PL169842B1 - Sposób wytwarzania 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania 2-hydroksymetylo-5-(5 fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu, zna- mienny tym, ze ewentualnie ochroniona 5-fluorocytozyne poddaje sie reakcji z 1,3-oksatiolanem o wzorze w którym R 1a oznacza atom wodoru lub grupe chroniaca grupe hydroksylowa, w tym grupe acylowa, a L oznacza grupe odszczepialna, po czym odszczepia sie ewentualnie obecna grupe chroniaca grupe hydroksylowa. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo1)-1,3-oksatiolanu (FTC), jego dopuszczalnej fizjologicznie pochodnej lub soli. Nowy związek jest nukleozydem wykazującym wysoką aktywność wobec wirusa ludzkiego niedoboru odpornościowego.

W 1981 r. zidentyfikowano zespół nabytego braku odporności (AIDS) jako chorobę, która upośledza ludzki układ odpornościowy i która prawie bez wyjątku prowadzi do śmierci. W 1983 r. ustalono etiologię AIDS, wykazując, że przyczyną tej choroby jest wirus niedoboru odpornościowego u ludzi (HIV). W grudniu 1990 r. Światowa Organizacja Zdrowia oceniła, że 8 do 10 milionów ludzi na świecie jest zakażonych wirusem HIV, z tej liczby 1000000-1400000 w St. Zjedn. Ameryki. W 1985 r. doniesiono, że syntetyczny nukleozyd, 3'-azydo-3'-dezoksytymidyna (AZT) hamuje rozmnażanie wirusa niedoboru odpornościowego u ludzi. Od tego czasu stwierdzono, że szereg innych syntetycznych nukleozydów, w tym 2',3'-dwudezoksyinozyna (DDI), 2',3'-dwudezoksycytydyna (DDC), 3'-fluoro-3'-dezoksytymidyna (FLT) i 2',3'-dwudezoksy-2',3'-dwudehydrotymidyna (D4T), wykazuje aktywność przeciw HIV. Stwierdzono, że wiele innych 2',3'dwudezoksynukleozydów hamuje wzrost różnych wirusów in vitro. Wydaje się, że powyższe syntetyczne nukleozydy po fosforylacji w komórce do 5'-trójfosforanu przez komórkowe kinazy są wbudowywane w rosnący łańcuch DNA wirusa i powodują zakończenie wzrostu łańcucha ze względu na brak grupy 3'-hydroksylowej.

Skuteczne hamowanie przez różne 2',3'-dwudezoksynukleozydy replikacji HIV in vivo lub in vitro skłoniło wielu badaczy do syntetyzowania i testowania nukleozydów, w których atom węgla w pozycji 3' nukleozydu zamieniono na heteroatom. Norbeck i wsp. podają, że (+)-1-/(2),4))-2(hydroksymetylo)-4-dioksolanylo/-tymina (określana jako (±)-dioksolano-T) wykazuje umiarkowaną aktywność wobec HIV (EC50 = 20μιη w komórkach ATHS) i nie jest toksyczna dla niezakażonych kontrolnych komórek w stężeniu 200 mM. Tetrahedron Letters, 30(46), 6246 (1989). W europejskim opublikowanym zgłoszeniu patentowym nr 0 337 713 i opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 5.041.449 (IAF BioChem International, Inc.) ujawniono 2- i 4- podstawione 1,3-dioksolany wykazujące aktywność przeciwwirusową.

W opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 5.047.407 i w europejskiej publikacji zgłoszenia patentowego nr 0 382 526 (także IAF BioChem International, Inc.) ujawniono szereg nukleozydów 2- i 5-podstawionych 1,3-oksatiolanów oraz podano, że mieszanina racemiczna (w pozycji C4') izomeru Cl'-) 2-hydroksymetylo-5-(cytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu (nazywanego dalej (±)-BCH189) wykazuje w przybliżeniu taką samą aktywność wobec HIV, jak AZT, i nie wykazuje toksyczności komórkowej przy testowanych poziomach. Stwierdzono także, że (±)-BCH-189 hamuje in vitro replikowanie opornych na AZT izolatów HIV od pacjentów, którym podawano AZT dłużej niż 36 tygodni.

Innym wirusem, który stwarza poważne problemy zdrowotne, jest wirus zapalenia wątroby B (określany dalej jako HBV). HBV jest drugą po tytoniu przyczyną raka u ludzi. Mechanizm wywoływania raka przez HBV nie jest znany, ale postuluje się, że może on bezpośrednio wywoływać rozwój nowotworu albo działać pośrednio poprzez przewlekłe zapalenie, marskość wątroby oraz regenerację komórek związaną z infekcją.

Po upływie 2 do 6 miesięcznego okresu wylęgania, w którym gospodarz jest nieświadomy infekcji, zakażenie HBV może prowadzić do ostrego zapalenia wątroby i jej uszkodzenia, wynikiem czego jest ból brzuszny, żółtaczka i podwyższone poziomy we krwi pewnych enzymów. HBV może wywoływać zapalenie wątroby o gwałtownym przebiegu, szybko postępującą 1 często śmiertelną postać choroby, w której duże fragmenty wątroby ulegają zniszczeniu.

Pacjenci na ogół odzyskują zdrowie po ostrym zapaleniu wątroby, u niektórych jednak utrzymują się we krwi wysokie poziomy antygenu wirusa w ciągu przedłużonego lub nieokreślonego okresu czasu, wywołując przewlekłą infekcję. Chroniczne zakażenia mogą prowadzić do chronicznego zapalenia wątroby. Pacjenci zakażeni chronicznie utrzymującym się HBV występują najczęściej w rozwijających się krajach. W połowie roku 1991 było w przybliżeniu 225 milionów chronicznych nosicieli HBV tylko w Azji, a w całym świecie prawie 300 milionów nosicieli. Chroniczne zapalenie wątroby może wywoływać zmęczenie, marskość wątroby oraz raka wątrobowo-komórkowego, głównego raka wątroby.

169 842

W zachodnich uprzemysłowionych krajach do grupy wysokiego ryzyka zakażenia HBV należą stykający się z nosicielami HBV lub próbkami ich krwi. Epidemiologia HBV jest bardzo podobna do epidemiologii zespołu nabytego niedoboru odpornościowego, co tłumaczy dlaczego zakażenie HBV jest pospolite wśród pacjentów z AIDS lub pokrewnym kompleksem. Jednak, HBV jest bardziej zaraźliwy niż HIV.

Dla uodporniania pacjentów wobec HBV wynaleziono szczepionkę, pochodzącą z surowicy krwi ludzkiej. Chociaż stwierdzono, że jest ona skuteczna, to wytwarzanie jest kłopotliwe, gdyż ilość surowicy krwi ludzkiej od chronicznych nosicieli jest ograniczona, a oczyszczanie jest długie i kosztowne. Ponadto, każda szarża szczepionki przyrządzona z różnych surowic musi być testowana na szympansach dla zapewnienia bezpieczeństwa. Szczepionki są także wytwarzane drogą inżynierii genetycznej. Codziennie podawanie α-interferonu, genetycznie skonstruowanego białka, wygląda także obiecująco. Jednakże, do dzisiaj nie jest znany środek farmaceutyczny, który skutecznie hamuje rozmnażanie wirusa.

Aby nukleozyd mógł być wprowadzony na rynek do celów farmaceutycznych, musi być on nie tylko skuteczny i mało toksyczny, ale także opłacalny w wytwarzaniu. Prowadzone są intensywne badania zmierzające do opracowania nowych, opłacalnych sposobów wytwarzania nukleozydu. 2',3'-dwudezoksynukleozydy są obecnie wytwarzane jednym z dwóch sposobów: pierwszy to otrzymywanie pochodnych kompletnych nukleozydów, drugi, kondensacja pochodnej reszty podstawionej pochodnej cukrowej z zasadą heterocykliczną. Chociaż z otrzymywaniem nowych nukleozydów drogą modyfikacji kompletnych nukleozydów są związane liczne niedogodności, to główną zaletą tego podejścia jest to, że utrzymuje się odpowiednią absolutną stereochemię naturalnego produktu. Jednak takie podejście nie może być stosowane w przypadku wytwarzania nukleozydów, które zawierają nie występujące w naturze zasady lub reszty węglowodanowe i które tym samym nie mogą być otrzymywane z kompletnych nukleozydów, takich jak nukleozydy 1,3oksatiolanowe i 1,3-dioksolanowe.

Gdy stosuje się resztę węglowodanową lub węglowodanopodobną z zasadą heterocykliczną w celu otrzymania syntetycznego nukleozydu, wytworzony nukleozyd posiada dwa chiralne centra (przy C1' i C4') i występuje w postaci pary diastereomerów. Każdy diastereomer istnieje w postaci pary enancjomerów. Produkt jest więc mieszaniną czterech enancjomerów:

Często stwierdza się, że nukleozydy o stereochemii innej niż w produktach naturalnych, w pozycji C1' lub C4', są mniej aktywne niż takie same naturalne nukleozydy. Np., Carter i wsp. donieśli, że stężenie (-)-enancjomeru preparatu carbovir (2',3'-dwudehydro-2',3'-dwudezoksyguanozyna) w hodowli komórek wymagane dla zmniejszenia o 50% (EC50) aktywności odwróconej transkryptazy wynosi 0,8 μΜ, natomiast EC50 dla ( + )-enancjomeru carboviru jest większe niż 60 μΜ. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 34(6), 1297-1300 (czerwiec 1990).

