418,0	3,50
49.	11,8 ± 1,0	23,0 ± 1,5	400,0	3,80
50.	12,0 ±0,8	23,8 ±2,0	421,0	3,50

190 645

c.d. tabeli 23

1	2	3	4	5
51	11,5 ± 1,0	23,5 ± 1,0	428,0	3,50
52.	11,0 ±0,8	23,0 ± 1,5	428,0	3,50
X wgr.	11,18	22,88	418,0	3,46

Tabela 24

Efekty profilaktycznego stosowania Lydium-KLP u prosiąt w okresie odsadzemowym.

Grupa	Doświadczalna	Kontrolna
Badane wskaźniki	n = 290 29 miotów	n = 296 26 miotów
Skuteczność profilaktyczna	89,7% 70-100,0%	0
Zachorowalność	10,3% 0-30%	32,4% 9,10-60,0%
Padnięcia	0	5,74% 0-20,0%
Przyrosty dzienne masy cialaw g	473,0 393,0-518,0	418,0 325,0-486,0
Zużycie paszy na przyrost 1 kg masy ciała	3,08 2,90-3,30	3,46 3,10-3,80

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie dimeru lizozymu do wytwarzania środka leczniczego do stosowania w profilaktyce chorób typowo rozwijających się w związku ze stresem o podłożu fizjologicznym, infekcyjnym lub środowiskowym, zwłaszcza w profilaktyce chorób zwierząt hodowlanych i drobiu.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania środka leczniczego do stosowania w profilaktyce powikłań okołoporodowych macior i krów, w szczególności w profilaktyce bezmleczności tych zwierząt.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania środka leczniczego do stosowania w profilaktyce zachorowalności w okresie odsądzenia młodych ssących od matek oraz po przerzucie technologicznym.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1, do wytwarzania środka do stosowania w profilaktyce zachorowalności w okresie przeniesienia piskląt drobiu z warunków inkubatorowych do zwykłych warunków odchowu.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, w którym środek leczniczy jest przystosowany do podawania w zastrzykach, zwłaszcza dożylnych lub domięśniowych.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, w którym wytwarzany środek leczniczy jest formułowany w dawkach jednorazowych lub wielokrotnych.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 6, w którym wytwarzany środek leczniczy zawiera dimer lizozymu w dawce 0,2 mg/ml w roztworze wodnym, stabilizowanym dopuszczalnymi środkami konserwującymi dla preparatów białkowych, do podawania w dawce 0,02 mg/kg masy ciała.
8. 8. Zastosowanie według zastrz. 7, w którym wytwarzany środek leczniczy ma postać apyrogennej, sterylnej kompozycji zawierającej, co najmniej jeden fizjologicznie akceptowalny rozpuszczalnik i/lub co najmniej jeden dopuszczalny farmaceutycznie środek konserwujący, korzystnie apyrogenną sterylizowaną wodę lub wodny roztwór PBS jako rozpuszczalnik i tiomersal jako środek konserwujący dopuszczalny do stosowania w farmaceutycznych środkach białkowych.
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 8, w którym wytwarzany środek leczniczy zawiera jako wodny roztwór wodny roztwór soli dopuszczalnej fizjologicznie, korzystnie PBS.
10. 10. Zastosowanie według zastrz . a, rz którym dimer lizozymu zawierz niewielkie ilości trimerów i wyższych oligomerów tego enzymu.

    Obecny wynalazek dotyczy nowego zastosowania dimeru lizozymu do wytwarzania środka leczniczego do stosowania w profilaktyce, zwłaszcza w profilaktyce zespołów chorobowych w szczególności u zwierząt hodowlanych i drobiu. Nowe zastosowania związane są z pobudzaniem naturalnych mechanizmów obronnych przez dimer lizozymu.

    Pod koniec lat osiemdziesiątych ujawnione zostało działanie przeciwwirusowe i przeciwbakteryjnz dimeru lizozymu oraz medyczne zastosowanie dimeru lizozymu w leczeniu chorób wywołanych przez wirusy i bakterie, pozbawione niekorzystnych skutków ubocznych towarzyszących podawaniu monomerycznzj postaci tego enzymu. Przzciwwirusowz i antybakteryjne kompozycje zawierające jako składnik aktywny Umer lizozymu lub inne zaCmeryznwane enzymy opisano w publikacji międzynarodowej nr WO/l 1294. W zgłoszeniu tym doniesiono, że w testach prowadzonych in vitro dimer lizozawu hamował proliferację szeregu kolonii bakterii wyhodowanych na próbkach pobieranych od pacjentów,

    190 645 w stężeniu 5-20 mg/ml hodowli. Doniesiono również dimer okazał się skuteczny w leczeniu infekcji parwowirozy u psów (CPV) przy podawaniu doustnym dwa razy dziennie w dawce 1-2 mg/kg masy ciała.