PL189711B1 - Sposób modulowania masy oraz nasiono - Google Patents

Sposób modulowania masy oraz nasiono

Info

Publication number
PL189711B1
PL189711B1 PL97364343A PL36434397A PL189711B1 PL 189711 B1 PL189711 B1 PL 189711B1 PL 97364343 A PL97364343 A PL 97364343A PL 36434397 A PL36434397 A PL 36434397A PL 189711 B1 PL189711 B1 PL 189711B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
plant
seed
promoter
gene
plants
Prior art date
Application number
PL97364343A
Other languages
English (en)
Inventor
K. Diane Jofuku
Jack K. Okamuro
Original Assignee
Univ California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/700,152 external-priority patent/US5994622A/en
Application filed by Univ California filed Critical Univ California
Publication of PL189711B1 publication Critical patent/PL189711B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)

Abstract

1. Sposób modulowania masy nasiona w roslinie, znamienny tym, ze obejmuje: dostarczenie pierwszej rosliny obejmujacej zrekombinowana kasetke ekspresyjna, zawierajaca kwas nukleinowy ADC, polaczony z promotorem roslinnym, przy czym kwas nukleinowy ADC hybrydyzuje w ostrych warunkach z SEK NR ID: 1 albo SEK NR ID: 2; krzyzowanie ze soba pierwszej rosliny lub krzyzowanie pierwszej rosliny z druga roslina, dla wytworzenia duzej liczby nasion; selekcjonowanie nasiona o zmienionej masie. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób modulowania masy oraz nasiono. W szczególności wynalazek dotyczy nowego sposobu modulowania masy i innych cech nasion rośliny, a jego ujawnienie jest przedmiotem inżynierii genetycznej roślin.
Zgłoszenie to jest częściową kontynuacją towarzyszącego zgłoszenia USSN 08/ 879 827 (Attorney Docket nr 023070-067210, złożonego 20 czerwca 1997, które jest częściową kontynuacją USSN 08/700 152 złożonego 20 sierpnia 1996, z których oba są tu wprowadzane poprzez odniesienia literaturowe.
Podstawa wynalazku
Wzór rozwoju kwiatu kontrolowany jest przez merystem kwiatu, tkankę złożoną, której komórki dają wzrost różnym systemom organów kwiatu. Badania genetyczne i molekularne doprowadziły do zdefiniowania ewolucyjnie konserwowanego układu genów kontrolujących typ merystemu kwiatu i rozwój organów kwiatów w Arabidopsis, lwiej paszczy i innych gatunkach roślin (patrz np. Coen i Carpenter, Plant Cell 5:1175-1181 (1993) i Okamuro i wsp., Plant Cell 5:1183-1193 (1993)). W Arabidopsis, homeotyczny gen kwiatu APETALA2 (AP2) kontroluje trzy krytyczne aspekty ontogenezy kwiatu organizację merystemu kwiatu (Irish i Sussex, Plant Cell 2:741-753 (1990); Huala i Sussex, Plant Cell 4:901-913 (1992); Bowman i wsp., Development 119:721-743 (1993); Schultz iHaughn, Development 119:745-765 (1993); Shannon i Meeks-Wagner, Plant Cell 5:639-655 (1993)), determinację typu organu kwiatu (Komaki i wsp , Development 104:195^03 (1988) Bowman i wsp., Plant Cell 1:37-52 (1989); Kunst i wsp., Plant Celi 1:1195-1208 (1989)); oraz czasową i przestrzenną regulację ekspresji homeotycznych genów kwiatu (Bowman i wsp., Plant Cell 3:749-758 (1991); Drews i wsp., Cell 65:91-1002 (1991)).
Jedną z wczesnych funkcji AP2 podczas rozwoju kwiatu jest umożliwienie organizacji merystemu kwiatu. AP2 pełni tę funkcję we współpracy z co najmniej trzema innymi genami merystemu kwiatu: APETALA1 (API), LEAFY (LFY) i CAUL1FLOWER (CAL) (Irish i Sussex (1990); Bowman, F1owering Newsletter 14:7-19 (1992); Huala i Sussex (1992); Bowman
189 711 i wsp. (1993); Schultz iHaughn (1993); Shannon i Meeks-Wagner (1993)). Drugą funkcją AP2 jest regulacja rozwoju organu kwiatu. W Arabidopsis, merystem kwiatu wytwarza cztery koncentryczne pierścienie lub okółki organów kwiatu - działek kielicha, płatków, pręcików i słupków. W łagodnych, o częściowej utracie funkcji (ang. loss of function) mutantach ap2, działki kielicha są homeotycznie przekształcone w liście, a płatki są przekształcone w wytwarzające pyłek organy pylnika (Bowman i wsp., Development 1112:1-20 (1991). Dla kontrastu w silnych mutantach ap2, działki kielicha są przekształcone w niosące zalążki słupki, rozwój płatków jest suprymowany, liczba pręcików jest zredukowana, a fuzja słupka jest przeważnie zaburzona (Bowman i wsp. (1991)). W końcu wpływy ap2 na rozwój organów kwiatu są częściowo wynikiem trzeciej funkcji AP2, która bezpośrednio lub pośrednio reguluje ekspresję kilku specyficznych regulatorów homeotycznych genów kwiatu (Bowman i wsp., Plant Cell 3:749-758 (1991); Drews i wsp., Cell 65:91-1002 (1991); Jack i wsp., Cell 68:683-697 (1992); Mandel i wsp., Cell 71:133-143 (1992)).
Bezspornie, Ap2 odgrywa krytyczną rolę w regulacji rozwoju kwiatu u Arabidopsis. Dotychczas niewiele wiadomo w jaki sposób pełni on swoje funkcje na poziomie komórkowym i molekularnym. Dla wyjaśnienia roli AP2 i innych homeotycznych genów kwiatu w determinacji typu organu kwiatu zaproponowano model przestrzenny i kombinacyjny (patrz np. Coen i Carpenter, powyżej). Jedną obiecującą przesłanką za tego typu modelem jest to, żeAP2 i drugi homeotyczny gen kwiatu AGAMOUS (AG) są genami wzajemnie antagonistycznymi. Oznacza to, zeAP2 negatywnie reguluje ekspresję genu AG w działkach kielicha i płatkach i na odwrót, AG negatywnie reguluje ekspresję genu w pręcikach i słupkach. Analiza hybrydyzacyjna in situ ekspresji genu AG w kwiatach dzikiego typu i mutanta ap2 wykazała, ze AP2 jest rzeczywiście negatywnym regulatorem ekspresji AG. Jakkolwiek, nie wiadomo do tej pory jak AP2 kontroluje AG Nie wiadomo także w jaki sposób AG wpływa na aktywność genu AP2.
Gen AP2 w Arabidopsis został wyizolowany poprzez insercyyną mutagenezę przy użyciu T-DNAjak opisał JofUku iwsp., The Plant Cell 6:1211-1225 (1994). AP2 koduje przypuszczalnie czynnik jądrowy, który nie wykazuje znaczącego podobieństwa do jakiegokolwiek białka regulacyjnego z grzybów lub zwierząt. Przedstawiony dowód wykazuje, że aktywność i funkcja genu AP2 nie są ograniczone do rozwijających się kwiatów, co sugeruje, ze może on odgrywać szerszą rolę w regulacji rozwoju Arabidopsis niż początkowo proponowano.
Pomimo, postępu w definiowaniu genetycznej kontroli rozwoju rośliny, nastąpił niewielki postęp w identyfikowaniu i analizie genów wpływających na ważne w rolnictwie cechy takie jak wielkość nasiona, zawartość białka, oleju i im podobne. Charakterystyka takich genów pozwoliłaby na zmianę za pomocą technik inżynierii genetycznej roślin różnorodnych pożądanych cech. Niniejszy wynalazek dotyczy tych i innych potrzeb.
Podsumowanie wynalazku
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu modulowania masy i innych cech nasion w roślinach. Sposoby wymagają dostarczenia rośliny obejmującej zrekombinowaną kasetkę ekspresyjną zawierającą kwas nukleinowy ADC podłączony pod promotor roślinny. Roślina jest albo krzyżowana ze sobą samą lub z drugą rośliną dla wytworzenia dużej liczby nasion. Nasiona z pożądaną cechą (np. zmieniona masa) są następnie selekcjonowane.
W pewnych wykonaniach transkrypcja kwasu nukleinowego ADC hamuje ekspresję endogennego genu ADC lub aktywność kodowanego białka. W wykonaniach tych, etap selekcjonowania obejmuje etap selekcjonowania nasion ze zwiększoną masą lub inną cechą. Nasiona mogą przykładowo posiadać zwiększoną zawartość białka, węglowodanu lub oleju W przypadku zwiększonej zawartości oleju rodzaj kwasów tłuszczowych może, ale nie musi, być zmieniony w porównaniu z liniami rodzicielskimi. W wykonaniach tych, kwas nukleinowy ADC może być podłączony do promotora w orientacji sensownej lub antysensownej. Alternatywnie, ekspresja kwasu nukleinowego ADC może wzmacniać ekspresję endogennego genu ADC lub aktywność ADC i etap selekcjonowania obejmuje etap selekcjonowania nasion o zmniejszonej masie. Wykonanie to jest szczególnie dogodne do wytwarzania odmian roślin zbożowych pozbawionych nasion.
189 711
Jeżeli pierwsza roślina jest krzyżowana z drugą rośliną obie rośliny mogą być tym samym lub różnym gatunkiem. Rośliny mogą być jakimikolwiek wyższymi roślinami, przykładowo członkami rodzin Brassicaceae lub Solanaceae. Przy wytwarzaniu nasiona według wynalazku zarówno żeńska czy męska roślina rodzicielska może obejmować kasetkę ekspresyjną zawierającą kwas nukleinowy ADC. Również obydwie z rodzicielskich roślin mogą zawierać kasetkę ekspresyjną.
W kasetkach ekspresyjnych promotor roślinny może być promotorem konstytutywnym, przykładowo promotor CaMV 35S. Alternatywnie, promotor może być promotorem tkankowo specyficznym. Przykłady ekspresji tkankowo - specyficznej dogodne w wynalazku obejmują ekspresję specyficzną dla owocu, specyficzną dla nasiona (np. specyficzne dla zalążka, specyficzne dla embrionu, specyficzne dla endospermy, specyficzne dla intagumentu czy specyficzne dla łupiny nasiona).
Przedmiotem wynalazku jest również nasiono obejmujące kasetkę ekspresyjną zawierającą kwas nukleinowy ADC. Jeżeli kasetka ekspresyjna jest wykorzystana do hamowania ekspresji endogennego ADC, nasiono będzie posiadało masę, co najmniej około 20% wyższą niż średnia masa nasion tej samej odmiany rośliny, bez zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej. Jeżeli kasetka ekspresyjna jest wykorzystana do wzmocnienia ekspresji ADC, nasiono będzie posiadało masę, co najmniej około 20% niższą niż średnia masa nasion tej samej odmiany rośliny bez zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej. Inne cechy takie jak zawartość białka, węglowodanu czy oleju można zmieniać w ten sam sposób.
Definicje
Wyrażenie „sekwencja kwasu nukleinowego” odnosi się do jedno- lub dwuniciowego polimeru zasad dezoksyrybo-nukleotydowych lub rybonukleotydowych czytanych od końca 5' do 3'. Obejmuje ono chromosomalny DNA, samoreplikujące się plazmidy, infekcyjne polimery DNA lub RNA i DNA lub RNA pełniący podstawową funkcję strukturalną.
Termin „promotor” odnosi się do obszaru lub sekwencji determinujących położonych powyżej lub poniżej startu transkrypcji, które są rozpoznawane i wiążą się z polimerazą RNA i innymi białkami inicjującymi transkrypcję. „Promotor roślinny” jest promotorem zdolnym do inicjacji transkrypcji w komórkach roślinnych.
Termin „roślina” obejmuje całe rośliny, organy roślin (np. liście, łodygi, kwiaty, korzenie itp.), nasiona i komórki roślinne oraz potomstwo niektórych z nich. Klasa roślin, których można użyć w sposobie według wynalazku jest zasadniczo tak szeroka jak klasa roślin wyższych podlegających technikom transformacji i obejmuje zarówno okrytonasienne (rośliny jednoliścienne i dwuliścienne) jak i nagonasienne. Obejmuje ona rośliny o różnych poziomach ploidalności, w tym poliploida, diploida, haploida i hemizygotę.
Sekwencja polinukleotydowa jest „heterologiczna do” organizmu lub drugiej sekwencji polinukleotydowej, jeżeli pochodzi z obcego gatunku lub, jeśli pochodzi z tego samego gatunku i jest zmodyfikowana w stosunku do swojej wyjściowej formy. Przykładowo promotor funkcjonalnie połączony z heterologiczną sekwencją kodującą odnosi się do sekwencji kodującej z gatunku różnego od tego, z którego pochodzi promotor lub sekwencji kodującej z tego samego gatunku, która różni się od jakiegokolwiek naturalnie występującego się wariantu allelu. Jak zdefiniowano tu, zmodyfikowana sekwencja kodująca ADC, która jest heterologiczna do funkcjonalnie połączonego promotora ADC nie obejmuje mutantów insercyjnych T-DNA (np. ap2-10) jak opisano w publikacji Jofuku i wsp., The Plant Cell 6:1211-1225 (1994).
Polinukleotyd „egzogenny dla” pojedynczej rośliny jest polinukleotydem, który jest wprowadzony do rośliny sposobami innymi niż krzyżowanie osobników. Przykłady sposobów, którymi można to osiągnąć są opisane poniżej i obejmują transformację za pośrednictwem Agrobacterium, metody balistyczne, elektroporację i im podobne. Roślina zawierająca egzogenny kwas nukleinowy jest określana tu jako roślina transgeniczna R1. Potomkami takiej rośliny są rośliny transgeniczne, które wyrastają po krzyżowaniu z inną rośliną lub z tą samą rośliną.
„Kwas nukleinowy ADC (zawierający domenę AP2)” lub „sekwencja polinukleotydowa ADC” według wynalazku jest częścią lub pełnej długości sekwencją polinukleotydową
189 711 zawierającą domenę AP2 i która, gdy jest obecna w transgenicznej roślinie może być użyta do modulowania właściwości nasion wytwarzanych przez roślinę. Przykładowym kwasem nukleinowym według wynalazku jest sekwencja AP2 z Arabidopsis przedstawiona przez Jofuku i wsp., The Plant Cell 6:1211-1225 (1994). Numer dostępu w GenBanku dla tej sekwencji jest U 12546. Jak przedstawiono w szczegółach poniżej wArabidposis zidentyfikowano rodzinę genów RAP2 (pokrewny do AP2). Zastrzeżona tu klasa kwasów nukleinowych dzieli się na, co najmniej dwie podklasy (geny typu AP2 i typu EREBP), które wyróżnia się poprzez przykładowo liczbę domen AP2, jakie zawiera każdy polipeptyd i poprzez sekwencje w określonych konserwowanych obszarach. Różnice pomiędzy tymi dwiema podklasami opisano bardziej szczegółowo poniżej. Polinukleotydy ADC są zdefiniowane przez zdolność do hybrydyzacji, w określonych warunkach, celem określenia kwasów nukleinowych lub produktów PCR pochodzących z nich. Polinukleotyd ADC (np. AP2 lub RAP2) ma zazwyczaj długość około 30-40 nukleotydowy do około 3000, zazwyczaj mniej niż około 5000 nukleotydów. Zazwyczaj kwasy nukleinowe mają długość od około 100 do około 2000 nukleotydów. często od około 500 do około 1700 nukleotydów.
Kwasy nukleinowe ADC, jak przedstawiono bardziej szczegółowo poniżej, są nową klasą roślinnych genów regulacyjnych kodujących polipeptydy ADC, które można rozróżnić przez obecność jednego lub więcej powtarzających się motywów o 56-58 aminokwasach, określanych tutaj jako „domena AP2”. Sekwencja aminokwasowa przykładowego polipeptydu AP2 jest przedstawiona przez Jofuku i wsp., w publikacjach jak powyżej. Specjalista rozpozna, że w świetle obecnego ujawnienia w sekwencjach tych można wytworzyć różne modyfikacje (np. podstawienia, addycje i delecje) bez wywierania zasadniczego wpływu na ich funkcję. Warianty te są objęte terminami polipeptyd ADC lub polinukleotyd ADC.
Specjalista rozpozna, ze w przypadku zarówno ekspresji transgenów lub hamowania genów endogennych (np. przez antysensowną lub sensowną supresję) wprowadzona sekwencja polinukleotydowa nie musi być identyczna, lecz może być jedynie „zasadniczo identyczna” do sekwencji genu z której pochodzi. Jak wyjaśniono poniżej, te zasadniczo identyczne warianty są objęte terminem kwas nukleinowy ADC.
W przypadku kiedy wprowadzona sekwencja polinukleotydowa podlega transkrypcji i translacji celem wytworzenia funkcjonalnego polipeptydu, specjalista rozpozna, ze ze względu na degenerację kodonów kilka sekwencji polinukleotydowych będzie kodować ten sam polipeptyd. Warianty te są objęte terminami „kwas nukleinowy ADC”, „kwas nukleinowy AP2” i „kwas nukleinowy RAP2”. Dodatkowo, termin obejmuje sekwencje pełnej długości zasadniczo identyczne (określone jak opisano poniżej) z sekwencją polinukleotydową ADC oraz kodujące białka, które zachowują funkcję polipeptydu ADC (np., powstające w wyniku konserwatywnych substytucji aminokwasów w polipeptydzie AP2). Dodatkowo, wariantami mogą być te, które kodują negatywnie dominujące mutanty jak opisano poniżej.
Dwie sekwencje kwasów nukleinowych lub dwa polipeptydy nazywane są „identycznymi” jeśli odpowiednio sekwencja nukleotydów lub reszt aminokwasowych w dwóch sekwencjach jest taka sama, przy maksimum dopasowania, jak opisano poniżej. Termin „komplementarny do” jest użyty tutaj dla określenia że komplementarna sekwencja jest identyczna do całej lub części polinukleotydowej sekwencji odniesienia.
Porównania sekwencji pomiędzy dwoma (lub więcej) polinukleotydami lub polipeptydami zasadniczo są prowadzone przez porównanie dwóch sekwencji w „oknach porównawczych” dla identyfikowania lokalnych obszarów podobieństwa sekwencji. „Okno porównawcze”, jak tutaj użyto, dotyczy segmentu, o co najmniej około 20 ciągłych pozycjach, zwykle około 50 do około 200 cześciei około 100 Hn około 150 którpao ępłsenpia mcjp bvć nnrównana do sekwencji odniesienia o tej samej liczbie ciągłych pozycji po optymalnym dopasowaniu dwóch sekwencji.
Optymalne dopasowanie sekwencji dla porównania może być prowadzone za pomocą algorytmu lokalnej homologii według Smith i Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), algorytmu homologicznego dopasowania według Needleman i Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), metody podobieństwa według Pearson i Lipman Proc. Natl. Acad. ci. (U.S.A) 85:2444
189 711 (1988), programów komputerowych wykorzystujących te algorytmy (GAP, BESTFIT, BLAST,
FASTA i TFASTA w Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG),
575 Science Dr., Madison, WI) lub przez sprawdzenie.
„Procent identyczności sekwencji” jest określony przez porównanie dwóch optymalnie dopasowanych sekwencji w oknie porównawczym, gdzie dla optymalnego dopasowania dwóch sekwencji część sekwencji polinukleotydowej w oknie porównawczym może obejmować addycje lub delecje (np. przerwy, ang. gaps) przy porównaniu z sekwencją odniesienia (która nie obejmuje addycji lub delecji). Procent jest obliczany przez określenie liczby pozycji, w których pojawia się identyczna zasada kwasu nukleinowego lub reszta aminokwasowa w obu sekwencjach, co daje liczbę pasujących pozycji, podzielenie liczby pasujących pozycji przez całkowitą liczbę pozycji w oknie porównawczym i pomnożenie wyniku przez 100, co daje procent identyczności sekwencji.
Termin „zasadniczo identyczny” w odniesieniu do sekwencji polinukleotydowych oznacza, ze polinukleotyd zawiera sekwencję, o co najmniej 60% identyczności sekwencji, korzystnie, co najmniej 80%, bardziej korzystnie, co najmniej 90%, najbardziej korzystnie, co najmniej 95% w porównaniu z sekwencją odniesienia przy zastosowaniu programów opisanych powyżej (korzystnie BLAST) stosujących standardowe parametry. Specjalista rozpozna, że wartości te można odpowiednio przełożyć dla określenia odpowiedniej identyczności białek kodowanych przez dwie sekwencje nukleotydowe biorąc pod uwagę zdegenerowanie kodonów, podobieństwo aminokwasów, położenie ramki odczytu i temu podobne. Zasadnicza identyczność sekwencji aminokwasowych dla tych celów normalnie oznacza, co najmniej 35% identyczność sekwencji, korzystnie, co najmniej 60%, bardziej korzystnie, co najmniej 90% i bardziej korzystnie, co najmniej 95%. Polipeptydy, które są „zasadniczo podobne” mają wspólne sekwencje jak wspomniano powyżej, z wyjątkiem tego, że pozycje reszt, które nie są identyczne mogą różnić się konserwatywnymi zmianami aminokwasów. Konserwatywne podstawienia aminokwasów odnoszą się do wzajemnej wymienialności reszt z podobnymi łańcuchami bocznymi. Przykładowo, do grupy aminokwasów z alifatycznymi łańcuchami bocznymi należy glicyna, alanina, walina, leucyna i izoleucyna; do grupy aminokwasów z alifatycznymi łańcuchami bocznymi zawierającymi grupę hydroksylową należy seryna i treonina; do grupy aminokwasów z łańcuchami bocznymi zawierającymi resztę amidową należy asparagina i glutamina; do grupy aminokwasów z aromatycznymi łańcuchami bocznymi należy fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan; do grupy aminokwasów z zasadowymi łańcuchami bocznymi należy lizyna, arginina i histydyna, a do grupy aminokwasów z łańcuchami bocznymi zawierającymi siarkę należy cysteina i metionina. Korzystne grupy konserwatywnych podstawień aminokwasów obejmują następujące:
walina-leucyna-izoleucyna, fenyloalanina-tyrozyna, lizyna-arginina, alanina-walina i asparagina-glutamina.
Innym wskaźnikiem tego, ze sekwencje nukleotydowe są zasadniczo identyczne jest, jeśli dwie cząsteczki hybrydyzują ze sobą, lub z trzecim kwasem nukleinowym, w ostrych warunkach. Ostre warunki zależą od sekwencji i będą różne w różnych okolicznościach. Zazwyczaj, ostre warunki ustala się jako około 5°C niższe od termicznego punktu topnienia (Tm) dla specyficznej sekwencji przy określonej sile jonowej i pH. Tm jest temperaturą (przy określonej sile jonowej i pH), w której 50% docelowej sekwencji hybrydyzuje do idealnie pasującej sondy. Zazwyczaj, ostrymi warunkami będą takie, w których stężenie soli jest około 0,02 molame przy pH 7, a temperatura wynosi, co najmniej około 60°C.
W niniejszym wynalazku, genomowy DNA lub cDNA obejmuje kwasy nukleinowe ADC według wynalazku, które można identyfikować standardową metodą typu Southern, w ostrych warunkach, przy użyciu sekwencji kwasów nukleinowych tu ujawnianych. Dla celów tego ujawnienia, ostrymi warunkami dla takich hybrydyzacji są te, które zawierają, co najmniej jedno płukanie w 0,2X SSC w temperaturze, co najmniej około 50°C, zazwyczaj około 55°C do około 60°C, przez 20 min. lub w równoważnych warunkach. Inne sposoby, przy pomocy których kwasy nukleinowe według wynalazku można identyfikować opisano bardziej szczegółowo poniżej.
189 711
Krótki opis rysunków
Figura 1A przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowych pomiędzy prostymi powtórzeniami AP2: AP2-R1 (aa 129-195) i AP2-R2 (aa 221-288). Pogrubione i kropkowane linie pomiędzy dwiema sekwencjami wskazują odpowiednio identyczne lub podobne reszty. Strzałki wskazują pozycje mutacji ap2-1, ap2-5 iap2-10 opisanych przez Jofuku i wsp. (1994). Klamra nad sekwencjami AP2-R1 i AP2-R2 wskazuje reszty zdolne do tworzenia amfipatycznej α-helisy, przedstawionej na fig. 1B.
Figura 1B jest schematycznym diagramem przewidywanych amfipatycznych α-helis Ap2-R1 (R1) iAP2-R2 (R2). Końce NH2 z helis R1 iR2 zaczynają się w resztach Phe-160 i Phe-253 i obracają się zgodnie z kierunkiem wskazówek zegara o 100° na resztę, odpowiednio do Phe-177 i Cys-270. Strzałki w kierunku lub na zewnątrz środka kołowych diagramów wskazują negatywny lub pozytywny stopień hydrofobowości określony przez Jones i wsp., J. Lipid Res. 33:87-296(1992).
Figura 2 pokazuje antysensowny konstrukt według wynalazku. pPW14,4 (identyczny z pPW15) przedstawia 13,41 kb konstrukt antysensownego genu AP2 stosowany do opisanej tu transformacji roślin. pPW14,4 składa się z kodującego obszaru genu AP2 połączonego w antysensownej orientacji z konstytutywnym promotorem wirusa mozaiki kalafiora 35S (P35S), tak aby mogła zachodzić transkrypcja. Zastosowany plazmidowy wektor Ti jest zmodyfikowaną wersją wektora pGSJ780A (Plant Genetic Systms, Gent, Belgia), w którym, w miejsce BamHI, wprowadzono pojedyncze miejsce restrykcyjne dla EcoRI, stosując adaptor Clal-EcoRI-BamHI. DNA zmodyfikowanego wektora pGSJ780A linearyzowano za pomocą EcoRI i wprowadzano fragment EcoRI DNA o wielkości 1,68 kb, zawierający obszar kodujący AP2 z cDNA AP2 plazmidu cAP2#l (Jofuku i wsp., 1994), w antysensownej orientacji w stosunku do promotora 35S. KmR oznacza gen NPII roślinnego markera selekcyjnego, który nadaje oporność na antybiotyk, kanamycynę, stransformowanym komórkom roślinnym niosącym konstrukt 35S-antysensowny gen AP2. Ramki 1 i 5 przedstawiają odpowiednio lewą i prawą granicę sekwencji T-DNA, które są wymagane do przeniesienia T-DNA zawierającego konstrukt 35S-antysensowny gen AP2 do genomu rośliny. Obszary 2 i 3 zawierają sekwencje T-DNA. Ramka 3 wyznacza sekwencje 3' genu syntazy oktopiny, funkcjonalnej przy terminacji transkrypcji. Obszar 6 określa sekwencje bakteryjnego DNa funkcjonujące jako bakteryjne miejsce startu replikacji zarówno w E. coli jak Agrobacterium tumefaciens, które tym samym pozwalają plazmidowi pPW14,4 na replikację i utrzymywanie się w obu bakteriach. Ramka 7 przedstawia gen bakteryjnego markera selekcyjnego, nadającego oporność na antybiotyki takie jak streptomycyna i spektynomycyna i pozwala na selekcję szczepów Agrobacterium niosących zrekombinowany plazmid pPW14,4.
Figura 3 pokazuje sensowny konstrukt według wynalazku. pPW12,4 (identyczny zpPW9) przedstawia 13,41 kb konstrukt sensownego genu AP2 stosowany do opisanej tu transformacji roślin. pPW12,4 składa się z kodującego obszaru genu AP2 połączonego w sensownej orientacji z konstytutywnym promotorem wirusa mozaiki kalafiora 35S (P35S), tak aby mogła zachodzić transkrypcja. Zastosowany plazmidowy wektor Ti jest zmodyfikowaną wersją wektora pGSJ780A (Plant Genetic Systms, Gent, Belgia), w którym, w miejsce BamHI, wprowadzono pojedyncze miejsce restrykcyjne dla EcoRI, stosując adaptor Clal-EcoRI-BamHI. DNA zmodyfikowanego wektora pGSJ780A linearyzowano za pomocą EcoRI i wprowadzano fragment EcoRI DNA o wielkości 1,68 kb, zawierający obszar kodujący AP2 z cDNA AP2 plazmidu cAP2#l (Jofuku i wsp., 1994), w sensownej orientacji w stosunku do promotora 35S. KmR oznacza gen NPII roślinnego markera selekcyjnego, który nadaje oporność na antybiotyk, kanamycynę, stransformowanym komórkom roślinnym niosącym konstrukt 35S-sensowny gen AP2. Ramki 1 i 5 przedstawiają odpowiednio lewą i prawą granicę sekwencji T-DNA, które są wymagane do przeniesienia T-DNA zawierającego konstrukt 35S-sensowny gen AP2 do genomu rośliny. Obszary 2 i 3 zawierają sekwencje T-DNA. Ramka 3 wyznacza sekwencje 3' genu syntazy oktopiny funkcjonalnej przy terminacji transkrypcji. Obszar 6 określa sekwencje bakteryjnego DNA funkcjonujące jako bakteryjne miejsce startu replikacji zarówno w E. coli jak Agrobacterium tumefaciens, które pozwalają tym
189 711 samym plazmidowi pPW14,4 na replikację i utrzymywanie się w obu bakteriach. Ramka 7 przedstawia gen bakteryjnego markera selekcyjnego, nadającego oporność na antybiotyki takie jak streptomycyna i spektynomycyna i pozwala na selekcję szczepów Agrobacterium niosących zrekombinowany plazmid pPW12,4.
Figury 4A i 4B przedstawiają sekwencję i strukturę domeny AP2. Liczbę reszt aminokwasowych pokazano po prawej stronie. Przerwy w sekwencji zostały wprowadzone dla maksymalnego dopasowania sekwencji. Pozycje reszt aminokwasowych i przerw sekwencji w dopasowaniach domen AP2 są numerowane, dla odniesienia, jako 1-77. Położenie konserwowanych elementów YRG i RAYD zaznaczono klamrami. Zacieniowane ramki wyróżniają obszary podobieństwa sekwencji. Aminokwasy o pozytywnym ładunku w elemencie YRG oznaczono znakiem + powyżej reszt. Położenie 18-aminokwasowego obszaru rdzeniowego, przypuszczalnie tworzącego amfipatyczną α-helisę zaznaczono klamrą. Reszty w elemencie RAYD dla każdej domeny AP2, przypuszczalnie tworzące amfipatyczną α-helisę są podkreślone. Figura 4A przedstawia członków podklasy typu AP2. Przedstawiono dopasowanie sekwencji aminokwasowej pomiędzy powtórzeniami R1 i R2 domeny AP2 wAP2, ANT i RAP2,7. Klamry powyżej sekwencji wyznaczają konserwowane bloki YRG i RAYD opisane powyżej. Wypełnione kółka i gwiazdki wyznaczają odpowiednio pozycje mutacji ap2-l i ap2-5. Reszty aminokwasowe tworzące consensus motywu domeny AP2 dla AP2, ANT i RaP2,7 są przedstawione poniżej dopasowania, przy czym nie zmieniające się reszty opisano dużymi literami. Figura 4B przedstawia członków podklasy typu EREBP. Przedstawiono dopasowanie sekwencji aminokwasowej pomiędzy domenami AP2 zawartymi w białkach EREBP z tytoniu i białkach RAP2 typu EREBP z Arabidopsis. Numerami dostępu w GenBanku dla EREBP-1, EREBP-2, EREBP-3 oraz EREBP-4 są odpowiednio D38123, D38126, D38124 i D38125.
Figura 4C dostarcza schematycznych diagramów przypuszczalnych amfipatycznych α-helis RAP2,7-R1, AP2-R1 iANT-R1. Reszty aminokwasowe w motywach RAP2,7-R1, AP2-R1 iANT-R1 podkreślone na fig. 4A, przypuszczalnie tworzące amfipatyczne α-helisy są schematycznie przedstawione jako obracające się zgodnie z kierunkiem wskazówek zegara o 100° na resztę, tworząc strukturę helisy. Strzałki w kierunku lub na zewnątrz środka kołowych diagramów wskazują negatywny lub pozytywny stopień hydrofobowości określony przez Jones i wsp., J. Lipid Res. 33:87-296 (1992). Reszty aminokwasowe o pozytywnym i negatywnym ładunku zaznaczono odpowiednio znakami + i -.
Figura 4D przedstawia schematyczne diagramy przypuszczalnych amfipatycznych αhelis RAP2,2, RaP2,5, RAP2-12 oraz EREBP-3. Reszty aminokwasowe w motywach RAP2,2, rAp2,5, RAP2-12 oraz EREBP-3 podkreślone na fig. 4B, które przypuszczalnie tworzą amfipatyczne α-helisy są schematycznie przedstawione jak opisano na fig. 4C.
Figura 4E przedstawia dopasowanie sekwencji pomiędzy 25-26 aminokwasowymi obszarami łączników wAP2, ANT iRAP2,7. R1 iR2 wyznaczają pozycje powtórzeń R1 i R2 odpowiednio w AP2, ANT i RAP2,7 w odniesieniu do sekwencji obszaru linkera. Ramki oznaczają nie zmieniające się reszty w konserwowanych obszarach łącznika. Reszty aminokwasowe tworzące consensus motywu obszaru łącznika dla AP2, ANT i RAP2,7 są przedstawione poniżej dopasowania, przy czym nie zmieniające się reszty opisano dużymi literami. Strzałki wyznaczają pozycję mutacji ant-3 opisaną przez Klucher i wsp., Plant Cell 8:137-153 (1996).
Figura 5 jest schematycznym diagramem pAP2, którego można użyć do konstrukcji wektorów ekspresyjnych według wynalazku.
Figura 6 jest schematycznym diagramem pBELl, którego można użyć do konstrukcji wektorów ekspresyjnych według wynalazku.
Opis korzystnych wykonań wynalazku
Niniejszy wynalazek odnosi się do roślinnych genów ADC, takich jak geny AP2 i RAP2 z Arabidopsis. Wynalazek dostarcza molekularnych strategii do kontrolowania wielkości nasion i całkowitej zawartości białek w nasionach przy użyciu nadekspresji ADC i konstruktów antysensownego genu. W szczególności transgeniczne rośliny zawierające antysensowne konstrukty mają dramatycznie podwyższoną masę nasiona, zawartość białka i oleju w nasionach.
189 711
Alternatywnie, nadekspresja ADC przy użyciu konstruktów według wynalazku prowadzi do zmniejszenia wielkości nasion i całkowitej zawartości białka w nasionach. Razem, dane przedstawiane tu prezentują, że w ważnych dla rolnictwa gatunkach można kontrolować szereg istotnych cech, w tym masę nasiona, całkowitą zawartość białka w nasionach oraz zawartość oleju.
Izolacja kwasów nukleinowych ADC
Najczęściej, nomenklatura i procedury laboratoryjne dotyczące technologii rekombinacji DNA, opisane poniżej, są dobrze znane i powszechnie stosowane przez specjalistów. Standardowe techniki są używane do klonowania, izolacji DNA i RNA, amplifikacji i oczyszczania. Zazwyczaj reakcje enzymatyczne wymagające ligazy DNA, polimerazy DNa, endonukleaz restrykcyjnych i temu podobnych przeprowadzane są zgodnie z zaleceniami producentów. Te i różne inne techniki są zasadniczo przeprowadzane zgodnie z Sambrook i wsp., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989).
Izolację kwasów nukleinowych ADC można wykonać za pomocą kilku technik. Przykładowo, do zidentyfikowania żądanego genu w bibliotece cDNA lub genomowej można wykorzystać sondy oligonukleotydowe oparte na ujawnianych tu sekwencjach. Do konstrukcji biblioteki genomowej stosuje się duze fragmenty genomowego DNA wytwarzane przez losowe fragmentowanie, np. przy użyciu endonukleaz restrykcyjnych i łączy z wektorowym DNA w konkatamery, które można pakować do odpowiednich wektorów. Do utworzenia biblioteki cDNA, izolowany jest mRNA z żądanego organu, jak kwiat; z tego mRNA wytwarzana jest biblioteka cDNA zawierająca transkrypt genu ADC Alternatywnie, cDNA można wytworzyć z mRNA wydzielonego z innych tkanek, w których geny ADC lub homologiczne ulegają ekspresji.
Bibliotekę cDNA lub genomową można przeszukiwać sondą opartą na ujawnionej tu sekwencji sklonowanego genu ADC. Celem izolowania genów homologicznych, z tego samego lub różnych gatunków roślin, można stosować sondy do hybrydyzacji z sekwencjami DNA genomowego lub cDNA. Alternatywnie, można stosować przeciwciała wytworzone przeciwko polipeptydowi ADC do przeszukiwania ekspresyjnej biblioteki mRNA.
Alternatywnie, interesujące kwasy nukleinowe można powielać na próbkach kwasu nukleinowego przy użyciu technik powielania. Przykładowo, techniki reakcji łańcuchowej polimerazy (PcR) można zastosować do powielenia sekwencji genów ADC bezpośrednio na genomowym DNa, cDNA, bibliotekach genomowych i bibliotekach cDNA. PCR i inne sposoby powielania in vitro mogą być przydatne, przykładowo, do klonowania sekwencji kwasu nukleinowego kodujących eksprymowane białka, do wytwarzania kwasów nukleinowych mogą być użyte jako sondy do wykrywania obecności pożądanego mRNA w próbkach, przykładowo do sekwencjonowania kwasu nukleinowego lub w innych celach.
Odpowiednie startery i sondy do identyfikowania sekwencji ADC z tkanek roślinnych wytwarzane są przez porównanie sekwencji dostarczonych przez Jofuku i wsp., powyżej. Dla ogólnego przeglądu technik PCR patrz PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications, (wyd. Innis M., Gelfand D., Sninsky J. i White T.), Academic Press, San Diego (1990).
Jak zauważono powyżej kwasy nukleinowe według wynalazku charakteryzują się obecnością sekwencji kodującej domenę AP2. A zatem, kwasy nukleinowe można identyfikować za pomocą ich zdolności do specyficznej hybrydyzacji z ujawnionymi tu sekwencjami kodującymi domenę AP2. Startery służące do specyficznego powielenia domeny AP2 demonstrowanych genów są szczególnie przydatne do identyfikowania określonych polinu1/·1θΑ+τΓ<^Λιΐ» Λ ’ γΊαγάλιγμα z-\ f-£krv/-v nal/iuaMAia i u nu rrM n mt/aL fu ΓταηΛπ;
lYiuuijuuw uttuinj οιυουννην wiu, νψαι w ovi\. vvv±ivj uj vvintu.i j νιι iu w
RAP2 są następujące:
189 711
Nazwa GenBank numer Startery
AP2 U12546 JOAP2U 5 *-GTTGiCł^<^^(^(^<^<^’^^AG'rG-3 ' JOAP2L 5’-GGTrCATCCTGAC<COCATATC-3'
RAP2.1 AF003094 JORAE2.1U 5’-CTCAAGAAGAAGTGCCTAACCACG-3’ JORAP2. UL 5'-GCAGAAGCTAGAAGAGCGTCG A-3‘
RAP2.2 AF003095 JORAP2 2U 5,-GGAAAATG«3CTGCGGAG-3' JORAP2.2L 5'-GTTACCT€CACR'ATCGAACGAG-3‘
RAP2.4 AF003097 JORATC.4U 5' GCTGGATCTTGTTTCGCrTACG-3' JORATC.4L S^-G^i^TAAiGi^TT^y^I^CG^^CGACTG- 3 ’
RAP2.5 AF003098 JORAP2.5U 5’-AGATGGGCTTGAAACCCGAC-3' JORAP2.5L 5-CTGGCTAGGGCrACGCGC-3·
RAP2.6 AF003099 JORAP2.6U 5°TTC3TT’'GCCTCCTCAACCATrG-3‘ JORAP2.6L 5'-TCTGAG'ΓΓCCAACATTTTCCCG~3‘
RATC.7 AF0031C0 JORAP2.7U 5,-CMAAVnGGTAACTCCGGTTCCG-3' JORAP2.7L S^C^i^C^ITTTTi^CjTTTC^CjtJi^iJCATT/^^-S·
RAP2.8 AF003101 JORAP2.8U 5-CCCG'ΓΓACCCC'^<CΓACCCC-3' JORAP2.8L 5’-CGCGGTCTTCCAGAACGTTC-3'
RAP2.9 AF003102 JORAP2.9U 5,-ATCACGGAT<CrGGCrTGGTTC-3’ JORAP2.9L 5,-GCCΎTCTTCCGTΛTCΛACGTCc~3l
RAP2.10 AF003103 JORA P2. i0U 5’-CTCAACTCCCCCCCTΓACC-3’ JORAP2-10L 5TTCTCCTΓΛTATACCCCCCCC A-3'
RArc.11 AF003104 IORAP2.HU 5·-GAGAACACCΛΛACΌCAACAACAC-3 ' JORAP2.1 1L 5,-ACTTCTTAGGAAAATCCTTTCCG-3’
RATC.12 A F003105 JORAP2.12U 5,-AAACCATTCCTTTTCACTTCGACTC-3, JORAP2.12L 5’·-TCACAGAGCGTTΓCTCACAA'ΠΆCC-3
189 711
Startery do PCR stosowano w standardowych warunkach techniki PCR (opisanych przykładowo w Innis i wsp.), używając jako matryce kwasów nukleinowych zidentyfikowanych pod wymienionymi powyżej numerami dostępu w GoaBanku. Produkty PCR wytwor/One w każdej reakcji mogą następnie być wykorzystane do identyfikowania kwasów nukloiaawych według wynalazku (np. z biblioteki cDNA) dzięki ich zdolności do hybrydyzacji z tymi produktami. S/c/ególaie korzystne warunki hybrydyzacji wykorzystują bufor do hybrydyzacji składający się z: 0,25 M bufor fosforanowy (pH 7,2), 1 mM eDtA, 1% wołowa albumina surowicza, 7% SDS. Po hybrydyzacji następuje pierwsze płukanie 2,0X SSC + 0,1% SDS lub 0,39 M Na+ i dalsze płukania w 0,2x SSC + 0,1% SDS lub 0,042 M Na+. Temperatura hybrydyzacji będzie od około 45°C do około 78°C, zazwyczaj około 50°C do około 70°C. Po czym następują płukania w 18°C.
S/c/ególaio korzystne warunki hybrydyzacji są następujące:
Temp. hybr. Czas hybr. Buf. A do płukania Buf. B do płukania
78°C 48 godz 18°C 18°C
70°C 48 godz 18°C 18°C
65°C 48 godz 18°C 18°C
60°C 72 godz 18°C 18°C
55°C 96 godz 18°C 18°C
45°C 200 godz 18°C bez płukania
Jeśli pożądane, można użyć starterów pozwalających na powielenie obszarów bardziej specyficznych do określonych genów ADC. Produkty PCR, wytworzone przy użyciu tych starterów, mogą być stosowane do izolacji kwasów nukleinowych według wynalazku, w warunkach hybrydyzacji opisanych powyżej.
Nazwa GenBank nr Startery
AP2 U12546 AP2U 5’-ATGTGGGATCTAAACGACGCAC-3’ AP2L 5* -GATCTFGGTCCACGCCGAC-3 ‘
RAP2.1 AF003094 RAP2.1U 5-AAG AGG ACC ATC TCT CAG-3' RA1P2. 1JL 5'--A\C ACTCGCTAG CTT CTC-3'
RAP2.2 AF003095 RAP2.2U 5'-TGG TTC AGC AGC CAA CAC-3* RAP2.2L 5-CAA TGC ATA GAG CTT GAG G-3’
RAP2.4 AF003097 RAP2.4U 5-ACG GAT TTC ACA TCG GAG-3' RAP2.4L 5-CTA AGC TAG AAT CGA ATC C-V
RAP2.5 AF003098 RAP2.5U 5'-TACCGGTTTC’&CGCGTAG-3‘ RAP2.5L 5’-CACCTrCGAAAT<CAAOGACCG-3’
189 711
c.d. tabeli
RAP2.6 AF003099 RAP2.6U 5,-TTCCCCGAAAATGTTGGAACTC-3' RAP2.6L 5'-TGGGAGAGAAAAAATTGGTAGATCG-3 '
RAP2.7 AF003100 RAP2.7U 5'- CGA TGG AGA CGA AGA CTC-3' RAP2.7L 5'- GTC GGA ACC GGA GTT ACC--’
RAP2.8 AF003101 RAP2.8U 5'-TCA CTC AAA GGC CGA GAT C-3‘ RAP2.8L 5-TAA CAA CAT CAC CGG CTC G-3'
RAP2.9 AF003I02 RAP2.9U 5-GTG AAG GCT TAG GAG GAG-3’ RAP2.9L 5’-TGC CTC ATA TGA GTC AGA G-3'
RAP2.10 AF003103 RAP2.10U 5'-TCCCGGAGCTTTTAGCCG-3· RAP210L 5*CAACCCGTTCCAACGATCC-3’
RAP2.11 AF003104 RAP2. 11U 5‘-TTCTTCACCAGAAGCAGAGCATG-3· RAJP2. 11L S’-CTCCATTCATTGCATATAGGGACG-3·
RAP2.12 AF003105 RAP2.12U AG AACTCGAACATC-3' RAP2-12L 5'-AGGrrGATAAACGAACGATGCG-3 *
Polinukleotydy można także syntetyzować za pomocą dobrze znanych technik opisanych w literaturze technicznej. Patrz, np. Carruthers i wsp., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418 (1982) i Adams i wsp., J. Am. Chem. Soc. 105:661 (1983). Fragmenty dwuniciowego DNA można wytwarzać zarówno poprzez syntetyzowanie komplementarnej nici i wiązanie obu nici ze sobą w odpowiednich warunkach, lub przez dodanie komplementarnej nici przy użyciu polimerazy DNA ze starterem o odpowiedniej sekwencji.
Alternatywnie, startery specyficznie hybrydyzujące do silnie konserwowanych obszarów domen AP2 mogą być użyte do powielania sekwencji z różnorodnych gatunków roślin takich jak Arabidopsis, kapusta rzepak (Brassica napus), soja, tytoń i lwia paszcza. Przykłady takich starterów są następujące:
Starter RISZU 1: 5 '-GGAYTGTGGGAAACAAGTTTA-3'
Starter RISZU 2: 5'-TGCAAAGTRACACCTCTATACTT-3’
Y = pirymidyna (T lub C)
R = puryna (A lub G)
Standardowe techniki hybrydyzacji kwasów nukleinowych stosujące warunki ujawnione powyżej mogą być użyte do identyfikowania klonów cDNA i genomowych o pełnej długości.
Dodatkowo, następujące startery, RISZU 3 i RISZU 4 mogą być użyte w odwrotnej reakcji PCR do powielenia sekwencji otaczających gen AP2 z różnorodnych gatunków roślin. Startery takie są następujące:
-J-- ΤΊΤΡ^ΤΤ O. Cl A 'Τ’/'ΊΧ'ϊ 7 S~> a a a -λ i
OUUIC1 MOLU J. J -kJUTAl KJ W ULAUi U i LAAAl
Starter RISZU 4: 5'-GAGGAAGTTCVAAGTATAGA-3'
W = A lub T
V = G, A lub C
Startery te zostały użyte w standardowych warunkach techniki PCR dla powielenia sekwencji genu ADC z kapusty, rzepaku (SEK NR ID: 1) i soi (SEK NR ID: 2).
189 711
Supresja aktywności ADC lub ekspresji genu
