PL169146B1

PL169146B1 - Method of isolating alpha-preprotachyquinine from recombined cells of bacterium escherichia coli

Info

Publication number: PL169146B1
Application number: PL28936791A
Authority: PL
Inventors: Elzbieta Hrabec; Zbigniew Hrabec; Grazyna Plucienniczak; Andrzej Plucienniczak; Piotr J Guga
Original assignee: Terpol Przed Farmaceutyczne Sa
Priority date: 1991-03-08
Filing date: 1991-03-08
Publication date: 1996-06-28
Also published as: PL289367A1

Abstract

Sposób izolowania i oczyszczania α-preprotachykininy z komórek zrekombinowanych bakterii Escherichia coli, znamienny tym, że komórki bakteryjne Escherichia coli, zawierające zrekombinowany plazmid pWRSPpozbawia się elementów ściany komórkowej, po czym izoluje się ciałka inkluzyjne, oczyszcza, następnie rozpuszcza sięje w 6 M roztworze mocznika, odwirowuje zanieczyszczenia i wytrąca się białko hybrydowe β-galaktozydaza x α-preprotachykinina, usuwając mocznik poprzez dializę, po czym z hybrydowego białka usuwa się fragment β-galaktozydazy poprzez kwaśną hydrolizę, podnosi pH roztworu do 5,2-5,8, a następnie przepuszcza się przez kolumnę jonowymienną wypełnioną słabym kationitem.A method of isolating and purifying α-preprotachykinin from recombinant cells Escherichia coli bacteria, characterized in that the Escherichia coli bacterial cells, containing the recombinant plasmid pWRSP devoid of cell wall elements, then the inclusion bodies are isolated, purified, then dissolved in a 6M solution urea, the impurities are centrifuged and the β-galactosidase x hybrid protein is precipitated α-preprotachykinin, removing urea by dialysis, then from the hybrid protein the β-galactosidase fragment is removed by acid hydrolysis, raising the pH of the solution to 5.2-5.8, and then passed through a weakly packed ion exchange column cation exchanger.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolowania i oczyszczania α-preprotachykininy [α-PPT] zwanej także prekursorem substancji P z komórek zrekombinowanych bakterii Escherichia coli.The present invention relates to a method for isolating and purifying α-preprotachykinin [α-PPT], also known as substance P precursor, from recombinant Escherichia coli bacteria cells.

Substancja P jest jedenastopeptydem, o następującej sekwencji aminokwasów: Arg-ProLiz-Pro-Gln-Gln-Fen-Gli-Leu-Met [M.M.Chang i wsp., J.Biol.Chem.245, 4784-4790, 1970], powodującym skurcz pozanaczyniowych mięśni gładkich i obniżającym ciśnienie krwi [U.S. von Euler, J.H.Gaddum, J.Physiol. 72, 74-87, 1931],Substance P is an eleven peptide with the following amino acid sequence: Arg-ProLiz-Pro-Gln-Gln-Phe-Gli-Leu-Met [MMChang et al., J.Biol.Chem. 245, 4784-4790, 1970], resulting in spasm of extravascular smooth and blood pressure lowering muscles [US von Euler, J. H. Gaddum, J. Physiol. 72, 74-87, 1931],