W międzynarodowej publikacji PCT nr WO 91/11186 ujawniono, że nukleozydy 1,3oksatiolanowe o wysokiej diastereoselektywności (o dużej wartości procentowej nukleozydu o konfiguracji β wiązania węgla C1' z zasadą heterocykliczną) można wytwarzać dobierając starannie kwas Lewisa stosowany w procesie kondensacji. Odkryto, że kondensacja nukleozydu 1,3oksatiolanowego z zasadą zachodzi z prawie całkowitą β-stereospecyficznością, gdy jako katalizator kondensacji stosuje się chlorek cynowy. Inne kwasy Lewisa dają niską (lub żadną) C Τ-β-selektywność albo wcale nie katalizują reakcji.

W świetle faktu, że zespół nabytego niedoboru odpornościowego, kompleks pokrewny AIDS i wirus zapalenia wątroby B osiągnęły na całym świecie poziomy epidemiczne i spowodowały tragiczne skutki dla zakażonych pacjentów, występuje silna potrzeba uzyskiwania nowych, skutecznych środków farmaceutycznych do leczenia powyższych chorób, charakteryzujących się niską toksycznością dla biorcy.

Istnieje również potrzeba opracowania ekonomicznej i nadającej się do przemysłowego stosowania metody wytwarzania ważnych farmaceutycznie nukleozydów oraz uzyskanie β-specyficzności w pozycji C4' syntetyczne nukleozydu wytwarzanego drogą kondensacji reszty węglowodanopodobnej z zasadą.

Nowy nukleozyd znajduje zastosowanie do zwalczania infekcji HIV i HBV u ludzi i zwierząt, a metoda ta polega na podawaniu skutecznej ilości 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3oksatiolanu lub jego dopuszczalnej w farmacji pochodnej, w tym 5' lub N⁴ alkilowanej lub acylowanej pochodnej albo dopuszczalnej w farmacji soli w dopuszczalnym w farmacji nośniku.

169 842

Stwierdzono, że 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolan (FTC) wykazuje zaskakująco wysoką aktywność wobec wirusa ludzkiego niedoboru odpornościowego, połączoną z bardzo niską toksycznością komórkową u biorcy. Stwierdzono również, że FTC wykazuje bardzo znaczną aktywność wobec HBV, może więc być stosowany do leczenia pacjentów cierpiących na różne choroby związane z zakażeniem HBV.

Badania toksylogiczne i farmakologiczne potwierdzają użyteczność FTC jako środka przeciwwirusowego do podawania jako farmaceutyku. FTC i jego enancjomery są nietoksyczne dla ludzkich obwodowych komórek szpiku kostnego w stężeniu do 50 μΜ i dla innych linii komórkowych w stężeniu do 200 μΜ. FTC-TP jest głównym metabolitem wewnątrzkomórkowym w komórkach PBMC i HepG2. FTC-TP kompetytywnie inhibituje odwrotną transkryptazę (RT) HIV-1 przy K1 =0,2 μΜ, stosując poli(I)oligo(dC) marker-primer. Stosując analizę sekwencyjną można wykazać, że FTC-TP jest silnym terminatorem łańcucha DNA, gdy stosowany jest HIV-RT (w końcu C).

Przewlekłe podawanie FTC nie jest toksyczne dla gryzoni, nawet w dawkach doustnych 85 mg/kg/dzień, w ciągu co najmniej dwóch miesięcy. Farmakokinetyka FTC u małp rezusów wskazuje wysoką biodostępność (około 73 ±6%) i okres półtrwania w plazmie wynoszący około 1,34 ± 0,18 (średnia z podawania doustnego i dożylnego).

Wynalazek zilustrowano rysunkiem, na którym fig. 1 przedstawia budowę chemiczną 2hydroksymetylo-5-(5-nuoiOcytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu (FTC);

Figura 2 ilustruje metodę otrzymywania 2-hydroksymetylo-5-(5-ffuorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu;

Figura 3 przedstawia wykres obrazujący wchłanianie trytylowanego (±)-FTC w ludzkich komórkach PBM, (średnia z dwóch oznaczeń), jako stosunek czasu (w godzinach) do pmol/1O6 komórek;

Figura 4 przedstawia wykres wydalania znakowanego (±)-FTC z ludzkich komórek PBM, jako stosunek czasu (w godzinach) do pmol/l0⁶ komórek;

Figura 5 ilustruje obecność [³H]-(± )-FTC i jego fosforylowanych pochodnych w ludzkich komórkach HepG-2 (średnia z dwóch oznaczeń) inkubowanych w podłożu zawierającym 10μΜ [³H]-(± )-FTC. Wykres obrazuje zależność pmol/1O6 komórek od czasu;

Figura 6 przedstawia wydalenie [³H]-(±)-FTC i jego fosforylowanych pochodnych z ludzkich komórek HepG2 po przetrzymywaniu komórek w ciągu 24 godzin z 10μΜ [³H]-(±)-FTC (700 DPM/pmol) i badaniu stężenia związku po 24 godzinach po usunięciu związku, jako zależność pmol/106 komórek od czasu; a

Figura 7 ilustruje spadek połączonego stężenia [³H]-(±)-FTC i jego fosforylowanych pochodnych w ludzkich komórkach HepG2 po inkubowaniu w ciągu 24 godzin z 10μΜ [³H]-(±)-FTC (700 dPM/pmol), jako zależność pinoH^ komórek od czasu.

Określenie FCT oznacza 2-hydroksymetylo-5-(5-ffuorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolan (mieszaninę racemiczną), którą także nazywa się 2-dezoksy-5-fluoro-3'-tiacytydyną.

Określenie (± )-FTC oznacza (±)-e-D,L-2-hydroksymety]o-5-(5-nuorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolan.

Określenia FTC-MP, FTC-DP i FTC-TP oznaczają odpowiednio jednofosforan, dwufosforan i trójfosforan FTC.

Określenie BCH-189 oznacza 2-hydroksymetylo-5-(cytozynylo-1)-0,3-oksatiolan.

Określenie „grupa odszczepialną oznacza grupę funkcyjną, która zapoczątkowuje przyłączenie atomu węgla oddzielając się od cząsteczki, do której jest przyłączona.

Sposobem według wynalazku wytwarza się (±)-e-D,L-2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-0)-0,3-oksatio]an i jego dopuszczalne w farmacji pochodne i sole.

Sposób wytwarzania 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu według wynalazku polega na tym, że ewentualnie ochronioną 5-fluorocytozynę poddaje się reakcji z 1,3-oksatiolanem o wzorze A

169 842 w którym Ria oznacza atom wodoru lub grupę chroniącą grupę hydroksylową, w tym acylową, a L oznacza grupę odszczepialną, po czym usuwa się ewentualnie grupę obecną chroniącą grupę hydroksylową.

W powyższym procesie grupami chroniącymi grupę hydroksylową mogą być grupy opisane szczegółowo powyżej, w tym grupa acylowa (np. acetylowa, aryloacylowa) (np. benzoilowa lub podstawiona benzoilowa), trytylowa lub jednotrytylowa, benzylowa lub podstawiona benzylowa, trójpodstawiona grupa sililowa, w tym trójalkilosililowa (np. dwumetylo-III-rzęd.-butylosililowa) lub dwufenylometylosililowa. Pochodna 5-fluorocytozynowa może być ewentualnie ochroniona grupami trójpodstawionymi sililowymi. Grupy ochronne można usuwać znanymi sposobami. Grupa odszczepialna L jest typową grupą znaną z chemii nukleozydów, np. atom chlorowca, taki jak chloru lub bromu, grupa alkoksylowa, taka jak metoksylowa lub etoksylowa, albo acylowa, taka jak acetylowa lub benzoilowa.

Reakcję tę można prowadzić w rozpuszczalniku organicznym (np. w 1,2-dwuchloroetanie lub acetonitrylu) w obecności kwasu Lewisa, korzystnie chlorku cynowego lub trójfluorometylosulfonianem trójmetylosililu.

Związki o wzorze A, w którym L oznacza grupę acylową (np. acetylową), wytwarza się w reakcji związku o wzorze B

1a

0.

(w którym R1a ma znaczenie podane uprzednio) z czynnikiem redukującym, np. wodorkiem litowoglinowym, a następnie reakcji z reagentem potrzebnym dla uzyskania pożądanego półproduktu, np. reakcji z bezwodnikiem kwasu karboksylowego, np. bezwodnikiem octowym, w przypadku acylowania, reakcji z czynnikiem chlorującym lub bromującym w przypadku chlorowcowania, lub z reagentami alkilującymi.