Specjaliście wiadomo, ze do inaktywacji lub supresji aktywności ADC lub ekspresji genu można użyć kilku sposobów. Kontrolę ekspresji można osiągnąć poprzez wprowadzenie mutacji do genu lub przez zastosowanie technik rekombinowania DNA. Techniki te, ogólnie dobrze znane specjalistom, są krótko omówione poniżej.
Sposoby wprowadzania mutacji genetycznych do genów roślinnych są dobrze znane. Przykładowo, nasiona lub inny materiał roślinny można poddać działaniu mutagenicznych substancji chemicznych, zgodnie ze standardowymi technikami. Do takich substancji chemicznych należą, lecz nie wyłącznie, następujące: siarczan dietylu, etylenoimina, metanosulfonian etylu i N-nitrozo-N-etylomocznik. Alternatywnie, można zastosować promieniowanie jonizujące, przykładowo, promienie X lub gamma. Żądane mutanty są selekcjonowane na podstawie wzrostu masy nasion, zawartości oleju i innych właściwości.
Ekspresję genu można inaktywować przy użyciu technik rekombinowania DNA jak transformacja komórek roślin konstruktami obejmującymi transpozony lub sekwencje T-DNA. Mutanty ADC wytworzone tymi metodami są identyfikowane standardowymi technikami. Przykładowo, mutanty można wykrywać techniką PCR lub przez wykrywanie obecności lub braku mRNA ADC, np. techniką typu Northern. Mutanty można także selekcjonować na podstawie wzrostu masy nasion, zawartości oleju i innych właściwości.
Wyizolowane sekwencje, wytworzone w sposób jak tu opisano, można także zastosować w wielu technikach do supresji ekspresji endogennego genu ADC. Szczególnie przydatnymi genami do tego celu są: gen AP2, opisany przez Jofuku i wsp., w publikacjach jak powyżej oraz opisane poniżej geny RAP2. Przykładowo, sekwencje otaczające domeny AP2 ujawnianych tu genów stosuje się do określenia docelowych indywidualnych genów.
Do zahamowania ekspresji genu w roślinach można zastosować kilka metod. Przykładowo, bez kłopotu można stosować technologię z antysensownymi sekwencjami. Dla osiągnięcia tego fragment kwasu nukleinowego z pożądanego genu jest klonowany i funkcjonalnie podłączony do promotora tak, że w wyniku transkrypcji powstaje antysensowna nić RNA. Konstrukt jest następnie transformowany do roślin i wytwarzana jest antysensowna nić RNA. Wydaje się, że w komórkach roślin antysensowny RNA hamuje ekspresję genu przez uniemożliwienie nagromadzenia mRNA, który koduje interesujący enzym, patrz np. Sheehy i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8805-8809 (1988) i Hiatt i wsp., patent USA nr 4801340.
Fragment kwasu nukleinowego, który ma być wprowadzony, najczęściej będzie zasadniczo identyczny, do co najmniej części endogennego genu ADC lub genów, które mają ulec represji. Jednakże, sekwencja nie musi być idealnie identyczna, aby mogła zahamować ekspresję. Wektory według niniejszego wynalazku można tak zaprojektować, ze ich hamujące działanie ma zastosowanie do innych genów w rodzinie genów wykazujących homologię lub zasadniczą homologię do docelowego DNA.
Przy antysensownej supresji, wprowadzana sekwencja także nie musi na pełnej długości odpowiadać zarówno pierwotnemu produktowi transkrypcji jak i całkowicie dojrzałemu mRNA. Zasadniczo, można zastosować wyższą homologię, aby skompensować użycie krótszej sekwencji. Ponadto, wprowadzana sekwencja nie musi mieć tego samego układu intronu lub egzonu, a homologia nie kodujących segmentów może być równie skuteczna. Normalnie, powinna być użyta sekwencja o długości pomiędzy około 30 lub 40 nukleotydów i o długości zbliżonej do pełnej, chociaż sekwencja, co najmniej około 100 nukleotydów jest korzystna, co najmniej około 200 nukleotydów jest bardziej korzystna oraz sekwencja około 500 do około 1700 nukleotydów jest szczególnie korzystna.
Cząsteczki katalityczego RNA lub rybozymów można także zastosować do zahamowania ekspresji genów ADC. Jest możliwe zaprojektowanie rybozymów specyficznie parujących potencjalnie z każdym docelowym RNA i tnących wiązanie fosfidiestrowe w określonym miejscu, powodując tym samym funkcjonalną inaktywację docelowego RNA. Podczas tego przecinania sam rybozym nie zmienia się, może być zatem użyty do przecinania innych cząsteczek, stając się rzeczywistym enzymem. Włączenie sekwencji rybozymowych do antysensownego RNA wprowadza aktywność cięcia RNA w nim samym co podnosi aktywność konstruktów.
189 711
Zidentyfikowano kilka klas rybozymów. Jedna klasa pochodzi z licznych małych, kolistych cząsteczek RNA, zdolnych do samoprzecinania i replikacji w roślinach. Cząsteczki RNA replikują się samodzielnie (RNA wiroidów) lub przy udziale wirusa pomocniczego (satelitarne RNA). Przykłady obejmują cząsteczki RNA z wiroida ASV (ang. avocado sunbloth viroid) oraz satelitarnych RNA z TRV (ang. tobacco ringspot virus), LTSV (ang. lucerne transient streak virus), VTMV (ang. velvet tobacco mottle virus), SNMV (ang. solanum nodiflorum mottle virus) i SCMV (ang. subterranean clover mottle virus). Zaprojektowanie i wykorzystanie rybozymów specyficznych dla RNA opisano w Haseloff i wsp. Nature, 334:585-591 (1988).
Innym sposobem supresji jest sensowna kosupresja. Skutecznym sposobem hamowania transkrypcji docelowych genów jest opisane ostatnio wprowadzenie kwasu nukleinowego ułożonego w sensownej orientacji. Przykładowy opis użycia tej metody do modulowania ekspresji endogennych genów znajduje się w:
Napoli i wsp., The Plant Cell 2:279-289 (1990) i patenty USA nr nr 5034323, 5231020 i 5283184.
Wynik supresji może pojawić się wtedy, kiedy wprowadzona sekwencja zawiera nie kodującą sekwencję per se, lecz jedynie intron lub nie podlegające translacji homologi sekwencji do sekwencji obecnych w pierwotnym transkrypcie endogennej sekwencji. Wprowadzona sekwencja najczęściej będzie zasadniczo identyczna do sekwencji endogennej, podlegającej represji. Minimalna identyczność typowo będzie większa niż około 65%, lecz wyższa identyczność powinna wywierać większą represję ekspresji endogennych sekwencji. Korzystna jest zasadniczo większa identyczność o ponad około 80%, chociaż bardziej korzystne jest około 95% całkowitej identyczności. Podobnie jak w regulacji antysensownej, wyniki te powinny mieć zastosowanie do dowolnych białek z podobnej rodziny genów, wykazujących homologię lub zasadniczą homologię.
Przy sensownej supresji, wprowadzana sekwencja wymaga mniejszej całkowitej identyczności, a także nie wymaga pełnej długości zarówno do pierwotnego produktu transkrypcji lub całkowicie dojrzałego mRNA. Może to być korzystne dla uniknięcia jednoczesnego wytwarzania roślin z nadprodukcją. Wyższa identyczność, w krótszej niż pełnej długości sekwencji kompensuje dłuższe, mniej identyczne sekwencje. Ponadto, wprowadzana sekwencja nie musi posiadać identycznego ułożenia intronu lub egzonu, a identyczność nie kodujących segmentów będzie równie skuteczna. Normalnie stosowany zakres długości sekwencji jest taki jak opisany powyżej dla antysensownej regulacji.
Wydaje się, że niektóre białka ADC (np. AP2) tworzą in vivo multimery. Dlatego, alternatywną metodą hamowania funkcji ADC jest użycie dominujących mutantów negatywnych. Podejście to wymaga transformacji roślin konstruktami kodującymi zmutowane polipeptydy ADC, które tworzą defektywne multimery z endogennymi białkami ADC dzikiego typu, reaktywując w ten sposób białko. Zmutowany polipeptyd może różnić się od naturalnie występującej sekwencji na poziomie struktury pierwszorzędowej aminokwasowym podstawieniem, addycją, delecją i temu podobnymi. Do wytworzenia zmodyfikowanego łańcucha białka można zastosować modyfikacje w wielu kombinacjach. Użycie dominujących mutantów negatywnych do inaktywacji AG opisano w publikacji Mizukami i wsp., Plant Cell 8:831-845 (1996).
Zastosowanie kwasów nukleinowych według wynalazku do wzmocnienia ekspresji genu ADC
Wyizolowane sekwencje wytworzone jak opisano powyżej można zastosować do uzyskania ekspresji określonego kwasu nukleinowego ADC celem wzmocnienia lub zwiększenia
ΡηΗπσΡπηΡσπ σρηυ W7mnrninnQ rłp zmniejszenia nasion i otrzymania owoców pozbawionych nasion. W przypadku, gdy pożądana jest nadekspresja genu można zastosować dany gen z innego gatunku dla obniżenia potencjalnych skutków sensownej supresji.
Specjalista rozpozna, że polipeptydy kodowane przez geny według wynalazku, podobnie jak inne białka, mają różne domeny pełniące różne funkcje. A zatem, sekwencje genów nie muszą być pełnej długości, dopóki pożądana funkcjonalna domena białka ulega ekspresji. Cechy wyróżniające polipeptydy ADC, w tym domenę AP2 są omówione w szczegółach poniżej.
189 711
Zmodyfikowanie łańcuchów białek można z łatwością osiągnąć wykorzystując różne techniki rekombinowania DNA dobrze znane specjalistom i opisane w szczegółach poniżej. Przykładowo łańcuchy mogą różnić się od naturalnie występującej sekwencji na poziomie struktury pierwszorzędowej dzięki aminokwasowemu podstawieniu, addycji, delecji i temu podobnym. Do wytworzenia zmodyfikowanego łańcucha białka można zastosować modyfikacje w wielu kombinacjach.
Wytwarzanie zrekombinowanych wektorów
Do użycia wyizolowanych sekwencji w opisanych powyżej technikach wytworzono wektory zrekombinowanego DNA odpowiednie do transformacji komórek roślinnych. Techniki transformacji wielu gatunkach roślin wyższych są dobrze znane i opisane w literaturze technicznej i naukowej. Dla przykładu patrz Weising i wsp., Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988). Sekwencja DNA kodująca żądany polipeptyd, dla przykładu sekwencja cDNA kodująca białko pełnej długości, będzie korzystnie połączona z sekwencjami regulacyjnymi dla inicjacji transkrypcji i translacji, które będą kierowały transkrypcją sekwencji z genu w pożądanych tkankach stransformowanej rośliny.
Przykładowo, dla nadekspresji można wykorzystać fragment promotora roślinnego, który będzie kierować ekspresją genu we wszystkich tkankach zregenerowanej rośliny. Takie promotory nazywane są promotorami „konstytutywnymi” i działają w większości warunków środowiska i większości stadiów rozwoju lub różnicowania komórki. Przykłady konstytutywnych promotorów obejmują obszar inicjacji transkrypcji wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) 35S, promotor 1'- lub 2'- pochodzący z T-DNA Agrobacterium tumefaciens lub inne obszary inicjacji transkrypcji z różnych genów roślinnych dobrze znanych specjalistom. Geny takie obejmują przykładowo gen AP2, ACT11 z Arabidopsis (Huang i wsp., Plant Mol. Biol. 33:125-139 (1996), Cat3 z Arabidopsis (GenBank nr U43147, Zhong i wsp., Mol. Gen. Genet. 251:196-203 (1996), gen kodujący desaturazę białka przenoszącego stearoilo-acyl z Brassica napus (GenBank nr Χ74782, Solocombe i wsp , Plant Physiol. 104:1167-1176 (1994)), GPcl z kukurydzy (GenBank nr Χ15596, Martinez i wsp., J. Mol. Biol. 208:551-565 (1989)) i Gpc2 z kukurydzy (GenBank nr U45855, Manjunath i wsp., Plant Mol. Biol. 33:97-112 (1997)).
Alternatywnie, promotor roślinny może kierować ekspresją kwasu nukleinowego ADC w określonej tkance lub może znajdować się pod ściślejszą kontrolą środowiska lub rozwoju. Przykłady warunków środowiskowych, które mogą działać na transkrypcję poprzez promotory indukowalne obejmują warunki beztlenowe, podwyższoną temperaturę lub obecność światła. Promotory takie określane są tu jako promotory „indukowalne” lub „tkankowo-specyficzne”. Specjalista rozpozna, ze promotor tkankowo-specyficzny może kierować funkcjonalnie połączonymi sekwencjami w tkankach innych niż tkanka docelowa. A zatem, zastosowany tu promotor tkankowo-specyficzny jest tym, który kieruje ekspresją korzystnie w docelowej tkance, lecz może także prowadzić do ekspresji w innych tkankach.
Przykłady promotorów podlegających kontroli rozwojowej obejmują promotory inicjujące transkrypcję jedynie (lub przede wszystkim) w określonych tkankach jak owoc, nasiona lub kwiaty. Promotory kierujące ekspresją kwasów nukleinowych w zalążkach, kwiatach lub nasionach są szczególnie przydatne w niniejszym wynalazku. Promotor specyficzny dla nasion jest promotorem, który kieruje ekspresją w tkankach nasion; takimi promotorami mogą być przykładowo promotory specyficzne dla zalążka, specyficzne dla zarodka, specyficzne dla bielma, specyficzne dla integumentu, specyficzne dla osłony, specyficzne dla łupiny nasiona lub ich kombinacje. Przykłady zawierają promotor genu BEL1, specyficznego dla zalążka, opisanego w Reiser i wsp., Cell 83:735-742 (1995) (GenBank nr U39944). Inne promotory odpowiednio specyficzne dla nasiona pochodzą z następujących genów: MAC1 z kukurydzy (Sheridan i wsp., Genetics 142:1009-1020 (1996), Cat3 z kukurydzy (GenBank nr L05934, Abler i wsp., Plant Mol. Biol. 22:10131-1038 (1993), gen kodujący oleozynę 18kD z kukurydzy (GenBank nr J05212, Lee i wsp.. Plant Mol. Biol. 26:1981-1987 (1994)), wiwparus-1 z Arabidopsis (GenBank nr U93215), gen kodujący oleozynę z Arabidopsis (GenBank nr Z17657), Atmycl z Arabidopsis (Urao i wsp., Plant Mol. Biol. 32:571-576 (1996), rodzina genów kodujących białko spichrzowe nasion 2s z Arabidopsis (Conceicao i wsp., Plant 5:493-505 (1994), gen kodujący oleozynę 20kD z Brassica napus (GenBank nr M63985),
189 711 napA z Brassica napus (GenBank nr J02798, Josefsson iwsp., JBL 26:12196-1301 (1987), rodzina genów napiny z Brassica napus (Sjodahl iwsp., Planta 197:264-271 (1995), gen kodujący białko zapasowe 2S z Brassica napus (Dasgupta iwsp., Gene 133:301-302 (1993), geny kodujące oleozynę A (GenBank nr U09118) i oleozynę B (GenBank nr U09119) z soi i gen kodujący białko o niskiej masie molekularnej, bogate w siarkę, pochodzące z soi (Choi i wsp., Mol. Gen. Genet. 246:266-268 (1995)).
Jeśli oczekiwana jest ekspresja właściwego polipeptydu powinien zostać włączony rejon poliadenylacji na końcu 3' obszaru kodującego. Rejon poliadenylacji może pochodzić z naturalnego genu, z różnorodnych genów innych roślin lub z T-DNA.
Wektor zawierający sekwencje (np. promotorów lub obszarów kodujących) z genów według wynalazku będzie zazwyczaj zawierać gen markerowy nadający komórkom roślinnym fenotyp selekcyjny. Dla przykładu marker może kodować oporność na bicyd, szczególnie oporność na antybiotyk, jak oporność na kanamycynę, G418, bleomycynę, higromycynę lub oporność na herbicyd jak chlorosulfuron lub Basta.
Wytwarzanie transgenicznych roślin
Konstrukty DNA według wynalazku można wprowadzić do genomu określonego gospodarza roślinnego różnymi klasycznymi technikami. Przykładowo, konstrukty DNA można wprowadzać bezpośrednio do genomowego DNA komórek roślinnych przy użyciu technik takich jak elektroporacja i mikroiniekcja protoplastów komórek roślinnych lub konstrukty DNA można wprowadzać bezpośrednio do tkanki roślinnej przy użyciu metod balistycznych jak bombardowanie cząsteczkami DNA.
Techniki mikroiniekcji są znane specjalistom i dobrze opisane w literaturze naukowej i patentowej. Wprowadzenie konstruktów DNA przy użyciu wytrącania glikolem polietylenowym opisana jest w publikacji Paszkowski iwsp, eMBo J. 3:2717-2722 (1984). Techniki elektroporacji opisał Fromm iwsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824 (1985). Techniki transformacji balistycznej opisano w publikacji Klein i wsp., Nature 327:70-73 (1987).
Alternatywnie, konstrukty DNA można łączyć z odpowiednimi obszarami otaczającymi T-DNA i wprowadzać do klasycznego wektora gospodarza Agrobacterium tumefaciens. Wirulentne funkcje gospodarza będą kierowały insercją konstruktu i przyległego markera do DNA komórki roślinnej, kiedy komórka jest zakażona bakteriami. Techniki transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens obejmujące rozbrojenie i użycie wektorów bifunkcyjnych są dobrze opisane w literaturze naukowej. Dla przykładu patrz Horsch i wsp., Science 233:496-498 (1984) i Fraley i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983).
Stransformowane komórki roślinne wytworzone w wyniku przeprowadzenia powyższych technik transformacji można hodować dla regeneracji całych roślin, które posiadają genotyp transformanta, a tym samym żądany fenotyp, jak zwiększona masa nasiona. Takie techniki regeneracji polegają na manipulacji fitohormonami w pożywce dla hodowli tkankowych, zasadniczo markerem biocydowym i/lub herbicydowym, który wprowadzano wraz z żądaną sekwencją nukleotydową. Regeneracja roślin z hodowli protoplastów jest opisana w publikacji Evans i wsp., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Celi Culture, str. 124-176, MacMillian Publishing Company, New York, 1983 iBinding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, str. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. Regenerację można także otrzymać z roślinnego kalusa, eksplantów, organów i ich części. Takie techniki regeneracji opisano ogólnie w publikacji Klee i wsp., Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486 (1987).
Kwasy nukleinowe według wynalazku mogą być użyte do nadania żądanych cech zasadniczo każdej roślinie. A zatem wynalazek ma zastosowanie dla szerokiego zakresu roślin włączając gatunki z rodzajów: Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotina, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonelia, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna i Zea.
189 711
Zwiększenie rozmiaru nasiona, zawartości białka, aminokwasów i olejów jest szczególnie pożądane u roślin uprawnych, których nasiona są używane bezpośrednio do konsumpcji zwierzęcej i przez człowieka lub w celach przetwórczych. Przykłady obejmują soję, kapustę rzepak i zboża takie jak ryż, pszenica, kukurydza, żyto i temu podobne. Zmniejszenie wielkości nasiona lub wytworzenie odmian pozbawionych nasion jest szczególnie ważne u roślin hodowanych dla ich owoców, w których duże nasiona są niepożądane. Przykłady obejmują ogórki, pomidory, melony i wiśnie.
Specjalista rozumie, że stabilna kasetka ekspresyjna w truasgeaic/aych roślinach, o potwierdzonej funkcjonalności, może być wprowadzana do innych roślin przez krzyżowanie. Zależnie od krzyżowanych gatunków można zastosować dowolną z wielu standardowych technik reprodukcji.
Wtedy, gdy transgeniczaa ekspresja kwasów nukleinowych według wynalazku prowadzi do zmian fenatypawych w nasionach i owocu, rośliny zawierające kasetki ekspresyjne omówione powyżej muszą być skrzyżowane z drugą rośliną dla otrzymania końcowego produktu. Nasiono według wynalazku może pochodzić z krzyzówki pomiędzy dwiema transgeaic/aymi roślinami według wynalazku lub z krzyzówki pomiędzy rośliną według wynalazku i inną rośliną. Żądane wyniki (np. zwiększona masa nasiona) są /azwyc/aj wzmocnione, kiedy obie rośliny rodzicielskie zawierają kasety ekspresyjne według wynalazku.
Nasiono wytworzone przez rośliny według niaiejszoga wynalazku można analizować zgodnie z dobrze znanymi procedurami dla identyfikacji nasiona z żądaną cechą. Zwiększoną lub zmniejszoną wielkość można określić przez ważenie lub na podstawie oglądu. Zawartość białka można dogodnie mierzyć metodą według Bradford i wsp., Anal. Bioch. 72:248 (1976). Zawartość oleju jest określana przy pomocy standardowych procedur takich jak chromatografia gazowa. Procedur tych można także użyć do określenia czy typy kwasów tłuszczowych i innych lipidów są zmienione w roślinach według wynalazku.