Podobnie jak endogenne związki opioidowe (endorfiny, enkefaliny) substancja P zaangażowana jest w przewodzenie bodźców bólowych [T.Hofkelt i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 3081-3085, 1977]. Badania farmakologiczne przeprowadzone na gryzoniach potwierdzają taką właśnie rolę spełnioną przez substancję P. Peptyd ten jest zdolny także do bezpośredniego modyfikowania odpowiedzi immunologicznej organizmu. Działa on jako mediator lokalnej odpowiedzi zapalnej. Powoduje rozszerzenie naczyń krwionośnych, zwiększa ich przepuszczalność. Wpływa na zlepianie się granulocytów wielojądrzastych i monocytów z komórkami oraz powoduje degranulację komórek tucznych (D.G.Payan, J.Immunol., 132, 1601-1603, 1984). Substancja P wiąże się także z receptorem chemotaktycznym granulocytów obojętnochłonnych, powodując zmianę ich orientacji i działa na nie chemotaktycznie. Oddziaływuje ona także chemotaktycznie na monocyty już przy stężeniu 10'¹³M. Dowodzi to, że substancja P jest neurotransmiterem uwalnianym przez zakończenia synaptyczne nerwów obwodowych w odpowiedzi na lokalne uszkodzenie tkanek.Like endogenous opioids (endorphins, enkephalins), substance P is involved in the conduction of pain stimuli [T.Hofkelt et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 74, 3081-3085, 1977]. Pharmacological studies carried out on rodents confirm this role played by substance P. This peptide is also able to directly modify the immune response of the organism. It acts as a mediator of the local inflammatory response. It causes the expansion of blood vessels and increases their permeability. It affects the adhesion of multinucleated granulocytes and monocytes with cells and causes degranulation of mast cells (DGPayan, J.Immunol., 132, 1601-1603, 1984). Substance P also binds to the chemotactic receptor of neutrophils, changing their orientation and has a chemotactic effect on them. It also acts on monocyte chemotactic already at 10 ^'13 M. This demonstrates that Substance P is a neurotransmitter released by synaptic nerve end in response to local tissue damage.

Wiadomo, że substancja P jest jednym z wielu peptydów należących do rodziny tachykinin (neurokinin) (V.Erspamer, Trends Neurosci, 4, 267-269, 1981). Tachykininy są rodziną peptydów spokrewnionych strukturalnie, funkcjonujących jako neurotransmitery i neuromodulatory. U ssaków występuje pięć neuropeptydów zaliczanych do tachykinin. Są to: substancja P (SP), neurokinina A (NKA), neurokinina B (NKB), neuropeptyd K (NPK) i neuropeptyd γ (NPy). Wszystkie poza neurokininą B są produktami jednego genu zwanego genem SP, a powstałą w wyniku zróżnicowanej obróbki potranskrypcyjnej i potranslacyjnej. Gen SP ma wielkość około 1 xl0³ par zasad i zawiera siedem eksonów różniących się długością. W wyniku transkrypcji tego genu i następującej po niej obróbki potranskrypcyjnej powstają trzy rodzaje mRNA: α-PPT mRNA, β-PPT mRNA i γ-PPT mRNA (PPT - preprotachykinina). α-PPT mRNA jest pozbawiony eksonu szóstego, który koduje neurokininę A, β-PPT mRNA posiada wszystkie siedem eksonów, a γ-PPT mRNA nie ma eksonu czwartego, kodującego N-końcową część neuropeptydu K.Substance P is known to be one of many peptides belonging to the tachykinin (neurokinin) family (V. Erspamer, Trends Neurosci, 4, 267-269, 1981). Tachykinins are a family of structurally related peptides that function as neurotransmitters and neuromodulators. In mammals, there are five tachykinin neuropeptides. They are: substance P (SP), neurokinin A (NKA), neurokinin B (NKB), neuropeptide K (NPK) and neuropeptide γ (NPy). All but neurokinin B are the products of a single gene, called the SP gene, and are produced by various posttranscriptional and posttranslational processing. SP gene has a size of about 1 xl0 ³ base pairs and contains the seven exons of different lengths. As a result of the transcription of this gene and subsequent post-transcriptional processing, three types of mRNA are produced: α-PPT mRNA, β-PPT mRNA and γ-PPT mRNA (PPT - preprotachykinin). α-PPT mRNA lacks exon six which encodes neurokinin A, β-PPT mRNA has all seven exons, and γ-PPT mRNA lacks exon four, which encodes the N-terminal part of neuropeptide K.