Związek o wzorze B wytwarza się w reakcji związku o wzorze C ze związkiem o wzorze HSCH2COOH, prowadzonej w podwyższonej temperaturze.

Związek o wzorze C wytwarza się drogą ozonolizy allilowego eteru lub estru o wzorze CH2 = CH-CH2-OR lub dwueteru albo dwuestru 2-buteno-1 ,3-diolu o wzorze ROCH2-CH = CHCH2OR, gdzie R oznacza grupę ochronną, taką jak alkilowa, sililowa lub acylowa.

FTC można przekształcać w dopuszczalny w farmacji ester w reakcji z odpowiednim środkiem estryfikującym, np. halogenkiem lub bezwodnikiem kwasowym. FTC lub jego dopuszczalną w farmacji pochodną można przekształcać w dopuszczalną w farmacji sól, stosując znany sposób, np. w reakcji z odpowiednią zasadą. Ester lub sól FTC można przekształcać w FTC, np. drogą hydrolizy.

Nowy aktywny przeciwwirusowo związek jest przedstawionym na fig. 1 2-hydroksymetylo-5(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolanem w postaci mieszaniny racemicznej.

169 842

Ί

Aktywny związek może być podawany w postaci pochodnej, która po podaniu biorcy jest zdolna bezpośrednio lub pośrednio przekształcać się w macierzysty FTC, lub która sama wykazuje aktywność. Nieograniczającymi przykładami są dopuszczalne w farmacji sole (alternatywnie określane jako dopuszczalne fizjologicznie sole) oraz 5' i N⁴ acylowane lub alkilowane pochodne (alternatywnie określane jako aktywne fizjologicznie lub farmaceutycznie pochodne). W jednej odmianie, grupą acylową jest ester kwasu karboksylowego, w którym reszta niekarbonylowa grupy estrowej jest prostą, rozgałęzioną lub cykliczną grupą alkilową; grupą alkoksyalkilową, np. fenoksymetylową; grupą arylooksyalkilową, np. fenoksymetylową; arylową, np. fenylową ewentualnie podstawioną atomem chlorowca, grupą C-]-4-alkilową lub C1-4-alkoksylową; ester sulfonianowy, taki jak alkilo- lub aryloalkilosulfonylowy, np. metanosulfonylowy; ester jedno-, dwu- lub trójfosforanowy; trytylowy lub jednometoksytrytylowy; podstawiony benzylowy; trójalkilosililowy (np. dwumetylo-III-rz.-butylosililowy) lub dwufenylometylosililowy. Grupą arylową w estrach jest optymalnie grupa fenylowa. Grupa alkilowa może być grupą prostą, rozgałęzioną lub cykliczną, optymalnie o C1-18.

Specyficznymi przykładami dopuszczalnych w farmacji pochodnych FTC są, ale nie wyłącznie, związki o wzorze:

w którym R1 i R2 oznaczają niezależnie od siebie grupę alkilową lub acylową, przykładowo, ale nie wyłącznie, taką jak metylowa, etylowa, propylowa, butylowa, pentylową, heksylowa, izopropylowa, izobutylowa, Il-rz.-butylowa, Ill-rz.-butylowa, izopentylowa, amylowa, IH-rz.-pentylowa, 3-metylobutyryIowa, wodorobursztynianowe, 3-chlorobenzoesanowa, cyklopentylowa, cykloheksylowa, benzoilowa, acetylowa, piwaloilowa, mezylanowa, propionylowa, butyrylowa, walerylowa, kapronowa, kaprylowa, kaprynowa, laurylowa, mirystynowa, palmitynowa, stearynowa, oleinowa, lub reszta aminokwasu, tak jak, ale nie wyłączenie, alanylowa, walinylowa, leucynylowa, izoleucynylowa, prolinylowa, fenyloalanylowa, tryptofanylowa, metioninylowa, glicynylowa, serynylowa, treoninylowa, cysteinowa, tyrozynylowa, asparaginylowa, glutaminylowa, aspartoilowa, glutaoilowa, lizynylowa, arginylowa i histydynylowa, a jeden z podstawników R1 i R2 może być atomem wodoru.

FTC lub jego pochodne mogą występować w postaci dopuszczalnych w farmacji soli. Stosowane w opisie określenie dopuszczalne w farmacji sole lub kompleksy dotyczy soli lub kompleksów FTC zachowujących pożądaną aktywność biologiczną macierzystego związku i wykazujących minimalne, jeśli w ogóle, niepożądane działanie toksyczne. Nie ograniczającymi przykładami takich soli są (a) addycyjne sole kwasowe utworzone z kwasami nieorganicznymi (np. z chlorowodorem, bromowodorem, kwasem siarkowym, kwasem fosforowym, kwasem azotowym, itp.) oraz sole z kwasami organicznymi, takimi jak kwas azotowy, kwas szczawiowy, kwas winowy, kwas bursztynowy, kwas jabłkowy, kwas askorbinowy, kwas benzoesowy, kwas garbnikowy, kwas embonowy, kwas alginowy, kwas poliglutaminowy, kwasy naftalenosulfonowe, kwasy naftalenodwusulfonowe i kwas poligalakturonowy; (b) zasadowe sole addycyjne utworzone z wielowartościowymi kationami metali, takich jak cynk, wapń, bizmut, bar, magnez, glin, miedź, kobalt, nikiel, kadm, sód, potas, itp., albo z organicznymi kationami utworzonymi z N,N-dwubenzyloetylenodwuaminy, soli amoniowej lub etylenodwuaminy; lub (c) kombinacje soli (a) i (b), np. sól cynkowo-taninowa lub podobna.

169 842

Modyfikacje aktywnego rwiąrkn w poozcjach N⁴ i -'-0 mogą wpływać na biodostępność i metabolirm i tym samym porwalają na kontrolę podawania leku. Ponadto, modyfikacje mogą wpływać na aktywność prreciwwirnsową, rwięksrając ją w niektórych prrcpadkach ponad aktywność macieroyktego owiąoku. Łatwo to można ocenić testnjąc otrrymaną pochodną na aktywność prreciwwirnsową metodami prredstawionymi w opisie.

Drięki swojej aktywność prreciwwtrukowej nowy nnkleoryd rnajduje się w metodrie rwalcrania infekcji HIV i HBV orar innymi wirukami roomnażającymi się w podobny sposób u lndri i rwierrąt. Metoda ta polega na podawaniu skntecrnej ilości (±))β-D,L-2)hcdroksymetylo---(-flnorocytorynylo-l)^ 1,3-oksatiolaaUl jego dopusocoalnej farmaceuty^nie (-ϊojologicrnie) pochodnej, w tym (' lub N4 alkilowej lub acylowej pochodnej lnb dopusrcralnej farmacentycrnie (fzjologicrnie) soli w dopnsrcralnym w farmacji nośniku. Jak wykarano poniżej, rwią^ wytworrone sposobem według wynalarkn albo same wykarują aktywność wobec retrowtrukóWl taką jak aktywność anty-H^-l, anty-HIV)2 lub wobec wirusa niedoboru odpornościowego u małp (antySIV) albo są metabolicrne do rwiąrków, które wykarnją powcżkoą aktywność.

FTC i jego dopu^^lne w farmacji pochodne albo dopusrcralne w farmacji preparaty rawierające te rwiąrki są użytecrne do oapobtegania i rwalcrania rakażeń HIV i innych pokrewnych stanów, takich jak owtąoany r AIDS kompleks (ARC), trwałe uogólnione powięksrenie węrłów chłonnych (PGL), rwuąrane o AIDS stany neurologic^e, stany rwią^ne r dodatnim odcrynem na prreciwciała anty-H^ i HIV, mięsak Kaposi'ego, plamica małopłytkowa i rakażenia rararkiem oportunistycraym. Ponadto, powcżsre rwiąo0t podaje się dla oapobiegania lnb opóźniania postępn choroby u osobników o dodatnim odcrynie na prrectwciała anty-HIY lub antygen HIV lub którry retknęli się o HIV.

FTC i jego dopusrcralne w farmacji pochodne lub sole albo dopusrcralne w farmacji preparaty rawierające te rwiąrki są także użytecrne w rapobieganin i rwalcranin infekcji HBV i innych pokrewnych stanów, takich jak stany rwiąrane r dodatnim odcrynem na prreciwciała antc-HBV i HBV, prrewlekłe rapalenie wątroby wywołane prrer HBV, marskość wątroby, ostre rapalenie wątroby, piorunujące rapalenie wątroby, prrewlekłe, prretrwałe rapalenie wątroby i rmęcrenie. Powyżsre rwiąrki lnb preparaty mogą być również stosowane profilaktycrnie dla ^pobiegania lub opóźniania postępn choroby n osobników, którry wykarnją dodatni odcryn na prr.eciwciała antz-HBV i antygen HBV lnb którry retknęli się r HBV.