Stosując te procedury fachowcy mogą identyfikować nasiona według wynalazku przez obecność kasetek ekspresyjnych według wynalazku i zwiększoną masę nasiona. Zazwyczaj, masa nasiona będzie, o co najmniej około 10%, często około 20% większa niż średnia masa nasiona roślin tej samej odmiany bez kasetki ekspresyjnej. Masa może być o około 50% większa i korzystnie, co najmniej około 75% do około Ϊ0ϋ% większa. Zwiększenie innych właściwości np., zawartości białka i oleju będzie /a/wyc/aj proporcjonalne do wzrostu masy. A zatem, w niektórych wykonaniach zawartość białka lub oleju może wzrosnąć o około 10%, 20%, 50%, 75% lub 100% lub w przybliżeniu proporcjonalnie do wzrostu masy.
Alternatywnie, nasiono według wynalazku, w którym wzmacaiosu jest ekspresja AP2 będzie zawierało kasetki ekspresyjne według wynalazku i będzie miało zmniejszoną masę nasiona. Masa nasiona, będzie o co najmniej około 20% mniejsza niż średnia masa nasiona roślin tej samej odmiany bez kasetki ekspresyjnej. Często masa będzie o około 50% mniejsza i korzystnie o co najmniej 75% mniejsza lub nasion będzie brak. Jak powyżej /maiojszonie innych właściwości np., zawartości białka i oleju będzie proporcjonalne do zmniejszenia masy.
Następujące przykłady są przedstawione dla zilustrowania, a nie ograniczema wynalazku.
Przykład 1
Izolacja genu AP2
Izolacja i charakterystyka genu AP2 z Arabidopsis jest szczegółowo opisana przez Jofuku i wsp., w publikacji jak wyżej. W skrócie, celem identyfikacji i izolacji genu kontrolującego formowanie kwiatu u Arabidopsis, zastosowano, jako mutagen wywołujący insercje, T-DNA z Agrobacterium. Jedna z linii truasformaatów, azaaczona jako T10, segregowała jak 3 do 1 względem mutacji kwiatu ^^typowo przypominającej liczne allele hameatycznoga genu ap2. Przebadanie T10 potwiordziła, że T10 i ap2 są mutacjami allelicznymi Mutant został ozauczaay jako ap2-10.
Stosując analizę sprzężeń, wykorzystującą jako zaac/aik genetyczny gen kodujący fosfotrαnsforuzę neomycyny II (NPTII), niosący T-DNA ustalono, że mutacja ap2-10 powstała w wyniku inserj T-DNA. Z biblioteki goaamowoj genów mutanta ap2-10 wyselekcjonowano zestaw nakładających się zrekambinowaaych fagów niosących T-DNA i roślinne sekwencje DNA otaczające element iasercyjay T-DNA wykorzystano jako sondy hybrydyzacyjao do izolacji fagów zawierających odpowiadające im fragmenty DNA znajdujące się w gonomawej
189 711 bibliotece genów sporządzonej dla DNA z Arabidopsis typu dzikiego. Miejsce wbudowania
T-DNA w ap2-10 ograniczono do fragmentu o wielkości 7,2 kb, otrzymywanego po trawieniu
EcoRI, zlokalizowanego w centralnej części genu AP2.
Wyizolowano pięć klonów cDNA z kwiatów Arabidopsis odpowiadających sekwencjom w rejonie genu AP2 o wielkości 7,2 kb. Stosując strategię „antysensownego genu” do wprowadzenia u roślin typu dzikiego mutanta ap2 kwiatów potwierdzono, ze wszystkie pięć klonów niesie cDNA odpowiadający transkryptom genu AP2.
Dla określenia struktury genu AP2 porównano sekwencje nukleotydowe insertów cDNA z sekwencją genomowego fragmentu AP2 o wielkości 7,2 kb. Uzyskane wyniki pokazały, ze gen AP2 ma długość 2,5 kb i zawiera 10 egzonów oraz 9 intronów, których długość mieści się w zakresie od 85 do 110 par zasad. Gen AP2 koduje teoretyczny polipeptyd zbudowany z 432 aminokwasów o przewidywanej masie cząsteczkowej 48 kD. Sekwencję nukleotydową AP2, oraz postulowaną sekwencję białka wykorzystano dla przeszukania baz danych. Stwierdzono, że AP2 nie wykazuje znaczącego, ogólnego podobieństwa do żadnego ze znanych białek regulatorowych.
Jednak analiza sekwencji wykazała występowanie w jego obrębie kilku sekwencji, które mogą być ważne dla struktury lub działania białka AP2. Po pierwsze, AP2 zawiera 37-aminokwasową, kwasową, bogatą w serynę domenę (aminokwasy 14 do 50), która jest analogiczna do obszarów działających jako domeny aktywujące w wielu czynnikach transkrypcyjnych dla RNA polimeraz II. Po drugie, AP2 zawiera wysoce zasadową 10-aminokwasową domenę (aminokwasy 119 do 128) obejmującą sekwencję KKSR, przypuszczalnie odpowiedzialną za lokalizację polipeptydu w jądrze komórkowym, co sugeruje, ze białko AP2 może działać w jądrze komórkowym. W końcu, centralna część polipeptydu AP2 (aminokwasy 129 do 288) zawiera dwie kopie 68-aminokwasowego prostego powtórzenia określanego tu jako domena AP2. Dwie kopie tego powtórzenia, nazywane tu AP2-R1 i AP2-R2 posiadają 53% identycznych i 69% homologicznych aminokwasów. Fig. 1A pokazuje, że każde z powtórzeń AP2 zawiera konserwowane 18-aminokwasowe rejony rdzeniowe zawierające 83% homologicznych aminokwasów. Fig. 1B pokazuje, że obie kopie rdzeniowych rejonów są teoretycznie zdolne do tworzenia amfipatycznych α-heliksów, mogących brać udział w oddziaływaniach białko-białko.
Przykład 2
Wytwarzanie konstruktu niosącego AP2
Wytworzono konstrukty genowe zawierające rejon kodujący AP2 opisany powyżej, połączony w sposób umożliwiający jego transkrypcję z konstytutywnym promotorem 35S z wirusa mozaiki kalafiora, przy czym połączenia wykonano tak, aby syntetyzowane były sensowne lub antysensowne RNA. Oryginalny wektor, pGSJ780A, niosący 35S promotor, otrzymano z Plant Genetic Systems (Gent, Belgium). Wektor pGSJ780A zmodyfikowano przez wstawienie adaptera Clal-BamHI, zawierającego sekwencję rozpoznawaną przez EcoRI, do unikalnej wpGSJ780A sekwencji rozpoznawanej przez BamHI. Zmodyfikowany DNA pGSJ780A linearyzowano przez trawienie EcoRI i wstawiono rejon kodujący genu AP2 o wielkości 1,68 kb uzyskany po trawieniu EcoRI, przy czym fragment ten przyłączany był do promotora 35S (patrz fig. 2 i 3) w sposób umożliwiający syntezę sensownego lub antysensownego RNA.
Uzyskany DNA wprowadzano przez transformację do E coli i selekcjonowano transformanty oporne na spektynomycynę. Z poszczególnych transformantow izolowano plazmidowy DNA, a następnie przez sekwencjonowanie DNA ustalano orientację wstawek DNA względem promotora 35S. Komórki bakterii niosące 35S/AP2 w sensownej orientacji (oznaczone jako pPW12.4 ipPW9) i55S/AP2 worientacj i antysensownej (oznaczone jako PPW14.4 ipPW15) aoniugowaok z Agrobacterium tumefaciens, a następnie selekcjonowano trnosfoomanty zpzroe na r^mp^^ę i spsatynzmycyoę celem zastosowania ich do zależnej od Agrobacterium transformacji roślin.
Przy pomocy stnodnotowyah technik do dzikiego typu roślin Arabidopsis i tytoniu wprowadzano aonstoukty 35/AP2 sensowne i 35S/AP2 nntysenskwne. Stabilne linie roślin traosgeoiaznyah uzyskano dzięki selekcyjnemu conazaiaowi roślinnemu NPTTI (wΓnruoaującemu odporność na anoamycyoę9 niesionemu przez zmodyfikowany plazmidowy wektor Ti pGSJ780A.
189 711
Przykład 3
Modyfikacja nasion przy pomocy sekwencji AP2
Przykład ten pokazuje, że rośliny z mutacją ap2 i rośliny transgeniczne, niosące konstrukt 35S/AP2 w antysensownej orientacji, wytwarzają nasiona o zwiększonej masie i zwiększonej zawartości całkowitej białka. Przeciwnie, rośliny transgeniczne niosące konstrukt 35S/AP2 o „sensownej” orientacji wytwarzają nasiona o zmniejszonej masie i zawartości białka. Łącznie wyniki te wykazują, że masa nasion oraz zawartość nasion wytwarzanych przez rośliny transgeniczne może być modyfikowana przez genetyczne różnicowanie aktywności AP2.
Z uwagi na zróżnicowanie wielkości nasion i zawartości białka w nasionach analizowano nasiona wytwarzane przez rośliny z 30 linii roślin włącznie z mutantami typu ap2 Arabidopsis, w tym mutantami ap2-1, ap2-3, ap2-4, ap2-5, ap2-6, ap2-9 i ap2-10 oraz transgenicznymi roślinami Arabidopsis i tytoniu zawierającymi antysensowne i sensowne konstrukty CaMV 35S/AP2 lub wektor pGSJ780A, jak opisane powyżej. Stosowane w powyższych badaniach mutanty ap2 opisali Komaki i wsp., Development 104,195-203 (1988), Kunst i wsp., Plant Celi 1,1195-1208 (1989), Bowman i wsp., Development 112,1-20 (1991) i Jofuku i wsp. supra.
Z uwagi na niewielkie rozmiary nasion Arabidopsis i tytoniu średnią masę nasiona wyznaczano przez zważenie nasion w porcji złożonej, w przypadku Arabidopsis ze 100, a dla tytoniu z 50 nasion. Zmianę masy nasiona w zależności od zmian w aktywności genu AP2 obliczano przez odjęcie średniej masy nasiona typu dzikiego od masy nasiona mutanta.
Jako kontrolę zastosowano nasiona trzech roślin Arabidopsis typu dzikiego w tym ekotypu C24, Landsberger-er i Columbia i jednej rośliny tytoniu SR1 typu dzikiego. Nasiona Arabidopsis typu dzikiego wykazywały, jak przedstawiono w tabeli I, sezonową zmienność masy w zakresie 1,6 - 2,3 mg dla 100 nasion. Dlatego nasiona transgenicznyjh roślin Arabidopsis, porównywano z nasionami kontrolnymi zbieranymi mniej więcej w tym samym okresie sezonu wegetacji. Wykazano, ze jest to ważne, gdy porównuje się wpływ na masę nasion słabych mutacji ap2.
Tabela I pokazuje, ze w porównaniu z nasionami typu dzikiego, nasiona wszystkich badanych mutantów typu ap2 to jest ap2-1, ap2-3, ap2-4, ap2-5, ap2-6, ap2-9 i ap2-10 charakteryzują się znacząco większą średnią masą, od +27 do +104 procent. Mutanty charakteryzujące się częściową, nieznaczną utratą funkcji, takie jak mutanty ap2-1 i ap2-3 wykazują mniejsze przyrosty średniej masy nasion wynoszące odpowiednio od +27 procent do +40 procent masy nasion typu dzikiego. Przeciwnie, silne mutanty ap2, takie jak ap2-6 i ap2-10 ujawniały większy przyrost średniej masy nasion, wynoszący odpowiednio od +69 procent do +104 procent masy nasion typu dzikiego. Tak więc, zmniejszenie aktywności genu AP2 jednoznacznie prowadzi do zwiększenia masy nasion Arabidopsis.
Celem określenia, czy w roślinach transgenijznyoh typu dzikiego można manipulować masą nasion przez obniżanie in planta aktywności genu AP2, zastosowano opisaną wyżej strategię równoczesnego hamowania przez AP2 antysensowny iAP2 sensowny. Wytworzono dwadzieścia dziewięć niezależnych linii transgenicznych roślin Arabidopsis niosących antysensowny gen CaMV 35S/AP2 w postaci konstruktu pPW14.4 i pPW15 (fig. 2). Każdą z użytych w tych badaniach linii transgenicznych przebadano, z pozytywnym skutkiem, z uwagi na oporność na kanamycynę i obecność jednej lub większej liczby kopii T-DNA.
Tabela I pokazuje, ze nasiona dziewięciu transgenlcznyoh roślin Arabidopsis, zawierających antysensowny AP2 charakteryzują się w stosunku do nasion kontrolnych zwiększoną masą, której przyrost wynosi od +22 procent dla linii C24 15-542 do +89 procent dla linii C24 15-566. Z powodzeniem użyto zarówno ekotypu C24 jak i Landsberg-er. Zwiększoną masę wykazały nasiona pokoleń F1, F2 i F3.
Uzyskano osiem linii niosących gen 35S/AP2 w orientacji sensownej, które wykazują fenotyp mutantów kosupresorowych. Jak przedstawiono w tabeli I nasiona z dwóch badanych linii kosupresorowych charakteryzują, się większymi o +26 do +86 procent nasionami. Przeciwnie, rośliny stransformowane wektorem pGSJ780A wykazują normalny zakres średniej masy od -0,5 do +13 procent w porównaniu z nasionami typu dzikiego (tabela I). Łącznie, przedstawione wyniki dowodzą, ze sekwencje genu AP2 mogą być użyte dla uzyskania znacznego przyrostu masy nasion Arabidopsis zarówno przy pomocy strategii wykorzystującej antysensowne cząsteczki jak i strategię współsupresorowej stosowanych dla kwitnącej rośliny.
189 711
Tabela I
Genetyczna kontrola masy nasion Arabidopsis przez AP2
Średnia masa nasion w mg na 100 nasion1,2 Procentowa wartość zmiany masy nasion względem nasion „typu dzikiego
1 2 3
ap2 mutant seed 2 1 (0.1) +27%
1 ap2-1 2 2 (0 1) +33%
2.1 (0 2) +31%
2 8 (0 2) +33%
2. ap2-3 2.6(0 1) +27%
3 ap2-4 3.5 (0 3) +69%
3.5 (0 2) +69%
4 ap2-5 2 9(0.1) +39%
5 ap2-6 3.5 (0.2) +69%o
6. ap2-9 2.9 (0.1) +40%
7. ap2-10 3 7 (0.4) +79%
3 9 (0.3) +90%
4.2 (0.5) + 104%
Nasiona wytwarzane przez rośliny transgemczne antysensownych linii CaMV35S/AP2 (rodzic oporny na kanamycynę)
1 C24 14 4E (F1-15) F2 sd 3.1 +35%
C24 14.4E (F1-15) F3 sd 3.4 (0 3) +47%
2 C24 14 4S (F1-1) 2 8 (0.2) +29%
3 C24 14.4AA (F1-24) 2 9(0.1) +30%
4. C24 14 4DD (F1-2) 2 8 (0.3) +30%
5 C24 15-522 3.6 (0 1) +76%
6 C24 15-542 (F1-2) 2.6 (0.1) +25%
C24 15-542 (F1-7) 2 5 (0 2) +22%
7 C24 15-566 3 9(0.1) +89%
8 LE 15-9992-3 (F1-1) F2 sd 2.4 (0 1) +42%
189 711 c d tabeli I
1 2 3
9 LE 15-83192-3 (F1-3) 2 8 (0 0) +33%
LE 15-83192-3 (F1-17) 2.7 (0.0) +28%
Nasiona wytwarzane przez rośliny transgonic/no linii kasuprosarawych CaMV35S/AP2
(rodzic oporny na kaaamycyaę)
1.C24 9-5 (F1-5) 3.8 (0.0) +86%
2 LE 9-83192-2 (F1-19) 2 7 (0.2) +26%
LE 9-83192-2 (F1-24) 2.7 (0.1) +26%
Nasiona wytwarzane przez linie traasgonic/no uzyskane przez transformację wektorem pGSJ780A
(rodzic oporny na kanamycynę)
1.C24 3-107 (F1-1) 2.2 (0 1) +9%
2. C24 3-109 (F1-1) 2.3 (0 1) +13%
3 LE 3-83192-1 (F1-2) 2 3(0.1) +7%
4 LE 3-83192-1 (F1-2) 2 4(0.1) +11%
5. LE 3-9992-4 (F1-4) 2.4 (0 2) +12%
LE 3-9992-4 (F1-6) 2.3 (0.0) +9%
LE 3-9992-4 (F1-8) 2 1 (0 0) -0,5%
6. LE 3-9992-9 (F1-3) 2.3 (0.1) +7%
Nasiona wytwarzane przez rośliny Arabidopsis typu dzikiego
1 C24 2.0 (0.1) 2.3 (0.1) 2.2
2. Laadsborg-or 1.6 (0.1) 2.1 (0.1) 2 l 2 3 (0 1)
3 Columbia 1.8 (0 1) 2.1 (0 1)
‘Wartości odchylenia standardowego podano w nawiasach ^Nasiona typu dzikiego użyte dla porównań były dobierane z uwagi na ekotyp rośliny i czas zbioru nasion
189 711
Sekwencji genu AP2 z Arabidopsis użyto również dla negatywnej kontroli masy nasion tytoniu, rośliny będącej gatunkiem heterologicznym. Tabela II pokazuje, że w przypadku pięciu transgenicznych linii tytoniu, w których zachodzi ekspresja konstruktu CaMV 35S/AP2 spowodowała zmniejszenie masy transgenicznych nasion o -27 do -38 procent w porównaniu do masy nasion typu dzikiego. Wyniki te świadczą o ewolucyjnej konserwacji funkcji genu AP2 na poziomie białka pozwalającej na kontrolowanie masy nasion w układach heterologicznych.
Tabela II
Genetyczna kontrola masy nasion tytoniu przy pomocy AP2 z A-rabidopsis
Średnia masa nasion w mg na 5 nasion1'2 Procentowa wartość zmiany masy nasion względem nasion dzikiego typu
1 2 3
Nasiona wytwarzane przez rośliny transgeniczne linii sensownej CaMV35S/AP2 (rodzic oporny na kanamycynę)
1. SR1 9-110 To 3.1 (0.0) -27%
SR1 9-110 (F1-5) 3 0 (0.2) -29%
2 8 (0.3) -34%
2 SR1 9-202 (F1-G) 3.1 (0 2) -27%
SR1 9-202 (F1-1) 3.2 (0 1) -24%
3 SR1 9-103 (F1-2) 3.9 (0 0) -8%
4 SR1 9-413-1 2 8 (0.0) -34%
3.0 (0.2) -29%
5 SR1 9-418-1 To 3.5 (0.1) -18%
Nasiona wytwarzane przez rośliny transgeniczne linii antysensownej CaMV35S/AP2 (rodzic opomy na kanamycynę)
1 SR1 15-111 5.1 (0 4) +20%
SR1 15-111 (F1) 5 0 (0 4) +19%
2 SR1 15-116 To 4 1 (0.4) -3%
SR1 15-116 (F1-2) 4 0(0.1) -5%
SR1 15-116 (F1-1) 4 5 (0.1) +5%
3 SR1 15-407 (F1) 4.8 (0.5) +10%
4.7(0 3) + 10%
4. SR1 15-102 (F1) 4.5 (0.2) +6%
5. SR1 15-413 (F1-3) 4.2 (0.0) +0%
189 711 c d tabeli II
1 2 3
6. SR1 15-410 (F1-2) 4.4 (0.0) +4%
7. SR1 15-210 (F1-4) 3 6(0.1) -15%
Nasiona wytwarzane przez rośliny traasgoaic/ao linii uzyskanej tylko przez transformację wektorem pGSJ780A (rodzic oporny na kanamycynę)
1.SR1 3-402 (F1) 5 0 (0 1) +17%
2. SR1 3-401 (F1) 4.6 (0.1) +8%
3. SR1 3-405 (F1) 4.4 (0.1) +4%
Nasiona wytwarzane przez rośliny tytoniu typu dzikiego
1.SR1 4.2 (0.3) 4.0 (0 1)
'Wartości odchylenia standardowego podano w nawiasach
Zastosowanie konstruktów genowych AP2 do kontrolowania zawartości białka w nasionach
Z nasion roślin typu dzikiego, mutanta ap2, traasgoniczaej rośliny z αatysoasowaym AP2 i truasgeaic/nej rośliny z kosupresją sensownego AP2, zgadaie z metodą Naito i wsp. Plant Mol. Biol. 11, 109-123 (1998), izolowano i o/nac/aao ilościowo całkowite białko. Izolację białek z nasion każdorazowo wykonywano w trzech powtórzeniach za każdym razem izolując białko ze 100 wysuszonych nasion Arabidopsis lub 50 wysuszonych nasion tytoniu. Całkowite białko a/aaczano, stosując procedurę wiązania barwnika Bradforda zgodnie z metodą opisaną przez Bradford, Anal. Biochem. 72:248 (1976). Wyniki przeprowadzonych badań przedstawiono w tabeli III.
W mutancie ap2 całkowita zawartość białka w nasionach wzrasta o 20 do 78 procent względem zawartości białek w nasionach typu dzikiego. W roślinach transgonic/aych niosących αatysonsoway AP2 całkowita zawartość białka w nasionach wzrasta o +31 do +97 procent względem nasion kontrolnych pochodzących z roślin typu dzikiego. Nasiona roślin transgeniczaych z kosupresją AP2 wykazywały większą zawartość białek, wynoszącą od +13 do +17 procent, względem nasion roślin typu dzikiego. Podsumowując, rośliny truasgeniczno niosące a^'^^sensowne konstrukty lub z mutacją typu kosupresji wytwarzają nasiona zawierające więcej białka niż nasiona roślin kontrolnych typu dzikiego lub roślin transgenicznych niosących jedynie wektor pGSJ780A (tabela III).
Tabela III
Genetyczna kontrola, przy pomocy AP2, całkowitej zawartości białka w nasionach Arabidopsis
Całkowita zawartość białka w pg na 100 nasion' Procentowa wartość zmiany zawartości białka w porównaniu z nasionami roślin typu dzikiego
1 2 3
Nasiona mutanta ap2
1. ap2-1 652 (17) +20% relat^ to WT seed
615 (30) +11%
189 711 c d. tabeli II
1 2 3
2. ap2-3 705 (47) +27%
3. ap2-4 729(107) +33%
4 ap2-5 617(24) +13%
5 ap2-6 836 (14) +52%
6. ap2-9 798 (11) +46%
7. ap2-10 836 (15) +78%
Masa nasion wytwarzanych przez rośliny transgenicznej linii antysensownej CaMV35S/AP2 (rodzic oporny na kanamycynę)
1 C24 14 4E (F1-1) F3 sd 615(60) +31%
2. C24 15-522 (F1-1) 790 (23) +68%
3 C24 15-566 925 (173) +97%
Masa nasion wytwarzanych przez rośliny z transgenloznej linii sensownej CaMV35S/AP2
z kosupresją (rodzic oporny na kanamycynę)
1 LE 9-83192-2 (F1-19) 616 +13%
LE 9-83192-2 (F1-24) 637 +17%
Nasiona wytwarzane przez rośliny Arabidopsis typu dzikiego
1.C24 469(19)
2. LE 545 (22) 555
3 Col 548 (42)
Wartość odchylenia standardowego podano w nawiasie
W transącmcznych roślinach tytoniu niosących konstrukt genu 35S/AP2 w orientacji sensownej wykazano, ze nadekspresja AP2 może powodować zmniejszenie zawartości białka w nasionach o 27 do 45 procent względem nasion typu dzikiego. Podsumowując, wyniki uzyskane dla transgenicznyjh roślin Arabidopsis i tytoniu wykazują, ze masa ί ,as,iTomiyl _ - O. e 1 Ji K ł 1_______________ ~ o. ż 1 - -V* uaaiun i uaaiuu iuułc uyv guiuiuiuwmic p uck genu AP2.
189 711
Tabela IV.
Negatywny wpływ na zawartość białka w ο^ωη^Ε tonoygnoiaoongk tytoniu ekspresji1 genu AP2 z Arabidopsis'
Średnia zawartość białka w 50 Procentowa omlnon zawartości białka w porównaniu z nnyloonml roślin typu dzikiego
Nasiona wytwnronnn przez trnnygnoiaoon rośliny posiadające kons^kt CaMV 355/APP w onnotnaci sensownej
1. SR1 9-110 24^(11) -45%
2. SR1 9-202 (F1-G) 271 (11) -38%
3. SR1 9-413 362 (8) -18%
4 SR1 9-418-1 319(16) -27%
Nasiona rośliz typu dzikiego SR1 (typ dziki)
440(8) (JO) NA
'Wartość odchylenia ytnodnrdkwngk podano w zawiasie
Analiza białek z nasiko roślin traosgeziazzyah przez elektroforezę w żelach.
Nasiona Arabidopsis wytwarzają dwa podstawowe typy białek zapasowych - 12S krucyferynę i 2S napizę, które strukturalnie są spokrewnione z głównymi białkami zapasowymi wykrytymi u Brassicaceae i Leguminoceae. Skład białka z nasion roślin typu dzikiego, mutanta ap2, i traosgezicznych roślin Arabidopsis porównywano przez elektroforezę w zelu poliakrylo-amidowym z SDS prowadzoną zgodzie z metodą opisaną przez Naito i wsp., Plaot Mol. Biol, 11, 109-123 (1988). Całkowite białko wydzielano z nasion w sposób opisany powyżej. 50 pg próbki rozdzielono przez elektroforezę w żelu i barwiono przy pomocy błękitu Coomasslegz. Uzyskane wyniki pokazały, że skład białek w nasiooaah roślin typu dzikiego i mutanta ap2 jest jakościowo zierozróżnialzy. Nie stwierdzono wykrywalnych różnic między zawartością białek zapasowych 12S lub 2S w ekstraktach uzyskanych z oasion roślin typu dzikiego i mutanta ap2. Dowodzi to, że obniżenie aktywności geou AP2 nie zmienia profilu białek zapasowych syntetyzowanych w czasie dojrzewania oaslkn. Skład białek w oasionach tonosgeoiacoych roślin niosących aotysenszwny AP2 i sensowny AP2 z kosupresją był także aie do odróżnienia od składu białek roślin typu dzikiego. W szczególności w dużych onsiznach nie stwierdzono wykrywalnych różnic w ilości białek spichrzowych 12S krucyferyzy lub 2S napiny.