169 146169 146

Powstająca w wyniku translacji α-PPT mRNA α-preprotachykinina (α-PPT) ma masę cząsteczkową 13 109 daltonów i zawiera na swym N-końcu sekwencję sygnałową. Obróbka λ 1 »-» λ» r « ·*» «» 1515' I ’ rrn rłpl rl-7i TT7 z-* f~5- z\ 1 rr « λ» t~r r\ « t-*r^/^ł*> rbn rib o·· τ z·» '-T**» « t — ·» T puLŁansKicyjna utn i zacnouM w ulatacie G»vigivgv i p^vi±vtzyΛ.ανπ &y uapiy vłu)vu ucuiuuu, po uprzednim skierowaniu prekursora przez peptyd sygnałowy do retikulum endoplazmatycznego. Odcięcie peptydu sygnałowego zachodzi po alaninie znajdującej się w pozycji 19. Usuwany jest hydrofobowy fragment odpowiedzialny za transport α-PPT przez błonę retikulum endoplazmatycznego.The translated α-PPT mRNA α-preprotachykinin (α-PPT) has a molecular weight of 13,109 Daltons and contains a signal sequence at its N-terminus. Machining λ 1 »-» λ »r« · * »« »1515 'I' rrn rłpl rl-7i TT7 z- * f ~ 5- z \ 1 rr« λ »t ~ rr \« t- * r ^ / ^ ł *> rbn rib o ·· τ z · »'-T **» «t - ·» T puLANSKicy utn i zacnouM in ulatacie G »vigivgv ip ^ vi ± vtzyΛ.ανπ & y uapiy vłu) vu ucuiuuu, after the targeting of a precursor by a signal peptide to the endoplasmic reticulum. Cleavage of the signal peptide occurs after the alanine at position 19. The hydrophobic fragment responsible for the transport of α-PPT across the endoplasmic reticulum membrane is removed.

Jedynym znanym, biologicznie aktywnym peptydem powstającym z α-PPT jest substancja P. Sekwencja substancji P stanowiąca część α-PPT otoczona jest aminokwasami zasadowymi. Po N-końcowej stronie występują dwie następujące po sobie reszty arginylowe, a po C-końcowej reszta lizylowa i arginylowa. Wiązania peptydowe utworzone przez te aminokwasy są przecinane przez endopeptydazę specyficzną dla aminokwasów zasadowych. W wyniku działania tego enzymu cząsteczki α-PPT wycięty zostaje dwunastopeptyd, który po enzymatycznym odszczepianiu C-końcowej reszty glicylowej i amidacji metioniny przekształca się w aktywną substancję P.The only known biologically active peptide formed from α-PPT is substance P. The sequence of substance P being part of α-PPT is flanked by basic amino acids. There are two consecutive arginyl residues on the N-terminal side and a lysyl and arginyl residue on the C-terminal side. The peptide bonds formed by these amino acids are cleaved by a basic amino acid specific endopeptidase. As a result of the action of this enzyme of the α-PPT molecule, a twelve peptide is excised, which, after enzymatic cleavage of the C-terminal glycyl residue and methionine amidation, is transformed into the active substance P.

Na matrycy tego samego mRNA może powstawać kilka różnych peptydów o aktywności biologicznej. Proces ten dokonuje się na etapie przekształceń potranslacyjnych powstałych prekursorów preprotachykinin. I tak przykładowo, cząsteczka białka prekursorowego - β-preprotachykinina przekształca się w trzy różne związki biologicznie aktywne: substancję P, neurokininę A i neuropeptyd K.Several different peptides with biological activity can be formed on the template of the same mRNA. This process takes place at the stage of post-translational transformations of the resulting pre-protachykinin precursors. For example, the precursor protein molecule - β-preprotachykinin is transformed into three different biologically active compounds: substance P, neurokinin A and neuropeptide K.