Aktywność farmakologicrną FTC prredstawiono w poniżs^ch testach, w których prredstawiono rdolność 2)hzdrokszmetzlo---(5-fuorocytorynzlo-1)-1,3-oksatiolann (FTC) do hamowania replikacji HIV.

Cręsto jest pożądane prreprowadrenie skriningn wieln racemicrnych miesoaaia nukleorydów, jako wstępnego etapn oceny, na podstawie której można dokonywać dalsrego rordriału na wrbogacone enancjomerycrnie składniki i prowadrić dalsre badania aktywności prreciwwiruso) wej. Zdolność aukleozzdów do hamowania HIV można oceniać różnymi technikami doświadcralnymi. W stosowanej tutaj i opisanej srcregółowo poniżej technice mierry się hamowanie replikacji wirnsa w pobudzonych fitohemoaglntyniną (PHA) jedaojądrrastzch komórkach (PBM) r obwodowej krwi lndrkiej rakażonej HIV-1 (srcrep LAV). Ilość wytwarranego wirusa ornacra się drogą pomiarn kodowanego wirusem enrymu, odwrotnej transkryptary. Ilość wytwarranego enrymu jest proporcjonalna do ilości wytwarranego wirusa. W tabeli 1 podano wartości EC50 (stężenie nnkleorydn hamnjące o -0% replikację wirnsa w komórkach PBM r nwrględnieniem błędn ocenianego na 10%) orar wartości IC50 (stężenie nnkleorydu hamujące o -0% wrrost pobudranych mitogenem nierakażonych lndrkich komórek PBM), dla sreregu nukleorydów (±)-1,3-okkatiolanowccb. Test A. Aktywność anty-HIy nukleorydów (±)-1,3-oksatiolanowcch

a) Trrydniowe, pobndrane fitohemoaglutzniną komórki PBM (10^e komórek/ml) od surowiczo-ujemazch w stosunku do HBV i HIV-1 Arowych dawców rakażono wirusem HIV-1 (srcrep LAV) w stężeniu na ml wynosrącym około 100 rary więcej niż -0% dawka rakażająca hodowlę komórkową (TICD -0) i następnie hodowano ber dodatkn lub r dodatkiem różnych stężeń rwiąrków prreciwwirusowych.

b) Po upływie około 1 godriaz od rakażenia, podłoże r testowanym rwiąrkiem (dwukrotne stężenie końcowe w podłożu) lub ber tego rwiąoku, prreniesiono do kolb (- ml, końcowa objętość 10 ml). Jako pozytzwaą kontrolę stosowano AZT.

169 842 9

c) Komórki poddano działaniu wirusa (około 2X 10⁵dpm/ml, zgodnie z oznaczeniem za pomocą odwrotnej transkryptazy) i następnie umieszczono w inkubatorze w CO2 · HIV-1 (szczep LAV) otrzymano z Disease Control, Atlanta, Georgia. Do hodowania komórek PBM, zbierania wirusa i oznaczania aktywności odwrotnej transkryptazy stosowano metody opisane przez McDougal'a i wsp. w J. Immun. Meth, 76,171-183 (1985) oraz Spira i wsp. w Clin. Meth., 25,97-99 (1987), z tym tylko, że do podłoża nie dodawano fungizonu (patrz: Schinazi i wsp., Antimicrob. Agents Chemother., 32, 1784-1787 (1988); oraz ibidem, 34, 1061-1067 (1990)).

d) W szóstym dniu komórki i supernatant przeniesiono do 15 ml probówki i wirowano przy około 900 g w ciągu 10 minut. Usunięto 5 ml supematantu i wirus zatężono drogą wirowania przy 40.000 obrotach/minutę w ciągu 30 minut (Beckman 70.1 Ti rotor). Rozpuszczalne pastylki wirusa przygotowano do oznaczenia poziomów odwrotnej transkryptazy. Wyniki wyrażono w dpm/ml pobranego supernatantu. Wirus z mniejszej objętości supematantu (1 ml) można także zatężać drogą wirowania przed rozpuszczeniem i oznaczeniem poziomów odwrotnej transkryptazy.

Średnie skuteczne stężenie (EC50) oznaczano metodą średniego działania (Antimicrob. Agents Chemother., 30, 491-498 (1986)). Sporządza się wykres zależności procentowego hamowania wirusa, oznaczanego z pomiarów odwrotnej transkryptazy, od mikromolarnego stężenia związku. EC50 jest to stężenie związku, przy którym zachodzi 50% hamowania wzrostu wirusa.

e) Pobudzane mitogenem niezakażone ludzkie komórki PBM (3,8 X 10⁵ komórek/ml) hodowano bez i w obecności leku, w warunkach podobnych do opisanych uprzednio badaniach przeciwwirusowych. Komórki zliczano po 6 dniach za pomocą hemocytometru i metodą eliminacji błękitu trypanowego, opisaną przez Schinazi'ego i wsp. w Antimicrobial Agents and Chemotheraphy, 22(3), 499 (1982). IC50 jest to stężenie związku hamujące o 50% normalny wzrost komórek.

Tabela 1

EC50 1 IC50 dla różnych analogów nukleozydów 1,3-oksatiolanowych w ludzkich komórkach PBM

Kod	X lub Y	R	Aktywność przeciwwirusowa EC5O, μΜ	Cytotoksyczność IC50, μΜ IC50, μΜ
DLS-009	X = O	H	>100	>100
DLS-010	X = O	Me	64,4	>100
DLS-027	X = O	F	>100	>100
DLS-028	X = O	Cl	60,8	>100
DLS-044	X = O	Br	>100	>100
DLS-029	X = O	J	>100	>100
DLS-020	Y = nh2	H	0,02	>100
DLS-011	Y = nh2	Me	>10	>100
DLS-022	Y = nh2	F	0,01	>100
DLS-023	Y = NH2	Cl	38,7	>100
DLS-021	Y = NH2	Br	77,4	>100
DLS-026	Y = NH2	J	0,72	>100
DLS-058(-)	Y = NH2	F	0,008	>100
DLS-059( + )	Y = NH2	F	0,84	>100
DLS-053	Y = NH2	cf3	60,7	>100

169 842

Jak podano w tabeli 1, generalnie, podstawione nukleozydy cytozyno- 1,3-oksatiolanowe są bardziej aktywne niż odpowiednie nukleozydy uracylowe. Błąd w pomiarach EC50 i IC50 oceniany jest na ±10%.

Jeden ze związków, (±)-FTC (określony jako „DLS-022“, związek 8) nie tylko wykazuje wyjątkową aktywność (około 10 nM w komórkach PBM), ale także zupełnie niską toksyczność (>100 w komórkach PBM, Vero i CEM).

IC50 dla (±)-FTC wynosi powyżej 100pM, co wskazuje, że związek nie jest toksyczny dla niezakażonych komórek PBM w badaniach do ^^0^M.

Tabela 2

Aktywność przeciwwirusową (±)-FTC

Podawane stężenie OM)	DPM/ml	% hamowania (niekorygowany	ECs<> OM)
FTC-(±)	0,0001	73,755	26,6	0,018
	0,005	83,005	16,3
	0,01	60,465	41,3
	0,05	34,120	70,4
	0,1	14,160	92,4
	0,5	18,095	88,1
	1,	7,555	99,7
	5,	7,940	99,3
	10,	5,810	101,7

Jak wynika z danych z tabeli 2, w tym doświadczeniu mieszanina racemiczna nie jest toksyczna do 100pM, co oznaczono metodą eliminacji błękitu trypanowego w ludzkich komórkach PBM.

Test B. Wchłanianie (±)-FTC przez ludzkie komórki PBM

Przeprowadzono badania, stosując znakowany FTC, mające na celu ustalenie poziomów wewnątrzkomórkowych macierzystego leku i jego metabolitów. Wszystkie badania powtarzano dwukrotnie. Ludzkie jednojądrzaste komórki (PBM) z obwodowej krwi zawieszono w podłożu RPMI 1640 zawierającym 10% surowicy płodu cielęcia i antybiotyki (2X 10⁶ komórek/ml, dla każdego przedziału czasu) i inkubowano z dodatkiem ^^/uM FTC (o aktywności właściwej około 700dpm/pmol). Komórki poddawano działaniu leku w ciągu 2, 6, 12 i 24 godzin. Po upływie kolejnych przedziałów czasu komórki przemywano dwukrotnie zimnym roztworem zrównoważonej soli Hanka. Ekstrakcję prowadzono z dodatkiem 0,2 ml 60% zimnego roztworu metanolu w wodzie, przechowywano w ciągu nocy w temperaturze -70°C. Następnego dnia zawiesiny wirowano i ekstrakcję powtórzono dwukrotnie w ciągu 0,5 godziny, w temperaturze -70°C. Wszystkie supernatanty (0,6ml) zliofilizowano . Pozostałości zawieszono w 250 μ\ wody i próbki po 50 do 100μ! analizowano za pomocą HPLC. Ocenę ilościową zawartości wewnątrzkomórkowej macierzystego leku i jego metabolitów prowadzono za pomocą HPLC. Ze względu na potencjalną nietrwałość niektórych związków w kwasie, w procesie rozdziału metabolitów stosowano układ buforujący bliski fizjologicznego pH.