W końcu, toansgsoiazos rośliny tytoniu niosące 35S/AP2 konstrukt genowy umożliwiający nadekspresję AP2, wytwarzają znacząco mniejsze oasikna. Pomijając zmniejszenie masy oasioo wytwarzanych przez tonosgeoiczos rośliny tytoniu nie obserwowano różnic w składzie białek zapasowych w oasikoach wytwarzanych przez toansgeoiazoe rośliny niosące 35SSAP2 i dzikiego typu rośliny linii SR1.
Przykład 4
Izolacja innych genów z Arabidopsis należących do rodziny AP2
W przykładzie tym opisano izolację kilku fragmentów kwasów nukleinowych AP2 z Arabidopsis. Te kwasy nukleinowe oazwaoo tu RAP2 (zbliżone do AP2 ang. Related to AP2) i zidentyfikowano przy pomocy starterów specyficznych dla opisanych wyżej sekwencji kwasu nukleinowego z domeny AP2.
189 711
MATERIAŁY I METODY
Materiał roślinny. Jako roślin typu dzikiego użyto roślin Arabidopsis thaliana ekotypów Landsberg erecta (L-er) i C24. Rośliny hodowano w 22°C przy cyklu świetlnym składających się z 16 godz. fazy świetlnej i 8 godz. fazy ciemnej, w podłożu złożonym w proporcjach 1:1:1 z wermikulitu/perlitu /mchu torfowca. Rośliny podlewano czterokrotnie rozcieńczonym roztworem Peters'a (Grace-Sierra, Milpitas, CA). Fragmenty korzeni zbierano z roślin hodowanych w kulturze hydroponicznej w sterylnych kolbach zawierających lx stężony roztwór soli dla roślin wg. Murashige i Skoog (GlBCO), 1 mg/litr tiaminy, 0,5 mg/litr pirydoksyny, 0,5 mg/litr kwasu nikotynowego, 0,5 g/litr kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) i 3% sacharozę, umiarkowanie wytrząsano i oświetlano światłem o natężeniu 70 pmol -m’2-sek.‘1
Analiza sklonowanych cDNA z Arabidopsis. Klony cDNA zawierające ekspresyjne sekwencje znacznikowe (EST, ang. expressed sequence tagged) reprezentujące RAP2.1 i RAP2.9 wytworzono zgodnie z metodą podaną przez Cooke i wsp. (Cooke, R., i wsp., 1996, Plant J. 9, 101-124). Klony EST cDNA odpowiadające RAP2.2 i RaP2.8 otrzymywano zgodnie z metodą opisaną przez Hofte i wsp. (Hófte, H., i wsp., 1993, Plant J. 4, 1051-1061). ETS cDNA klony odpowiadające wszystkim innym genom RAP2 skonstruował Newman i wsp. (Newman, T., i wsp., 1994, Plant Physiol. 106, 1241-1255), a otrzymano je z Arabidopsis Biological Resource Center (Ohio State University). Plazmidowy DNA izolowano i oczyszczano przez chromatografię anionowymienną (Qiagen, Chatsworth, CA). Sekwencję DNA wytworzono stosując wyznakowane fluorescencyjnie nukleotydy terminacyjne i analizowano zgodnie z zaleceniami producenta (Applied Biosystems).
Porównanie sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych. Celem wyszukania genów kodujących białka posiadające domeny AP2 przeszukano bazy danych EST dla Arabidopsis (AAtDB 4-7) stosując program TBLASTN (Altschul, S.F., i wsp., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410 i domyślne ustawienie parametrów. Zestawienia sekwencji aminokwasowych sporządzono przy pomocy zestawiającego równocześnie wiele sekwencji programu CLUSTAL W (Thompson, J.D. iwsp., 1994, Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680). Drugorzędową strukturę cząsteczek przewidywano stosując założenia i oprogramowanie opisane przez Rost (Rost, B., 1996, Methods Enzymol. 266, 525-539) i Rost i Sander (Rost, B., i wsp., 1993, J. Mol. Biol. 232, 589-599; Rost, B., i wsp., 1994, Proteins 19, 55-77).
Sondy specyficzne dla genu RAP2. Fragmenty specyficzne dla genu RAP2 uzyskiwano przez PCR stosując, zgodnie z wyszczególnieniem podanym przez Perkin-Elmer (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ) startery specyficzne dla genu i jako matrycę plazmidowy DNA z poszczególnych RAP2. Dla uzyskania fragmentów DNA odpowiadających każdemu genowi RAP2 zastosowano niżej wymienione startery:
RAP2.1,
RAP2.2,
RAP2.3.
RAP2.4,
RAP2.7,
RAP2.8,
RAP2.9,
5- - AAGAGGACCATCTCTCAG-3 ' , ' - TCG^TTCAGCAGCCCAlCAC-- ' 5 ' - -^CCtT^C^-^(^-C^(^-G^r^(^-A^C^-^--' 5' - AAGGATTTCACA'TCGGAG-3' .
5' -CCATGGAGACCGAGACCT-3' 5' -TCACTCAAAGGCCGAGATC-3 - .
5' -GTGAAGGCTTAGGAGGAG-3' .
5'-AACACTCGCTAGCTTCTC-3' ;
5' .CCAATGCATAGAGCTTGAGG-3. ;
5' . AGCAGTCaAAKGCGACGG-. . .
5' . CTTAA3CTAGJA\TCG?AVrCC-3. 5'-GTCGGAACGGGAGTTACC-3 -;
5'-TAACAACATCACCGGCTCG-3.;
5'-TGCCTCATATGAGTCAGAG-3'.
Celem uzyskania sond do mapowania genu i doświadczeń z hybrydyzacją RNA, zsyntetyzowane przy pomocy PCR fragmenty DNA oczyszczano przez elektroforezę w żelu i znakowano radioaktywnie przy pomocy losowych oligonukleotydów (Amersham).
Mapowanie genu. Geny RAP2 zlokalizowano na mapie genetycznej Arabidopsis albo przez analizę segregacji polimorfizmu fragmentów długości restrykcyjnych prowadzoną
189 711 z użyciem zrekombinowanych linii wsobnych, jak opisano w publikacji Reiter i wsp. (Reiter, R.S., i wsp. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1477-1481) albo przez analizę macierzy stworzonej z pul DNA z Arabidopsis zawartych w genomowych bibliotekach skonstruowanych na sztucznych chromosomach drożdżowych (YAC) yUP lub CIC (Ecker, J.R., 1990, Methods 1, 186-194; Creusot, F„ i wsp., 1995, Plant J. 8, 763-770) stosując PGR (Green, E.D., i wsp., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1213-1217; Kwiatkowski, T.J., i wsp., 1990, Nucleic Acid Res. 18, 7191-7192). Wyniki uzyskane z mapowania opartego na analizie macierzy potwierdzano przez PGR stosując DNA poszczególnych klonów YAC.
Izolacja mRNA. Polisomalne poli(A)mRNA z Arabidopsis izolowano zgodnie z metodą Cox i Goldberg (Cox, K.H., i wsp. 1988 w Plant Molecular Biology. A Practical Approach, wyd. Shaw, C.H. (IRL, Oxford) str. 1-35) z kwiatu, okółka liściowego, bezkwiatowych międzywęzłowych fragmentów łodygi oraz uzyskanych w hodowli hydroponicznej korzeni.
Badania metodą „RNA gel blot”. Hybrydyzację z RNA unieruchomionym na filtrach prowadzono zgodnie z zaleceniami producenta (Amersham). Wielkość cząsteczek mRNA szacowano przez porównanie ze znanymi wzorcami RNA (BRL). Transkrypty AP2 wykrywano stosując znakowane fragmenty DNA odpowiadające nukleotydom 1-1371 z cDNA AP2 niesionego przez klon plazmidowy pAP2cl (Jofuku, K.D., i wsp., 1994, Plant Celi 6, 1211-1225).
WYNIKI
Domena AP2 określa dużą rodzinę białek roślinnych. Przeszukując bazę danych EST dla Arabidopsis (Materiały i Metody) przy pomocy domeny AP2 jako sondy wykryto 34 klony cDNA niosące sekwencje kodujące przypuszczalne RAP2. Kilka z tych fragmentarycznych sekwencji opisano wcześniej (Ohme-Takagi, i wsp., 1995, Plant Celi 7, 173-182; Elliot, R.C., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 155-168; Klucher, K.M., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 137-153; Wilson, K., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 659-671; Ecker, J.R., 1995, Science 268, 667-675; Weigel, D., 1995, Plant Cell 7, 388-389). Opierając się na porównaniu sekwencji nukleotydowych wyciągnięto wniosek, ze w przybliżeniu połowa z 34 sekwencji RAP2 cDNA prawdopodobnie należy do powtarzających się klonów. Co za tym idzie wyselekcjonowano i wytworzono pełne sekwencje DNA dla 17 hipotetycznych klonów cDNA RAP2, które wydają się reprezentować unikalne geny i które zawierają największe fragmenty cDNA. Na podstawie przewidywanej sekwencji aminokwasowej wspomnianych klonów określono, że RAP2 ESTy z Arabidopsis reprezentują, co najmniej 12 genów, które oznaczono RAP2.1-RAP2.12. Jak przedstawiono w tabeli V, wstępne mapowanie’z wykorzystaniem analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych i opartej na PCR analizie przesiewowej bibliotek genów Arabidopsis (Materiały i Metody) skonstruowanych na sztucznych chromosomach drożdżowych yUP i CIC, ujawniło, ze co najmniej 7 przedstawicieli rodziny genowej RAP2 rozrzuconych na 4 różnych chromosomach. Dodatkowo kilku przedstawicieli rodziny jest w genomie ze sobą silnie sprzężonych. Przykładowo RAP2.10 jest oddalony jedynie o 10 kb od AP2, który jest również silnie sprzężony z leżącym na chromosomie 4 genem ANT (Elliot, R.C., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 155-168; Klucher, K.M., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 137-153).
Analiza sekwencji ujawniła również, że wszystkie białka kodowane przez geny RAP2 charakteryzują się obecnością przynajmniej jednej domeny AP2. Fig. 4 przedstawia porównanie sekwencji 21 domen AP2 pochodzących z 19 różnych polipeptydów w tym RAP2.1-RAP2-12, AP2, ANT, TINY i pochodzącej z tytoniu EREBP. Z porównania wynika, że każda z domen AP2 zawiera dwa bloki konserwowanych sekwencji. Pierwszy blok, określany jako element YRG, zbudowany jest z 19-22 bardzo zasadowych aminokwasów i zawiera konsert wnwanv mctvw nminnV\v«Qnwv νΡΓτ όίϊσ 4Δ i RA Γϊηισί blnlr nlrrp^lfinA/ inVn plpmpnt RAYD, zbudowany jest z 42-43 aminokwasów i zawiera silnie konserwowany 18-aminokwasowy rejon rdzeniowy, który przypuszczalnie tworzy amfipatyczny α-heliks w domenie AP2 genów aP2, ANT, TINY i EREBP. Dodatkowo w obrębie elementów YRG i RAYD występuje kilka niezmiennych aminokwasów, które mogą mieć podstawowe znaczenie dla struktury lub funkcji tych białek. Przykładowo, reszta glicyny w pozycji 40 w elemencie RAYD jest niezmienna we wszystkich białkach zawierających domenę AP2 (fig. 4A i B) i wykazano, że jest ważna dla działania AP2 (Jofuku, K.D., i wsp., 1994, Plant Celi 6, 1211-1225).
189 711
Tabela V Geny RAP2 z Arabidopsis
Gen Klony YAC zawierające gen RAP2 Pozycja na mapie chromosomu f
AINTEGUMENTA ND 4-73
TINY ND 5-32 to 5-45
RAP2.1 yUP18H2, CIC11D10 ND f
RAP2 2 yUP6Cl yUP12G6, yUP24B8, yUP23El 1, CIC4H5 38' §
RAP2.3 CIC12C2 3-21
RAP2 4 CIC7D2, CIC10C4 ND ί
RAP2.7 yUPlOEl ND ί
RAP2.8 CIC10G7 1-94 to 1-103'§
RAP2 9 CIC9E12 ^-117Ԥ
RAP2 10 ND 4-73
* klony YAC, które zawierają określony gen RAP2, jak określono stosując technikę syntezy DNA opartej na PGR z wykorzystaniem specyficznych starterów (Green, E,D., i wsp., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, ^^13-1217, Kwiatkowski, T.J , i wsp , 1990, Nucleic Acids Res. 18, 7191 -7192) f Pozycja na mapie chromosomowej została podana w odniesieniu do ujednoliconej mapy genetycznej Arabidopsis (AatDB 4-7) i Pozycja na mapie wyznaczona na podstawie analizy YACa jest wątpliwa § Wstępnie ustalona pozycja mapowajest oparta na jednym wyznaczonym punkcie wspólnym z mapą fizyczną
Numery dostępu kompletnych sekwencji EST dla RAP2 i innych genów są jak niżej: AINTEGUMENTA (U40256/U41339); TINY (Χ94598), RAP2.1 (AF003094), RAP2.2 (AF003095), RAP2.3 (AF003096), RAP2.4 (AF003097), RAP2.5 (AF003098), RAP2.6 (AF003099), RAP2.7 (AF003100), RAP2.8 (AF0030101), RAP2.9 (AF0030102), RAP2.10 (AF0030103), RAP2.11 (AF0030104) iRAP2.12 (AF003105). Wszystkie klony cDNA RAP2 były początkowo zgłoszone jako częściowe sekwencje i otrzymały numery zgłoszenia w GenBanku, takie jakie podano w nawiasach przy nazwach poszczególnych genów: RAP2.1 (Z27045), RAP2.2 (Z26440), RAP2.3 (T04320 i T13104), RAP2.4 (T13774), RAP2.5 (T45365), RAP2.6 (T45770), RAP2.7 (T20443), RAP2.8 (Z33865), RAP2.9 (Z37270), RAP2.10 (T76017), RAP2.11 (T42962) i RAP2.12 (T42544). Z uwagi na wstępny charakter danych dotyczących sekwencji EST, sekwencje aminokwasowe wydedukowane dla EST Z27045, T04320, T13774 i T42544 zawierały szereg błędów i były nieprawidłowo podawane (Ohme-Takagi, i wsp., 1995, Plant Celi 7, 173-182; Klucher, K.M., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 137-153; Wilson, K„ i wsp., 1996, Plant Celi 8, 659-671; Eckert, J.R., 1995, Science 268, 667-675; Weigel, D., 1995, Plant Celi 7, 388-389. Zostały one prawidłowo podane w GenBanku pod numerami zgłoszeń podanymi powyżej.
Porównanie sekwencji cDNA RAP2 pokazało, że istnieją co najmniej dwie gałęzie w drzewie ewolucyjnym genów z rodziny RAP2. Gałąź AP2 i gałąź EREBP są rozróżnialne dzięki różnej liczbie domen AP2 jaką, każdy z tych peptydów zawiera, oraz sekwencjom
189 711 występującym w obrębie konserwowanego elementu YRG. Gałąź AP2 rodziny genów RAP2 obejmuje geny AP2, ANT i RAP2.7 z których każdy koduje białko posiadające dwie domeny AP2 (fig. 4A). Dodatkowo białka te posiadają konserwowaną sekwencję aminokwasową WEAR/WESH występującą w obrębie elementu YRG każdej, powtórzonej domeny AP2 (fig. 4A). Odmiennie, geny należące do gałęzi obejmującej geny typu EREPB należące do rodziny _RAP2, w tym RAP2.1-RAP2.6, RAP2.8-RAP2.12 i TINY (fig. 4B), kodują białka posiadające tylko jedną domenę AP2. Białka z tej grupy posiadają konserwowany 7-aminokwasowy motyw określany tu jako blok WAAE1RD (fig. 4B), który zastępuje w elemencie YRG motyw WEAR/WESH (fig. 4A). Opierając się na takim porównaniu wyznaczono, niezależnie dla białek należących do obu klas białek RAP2, sekwencje najwyższej zgodności AP2 (fig. 4A i B). Powyższe wyniki sugerują, że domeny AP2 i poszczególne fragmenty sekwencji AP2 są ważne dla funkcjonowania białka RAP2.
Charakterystycznym dla białek RAP2 z klasy AP2-podobnych jest występowanie wysoce konserwowanego 25-26-aminokwasowego fragmentu łącznikowego lezącego pomiędzy dwoma powtórzeniami domen AP2 (Klucher, K.M., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 137-153). Obszar ten jest w 40% identyczny, a w 48% homologiczny w białkach AP2, ANT i RAP2.7 i nie znaleziono go w białkach należących do białek RAP2 z grupy EREBP-podobnych. Analiza molekularna zmutowanego allelu ant-3 pokazała, że konserwowana glicyna stanowiąca C-końcowy aminokwas łącznika ma in vivo zasadnicze znaczenie dla działania ANT (Klucher,
K.M., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 137-153), co sugeruje, ze rejon łącznikowy może pełnić istotną funkcję w aP2 i RAP2.7.
Sekwencje w obrębie elementu RAYD przypuszczalnie tworzą amfipatyczny α-heliks. Jak wspomniano powyżej przypuszcza się, żewAP2, 18-aminokwasowy rejon rdzeniowy elementu RAYD z AP2 tworzy amfipatyczny α-heliks, który może być ważny dla struktury lub funkcji AP2. Celem określenia czy w białkach RAP2 konserwowana jest ich struktura drugorzędową, przeprowadzono jej analizę. Jak pokazano na fig. 4, rejon rdzeniowy stanowi blok najsilniej konserwowanej sekwencji w elemencie RAYD AP2 i białkach RAP2. Wyniki analizy struktury drugorzędowej przewidują, że wszystkie białka RAP2 zawierają w obrębie elementu RAYD sekwencje, które przypuszczalnie tworzą amfipatyczny α-heliks (fig. 4A i B). Fig. 4C pokazuje, że sekwencje w RAP2.7-R1 przypuszczalnie tworzą amfipatyczny α-heliks, który jest w 100% identyczny z przewidywanym dla AP2-R1 i w 63% podobny do przewidywanej dla ANT-R1. Przewiduje się, że sekwencje występujące w obrębie domen AP2 białek RAP2 EREBP-podobnych tworzą podobne α-heliksy. Fig. 4D pokazuje, że α-heliksy wRAP2.2, RAP2.5 i RAP2.12 są odpowiednio w 81, 100 i 81% podobne do przewidywanej dla EREBP-3. Podsumowując, przedstawione wyniki silnie sugerują, ze hipotetyczny amfipatyczny α-heliks w elemencie RAYD jest motywem o konserwowanej strukturze ważnym dla finkcji jaką wc wszystkich białkach RAP2 pełni domena AP2.
Geny RAP2 ulegają ekspresji w kwiatach i tkankach wegetatywnych. Wcześniejsze badania pokazały, że w czasie rozwoju rośliny AP2 i ANT ulegają różnej ekspresji na poziomie RNA (Jofuku, K.D., i wsp., 1994, Plant Celi 6, 1211-1225; Elliot, R.C., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 155-168; Klucher, K.M., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 137-153). AP2 jest eksprymowany z różną wydajnością w rozwijających się kwiatach, liściach, pozbawionych kwiatów łodygach i korzeniach. Celem oznaczenia gdzie w rozwoju rośliny ulegają ekspresji geny RAP2 z klasy EREBP-podobnych przeprowadzono hybrydyzację sond specyficznych dla genów RAP2.1, RAP2.2, RAP2.3 i Rap2.4 z unieruchomionymi na filtrze mRNA korzeni. Uzyskane w tym doświadczeniu wyniki pokazują, że każdy z genów RAP2 wytwarza cząsteczki mRNA o innej wielkości i charakteryzuje się odmiennym wzorem ekspresji w kwiatach, liściach, pozbawio nych kwiatów łodygach i korzeniach. Przykładowo, wydaje się, że transkrypcja genu RAP2.1 zachodzi z niską wydajnością w kwiatach, liściach, łodydze i korzeniach roślin typu dzikiego. Ekspresja genu RAP2.2 wydaje się zachodzić konstytutywnie, transkrypty RAP2.2 są wykrywane na podobnym poziomie w kwiatach, liściach, łodygach i korzeniach typu dzikiego. Przeciwnie gen RAP2.3 ulega słabej ekspresji w kwiatach typu dzikiego, nieco bardziej wydajnie w liściach, a na względnie wysokim poziomie zarówno w łodygach jak i korzeniach. I w końcu, gen rAp2.4 jest również eksprymowany w kwiatach, liściach, łodygach i korzeniach
189 711 typu dzikiego, a najwydajniej ekspresji ulega w korzeniach i liściach. Przedstawione wyniki wykazują, że geny z rodziny RAP2 z grupy EREBP-podobnych ulegają ekspresji na poziomie mRNA, zarówno w kwiatach jak i w tkankach wegetatywnych, a wzory ich regulacji wykazują jakościowe różnice.
Wzory ekspresji genu RAP2 są zaburzane przez ap2. Celem określenia czy AP2 jest wymagany dla ekspresji genu RAP2, RNA ze zmutowanej rośliny ap2-10 przenoszono na filtr i analizowano przez hybrydyzację. Utrata funkcji AP2 odmiennie wpływała na ekspresję trzech genów RAP2. Przykładowo ekspresja genu RAP2.2 nie została dramatycznie zmieniona w kwiatach, liściach i korzeniach rośliny zmutowanej w porównaniu z dzikim typem Landsberg erecta lecz jest ograniczona w łodydze mutanta. Ekspresja genu RAP2.3 wydaje się być niezmieniona w korzeniach mutanta lecz jest nieznacznie podniesiona w kwiatach i liściach mutanta i obniżona w jego łodygach. Przeciwnie ekspresja genu RAP2.4 wydaje się zasadniczo niezmieniona w łodygach i korzeniach mutanta i jest nieznacznie podniesiona w jego kwiatach i liściach. Dla sprawdzenia możliwego wtórnego wpływu ekotypu na ekspresję genu RAP2 porównano poziom ekspresji genu RAP2 w łodygach roślin C24 typu dzikiego i mutanta ap2-10. Uzyskane wyniki pokazały, ze różnice w ekspresji genów RAP2.2, RAP2.3 i RAP2.4 w łodygach roślin C24 i ap2-10 są podobne do tych obserwowanych pomiędzy łodygami roślin typu dzikiego Landsberg erecta i mutanta ap2-10. Łącznie wyniki te sugerują, żeAP2 bezpośrednio lub pośrednio reguluje ekspresję, co najmniej trzech genów RAP2. Co wazniejsze, wyniki te sugerują, że AP2 kontroluje ekspresję genu zarówno w czasie rozwoju wegetatywnego jak i generatywnego.
OMÓWIENIE
Geny RAP2 kodują białka należące do nowej rodziny hipotetycznych białek wiążących DNA
Ważnym wnioskiem wypływającym z charakterystyki tych klonów jest, to że domena AP2 jest ewolucyjnie konserwowana u Arabidopsis i tytoniu. Dodatkowo, stwierdzono istnienie u Arabidopsis dwóch podrodzin białek z domenami AP2, które oznaczono jako AP2-podobne i EREBP-podobne klasy białek RAP2. Badania in vitro pokazały, ze zarówno białka EREBP jak i AP2 wiążą się w DNA do specyficznych sekwencji, a domena AP2 jest wystarczającą aby nadać białku EREBP zdolność wiązania DNA (Ohme-Takagi, i wsp., 1995, Plant Celi 7, 173-182). Powyższe wyniki i wysokie podobieństwo motywów domen AP2 w białkach AP2, EREBP i RAP2, sugerują, ze białko RAP2 działa u roślin jak białko specyficznie wiążące DNA. Choć nie zostały jeszcze wyznaczone w obrębie domeny AP2 specyficzne aminokwasy odpowiedzialne za wiązanie DNA, to porównanie sekwencji ujawniło występowanie w domenie AP2 dwóch silnie konserwowanych motywów nazywanych tu YRG i RAYD.