Ciekawa zależność ma miejsce między neurokininą A a neuropeptydem K. Otóż neurokinina A stanowi C-końcowy fragment neuropeptydu K, oba związki wykazują aktywność biologiczną. Możliwości takie, w odniesieniu do grupy tachykinin odkryto zupełnie niedawno (koniec lat osiemdziesiątych). W związku z tym nie można wykluczyć, że również inne produkty rozpadu prekursorów tachykinin mogą wykazywać aktywność biologiczną. Do tej pory nie istniały możliwości prowadzenia badań w tym kierunku, ponieważ proces przekształcenia prekursora substancji P w czynną substancję P zachodzi bardzo szybko po syntezie i nie ma możliwości wyizolowania z komórki eukariotycznej białka prekursorowego. Białko otrzymywane sposobem według wynalazku może niewątpliwie przyczynić się do poszerzenia wiedzy w tej dziedzinie.An interesting relationship takes place between neurokinin A and neuropeptide K. Well, neurokinin A is the C-terminal fragment of neuropeptide K, both compounds show biological activity. Such possibilities in relation to the tachykinin group were discovered quite recently (late 1980s). Therefore, it cannot be ruled out that other decomposition products of tachykinin precursors may also show biological activity. Until now, it has not been possible to conduct research in this direction because the process of converting the precursor substance P into the active substance P takes place very quickly after synthesis and it is not possible to isolate the precursor protein from the eukaryotic cell. The protein obtained by the method according to the invention may undoubtedly contribute to the expansion of knowledge in this field.

Poza tym, bardzo słabo poznane są enzymy proteolityczne uwalniające z prekursorów aktywne tachykininy i dysponowanie białkiem otrzymanym sposobem według wynalazku daje możliwość wyizolowania i zbadania tych enzymów.Moreover, the proteolytic enzymes releasing active tachykinins from precursors are very poorly known and the availability of the protein obtained by the method according to the invention makes it possible to isolate and study these enzymes.

Gen kodujący prekursor substancji P wprowadzono do bakterii Escherichia coli, szczep DH5, wykorzystując wektor plazmidowy pwRSP. Konstrukcja wektora plazmidowego została tak zaplanowana, że zasady kodujące α-preprotachykininę łączą się z fragmentem genu βgalaktozydazy i pozostają pod kontrolą jej promotora. Efektem ekspresji jest białko hybrydowe zawierające N-końcowy fragment β-galaktozydazy oraz prekursor substancji P. Na styku obu genów występuje krótki łącznik kodujący asparaginę i następującą po niej prolinę. Wiązanie Asp-Pro jest wiązaniem niezwykle kwasolabilnym i taki układ aminokwasów nie występuje w cząsteczce α-preprot.achykininy. Umożliwia to (po wyodrębnieniu z komórek E.coli hybrydowego białka) odcięcie fragmentu β-galaktozydazy i uwolnienie prekursora substancji P. Białko hybrydowe gromadzi się w komórkach Escherichii coli w postaci ziarnistości zwanych ciałkami inkluzyjnymi.The gene encoding the substance P precursor was introduced into Escherichia coli, strain DH5, using the plasmid vector pwRSP. The construction of the plasmid vector was designed such that the bases encoding α-preprotachykinin bind to the β-galactosidase gene fragment and remain under the control of its promoter. The expression results in a hybrid protein containing the N-terminal fragment of β-galactosidase and a precursor of substance P. At the junction of both genes there is a short linker encoding asparagine and the following proline. The Asp-Pro bond is an extremely acid labile bond and such a system of amino acids is absent in the α-preprotachikinin molecule. This allows (after isolating the hybrid protein from E.coli cells) to cut off the β-galactosidase fragment and release the precursor of substance P. The hybrid protein accumulates in Escherichii coli cells in the form of granules called inclusion bodies.