Na fig. 3 przedstawiono wykres zależności obecności (wchłonięcia) trytylowanego (±)-FTC w ludzkich komórkach PBM (średnia z dwóch oznaczeń) w czasie (godziny) od pmol/106 komórek. Badania wchłaniania wykazują, że znakowany FTC jest łatwo wychwytywany przez ludzkie limfocyty, w których powstają bardzo duże ilości pochodnej 5'-trójfosforanowej FTC.

Test C. Aktywność przeciwwirusowa FTC w różnych liniach komórkowych

Aktywność przeciwretrowirusową FTC oznaczano w wielu liniach komórkowych stosując postępowanie podobne, ale nie identyczne, do przedstawionego w teście A. Linie komórkowe otrzymano od dawców ludzkich z AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH, Rockville, Maryland, ATCC lub z Czerwonego Krzyża. Komórki CEM z niedoborem kinazy tymidynowej preparowano drogą kolejnych pasaży komórek CEM w obecności 5-bromo-2'-dezoksyurydyny. Wyniki przedstawiono w tabeli 3.

169 842

Tabela 3

Aktywność przeciwretrowirusowa FTC w różnych układach komórkowych

Układ komórkowy	EC50 (pM)
(szczep wirusa)	(±)-FTC
HIV-1 PMBC (LAV-1)	0,027
MT2-(HTLV,iib)	0,89
CEM (LAV-1)	0,08
CEM-TK1 ’(LAV-1)	0,026
CEM (HTLVmb)NIH HIV-2	0,09
PBMC (ROD2)	0,0038 (±)-FTC 0,0007 (-)-FTC 0,026 ( + -FTC
SIV AA-2 (SIV251)	4,6
C-8166 (SIV251) FIV	<8,0
CrFK (61E)	< 1

Test D. Wydalanie (±)-FTC z ludzkich komórek PBM

Przeprowadzono badania z zastosowaniem znakowanego FTC w celu ustalenia poziomów macierzystego leku i jego metabolitów wewnątrz komórek po inkubowaniu w pożywkach z lekiem w ciągu 24 godzin i następnie usunięciu leku. W tym badaniu dokonywano pomiaru czasu niezbędnego do obniżenia poziomów wewnątrzkomórkowych trójfosforanów. Każde doświadczenie prowadzono dwukrotnie. Niezakażone komórki (2X10^eml) zawieszono w odpowiednim podłożu uzupełnionym o surowicę (10 ml dla każdego przedziału czasu) i inkubowano w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2. Stężenie znakowanego FTC wynosiło 10μΜ. Po przetrzymaniu komórek ze znakowanym związkiem w ciągu 24 godzin przemyto je starannie i dodano świeżego podłoża bez związku przeciwwirusowego (godzina 0). Po upływie 0 2,4,6,12 i 48 godzin (drugi okres inkubacji) komórki usuwano i natychmiast ekstrahowano zimnym 60% roztworem metanolu w wodzie. Ekstrakty, otrzymane drogą wirowania i usunięcia pastylek zawierających komórki, zliofilizowano i przechowywano w temperaturze -70°C. Przed poddaniem analizie powyższy materiał zawieszono w 250 mikrolitrach buforu do HPLC i natychmiast analizowano. Oznaczenia ilościowe obecnego wewnątrz komórki macierzystego leku i metabolitów wykonywano za pomocą HPLC, stosując do tego celu albo aparat Micromeritios albo aparat HewlettPackard model 1090 PHLC, z anionowymienną kolumną Partisil 10 SAX (Whatman, Inc.), szybkość przepływu 1 ml/minutę, ciśnienie 287 MPa i detekcję w UV przy 262 nm. Faza ruchoma składała się z dejonizowanej wody (A), 2 mM NaH2^<04-^/16mM NaOAC, pH 6,6 (B), 15 mM NaH2P04/120,2mM NaOAc, pH 6,6 (C), i 100 mM NaH2P04/800 mM NaOAc, pH 6,6 (D).

Sposób rozdziału: w ciągu 5 minut izokratycznie A, następnie 15 minut w liniowym gradiencie do 100% B, następnie 20 minut w liniowym gradiencie do 100% C, następnie 10 minut w liniowym gradiencie do 100% D, i w końcu 30 minut izokrytycznie 100% D.

Czasy retencji (w minutach) w komórkach ludzkich

Związek	Niezmieniony	Jednofosforan	Dwufosforan	Trójfosforan
(±)-FTC	5,0	39,0	55,0	68,0

Na fig. 4 przedstawiono wykres wydalania znakowanego (±)-FTC z ludzkich komórek PBM, podany jako zależność stężenia leku (pmoli/10⁶ komórek) od czasu po usunięciu leku. Jak wynika z fig. 8, czas wewnątrzkomórkowego półtrwania dla trójfosforanu FTC wynosi około 12 godzin i związek ten można z łatwością wykryć wewnątrz komórki w stężeniach 1-5 pM po 48 godzinach od usunięcia z zewnątrz komórek leku. Jest to znacznie powyżej wartości EC-o dla tego związku. Ponadto, powinowactwo (K1) trójfosforanu (±)-FTC przy stosowaniu HIV RT wynosi 0,2 μΜ czyli poniżej poziomu stężenia po 48 godzinach.

169 842

Test E. Aktywność anty-HIV dopuszczalnych w farmacji pochodnych (±)-FTC

a) Badano szereg dopuszczalnych w farmacji pochodnych (±)-FTC, otrzymanych przez podstawienie w pozycjach 5' i N⁴, na aktywność anty-HIV, w komórkach PBM. Stosowano postępowanie podobne do opisanego w teście A. Uzyskano następujące wyniki: 5'-0-maślan (±)-FTC wykazywał EC50 = 0,0017; pochodna N4-acetylowa miała EC50 = 0,0028, a 5'-0-maślan N4-estru (±)-FTC wykazywał EC50 = 0,0058.

b) Aktywność anty-HIV 5'-0-maślanu (±)-FTC w układzie MT4 (EC 50) wynosiła 0,04 μΜ. W tym samym badaniu, nieacylowany (±)-FTC miał IC 50 = 0,52 μΜ- IC 50 dla AZT w tym układzie wynosił 0,09 μΜ.

Test F. Wchłanianie (±)-FTC w komórkach ludzkiej wątroby; aktywność FTC wobec HVB

Powtórzono postępowanie z testu B. stosując komórki ludzkiej wątroby (komórki HepG2, dostępne w ATCC) do oznaczania wchłaniania i metabolizmu FTC w tych komórkach. Jak pokazano na fig. 5, (±)-FTC jest wchłaniany przez komórki HepG2 w dużych ilościach. Powyższe komórki ludzkiej wątroby metabolizują duży procent (±)-FTC do trójfosforanu (±)-FTC.

Powyższe dane, w połączeniu z innymi danymi podanymi w opisie, wskazują, że (±)-FTC, jak też jego (-) i (+) enancjomery, są fosforylowane w komórkach wątroby. Powyższe komórki mogą być transformowane wirusem zapalenia wątroby B.

Test G. Wydalanie FTC z ludzkich komórek HepG2

Figura 6 ilustruje wydalanie [³H]-(±)-FTC i jego fosforylowanych pochodnych z ludzkich komórek HepG2 wyrażane jako ilość pmol/10⁶ komórek w czasie, po 24 godzinach przetrzymywania komórek z 10μΜ [3H]-(±)-FTC (700DPM/pmol) i oznaczeniu stężenia związku po 24 godzinach od usunięcia leku.

Figura 7 ilustruje obniżenie połączonego stężenia [3H]-(±)-FTC i jego fosforylowanych pochodnych w ludzkich komórkach HepG2 po inkubowaniu z 10 μΜ [3H]-(±)-FTC (700 DPM/pmol) w ciągu 24 godzin, wyrażone jako ilość pmoli/106 komórek w czasie.

Jak z tego wynika, nawet po 48 godzinach, ciągle jeszcze ponad 1 μΜ aktywnego związku jest obecne w komórkach, co jest znacznie większe niż EC50 związku.

Test H. Farmakokinetyka FTC - Metabolizm FTC po podaniu szczurom (±)-FTC podawano dożylnie szczurom w dawkach 10, 50 i 100mg/kg i określano pole powierzchni pod krzywą stężenia leku w czasie (AUC), całkowity klirens (CL), objętość dystrybucji w ustalonym stanie (Vss), średni czas przebywania (MRT) i okres półtrwania (t-i/r).

Wyniki doświadczeń przedstawiono w tabeli 4.