Element RAYD znaleziono we wszystkich znanych domenach AP2; zawiera on konserwowany rejon rdzeniowy, który przypuszczalnie tworzy amfipatyczny α-heliks (fig. 4). Jedna z hipotez dotycząca funkcji struktury α-heliksu mówi, że jest ona zaangażowana w wiązanie DNA, prawdopodobnie przez oddziaływanie jej hydrofobowej części czołowej w dużej bruździe DNA (Zubay, G., i wsp., 1959, J. Mol. Biol. 7, 1-20). Alternatywnie struktura ta może pośredniczyć w ważnym dla funkcjonowania RAP2 oddziaływaniu białko-białko. Podobnie jak ma to miejsce w przypadku roślinnych białek regulatorowych posiadających blok MADS, wyżej wspomniane oddziaływanie może wymagać zdolności do tworzenia homo- lub heterodimerów (Huang, H., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 81-94; Riechmann, J.L., i wsp., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4793-4798) co również obserwuje się w przypadku ssaczych czynników transkrypcyjnych z rodziny ATF/CREB (Hai, T., i wsp., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3720-3724; 0'Shea, EK,i wsp , 1992, Celi 68, 699-708).
Konserwowany element YRG może również brać udział w wiązaniu DNA, na co wskazuje wybitnie zasadowy charakter tego rejonu we wszystkich białkach RAP2 (fig. 4). Jednakże element YRG zawiera także sekwencje, które są specyficzne dla każdej z klas białek RAP2 i mogą być istotne pod funkcjonalnym względem dla wiązania DNA. Szczególnie motyw WAAIERD jest silnie konserwowany w EREBP i innych białkach RAP2 z rodzaju EREBPpodobnych z tytoniu. Przeciwnie w białkach RAP2 z rodzaju AP2-podobnych motyw WEARAVESH zastąpił blok WAAIERD (fig. 4). Badania in vitro sugerują, że EREBP i AP2
189 711 rozpaznαją w DNA specyficzne sekwencje (Ohme-Takagi, i wsp., 1995, Plant Celi 7, 173-182). Jest możliwe, że motywy WAAIERD i wEaE/WESH są odpowiedzialne za wiązanie się ze spocyfic/aymi sekwencjami w DNA. Obecność dwóch domen AP2 wAP2 może również wpływać na zróżnicowanie specyfic/naści względem sekwencji. Choć /aac/enie, na poziomie molekularnym, posiadania jednego lub dwóch motywów domen AP2 nie jest jeszcze znane, to badania goaetyc/ae i molekularne pokazały, że mutacje w obu domenach AP2 wpływają na działanie AP2, wskazując tym samym, że obie one są wymagane, aby białko AP2 wykazywało aktywność białka typu dzikiego (Jofuku, K.D., i wsp., 1994, Plant Celi 6, 1211-1225).
Poza Arabidopsis i tytoniem cDNA kodujące białka posiadające odmienne domeny AP2 /nale/iaaa w kukurydzy, ryzu, rączniku i u kilku przedstawicieli Brassicaceae w tym kapuście rzepaku (Ohme-Takagi, i wsp., 1995, Plant Celi 7, 173-182; Elliot, R.C., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 155-168; Klucher, K.M., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 137-153; Wilson, K., i wsp., 1996, Plant Cell 8, 659-671 i Weigel, D., 1995, Plant Cieli 7, 388-389). Sugeruje to silnie, ze domena AP2 jest ważnym i ewolucyjnie konserwowanym elementem niezbędnym z uwagi na strukturę lub funkcję tego białka.
Ekspresja genu RAP2 w tkankach kwiatowych i wegetatywnych. Geny RAP2.1, RAP2.2, RAP2.3 i RAP2.4 będące genami typu AP2 wykazują w kwiatach, liściach, bezkwiatowych łodygach i kar/oaiach nakładające się wzory ekspresji. Jednakże każdy z genów jest niozalo/aie regulowany, czego efektem jest charakterystyczny dla niego po/iam mRNA. Nakładająca się aktywność genu RAP2, może wpływać na analizę funkcji genu AP2 i RAP2 jeśli działanie tych genów jest również rozciągnięte w czasie. Przykładowo, w czasie rozwoju kwiatów w różnych organach i tkankach aktywność genów AP2 i ANT częściowo na siebie zachodzi (Jofuku, K.D., i wsp., 1994, Plant Celi 6, 1211-1225; Elliot, R.C., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 155-168; Klucher, K.M., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 137-153; W. Szeto). Badania pojedynczych i podwójnych mutantów sugerują, że również AP2 może częściowo pełnić funkcję ANT (Elliot, R.C., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 155-168). Zjawisko zbyt szerokiej ekspresji genów i jej zdolność do maskowania efektów mutacji w genach jest jaśniej przedstawiona na przykładzie kodujących regulatory kwitnienia genów APETALA 1 (API) i CAULIFLOWER (CAL), posiadających domeny MADS,. Badania genetyczne pokazały, że mutacje w cal nie wpływa w sposób widoczny na kwitnienie z wyjątkiem sytuacji, gdy roślina równocześnie posiada mutację apl (Bowman, J.L., i wsp., Devolopment Cambridge, U.K., 119, 721-743), co wskazuje na pełne pokrywanie się funkcji API i CAL. Hipoteza mówiąca, że funkcje genów RAP2 mogą się pokrywać jest wspierana przez fakt, że jedynym do tej pory wyizolowanymi mutantem w genach RAP2 z grupy typu EREBP jest mutacja tiny prowadząca do zyskania nowej funkcji (Wilson, K., i wsp., 1996, Plant Celi 8, 659-671).
Aktywność AP2 jest wykrywalna w czasie rozwoju wegetatyw^o. Obunie bnii^ania ekspresji genu RAP2 w rośllnach typu dzikiego i mutantach ap2-10 uggeuiiją, ze w czasie rozwoju Arabidopsis AP2 bierze udział w regulacji aktywności genu RAP2. Nieobecność aktywności AP2 podczas rozwoju wpływa zarówno dodatnio, jak i ujemnie, na ekspresję genu RAP2. Obserwowane różnice w poziomie ekspresji RAP2.2, RAP2.3 i RAP2.4 w kwiatach i tkankach wegetatywnych typu dzikiego i ap2-10 nie są w widoczny sposób związane z różnicami w ekotypie, ponieważ podobne zmiany w poziomie ekspresji genów obserwowano dla wszystkich trzech genów RAP2 w łodygach kontrolnych ekotypów. Regulacja ekspresji genu RAP2 przez AP2 w łodygach wyraźnie wykazuje, ze w odróżnieniu od innych hameotyczaych genów związanych z kwitnieniem, geny AP2 działają zarówaa w czasie rozwoju goneratywnego jak i wegetatywnego.
Przykład ten paka/ujo, że traasgeaiczno rośliny według wynalazku wytwarzają nasiona ze zmioaiaaą zawartością i składem kwasów tłuszczowych.
Stosując metody opisane powyżej, otrzymano transgoniczae rośliny niosące αntysoasawno konstrukty AP2, RAP2.8 i RAP2.1 (po dwie niezαleżale otrzymane rośliny). Zawartość i skład kwasów tłuszczowych określono przy pomocy chromatografii gazowej zgodnie z metodą Broun i Somerville Plant Physiol. 1113:933-942 (1997). Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli VI (dla AP2) i tabeli VII (dla genów RAP2). Jak można zauwazyć, rośliny traasgeaiczao
189 711 według wynalazku charakteryzują się, w porównaniu z roślinami typu dzikiego, zwiększoną zawartością kwasów tłuszczowych, co więcej, zmieniony jest skład kwasów tłuszczowych w roślinach.
Tabela VI
Analiza zawartości i składu kwasów tłuszczowych w nasionach Arabidopsis
Rośliny Masa nasion μ g/nasiono) Całkowita zawartość kwasu tłuszczowego (pg/nasiono) Estry metylowe kwasów tłuszczowych (%) (% obszaru w GLC)
16:0 18:0 18:1 18:2 183 20:1 22.1 24:0
Mutant ap2-10 27 3.94 9.4 4.4 25 70.8 0.8 6.6 0.1 1.9
Transgeniczna roślina aAP2
C24 15-522 (F1-1) 34 11.0 45 3.3 3 1 49.0 3.2 26 3 06 4.9
C34 15-542 (F1-2) 24 2.5 6.3 3.4 3.1 52.1 4 0 28.1 04 04
Roślina typu dzikiego C24 20 2.67 9.4 4.9 8 8 62.7 0.7 8.1 0 '3 1.9
Tabela VII
Analiza zawartości i składu kwasów tłuszczowych w nasionach transgenioznyoh roślin Arabidopsis z antysensownym RAP2
Rośliny Masa nasion (pg/nasiono) Całkowita zawartość kwasu tłuszczowego (pg/nasiono) Estry metylowe kwasów tłuszczowych (%) (% obszaru w GLC)
16:0 18.0 18:1 18:2 18:3 20:1 22:1 24.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Rośliny transgenlozne z antysensownym RAP2
RAP34-2.8C LE 24 9.7 5 1 3.0 3.6 53.6 3.2 29.3 0.3 02
RAP34-2.1A' COL 34 11 0 9.5 1 9 3.0 53.6 4.2 20.3 55 0.5
189 711 c d tabeli VII
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
RAP34-2 ID' COL 26 8.1 4.6 26 2.6 50.3 3.2 33.2 03 1 0
Roślina typu dzikiego COLa 24 ND 60 4.0 14.0 27.0 18.0 22 0 20 ND
ND, nie określano aPatak i wsp., (1994) Zawartość oleju i skład kwasów tłuszczowych w nasionach różnych ekotypów Arabidopsis taliana. badania dla użytecznych odmian genetycznych. Curr Sci 67. 470-472.
Przykład 6
Przykład ten opisuje otrzymywanie konstruktów promotorowych używanych do przygotowania kasetek ekspresyjnych użytecznych do uzyskiwania roślin transgenicznych według wynalazku. W szczególności, w przykładzie pokazano zastosowanie dwóch korzystnych promotorów, pochodzących z genu AP2 i genu Be1I.
Figura 5 przedstawia konstrukt z promotorem Ap2. pAP2 jest wektorem o wielkości 16,3 kb niosącym kasetkę AP2 stosowaną do konstrukcji genów chimerowych stosowanych w opisanych tu transformacjach roślin. pAP2 zawiera rejon promotora o wielkości 4,0 kb z genu AP2 Arabidopsis. Jako wektor plazmidu Ti zastosowano wektor pDE1000 (Plant Genetic Systems, Ghent, Belgium). DNA wektora pDE1000 linearyzowano przez trawienie BamHI i wstawiono do niego fragment DNA o wielkości 4,0 kb otrzymany w wyniku trawienia subklonu plazmidowego pLE7.2 enzymem BamHI. Na 3' końcu wstawionego rejonu promotorowego AP2 znajdują trzy miejsca restrykcyjne (dla EcoRI, Smal i SnaBI), w które w czasie tworzenia konstruktów chimerowych typu AP2 promotor/kasetka genowa, mogą być wstawione sekwencje kodujące różnych genów. NOS::NPTII oznacza roślinny marker selekcyjny NP1I znajdujący się pod bezpośrednią kontrolą promotora syntazy nopalinowej warunkujący oporność na kanamycynę w komórkach roślinnych, które uległy transformacji i w których doszło do integracji kasetki z promotorem AP2. LB i RB oznaczają odpowiednio lewą i prawą sekwencję graniczną T-DNA wymagane do wbudowania do genomu rośliny T-DNA z kasetką posiadającą promotor AP2. PVS1 oznacza bakteryjny DNA działający jako miejsce inicjacji replikacji działające zarówno w komórkach E. coli jak i Agrobacterium tumefaciens, pozwalając zatem plazmidowi pAP2 na replikację i utrzymanie się w komórkach obu gatunków bakterii. AmpR i Sm/SpR oznaczają bakteryjne selekcyjne geny markerowe warunkujące oporność na antybiotyki odpowiednio ampicylinę i streptomycynę/spektynomycynę i umożliwiające wyselekcjonowanie szczepów Agrobacterium niosących zrekombinowany plazmid pAP2.
Figura 6 przedstawia konstrukt z promotorem BELL pBEL1 jest wektorem o wielkości 16,8 kb niosącym promotorową kasetkę BEL1 stosowaną do konstrukcji genów chimerowych użytych w opisanych tu transformacjach roślin. pBEL1 niesie obszar promotorowy o wielkości 4,5 kb z genu BEL1 z Arabidopsis. Jako wektor plazmidu Ti stosowano wektor pDE1000 (Plant Genetic Systems, Ghent, Belgium). DNA wektora pDE1000 linearyzowano przez trawienie BamH1 i wstawionio do niego fragment DNA o wielkości 4,5 kb otrzymany w wyniku trawienia subklonu plazmidowego pX1C9R (L. Reiser, dane nie publikowane) enzymami BamH1 iBglII. Na 3' końcu wstawionego rejonu promotorowego BEL1, nazwanego BEL1, znajdują trzy miejsca restrykcyjne (dla EcoR1, Smal i SnaBI), w które w czasie tworzenia konstruktów chimerowych typu BRL promotor/kasetka genowa mogą być wstawione sekwencje kodujące różnych genów. NOS::NPTII oznacza roślinny marker selekcyjny NPII znajdujący się pod bezpośrednią kontrolą promotora syntazy nopalinowej warunkujący oporność na kanamycynę w komórkach roślinnych, które uległy transformacji i w których doszło do integracji kasetki z promotorem BEL. LB i RB oznaczają odpowiednio lewą i prawą sekwencję graniczną T-DNA wymagane do wbudowania T-DNA z kasetką posiadającą promotor AP2 do genomu rośliny. PVS1 oznacza bakteryjny DNA działający jako miejsce inicjacji replikacji,
189 711 funkcjonujące zarówno w komórkach E coli jak i Agrobacterium tumefaciens, pozwalające plazmidowi pAP'2 na replikację i utrzymanie się w komórkach obu gatunków bakterii. AmpR i Sm/SpR oznaczają bakteryjne geny markerowe warunkujące oporność za antybiotyki odpowiednio ampicylinę i ytreptkmycyoę/spsktynzmycyoę umożliwiające wyselekcjonowanie szczepów Agrobacterium niosących zrekombinzwaoy plazmid pBEL.
Powyzsze przykłady podano dla zilustrowania wynalazku, a aie celem ogoaoiazeoia jego zakresu. Inoe warianty wynalazku będą oczywiste dla osób z podstawowymi umiejętnościami. Załączone i są objęte załączonymi zastrzezeniami patentowymi. W tym celu włącza się do wynalazku wszystkie cytowane w nim publikacje, patenty i zgłoszeoia patentowe.
189 711
Lista sekwencji
SEK NR ID: 1 gen ADC z kapusty rzepaku
Wielkość wstawki: 559 par zasad
Umiejscowienie startera RISZU1 nukleotydy 1-21
Umiejscowienie startera RISZU2 nukleotydy 544-559
Przewidywane 573' końce:
egzon 2 nukleotydy 1 -26 intron 2 nukleotydy 27-169 egzon 3 nukleotydy 170-200 intron 3 nukleotydy 201-306 egzon 4 nukleotydy 307-394 intron 4 nukleotydy 395-473 egzon 5 nukleotydy 474-559 UWAGA: RISZU2 kończy się wraz z końcem sekwencji kodującej egzon 5
5' JG^/^ICT’GrGi^<^j^iAAC^/^i3TrTACTTAGGTATG.AT(^^TOT/^?\T<Tr^OT^l^^A-^<CACAOATCAAATAT CCTATTGA
AACTAAGTTGrGTTGTGTCCGTCCATTTTTATATGATTTCTTCGACCAAATAAAGGTTTNANTATCTC
CTTATATT
ΛCTτm^Grr·ACArArτ‘CAGGrGGAτrrGACACACCACATGCCGC<GσrcoG^^rσr·rrAAcrcAτcc
AAATATGA rcAA'rrAαΛAcoAArcrAArAT·rcCTTA'Π'rCTAArτrGCTCATArACAAAτrAArnrrc;GCTGGGrAA crGrrrGG
GACAGTGCCTACGArAGAGCCGCAG·rrΛAGrTrAσAtt3'rGrNATGCAOA^TΛ^^NANTTNCAANATr
GAAGACTANG rGGAGaANΓrGAAACAGCTAσAACATCrArCATrrGσTNGGNCCAAGCNNTNGACCNANATCrrAC
TCCACCNTCC
NCCrNrAATNCNrΓσNTGCNGATσAσCACC<TrσACAANGGACϋAGrCArGCNTGTCAπ·AGNCσcNA
CCANNAAGCNCCTCA.AGrANAGANGGTCAC-3 '
SEK NR ID:2 gen ADC z soi
Wielkość wstawki: ~800 par zasad
a. Częściowa sekwencja uzyskana przez sekwencjonowanie od 5' końca genu nukleotydy 1-291
Umiejscowienie startera RISZU1 nukleotydy 1-21
PTewan e m m*·» o l-r..... —
3/3 JtWUW.
egzon 2 nukleotydy 1-27 intron 2 nukleotydy 28-264 egzon 3 nukleotydy 265-291 (UWAGA: sekwencja fragmentaryczna; sekwencja kodująca egzonu 5 rozciąga się poza podaną tu sekwencję).
189 711
5’-GOATTUTG<GjA\ACA.AGTTTATCTAGATAAAGrTGAYTAAYAACAATAATTCTATATOTOTTTGTG
AGAACTG r<G}CASTTAπΎτcccTAArΓAGrττrn·AAGAcccτAΛ^^GCCG'rnrΓrττγcccττrτGrrGτσπrr
TTG^CTT
GGCTσTGAYGCCGTAAAMACAANAGrGTGAGTGTGrGTTGTGTGTGGGTGA<GJAYTYm'CCrNTC
NCCGrGGrOA crσAC'rrσArGGNτcrrαNcτGGGTNCANNτrNrc'rACGTGGArrcGACAC^ι^'CACAτσcGGCNGc3'
b. Częściowaszkweslcjo naajjkanapraen soOszans-onowanίz ca 3' ooń3a genu nukleotydy 1-972
Umiejscowienie startera RISZU oykleotyOy 952-972
Przewidywane 5S3' końce: egzotu 4 nukleotydy 629-716 introku 5 nukleotyOy 717-876 egzotu 5 nukleztydy 877- do końca (UWAGA: Niżej podaoa sekwencja jest odwrotna i komplementarna względem wytworzonej, zatem biegnie od 5' do 3' końca sekwencji geau AP2 z soi. Sekwencja odpowiadająca RISZU2 kończy się w obrębie obszaru kodującego egzot 5).
5·-NCGGGAC<G3ACNGGNCGGANGCNANOCGCNNNNACACGGNΛNCGCAANNACGNCNCNTCGCCr
CCGNGGGCCC
NACNCNCrCGGACGGNTGNGAGGNCCCCNNGNNTC^’NGCNNGGNAGCANGNGGTGCNGCCNrGG
CGANCCGCCCOG
NNOAGNGNAGNCNrGGNGNCGACACCNTGCAGNCNrcrNGCNATCNGArGG^INAACNGαAGACCG
GAGTGACNGTC
GNGAGNAANGCGANANNrNίNTCR5TGNTCCCCRG!CGNCAANGNCCNGACAGArGGGrGGAACGTAr rGCAGTGrANA ccAAGAAGGoτNGGACGOCGTAτrτcrAArGrτAGσNTANNN·πrNTcc.πrGGrτANτcrGccN’GN
GCGAAACNG
GGOAGATGGNNNG<GJGNGAGA·rTrrrNTNTGN□NGACGACrGANGNNTCrGrTGGGrNAArrGTCr
AGGGjATTCA
CACNCACArGCGrGcrcGrGGCccrGccccrrccrrcAστATNArACccAAGcτrσrATNrrAcrΓr
NTCCATGTC
TTGAACCAAATATcAAATATTaTTGTNAATCaCaTTTCGTTGTGGnCCGGGaaTTGTGaGTCTCaaa
GAAAArTGr
GrArrNσccGτcrcrcrrrrτcAGTGcττATGATAΰΛOCGccrArrAAA'π'ccGΛGGAGτσGAσGCTG
ACAATAACT
189 711
TCAATATTGNAOACTATGAAOATOACTTGAAGCAGCmMTCAAATTCTGOA-rrATaTTTrnTrATTC
GAATAAAT
GCATTTATCGTATTTATCTTATCTTACAGTCATACaTATAGGATGCACł^TTATCTCCCACAGTTAGTG
TTTTTTTT
ATCTGAATTATTC'TCATGATTTT^GTT^AA^A^T^GCAATC1'TAA'TAG>ATaAGCAAT'CTT^ACCAACaAAGAa
TTCGTCCAC
GTGCrTC<GCCGCCAAAGCACTGGATTTCCGAGAGG^OaTCCCA\GTATAGAGGTCACT-rTGCA-3·
Oznaczenia dla niejednoznacznie określonych sekwencji
N = A, G, C, T
Y = C, T
S = G, C
M = A, C ααΙ29
WMI,AP2-RI SSQ YRSVTF Y RRT6RWES H j ~ WDC G KO V YL CG F DT A H A A A RA Ϊ 0 R A AIK F R G VĘAOIKFN IOOYDDDL AP2-R2 m Vłt^vlLHfc Ο-ϋ^ΑήήΒΟΓΙ.βΚΐίγνϋ^ΙΑεν εΑΑΠ iflUU min ÓAVTHFOP SI ΙόΕέ
195 ao22l
A ap2·!
FIG. IA.
etf-lO
288
FiG. iB
189 711
f/g 2
FIG. +3.
189 711 <o rX Η μ X ? ~
1U ίχ| K UOMI o ω se > a z m α ω o
22S S3
Ω M 2 X Ω co o co ω η o ω CL· < Η 4 2 g-ff-e-Ł-e
2 Ph fi u«
Ω > CC > Q > < < H < < < ω o w 2 q ω lu ΰ υ,υ u ϋι ΰ
I <1
GO >—I u
s
X
Η
Ω >ι <
<
<
Ο
Ω >Η >
ο 5Ć ό 2 U 1
υ υ i
1 (£, 1 1
1 <0 1 1
1 X 1 1
1 to 1 1
1 Ul I 1
1 χ: 1 1
1 iC ł 1
1 υ (χι CO 1 1
1 u co < t 1
1 u, 2 > I t
M χ:
<0 to
<1> Φ
5 2
cc
o
γ- οο Γ σ> Γ η kP CD Γ νο lo m
Π7Γ τ τγ<ό
Η >
Ο cc >· co
cc I cc cc. x cc cc K K K
1 CsJ 1 1 1 r- CN f-l
Ul 2 cu 2
< < CM CU 2 < <
ι
Γ*
Ο\) cu co ο
ω ω
ω /χ ο
189 711
cn cn CO CT\ •U* CO CO co co CO CO CO KD CO CO
i— KD KD KD KD KD KD KD KD KD KD KD KD KD KD KD
KD o U. Du X > CU cy RM CO X Ω X fe > O
o x Ul <0 ω > CU u fe 2 CU ω lu O fe V)
fe 2 a 2 to CU to O rt tu fel <9 (9 > 2
Z fe 2 fe CU CU u fe id to o 2 a O 2
< UJ u UJ 2 X fel CJ o u X Cd < X
> HI fe HM X X fe > 2 < fe X x fe Lu
ω X X X UJ u Lu 2 ω fe UJ > u X
fe 2; to X fel Q fe Cd ω Q co 2 7. fel 2
u U. u. u. Cu CU X U Cu X Cu fel X Cu rt
fe Lu fel u. fel fel Lu Lu fel Cu Cu Cu fel tu Lu
ia
ω w «U MM ►** 1^. IX* l-M <X< MM tW «. \JJ M4 I—I <JJ
Ο&·β.....58Ο-β-0 8 6-0
CZ Oj CO CO Od Lu fe> Pt
2 od fe ς X fe Lu Lu X Ί2 X W H X pi 1—1 Uj Oł Cl 2 fS od H na ui cd (0 S fe fe feT id χ >4 α > μ t: fel ζ'
2 rt < rt rt s < a a rt a < rt rt 2 a a rtl rtl i> rt i
£ *F X > (- rt 25 > Sl iCrf Ui fe TS
3 > rt Ul s fe Ił h- > < A < rt cd > Λ fel < < fe Jł tJ fe rt y rt fe u £ fe rt X < rt fel Of o fej fe a a 2 X 25 fel X JŁ,?£ fe e-i 5 rt fe ć3 c. a 3 cd X 2 3 fel 2 fej fe| u >4 rt X § rt h fej LI >Ί > rtl co 4 w a <] rt3 rtl A fe łj fe fe > rt X rt rt rt fe T3 >< rt X rt rt fe! X
<u rt
Q fe < i +
OJ oj
OJ OJ OJ OJ χ X χ x t J......L I
UJ UJlUJł Ια. x_xJxl A <>Γ0, W, ifel IU fel ( feJ ki-£2_42j(3 w.H fe fe fe fe u> u> uj uj J X fe J 2 S 2 3 > > > > Ig g &...&
X U. U. fcu. Lu fefefefefe UJ U> UJ Ο» U) fe fe fe fe fe
2 3 3 2 ω > > > m χ χ χ χ x
HCOfefeCOfe U O U) UJ UJ UJ ύ J J J >J s 2 3 2 3 w fe fe > w 2
-gd-Χ x χ x .y
UJ fe ttł <5 i
cz α os cz
19 (9 to C9 to > H H rt to IO H to u1
2 2 X X UJ UJ X rt UJ + X X X X X
X X X X Ί- X X X X fel + X X 2 Ol X o
rt rt U) 2 4- X CU UJ X X + X 2 X X fe
X”X Ui U. Q a Q Q od od cd cd
Μ M hU HM ω ω ω ω ssss tu. fet. fe_fet u, Cd cu uT“x q a a a a pd od cd od od
M W Hł HM HJ ω u x cd >
sssss
S > S S
X X X X
ω X fe ω X α
X X X >« X X
w w Ul w M w
ω X X Ot X X
V) rt rt rt rt rt
> > > UJ > >
2 3 3 -S s... 2
. . 00 tó
H > > w o o u σ o tt cz α a: cc od > od x > > m >
lu to
ł-M 2
ω CO
rt Γ- 2
> aj fe)
fe 3 >1 Ol CO
OJ fe X 2
+ X 2 O
UJ rt rt X O
Od κ i w
UJ UJ U> U) UJ UJ cd od od sc x >
iu >
UJ od
fe· fel fe- fe· X Sm £2 feź fe! fe- fe fe fe •χ iłi >
X X X O > X X o 5> X X X ϋ;
X X > X 2 2 w X 2 X X X to X fe*
UJ UJ w X + X X X X X + X X fe to Q X
co
o
r-l DJ Π9 04 O r-4 co
<M m LT) KD τ—1 »—1 *3· co 1—< mM z
X X X X ω
X X X X OJ OJ Ol OJ Ol >* Ol Ol OJ OJ 04 co
ω w ω X X X X X X 2 Ol X X X X 2
X X X X rt rt «5 M rt rt rt rt rt O
fel ω u) X X X X X 2 fe Dd X X 2 X UJ
189 711
FIG. 4C.
FIG. 4D.
189 711
NOS-NPTII
AP2
Sma IEcoRi SnaBI—
LB
pAP2 16,3 kb Sm/SpR i
WP RB
FIG. &
189 711
EcoRI
-
NOS :NPTII
BELI
FIG. 6.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.
Cena 6,00 zł.