Otrzymywanie prekursora substancji P przebiega poprzez etap pośredni izolowanie sferoplastów, podczas gdy znane sposoby izolowania ciałek inkluzyjnych uwzględniają otrzymywanie tych ziarnistości bezpośrednio z zawiesiny hodowli bakteryjnej po uprzedniej dezintegracji ściany i błony komórkowej. (T.R.J.Harris i wsp., Mol. Biol. Med. 3, 279-287, 1986). Postępowanie sposobem według wynalazku z jednej strony umożliwia otrzymanie ciałek inkluzyjnych wolnych od zanieczyszczeń elementami ściany komórkowej, a ponadto minimalizuje się degradację białka będącego przedmiotem zainteresowania zachodzącą w wyniku uwolnienia bakteryjnych proteaz periplazmatycznych. Otrzymane sferoplasty poddaje się następnie lizie przy użyciu niejonowego detergentu, na przykład Tritonu Χ-100 i oczyszcza uwolnione w ten sposób ciałka inkluzyjne. Ciałka inkluzyjne oczyszcza się stosując wirowanie zawiesiny tych ziarnistości przez roztwór o gęstości 1,θ8ΐ-1,118 g/cm³. Na tym etapie· na granicy faz pozostajeThe preparation of the substance P precursor proceeds through the intermediate step of isolating spheroplasts, while known methods for isolating inclusion bodies involve obtaining these granules directly from the bacterial culture suspension after prior disintegration of the cell wall and membrane. (TRJ Harris et al., Mol. Biol. Med. 3, 279-287, 1986). The procedure according to the invention, on the one hand, makes it possible to obtain inclusion bodies free from contamination with cell wall elements and, moreover, minimizes the degradation of the protein of interest due to the release of bacterial periplasmic proteases. The resulting spheroplasts are then lysed with a non-ionic detergent, for example Triton Χ-100, and the thus released inclusion bodies are purified. The inclusion bodies are purified by centrifuging the suspension of these granules through a solution with a density of 1. 8ΐ-1.118 g / cm ³ . At this stage, the interface remains

169 146 większość zanieczyszczających białek bakteryjnych, podczas gdy oczyszczone ciałka inkluzyjne zbierają się na dnie probówki wirówkowej. W kolejnym etapie ciałka inkluzyjne otrzymane sposobem według wynalazku rozpuszcza się w 6 M moczniku, odwirowuje nierozpuszczalne zanieczyszczenia, po czym wytrąca się białko hybrydowe przez usunięcie mocznika na drodze dializy. Z białka hybrydowego uwalnia się α-preprotachykininę poprzez rozszczepienie wiązań Asp-Pro w środowisku kwaśnym. W metodzie według wynalazku wyodrębnia się następnie α -preprotachykininę poprzez podniesienie pH do wartości 5,2-5,8. W tych warunkach znaczna część białek wytrąca się podczas gdy α-preprotachykinina wraz z nielicznymi białkami zanieczyszczającymi pozostaje w roztworze. Finalne oczyszczenie α-preprotachykininy przeprowadza się metodą chromatografii jonowymiennej na słabym kationicie.Most of the contaminating bacterial proteins, while the purified inclusion bodies collect at the bottom of the centrifuge tube. In the next step, the inclusion bodies obtained by the method according to the invention are dissolved in 6 M urea, the insoluble impurities are centrifuged, and then the hybrid protein is precipitated by removing the urea by dialysis. Α-preprotachykinin is released from the hybrid protein by cleavage of Asp-Pro bonds in an acidic environment. The method according to the invention then isolates α-preprotachykinin by raising the pH to a value of 5.2-5.8. Under these conditions, a significant proportion of the proteins precipitates while the α-preprotachykinin, along with a few contaminating proteins, remains in solution. Final purification of the α-preprotachykinin is performed by weak cation exchange chromatography.

Otrzymane w ten sposób białko jest czyste chromatograficznie oraz elektroforetycznie. Jego tożsamość została potwierdzona przez analizę sekwencji pierwszych 20 reszt aminokwasowych. Ponadto, metodą immunoblottingu wykazano również, że otrzymany prekursor substancji P nie jest zanieczyszczony innymi białkami bakteryjnymi (H.Towbin, J.Gordon, J. Immunol., 72, 313-340, 1984).The protein obtained in this way is pure chromatographically and electrophoretically. Its identity was confirmed by sequence analysis of the first 20 amino acid residues. Moreover, the immunoblotting method also showed that the obtained substance P precursor was not contaminated with other bacterial proteins (H. Towbin, J. Gordon, J. Immunol., 72, 313-340, 1984).