Tabela 4

Parametry farmakokinetyczne ITC po podaniu dożylnym szczurom w dawkach 10, 50 i 1(0) mg/kgj

Dawka mg/kg	AUC mg h/L	CL L/h/kg	Va8 L/kg	MRT godz	t1/2 godz
10	9,65	0,988	0,758	0,768	0,757
50	57,11	0,874	0,699	0,800	0,815
100	120,72	0,830	0,663	0,798	0,969

AUC - pole powierzchni pod krzywą stężenia leku w osoczu w czasie,

CL - całkowity klirens,

Vss - objętość dystrybucji w ustalonym stanie,

MRT - średni czas przebywania; h/r - okres półtrwania

Test I. Parametry farmakokinetyczne FTC po podaniu dożylnym i doustnym

Niezależne od modelu parametry farmakokinetyczne wyznaczano podając małpom rezusom dożylnie (IV) i doustnie (P.O) 33,3mg/kg (±)-FTC. Wyniki przedstawiono w tabeli 5. Co jest ważne, średnia biodostępność związku u małp wynosiła 73% (±6%).

169 842

Tabela 5

Niezależne od modelu parametry farmakokinetyczne dla FTC pod dożylnym (I V.) lub doustnym podaniu 33,3 mg/kg rezusom

Małpa	AUC mg h/L	CL L/h/kg	V„ L/kg	MRT h	t1/2 h	Ks h-1	F %
IV
RUh	19,14	1,74	2,71	1,56	1,28
RM1	26,31	1,26	1,97	1,56	1,22
RJd	22,51	1,48	2,00	1,36	1,47
Średnia Standardowe od-	22,65	1,49	2,23	1,49	1,32
chylenie PO	3,59	0,24	0,42	0,12	0,13
RUh	13,21			2,07	1,58	0,48	71
RM1	21,11			2,32	1,08	0,43	80
RJd	15,29			3,23	1,47	0,31	68
Średnia	16,54			2,54	1,38	0,41	73,00(±6)
Standardowe odchylenie	4,09			0,61	0,26	0,09	6,24

AUC - pole powierzchni pod krzywą stężenia leku w osoczu w czasie;

CL - całkowity klirens,

Vss - objętość dystrybucji w ustalonym stanie,

MRT - średni czas przebywania, t1/2 - okres półtrwania,

F - biodostępność,

Ks - stała szybkości absorpcji pierwszego rzędu.

Tabela 6

Stosunek zawartości w CSF i surowicy krwi FTC i jego dezaminowanego metabolitu po 1 godzinie po podaniu

Małpa	Droga podawania	FTC	Metabolit (FTU)
RUh	dożylnie	0,076	0,024
RM1	dożylnie	0,062	0,032
RJd	dożylnie	0,162	0,052
Średnia		0,100	0,036
± standardowe odchylenie	0,054	0,014
RUh	doustnie	0,048	0,026
RM1	doustnie	0,039	0,037
RJd	doustnie	0,117	0,055
Średnia		0,068	0,039
± standardowe odchylenie	0,043	0,015

Test J. Stosunek zawartości w CSF i surowicy krwi FTC i jego metabolitów u małp rezusów

Zdolność (±)-FTC do przekraczania bariery krew-mózg badano podając 33,3 mg/kg aktywnego związku małpom rezusom i oznaczając ilość (±)-FTC w płynie mózgowo-rdzeniowym i w surowicy krwi po upływie 1 godziny po podaniu. Wyniki zestawiono w tabeli 6. Dane wykazują, że znaczna ilość aktywnego związku przekracza barierę krew-mózg u tych ssaków.

Wytwarzanie kompozycji farmaceutycznych

Ludzie cierpiący na choroby wywoływane przez HIV lub HBV mogą być leczeni drogą podawania skutecznej ilości (±)-FTC lub jego dopuszczalnej w farmacji pochodnej albo soli powyższego związku, razem z dopuszczalnym w farmacji nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Aktywne związki można podawać w dowolny odpowiedni sposób, np. doustnie, pozajelitowo, dożylnie, śródskórnie, podskórnie lub miejscowo, w postaci preparatów ciekłych lub stałych.

Aktywny związek jest zawarty w dopuszczalnym w farmacji nośniku lub rozcieńczalniku w ilości dostatecznej do dostarczenia pacjentowi do skutecznego hamowania in vivo replikacji wirusa, w szczególności HIV i HBV, bez powodowania poważnych działań toksycznych u leczonych pacjentów. Określenie „ilość hamująca oznacza ilość aktywnej substancji wystarczającą do wywoływania działania hamującego, oznaczanego np. jedną z opisanych tutaj metod.

169 842

Korzystna dawka (±)-FTC dla wszystkich wspomnianych powyżej chorób wynosi od około 1 do 50 mg/kg, korzystnie 1-20 mg/kg ciężaru ciała na dzień, bardziej ogólnie od 0,1 do około 100 mg/kg ciężaru ciała biorcy dziennie. Skuteczną dawkę dopuszczalnych w farmacji pochodnych można obliczyć na podstawie ilości wagowej macierzystego nukleozydu, jaką należy podawać. Jeśli sama pochodna wykazuje aktywność, wówczas właściwe dawkowanie można ustalać jak powyżej, na podstawie ciężaru pochodnej albo innymi sposobami znanymi specjalistom.

Związek dogodnie podaje się w dawkach jednostkowych w odpowiedniej postaci, w tym, ale nie wyłącznie, w ilości 7-3000 mg, korzystnie 70-1400 mg aktywnej substancji w dawce jednostkowej. Dawki ustne wynoszące 50-1000 mg są zwykle odpowiednie.

W idealnym przypadku, substancja aktywna powinna być podawana tak aby osiągnąć szczytowe stężenie w surowicy aktywnego związku wynoszące od około 0,2 do 70 μΜ, korzystnie około 1,0 do 10μΜ. Można to uzyskać, np. przez podawanie drogą iniekcji dożylnej 0,1 do 5% roztworu substancji aktywnej w roztworze soli fizjologicznej lub jednej dużej dawki aktywnej substancji.

Stężenie aktywnego związku w kompozycji zależy od absorpcji, inaktywacji i szybkości wydzielania leku oraz od innych czynników znanych specjalistom. Należy także zauważyć, że wartości dawkowania mogą być różne w zależności od przebiegu leczonej choroby. Jest również zrozumiałe, że dla każdego indywidualnego pacjenta należy ustalić specyficzny reżim dawkowania w czasie, zgodny z indywidualną potrzebą i oceną osoby leczącej lub nadzorującej podawanie leku. Dlatego, podane stężenia są tylko przykładowymi i nie mają na celu ograniczenia zakresu podawania zastrzeżonych kompozycji. Aktywny składnik może być podawany jednorazowo lub może być dzielony na wiele mniejszych dawek podawanych w różnych odstępach czasu.

Korzystnym sposobem podawania aktywnego związku jest podawanie doustne. Preparaty doustne zawierają generalnie obojętny rozcieńczalnik lub jadalny nośnik. Mogą one mieć postać żelatynowych kapsułek lub tabletek. Do terapeutycznego podawania doustnego, aktywny związek może być mieszany z wypełniaczami i stosowany w postaci tabletek, kołaczyków lub kapsułek. W skład prepratu mogą wchodzić odpowiednie środki wiążące i/lub adjuwanty.

Tabletki, pigułki, kapsułki, kołaczyki i podobne mogą zawierać któreś z następujących substancji lub związków o podobnym charakterze: środek wiążący, taki jak celuloza mikrokrystaliczna, guma tragakant lub żelatyna; wypełniacz, taki jak skrobia lub laktoza; środek rozpraszający, taki jak kwas alginowy, Primogel lub skrobia kukurydziana; środek poślizgowy, taki jak stearynian magnezu lub Sterotes; albo koloidalny dwutlenek krzemu; środek słodzący, taki jak sacharoza lub sacharyna; albo środek aromatyzujący, taki jak olejek miętowy, salicylan metylu lub olejek pomarańczowy. W przypadku kapsułek, to poza wymienionymi wyżej materiałami mogą one zawierać ciekły nośnik, taki jak olej tłuszczowy. Ponadto, preparaty mogą zawierać różne inne materiały modyfikujące ich fizyczną postać, np. powłoczki cukrowe, szelakowe lub inne środki do podawania do jelit.

(±)-FTC lub jego dopuszczalne w farmacji pochodne albo sole powyższych związków mogą być podawane jako składniki eliksiru, zawiesiny, syropu, opłatka, gumy do żucia, itp. Syrop, poza związkiem aktywnym, może zawierać środek słodzący oraz środki konserwujące, barwiące i aromatyzujące.

(±)-FTC lub jego dopuszczalne w farmacji pochodne lub sole powyższych związków mogą również być mieszane z innymi aktywnymi substancjami nie przeszkadzającymi w pożądanym działaniu, albo z substancjami, które wspomagają pożądane działanie, takimi jak antybiotyki, środki przeciwgrzybicze, przeciwzapalne, lub inne środki przeciwwirusowe, w tym także inne nukleozydy anty-HIV.