Claims (29)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób modulowania masy nasiona w roślinie, znamienny tym, ze obejmuje: dostarczenie pierwszej rośliny obejmującej zrekombinowaną kasetkę ekspresyjną, zawierającą kwas nukleinowy ADC, połączony z promotorem roślinnym, przy czym kwas nukleinowy ADC hybrydyzuje w ostrych warunkach z SEK NR ID:1 albo SEK NR ID: 2;
    krzyżowanie ze sobą pierwszej rośliny lub krzyzowanie pierwszej rośliny z drugą rośliną, dla wytworzenia dużej liczby nasion;
    selekcjonowanie nasiona o zmienionej masie.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekspresja kwasu nukleinowego ADC hamuje ekspresję endogennego genu ADC, a etap selekcjonowania obejmuje etap selekcjonowania nasion o zwiększonej masie.
  3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że nasiona mają podwyższoną zawartość białka, zawartość węglowodanu lub zawartość oleju.
  4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że kwas nukleinowy ADC jest połączony z promotorem roślinnym w antysensownej orientacji.
  5. 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że rośliny pierwsza i druga są tego samego gatunku.
  6. 6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że rośliny pierwsza i druga są członkami rodziny Brassicaceae.
  7. 7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że rośliny pierwsza i druga są członkami rodziny Solanaceae.
  8. 8. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, ze promotor roślinny jest promotorem konstytutywnym.
  9. 9. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, ze promotor jest promotorem CaMV 35S.
  10. 10. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, ze promotor jest promotorem tkankowospecyficznym.
  11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że promotor jest promotorem specyficznym dla zalążka.
  12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekspresja kwasu nukleinowego ADC wzmacnia ekspresję endogennego genu ADC, a etap selekcjonowania obejmuje etap selekcjonowania nasion o zmniejszonej masie.
  13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, ze rośliny pierwsza i druga są tego samego gatunku.
  14. 14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, ze rośliny pierwsza i druga są członkami rodziny Brassicaceae.
  15. 15. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że rośliny pierwsza i druga są członkami rodziny Solanaceae.
  16. 16. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że promotor roślinny jest promotorem konstytutywnym.
  17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, ze promotor jest promotorem CaMV 35S.
  18. 18. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, ze promotor jest promotorem tkankowo-specyficznym.
  19. 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, ze promotor jest promotorem specyficznym dla zalążka.
  20. 20. Nasiono transgeniczne obejmujące zrekombinowaną kasetkę ekspresyjną zawierającą kwas nukleinowy ADC, który hybrydyzuje w ostrych warunkach z SEK Nr ID: 1 albo SEK NR ID: 2.
  21. 21. Nasiono według zastrz. 20 pochodzące z rośliny będącej członkiem rodziny Brassicaceae.
    189 711
  22. 22. Nasiono według zastrz. 20, w którym kwas nukleinowy ADC jest połączony z promotorem roślinnym w antysensownej orientacji i masa nasiona jest o co najmniej około 10% większa niż średnia masa nasion rośliny tej samej odmiany bez zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej.
  23. 23. Nasiono według zastrz. 22, w którym masa nasiona jest o co najmniej około 20% większa niż średnia masa nasion rośliny tej samej odmiany, bez zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej.
  24. 24. Nasiono według zastrz. 22, w którym masa nasiona jest o co najmniej około 50% większa niż średnia masa nasion rośliny tej samej odmiany, bez zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej.
  25. 25. Nasiono według zastrz. 22, w którym zawartość oleju jest proporcjonalnie zwiększona.
  26. 26. Nasiono według zastrz. 22, w którym zawartość białka jest proporcjonalnie zwiększona.
  27. 27. Nasiono według zastrz. 20, w którym kwas nukleinowy ADC jest połączony z promotorem roślinnym w sensownej orientacji i masa nasiona jest o co najmniej około 10% mniejsza niż średnia masa nasion rośliny tej samej odmiany bez zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej.
  28. 28. Nasiono według zastrz. 27, w którym masa nasiona jest o co najmniej około 20% mniejsza niż średnia masa nasion rośliny tej samej odmiany, bez zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej.
  29. 29. Nasiono według zastrz. 27, w którym masa nasiona jest o co najmniej około 50% mniejsza niż średnia masa nasion rośliny tej samej odmiany, bez zrekombinowanej kasetki ekspresyjnej.
PL97364343A 1996-08-20 1997-08-19 Sposób modulowania masy oraz nasiono PL189711B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/700,152 US5994622A (en) 1996-08-20 1996-08-20 Methods for improving seeds
US08/879,827 US6846669B1 (en) 1996-08-20 1997-06-20 Methods for improving seeds
PCT/US1997/014659 WO1998007842A1 (en) 1996-08-20 1997-08-19 Methods for improving seeds