PrzykładExample

Opisano poniżej, tok postępowania preparaty wnego:The preparation procedure is described below:

7. Hodowla kultury bakterii Escherichia coli, szczep DH5 produkujących fuzyjne białko β-galaktozydaza x a-preprotachykinina7. Culture of Escherichia coli bacteria, strain DH5 producing the fusion protein β-galactosidase x a-preprotachykinin

Hodowlę bakterii prowadzono w płynnej pożywce LB (Luria-Bertoni) przez 15-21 godzin w temperaturze 37°C.Bacteria were grown in liquid LB medium (Luria-Bertoni) for 15-21 hours at 37 ° C.

2. Izolowanie sferoplastów2. Isolating spheroplasts

Pożywkę zawierającą namnożone bakterie ochłodzono do temperatury +4°C i odwirowano. Osad bakterii zawieszono w medium zawierającym 5 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,1 M CaCF i inkubowano przez 10 minut w temperaturze 0°C. Po powtórnym odwirowaniu osad zawieszono w identycznym medium i inkubowano przez 40 minut w temperaturze 0°C. Po kolejnym odwirowaniu osad zawieszono w roztworze o składzie: 0,1 M bufor fosforanowy, pH 6,2 (NaH2PO4Na2HPO4), 10 mM glicerol i 0,05% lizozym jaja kurzego. Zawiesinę inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej, po czym schłodzono do temperatury 0°C, dodano wersenian dwusodowy do końcowego stężenia 1 mM i odwirowano. Osad zawieszono w medium zawierającym 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM wersenian dwusodowy i inkubowano przez 5 minut w temperaturze 0°C po czym odwirowano otrzymane sferoplasty komórek Escherichia coli.The medium containing the multiplied bacteria was cooled to + 4 ° C and centrifuged. The bacterial pellet was suspended in a medium containing 5 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0.1 M CaCF and incubated for 10 minutes at 0 ° C. After re-centrifugation, the pellet was suspended in an identical medium and incubated for 40 minutes at 0 ° C. After another centrifugation, the pellet was suspended in a solution composed of: 0.1 M phosphate buffer, pH 6.2 (NaH2PO4Na2HPO4), 10 mM glycerol and 0.05% hen egg lysozyme. The suspension was incubated for 10 minutes at room temperature, then cooled to 0 ° C, disodium edetate was added to a final concentration of 1 mM and centrifuged. The pellet was suspended in a medium containing 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM disodium edetate and incubated for 5 minutes at 0 ° C, followed by centrifugation of the obtained Escherichia coli cell spheroplasts.

3. Izolowanie ciałek inkluzyjnych3. Isolation of inclusion bodies

Osad sferoplastów poddano lizie w roztworze zawierającym 50 mM Tris-HCl, pH 8,0,10 mM wersenian dwusodowy, 10 mM β-merkaptoetanol, sonikując zawieszony osad za pomocą generatora ultradźwięków pięciokrotnie w ciągu 1 minuty. Po odwirowaniu zawiesiny przy 35 000xg otrzymano osad zawierający ciałka inkluzyjne zanieczyszczone białkami bakteryjnymi.The spheroplast pellet was lysed in a solution containing 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM disodium edetate, 10 mM β-mercaptoethanol, sonicating the suspended pellet with an ultrasound generator five times for 1 minute. After centrifuging the suspension at 35,000 × g, a pellet containing inclusion bodies contaminated with bacterial proteins was obtained.

4. Oczyszczanie ciałek inkluzyjnych i otrzymywanie białka hybrydowego4. Purification of inclusion bodies and obtaining a hybrid protein

Osad ciałek inkluzyjnych zawieszono w niewielkiej ilości 10 mM buforu Tris-HCl, pH 8,0, nawarstwiano na 25% roztwór sacharozy i odwirowano w ciągu 20 minut przy 18 000xg. Część zanieczyszczeń zatrzymuje się na granicy faz między buforem a roztworem sacharozy, natomiast ciałka inkluzyjne osadzają się na dnie probówki. Otrzymane ciałka inkluzyjne rozpuszczono w 6 M roztworze mocznika zawierającym 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, po czym odwirowano nierozpuszczalne zanieczyszczenia. Supernatant poddano dializie przez 18 godzin wobec wody. Wytrącone białko hybrydowe odwirowano.The inclusion body pellet was suspended in a small amount of 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0, layered on a 25% sucrose solution and centrifuged for 20 minutes at 18,000 × g. Some of the impurities are retained at the interface between the buffer and the sucrose solution, while the inclusion bodies are deposited at the bottom of the test tube. The obtained inclusion bodies were dissolved in 6 M urea solution containing 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, and the insoluble impurities were centrifuged. The supernatant was dialyzed for 18 hours against water. The precipitated hybrid protein was centrifuged.