Roztwory lub zawiesiny do stosowania pozajelitowego, śródskórnego lub miejscowego mogą zawierać następujące składniki: jałowy rozcieńczalnik, taki jak woda do iniekcji, roztwór soli fizjologicznej, oleje, glikole polietylenowe, glicerynę, glikol propylenowy lub inne syntetyczne rozpuszczalniki; czynniki przeciwbakteryjne, takie jak alkohol benzylowy lub metyloparaben; przeciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy lub wodorosiarczyn sodowy; czynniki chelatujące, takie jak kwas etylenodwuaminoczterooctowy; środki buforujące, takie jak octany, cytryniany lub fosforany; oraz środki tonizujące, takie jak chlorek sodowy lub dekstroza. Preparaty do podawania pozajelitowego mogą być zamknięte w ampułkach, jednorazowych strzykawkach lub fiolkach do wielokrotnego stosowania, wykonanych ze szkła lub tworzywa sztucznego.

169 842 15

Korzystnymi do podawania dożylnego nośnikami są fizjologiczny roztwór soli lub buforowany fosforanem fizjologiczny roztwór soli (PBS).

Korzystnie związki aktywne są sporządzane w postaci preparatów zawierających nośniki chroniące je przed szybkim wydalaniem z organizmu, takich jak preparaty o kontrolowanym uwalnianiu, np. wszczepy lub mikro kapsułki. Można stosować rozkładane biologicznie, odpowiednie biologicznie polimery, takie jak octan etylenowinylu, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Metody wytwarzania takich preparatów są dobrze znane specjalistom. Materiały takie są również dostarczane przez firmy Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc.

Zawiesiny lipozomalne (w tym lipozomy działające na zakażone komórki z monoklonalnymi przeciwciałami wirusowych antygenów) są także korzystne jako dopuszczalne w farmacji nośniki. Można je otrzymywać znanymi specjalistom metodami, np. opisanymi w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4 522 812 (włączonym tutaj w całości jako odnośnik). Np., preparat lipozomowy można' otrzymywać rozpuszczając odpowiedni lipid (lipidy) (np. stearoilo-fosfatydyloetanolaminą, stearoilo-fosfatydylocholinę, arachodoilo-fosfatydylocholinę lub cholesterol) w nieorganicznym rozpuszczalniku, który następnie odparowuje się. Pozostaje cienka filmowa warstwa suchego lipidu na powierzchni pojemnika. Do pojemnika wprowadza się następnie wodny roztwór aktywnego związku lub jego jednofosforanu, dwufosforanu albo trójfosforanu. Pojemnik wstrząsa się w ręku w celu uwolnienia materiału lipidowego ze ścianek i zawieszenia agregatów lipidu. Otrzymuje się lipozomalną zawiesinę.

Przykład I. Wytwarzanie (±)-β-D,L-2-hydroksymetylo-5-(5-ffuorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu

Opisano poniżej szczegółowo sposób wytwarzania mieszaniny racemicznej FTC, zilustrowany schematem podstawowym na fig. 2.

a) Ochrona 2-but eno-1,4-diolu

W suchej 2-litrowej, trójszyjnej kolbie rozpuszczono w obojętnej atmosferze 100g (93,5 ml, 1,135 mola, 1,00 równoważnik) 2-buteno-1,4-diolu i 15 g (około 0,1 równoważnika) DMAP (4-dwumetyloaminopirymidyny) w 800 ml bezwodnej pirydyny i całość mieszano i ochłodzono do temperatury 0°C. Następnie dodano powoli dla uniknięcia przegrzania 260 ml (2,2 równoważnika) chlorku butyrylu i znów mieszano w ciągu 1 godziny. Reakcję zatrzymano dodając małą ilość lodowatej wody. Ciecz zdekantowano znad soli i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałą sól rozpuszczono w wodzie i wodny roztwór ekstrahowano dwukrotnie eterem etylowym. Połączone ekstrakty eterowe przemyto jeden raz nasyconym roztworem CuSO4 i dwukrotnie nasyconym roztworem NaHCOą zawierającym Norit® i przesączono pod zmniejszonym ciśnieniem przez warstwę ziemi okrzemkowej Celite®.

Zatężoną mieszaninę reakcyjną rozpuszczono w eterze etylowym i przemyto, stosując takie same jak powyżej postępowanie. Połączone warstwy organiczne zatężono w wyparce obrotowej i umieszczono pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydajność reakcji zwykle jest bardzo bliska ilościowej. Skalę wytwarzania można łatwo w razie potrzeby zwiększyć. Produkt, 1,4-dwubutyrylo-2buteno-1,4-diol jest bezbarwną do jasnożółtej, klarowną cieczą.

b) Ozonoliza ochronionego diolu

1,365 mola 1,4-dwubutyrylo-2-buteno-1,4-diolu rozpuszczono w 4 litrach bezwodnego CH2CI2 w suchej 5-litrowej kolbie trójszyjnej, wyposażonej w dużą rurkę suszącą i otwartą rurę do wprowadzania gazu. Rura jest korzystnie rurą do przepuszczania gazu nie zawierającą spieku, który może się zatykać w przypadku stężonego roztworu. Roztwór miesza się i oziębia do temperatury -78°C, przepuszczając obojętny gaz. Wlot gazu zamyka się, gdy roztwór został dostatecznie oziębiony, po czym kolbę i mieszadło przenosi się do generatora ozonu. Przez mieszany roztwór przepuszcza się w ciągu co najmniej 20 minut tlen, oziębiając przez ten czas. Urządzenie „Cryocool“ jest idealne do utrzymywania niskiej temperatury podczas tej długotrwałej reakcji. Ozon wprowadza się pod ciśnieniem 2,29-2,44 MPa. Po zakończeniu reakcji zatrzymuje się dopływ ozonu i przez roztwór przepuszcza się tlen w ciągu pół godziny, a następnie dodaje się 3 równoważniki Me2S. Kolbę usuwa się z łaźni oziębiającej, przenosi pod wyciąg i miesza w ciągu około dwóch dni, do uzyskania całkowitej redukcji. Roztwór odparowuje się i pozostawia pod zmniejszonym ciśnieniem w ciągu kilku godzin.

169 842

W tej reakcji otrzymuje się typowo około 95% ochronionego aldehydu (aldehydu 2butyrylooksyoctowego) w postaci bezbarwnego do żółtego, przezroczystego roztworu.

c) Cyklizacja aldehydu z kwasem merkaptooctowym

1,0 równoważnik aidehydh rozpuszczono w t oluenie i otrzymano 0,80-0,85 M roz twór w kolbie zaopatrzonej w nasadkę Deana-Starka. Następnie dodano 1,1 równoważnika kwasu tioglikolowego i mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia. Wodę usuwano azeurrupowo w nasadce. Reakcja została zakończona po 3 godzinach. Mieszaninę pozostawiono do ochłodzenia do pokojowej temperatury, po czym przemyto dwukrotnie równymi objętościami nasyconego roztworu wodnego NaHCO 3 i jednokrotnie wodą, suszono nad MgSO 4 i Noritem, przesączono pod zmniejszonym ciśnieniem przez celit i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pierwszy roztwór NaHCO3 z przemycia ekstrahowano eterem etylowym, ekstrakt przemyto wodą, suszono nad MgSO 4 i Noritem®, przesączono próżniowo przez ziemię krzemionkową celite® i odparowano razem z innym organicznym materiałem z roztworu toluenowego. Połączony materiał pozostawiono pod zmniejszonym ciśnieniem w ciągu nocy.

W reakcji otrzymuje się typowo z 90% wydajnością 2-(butyryIooksy)-metyIo-5-keto-1,3-oksaPolan.

d) Redukcja laktonu i przekształcenie w octan

W trójszyjnej kolbie wyposażonej w mieszadło mechaniczne 1,00 równoważnik 25butyrylo5 oksymetylo-5-keto-1,3-oksatiolanu rozpuszcza się w obojętnej atmosferze w bezwodnym THF, otrzymując 0,23 M roztwór. Roztwór mieszano i ochłodzono do temperatury 0°C, po czym dodano: przez rurkę 1,1 równoważnika 1,0 M roztworu Li^-BuOjaAlH w THF. Redukcja zaszła całkowicie po upływie około trzech godzin, zgodnie z TLC, w której stosowano do rozwijania mieszaninę 2:1 eteru etylowego i heksanu, a do wywoływania aldehyd anyżowy.