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL189711B1 true PL189711B1 (pl) 2005-09-30

Family

ID=27106560

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL331771A PL193299B1 (pl) 1996-08-20 1997-08-19 Sposób modulowania masy nasion oraz nasiono
PL97364343A PL189711B1 (pl) 1996-08-20 1997-08-19 Sposób modulowania masy oraz nasiono

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL331771A PL193299B1 (pl) 1996-08-20 1997-08-19 Sposób modulowania masy nasion oraz nasiono

Country Status (7)

Country Link
US (3) US6846669B1 (pl)
EP (1) EP0964920A4 (pl)
AU (1) AU735715B2 (pl)
CA (1) CA2263797C (pl)
HU (1) HUP0000218A3 (pl)
PL (2) PL193299B1 (pl)
WO (1) WO1998007842A1 (pl)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6329567B1 (en) * 1996-08-20 2001-12-11 The Regents Of The University Of California Methods for improving seeds
US6846669B1 (en) * 1996-08-20 2005-01-25 The Regents Of The University Of California Methods for improving seeds
US6368840B1 (en) 1998-07-10 2002-04-09 E.I. Du Pont De Nemours And Company Acyl-CoA oxidase homologues
US7598429B2 (en) 2001-04-18 2009-10-06 Mendel Biotechnology, Inc. Transcription factor sequences for conferring advantageous properties to plants
US7888558B2 (en) * 1999-11-17 2011-02-15 Mendel Biotechnology, Inc. Conferring biotic and abiotic stress tolerance in plants
US7858848B2 (en) * 1999-11-17 2010-12-28 Mendel Biotechnology Inc. Transcription factors for increasing yield
US8030546B2 (en) * 1998-09-22 2011-10-04 Mendel Biotechnology, Inc. Biotic and abiotic stress tolerance in plants
US8912394B2 (en) * 2001-04-18 2014-12-16 Mendel Biotechnology Inc. Transcriptional regulation of plant disease tolerance
US7193129B2 (en) 2001-04-18 2007-03-20 Mendel Biotechnology, Inc. Stress-related polynucleotides and polypeptides in plants
US7663025B2 (en) * 1999-03-23 2010-02-16 Mendel Biotechnology, Inc. Plant Transcriptional Regulators
US20030101481A1 (en) * 1998-09-22 2003-05-29 James Zhang Plant gene sequences I
US7345217B2 (en) 1998-09-22 2008-03-18 Mendel Biotechnology, Inc. Polynucleotides and polypeptides in plants
WO2000046383A2 (en) * 1999-02-05 2000-08-10 Rijksuniversiteit Leiden Method of modulating metabolite biosynthesis in recombinant cells
US7126043B1 (en) * 1999-02-25 2006-10-24 Ceres, Inc. ADC polynucleotides and polypeptides, uses thereof including methods for improving seeds
US7365183B2 (en) 2001-01-03 2008-04-29 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding SRF-type transcription factor proteins
EP1586645A3 (en) 1999-02-25 2006-02-22 Ceres Incorporated Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
US8299231B2 (en) 1999-03-09 2012-10-30 Ceres, Inc. Nucleic acid sequences encoding AN1-like zinc finger proteins
US8710204B2 (en) 1999-02-25 2014-04-29 Ceres, Inc. Nucleic acid sequences encoding secE/sec61-gamma subunits of protein translocation complexes
US7659386B2 (en) 2000-08-03 2010-02-09 Ceres, Inc. Nucleic acid sequences encoding transcription factor proteins
CA2363599A1 (en) * 1999-02-25 2000-08-31 K. Diane Jofuku Novel adc polynucleotides and polypeptides, uses thereof including methods for improving seeds
US8710201B2 (en) 1999-12-08 2014-04-29 Ceres, Inc. Nucleic acid sequences encoding strictosidine synthase proteins
US9000140B2 (en) 1999-03-05 2015-04-07 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding AN1-like zinc finger proteins
EP1057891A1 (en) * 1999-06-02 2000-12-06 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek Use of the BNM3 transcriptional activator to control plant embryogenesis and regeneration processes
US7420049B2 (en) 1999-06-18 2008-09-02 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding AP2 domain proteins
US7485715B2 (en) 1999-06-18 2009-02-03 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA encoding AP2 domain polypeptides
US7399850B2 (en) 1999-06-18 2008-07-15 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding AP2 domain proteins
US7479555B2 (en) 1999-07-21 2009-01-20 Ceres, Inc. Polynucleotides having a nucleotide sequence that encodes a polypeptide having MOV34 family activity
US7420046B2 (en) 1999-11-10 2008-09-02 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding RNA polymerase proteins
WO2001035726A1 (en) * 1999-11-17 2001-05-25 Mendel Biotechnology, Inc. Pathogen tolerance genes
US7355026B2 (en) 2000-01-27 2008-04-08 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding SRF-type transcription factor proteins
US20070094750A1 (en) * 2000-02-25 2007-04-26 Ceres, Inc. Novel ADC polynucleotides and polypeptides, uses thereof including methods for improving seeds
US20060252920A1 (en) 2001-08-10 2006-11-09 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments encoding cyclopropyl isomerase proteins
US7691991B2 (en) 2000-04-17 2010-04-06 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding cytochrome P450 proteins
US9085771B2 (en) 2001-01-03 2015-07-21 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments with regulatory functions
US7390893B2 (en) 2000-08-07 2008-06-24 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding peptide transport proteins
US10106586B2 (en) 2000-08-07 2018-10-23 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding peptide transport proteins
US9024004B2 (en) 2000-08-31 2015-05-05 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding acetohydroxyacid synthase proteins
US7608441B2 (en) 2000-08-31 2009-10-27 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding sterol desaturase proteins
AUPR087300A0 (en) * 2000-10-19 2000-11-16 Agresearch Limited Manipulation of flowering and plant architecture
AU2012200604B2 (en) * 2000-10-19 2014-10-16 Agresearch Limited Manipulation of flowering and plant architecture (3)
US7604971B2 (en) 2000-10-19 2009-10-20 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding UBIE/COQ5 methyltransferase family proteins
US7939715B2 (en) 2000-11-16 2011-05-10 Mendel Biotechnology, Inc. Plants with improved yield and stress tolerance
US7368555B2 (en) 2001-01-03 2008-05-06 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding EF-hand calcium-binding proteins
US7385046B2 (en) 2001-01-03 2008-06-10 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding ethylene responsive element binding proteins
US7604976B2 (en) 2001-04-02 2009-10-20 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding glutamine amidotransferase proteins
WO2003014327A2 (en) 2001-08-09 2003-02-20 Mendel Biotechnology, Inc. Stress-related polynucleotides and polypeptides in plants
US8426678B2 (en) 2002-09-18 2013-04-23 Mendel Biotechnology, Inc. Polynucleotides and polypeptides in plants
US9068173B2 (en) 2002-06-17 2015-06-30 Ceres, Inc. Sequence-determined DNA fragments encoding trehalose-6P phosphatase proteins
MXPA05003003A (es) * 2002-09-17 2005-11-23 Ceres Inc Sistema de contencion biologico.
US7476777B2 (en) * 2002-09-17 2009-01-13 Ceres, Inc. Biological containment system
US7579529B2 (en) * 2004-02-02 2009-08-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. AP2 domain transcription factor ODP2 (ovule development protein 2) and methods of use
US20060059585A1 (en) 2004-09-14 2006-03-16 Boris Jankowski Modulating plant sugar levels
US20080229448A1 (en) * 2004-12-20 2008-09-18 Mendel Biotechnology, Inc. Plant Stress Tolerance from Modified Ap2 Transcription Factors
WO2007044043A2 (en) 2004-12-21 2007-04-19 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
WO2006091676A2 (en) * 2005-02-22 2006-08-31 Ceres Inc. Modulating plant alkaloids
US8124839B2 (en) * 2005-06-08 2012-02-28 Ceres, Inc. Identification of terpenoid-biosynthesis related regulatory protein-regulatory region associations
US20080301839A1 (en) * 2005-08-30 2008-12-04 Ravanello Monica P Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US20100062137A1 (en) * 2005-09-30 2010-03-11 Steven Craig Bobzin Modulating plant tocopherol levels
US20090178160A1 (en) * 2005-10-25 2009-07-09 Joon-Hyun Park Modulation of Triterpenoid Content in Plants
EP1962577A4 (en) * 2005-12-21 2009-12-16 Monsanto Technology Llc TRANSGENIC PLANTS WITH IMPROVED AGRONOMIC CHARACTERISTICS
US20070199090A1 (en) * 2006-02-22 2007-08-23 Nestor Apuya Modulating alkaloid biosynthesis
WO2007117693A2 (en) * 2006-04-07 2007-10-18 Ceres, Inc. Regulatory protein-regulatory region associations related to alkaloid biosynthesis
US20080301836A1 (en) * 2007-05-17 2008-12-04 Mendel Biotechnology, Inc. Selection of transcription factor variants
US8704041B2 (en) * 2009-12-30 2014-04-22 Pioneer Hi Bred International Inc Methods and compositions for targeted polynucleotide modification
WO2011082318A2 (en) * 2009-12-30 2011-07-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for the introduction and regulated expression of genes in plants

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5773697A (en) * 1996-04-23 1998-06-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic constructs and methods for producing fruits with very little or diminished seed
US5994622A (en) * 1996-08-20 1999-11-30 The Regents Of The University Of California Methods for improving seeds
US6846669B1 (en) * 1996-08-20 2005-01-25 The Regents Of The University Of California Methods for improving seeds

Also Published As

Publication number Publication date
PL331771A1 (en) 1999-08-02
AU735715B2 (en) 2001-07-12
PL193299B1 (pl) 2007-01-31
US6846669B1 (en) 2005-01-25
WO1998007842A1 (en) 1998-02-26
US7291766B2 (en) 2007-11-06
US20060048245A1 (en) 2006-03-02
CA2263797A1 (en) 1998-02-26
CA2263797C (en) 2008-10-28
HUP0000218A3 (en) 2002-02-28
EP0964920A4 (en) 2004-06-02
HUP0000218A2 (hu) 2000-06-28
AU3986797A (en) 1998-03-06
US6093874A (en) 2000-07-25
EP0964920A1 (en) 1999-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL189711B1 (pl) Sposób modulowania masy oraz nasiono
AU759027B2 (en) Methods for improving seeds
US20030126642A1 (en) Compositions and methods for modulating plant development
CA2281487A1 (en) Leafy cotyledon1 genes and their uses
US6559357B1 (en) Methods for altering mass and fertility in plants
US7595434B2 (en) Methods for altering organ mass in plants
CA2399886A1 (en) Leafy cotyledon1 genes and their uses
CA2425794C (en) Nucleic acid molecules associated with plant cell proliferation and growth and uses thereof
US20020199219A1 (en) Modulation of abscisic acid signal transduction in plants
US20070094750A1 (en) Novel ADC polynucleotides and polypeptides, uses thereof including methods for improving seeds
US7199285B2 (en) Modulation of abscisic acid signal transduction in plants
US6376751B1 (en) Nucleic acids encoding EMF1 that control reproductive development in plants
US7164006B1 (en) Alteration of plant meristem function by manipulation of the Retinoblastoma-like plant RRB gene
US7126043B1 (en) ADC polynucleotides and polypeptides, uses thereof including methods for improving seeds
WO2000050585A1 (en) Novel adc polynucleotides and polypeptides, uses thereof including methods for improving seeds

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20090819