5. Rozszczepienie hybrydowego białka β-galaktozydaza x α-preprotachykinina5. Cleavage of the hybrid protein β-galactosidase x α-preprotachykinin

Białko hybrydowe poddano 42 godzinnej hydrolizie w roztworze 75% kwasu mrówkowego, w temperaturze 37°C. Nadmiar kwasu mrówkowego usuwano na wyparce próżniowej. Po odparowaniu próbki do niewielkiej objętości rozcieńczano ją wodą i odparowano ponownie powtarzając tę procedurę aż do osiągnięcia pH około 4,0.The hybrid protein was hydrolysed for 42 hours in a solution of 75% formic acid at 37 ° C. The excess formic acid was removed in a vacuum evaporator. After the sample was evaporated to a small volume, it was diluted with water and evaporated again by repeating this procedure until the pH was about 4.0.

6. Wyodrębnienie α-preprotachykininy6. Isolation of α-preprotachykinin

Do próbki dodano dejonizowany mocznik do końcowego stężenia 4 Ma następnie doprowadzono pH preparatu do wartości 5,8 przy pomocy Na2HPO4. W tych warunkach wytrąca się osad zawierający znaczne ilości zanieczyszczających białek wysokocząsteczkowych. Wytrącony osad odwirowano przy 30 000xg.Deionized urea was added to the sample to a final concentration of 4M, then the formulation pH was adjusted to 5.8 with Na2HPO4. Under these conditions, a precipitate containing significant amounts of contaminating high molecular weight proteins is formed. The precipitate formed was centrifuged at 30,000 × g.

GCcySć£Zw~ii£ £L-pr€prGtCichyklTliiTyGCcySć £ Zw ~ ii £ £ L-pr € prGtCichyklTliiTy

W kolejnym etapie przeprowadzono chromatografię jonowymienną supernatantu na karboksymetylocelulozie CM 52 w gradiencie stężenia NaCl 0-0,2 M. Eluent zawierał 10 mM bufor 5 fosforanowy, pH 5,8 oraz 4 M mocznik. Zbierano frakcje o objętości 2 ml, przy szybkości przepływu 20 ml na godzinę. W tych warunkach prowadzenia chromatografii prekursor substancji P eluuje się w trzecim szczycie chromatograficznym.In the next step, ion-exchange chromatography of the CM 52 carboxymethylcellulose supernatant was performed with a NaCl concentration gradient of 0-0.2 M. The eluent contained 10 mM phosphate buffer, pH 5.8 and 4 M urea. 2 ml fractions were collected at a flow rate of 20 ml per hour. Under these chromatographic conditions, the substance P precursor elutes from the third chromatographic peak.

169 146169 146

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz.Publishing Department of the Polish Patent Office of the Republic of Poland Circulation 90 copies

Cena 2,00 złPrice PLN 2.00

Claims

Patent claims

1. The method of isolating and purifying α-preprotachykinin from recombinant Escherichia coli cells, characterized in that Escherichia coli bacterial cells containing the recombinant pWRSP plasmid are stripped of cell wall elements, and then inclusion bodies are isolated, purified, and then dissolved in 6 M urea solution, centrifuging the impurities and the hybrid protein β-galactosidase x α-preprotachykinin is precipitated, removing urea by dialysis, then the β-galactosidase fragment is removed from the hybrid protein by acidic hydrolysis, the pH of the solution is raised to 5.2-5.8 and then passed through an ion-exchange column packed with weak cation exchanger.

2. The method according to p. The method of claim 1, wherein the inclusion bodies are purified by centrifugation through a solution with a density of 1.081-1.118 g / cm ³ .