Do mieszaniny dodano około 10 równoważników świeżo destylowanego Ac2O i całość mieszano w ciągu 2 dni, otrzymując acetylowany produkt. Reakcję zatrzymano dodając nasycony roztwór NaHCO 3 i mieszano w ciągu nocy. Roztwór odparowano i mieszano w ciągu nocy z nową porcją roztworu NaHCO3, po czym ekstrahowano eterem etylowym. Ekstrakt przemyto starannie nasyconym roztworem NaHCO 3 (dwukrotnie) i jeden raz wodą, suszono nad MgS(04 i preparatem Nom®, przesączono próżniowo przez ziemię okrzemkową celite® i odparowano. Otrzymano produkt w postaci ciemnożółtego, przezroczystego płynu. Chromatografia gazowa (temperatura początkowa - 80°C, wstępny czas - 5 minut, przyrost temperatury - 10°C/min., końcowa temperatura - 240°C) wykazała czystość około 70%.

e) Sililowanie 5-fluorocyrozyny

5-fluorocyrozynę (1,05 równoważnika jak obliczono na podstawie acerylowanego laktolu otrzymanego w poprzednim etapie o czystości według chromatografii gazowej) sililowaao w temperaturze wrzenia z co najmniej 10 równoważnikami heksametylodisilazanu zawierającego katalityczną ilość czystego siarczanu amonowego (0,05 do 0,1 równoważnika). Reakcję prowadzono w ciągu dwóch godzin od momentu, gdy roztwór osiągnął klarowność. Kolbę dobrze zamknięto i rozpuszczalnik odparowano, stosując pompę próżniową i pomocniczy łapacz. Produkt, mający postać białego osadu, pozostawiono w ciągu nocy pod zmniejszonym ciśnieniem i stosowno następnie w reakcji sprzęgania.

i) Sprzęganie sililowanej 5-f uorocyrozyay z acetylżwanym laktolem

Do roztworu 33,86 g (0,124 mola) sililanowej 5-fluorocytozyny w 350 ml bezwodnego chlorku metylenu dodano 135,6 ml 1 m roztworu SnCL w chlorku metylenu, w atmosferze azotu. Całość mieszano w ciągu 15 minut w pokojowej temperaturze, po czym w ciągu 30 minut podano rurką do roztworu 38 g (0,113 mola) octanu laktolu w 400 ml chlorku metylenu, utrzymywanego pod azotem.

Całość mieszano w ciągu 2 godzin i za pomocą HPLC stwierdzono zakończenie reakcji. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono chlorkiem metylenu (500 ml) i zatrzymano reakcję dodając roztwór wodorotlenku amonowego. Do roztworu dodano powoli 100 ml wodorotlenku amonowego, utrzymując temperaturę poniżej 30°C. Obserwowano wypadanie białego osadu.

Całość mieszano w ciągu dalszych 30 minut, po czym podano na kolumnę z żelem krzemionkowym (o średnicy 7 cali i długości 5 cali), eluując kolejno 2 litrami chlorku metylenu, 2 litrami octanu etylu i 4 litrami mieszaniny 9:1 octanu etylu i etanolu. Zawierające pożądany produkt eluaty octanowe oraz octanowo-etanolowe połączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem.

169 842

Pozostały lepki, stały produkt przemyto 200 ml bezwodnego eteru etylowego i otrzymano 25,35 g (71%) 5'-maślanu FTC w postaci białego, stałego produktu.

Porcję 8,74 g (0,026) 5'-maślanu FTC rozpuszczono w 250 ml metanolu i dodano w pokojowej temperaturze 2,85 g (0,052 mola) metoksylanu sodowego. Całość mieszano w ciągu 1 godziny, stwierdzając za pomocą TLC zakończenie reakcji. W celu zatrzymania reakcji dodano 10 ml roztworu NH4CI, po czym odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość zaabsorbowano na 5 g żelu krzemionkowego i przepuszczno przez małą kolumnę, eluując mieszaniną 9:1 octanu etylu i etanolu. Połączone frakcje zawierające produkt odparowano i otrzymano lepki osad, który przemyto bezwodnym eterem etylowym i uzyskano 6,00 g (88%) FTC w postaci białego osadu.

Widmo 1H NMR (DMSO-d⁶): 8,18 (1H, d, He, J = 8,4 Hz), 7,81 i 7,57 (2H, szeroki sygnał, NH2), 6,12 (1H, dd, H1, J = 5,7 i 4,2 Hz), 5,40 (1H, t, OH, J = 5,7 Hz), 5,17 (1H, t, 1H4, J = 3,6 Hz), 3,74 (2H, m 2H₅), 3,41 (1H, dd, 1H₂, J = 5,7 i 11,7 Hz), 3,11 (1H, dd, 1H₂, J = 4,2 i 11,7 Hz); widmo 1³C NMR (DMSO-d⁶): 157,85 (d, J= 13,4 Hz), 15^^^^, 136,12 (d, J = 241 Hz), 126,01 (d,J = 32,6

Hz), 86,90, 86,84, 62,48, 37,07; temperatura topnienia 195-196°C.

Przykładu. Wytwarzanie fosforanów FTC

Jedno-, dwu- i trójfosforanowe pochodne FTC można otrzymywać w sposób opisany poniżej.

Jednofosforan można wytwarzać metodą opisaną przez Imai i wsp. w J. Org. Chem., 34(6), 1547-1550 (czerwiec 1989). Np., około 100 mg FTC poddaje się reakcji z około 280 pl chlorku fosforylu, mieszając w około 8 ml bezwodnego octanu etylu, w temperaturze około 0°C, w ciągu około czterech godzin. Reakcję zatrzymuje się oziębiając lodem. Fazę wodną oczyszcza się węglem aktywnym na kolumnie, eluując 5% roztworem wodorotlenku amonowego w mieszaninie 1:1 etanolu i wody. Po odparowaniu eluatu otrzymuje się sól amonową 5'-jednofosforanu FTC.

Dwufosforan można otrzymywać metodą opisaną przez Davissona i wsp. w J. Org. Chem., 52(9), 179-4^1801 (1987). Dwufosforan FTC można otrzymywać z odpowiedniego tozylanu, który wytwarza się np. poddając nukleozyd reakcji z chlorkiem tozylu w pirymidynie, w pokojowej temperaturze, w ciągu około 24 godzin. Mieszaninę reakcyjną przerabia się w zwykły sposób, np. przemywa, suszy i krystalizuje produkt.

Trójfosforan można wytwarzać metodą opisaną przez Hoarda i wsp. w J. Am. Chem. Soc., 87(8), 1785-1788 (1965). FTC poddaje się aktywowaniu (np. przekształcając w imidazolid znanymi specjalistom metodami) i następnie reakcji z pirofosforanem trójbutyloamoniowym w DMF. W reakcji otrzymuje się głównie trójfosforan nukleozydu, zawierający nieco nieprzereagowanego jednofosforanu i dwufosforanu. Mieszaninę oczyszcza się drogą chromatografii anionowymiennej na kolumnie z DEAE i izoluje trójfosforan, np. w postaci soli czterosodowej.

Wynalazek został opisany w odniesieniu do korzystnych jego odmian. Wariacje i modyfikacje sposobu według wynalazku powinny być oczywiste dla specjalistów z przedstawionego szczegółowego opisu. Wszystkie powyższe wariacje i modyfikacje wchodzą w zakres wynalazku i załączone zastrzeżenia.

pmol/ΙΟ⁰ komórek pmol/10 komórek

Czas, godzina □ FTC

Ξ FTC-MP □ FTC-DP 0 FTC-TP

FIGURA 3

FIGURh 4

Moment czasu, godziny

FIGURA 5 pmol/10° komórek

Czas, godziny

FIGURA 6

FIGURA 7

FIGURA 2

RO—' OR R = n-butyryl

OR HS^OH ,

RO

0^ .0

1. Środek redukujący

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims (1)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania Z-hyaroksymetylo-5-(5-fluorociUorynylo-1 n i,3-oksatiolanu, zanmiznay tym, że ewentualnie ochronioną 5-Cluoronztozznę poddaje się reakcji z Sit-oksatiolanem o wzorze

   1a w którym Ri- oznacza atom wodoru lub grupę chroniącą grupę hydroksylową, w tym grupę acylową, a L oznacza grupę odszczepialną, po czym odszczepia się ewentualnie obecną grupę chroniącą grupę hydroksylową.

   r. Sposbp webłwg zastrz. 1, zn^mże-mi tym , z- reakcji kcdda^ s—j kć^-oSit-nklan, który wytwarza się (i) podda-sc -eąkcji związwk o wzo me CHt = CH-CH2-OR iub związwk o wzo me ROCH2CH = CH-CHrOR, w którym R oznacza grupę ochronną, reakcji —nowania i otrzymuje się związek o wzorze

   H

   R

   1 a (ii) poddaj produko z dap u (ip ueak cji z cwa sem snmkypjoaatowyπW ytrzymuSe -ię ewiązwk o w—rze la (iii) poda3Sąs ρκχίι.^ u e tzpu («u rekuUdji i naattpnieteukcji z ji eawudmkitm Umatnwym, środkiem alkilującym lub środkiem nkl3rownajączm i otrzymuje się związek o w-czu

   1a w klóczm L —nacza grupę 3dsznzeaialeą.

   t. Sposób yyóiun ^^^urz. 2, caamieeny tymy żejmkż j-zwodniw kwak u nasboksyi3weg3 rtotote się beaw3deik 3ct3wz.

   169 842