PL168032B1 - Sposób otrzymywania enzymów celulolitycznych - Google Patents

Abstract

1. Sposób otrzymywania enzymów celulolitycznych metodą hodowli wgłębnej grzyba strzępkowego Trichodermareesei w pożywce płynnej zawierającej nierozpuszczalnymateriał celulozowy oraz składniki mineralne, przy równoczesnym mieszaniu i napowietrzaniu, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się przy użyciu wyselekcjonowanego szczepu Trichoderma reesei Tch. r. 12 lub jego kolejnych mutantów, korzystnie metodą dolewową, przez 192 - 360 godzin, stosując jako źródło węgla w podłożu produkcyjnym 1,5 - 4% wagowych celulozy pochodzącej z surowca roślinnego pozbawionego pentozanów poprzez przeprowadzenie ich w lotne pochodne, korzystnie furfural, oraz ewentualnie częściowo zdelignifikowanego.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania enzymów celulolitycznych metodą hodowli wgłębnej przez hodowlę grzyba strzępkowego z rodzaju Trichoderma reesei, w podłożu z odpadami pochodzenia roślinnego zawierającymi celulozę.

Biosynteza enzymów celulolitycznych zachodzi podczas hodowli grzybów lub bakterii w podłożu stałym lub ciekłym zawierającym celulozę jako źródło węgla, składniki mineralne i substancje organiczne stymulujące wzrost mikroorganizmów.Do drobnoustrojów wytwarzających enzymy celulolityczne należą między innymi: Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Aspergillus niger, Fusarium solani, Penicillum funiculosum, Sporotrichum pulverulentum, Clostridium thermocellum. Najczęściej stosowanymi mikroorganizmami do otrzymywania enzymów celulolitycznych są różne szczepy Trichoderma reesei, np. z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4472504 znane jest stosowanie Trichoderma reesei MCG80, a z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4634670 znana jest hodowla grzybów Trichoderma reesei PC-1-4, PC-3-7, X30 i X31. Szczepy Trichoderma reesei otrzymane metodami mutagenizacji są własnością twórców.

Efektywność procesu otrzymywania enzymów celulolitycznych zależy od doboru mikroorganizmu i od dobranego dla niego sposobu hodowli.

W piśmiennictwie światowym dotyczącym biosyntezy enzymów celulolitycznych przez szczepy- Trichoderma reesei, podawane są bardzo różne informacje odnośnie aktywności i produktywności enzymów. W artykule przeglądowym Fungal cellulolytic enzyme production: A review, Persson i in. /Process Biochemistry 1991 r., t.26, Nr 2, s.65-74/ podano, że w zależności od rodzaju mutanta Trichoderma reesei, stosowanego źródła węgla w podłożach /w tym czyste preparaty celulozowe, np. mikrokrystaliczna celuloza/, warunków i metody hodowli, aktywność enzymów zmienia się w zakresie od 0,2 do 25 FPU/ml filtratu. Istnieją sporadyczne przykłady wyników odbiegających od powyższych wartości.

168 032

Znane są sposoby stosowania i przygotowywania różnych surowców roślinnych przydatnych w biosyntezie enzymów celulolitycznych zastępujących uprzednio używaną, drogą celulozę mikrokrystaliczną.

Z publikacji Peitersena Production of cellulase and protein from barley straw by Trichoderma viride/Biotechnol. Bioeng. 17:361., 1975/ znane jest stosowanie do hodowli szczepu Trichoderma, słomy jęczmiennej uprzednio traktowanej ługiem sodowym w temperaturze 121°C. W efekcie uzyskano aktywność enzymatyczną wynoszącą 0,28 FPU/ml.

Do biosyntezy enzymów celulolitycznych stosuje się też odpady z kolb kukurydzy traktowane uprzednio ługiem sodowym w podwyższonej temperaturze. Uzyskano aktywność cieczy po hodowli odpowiedniego szczepu Trichoderma reesei na poziomie 2,0 FPU/ml. /Tangnu Enhanced production of cellulase... Biotechnol. Bioeng. 23: 1837, 1981/.

Z publikacji Chahal Production of cellulase complex by Trichoderma /Biomass 2: 127, 1982/ znane jest stosowanie jako głównej pożywki dla grzybów, parowanego drewna topolowego. Efekty biosyntezy enzymów zależały od temperatury i czasu parowania surowca. Maksymalną aktywność enzymów 1,1 - 1,3 FPU/ml osiągnięto dla temperatur)' 210 - 200°C.

Znane są efekty stosowania w procesie biosyntezy enzymów celulolitycznych, siarczynowej pulpy papierowej, gdzie uzyskano aktywność enzymów na poziomie 2,0 FPU/ml, oraz stosowanie słomy pszennej zaimpregnowanej 3% ługiem sodowym, a następnie parowanej w temperaturze 180°C, gdzie uzyskano aktywność celulolityczną 1,7 FPU/ml /Doppelhauer i inn. The use of lignocellulosic wastes for production of cellulase by Trichoderma Appl. Microbiol. 26: 485, 1987/.

W pracach polskich /Podgórska i inn. Wykorzystanie słomy pszennej i trocin drzewnych do biosyntezy celulaz przez mutanty Trichoderma reesei Biotechnologia 2/12, 44, 1991/, publikowane są wyniki zastosowania parowanych w temperaturze 200°C, trocin bukowych i sosnowych oraz słomy pszennej, do produkcji enzymów celulolitycznych. Uzyskano w różnych wariantach doświadczeń aktywności w przedziale 0,13 -3,4 FPU/ml. Natomiast Szczodrak, stosując podobnie obrabianą słomę pszenną, dla innego szczepu Trichoderma reesei, uzyskał aktywności w przedziale 0,4 - 0,6 FPU/ml /Szczodrak J. Production of cellulases and xylanases by Trichoderma reesei F-522 on pretreated wheat straw Acta Biotechnology, 1988, t.8, Nr 6, s. 509-515/.

Uruchomienie produkcji enzymów celulolitycznych w Polsce wiąże się z potrzebą uzyskania własnego szczepu i własnej technologii. Obecnie wysokie koszty produkcji enzymów, związane w głównej mierze z kosztami surowców celulozowych, inspirują do prowadzenia poszukiwań w kierunku wykorzystania tanich źródeł węgla i tanich metod obróbki surowców.

Celem wynalazku jest opracowanie ekonomicznego sposobu otrzymywania enzymów celulolitycznych przez dobór szczepu Trichoderma reesei i warunków jego hodowli oraz wykorzystanie tanich roślinnych surowców celulozowych.

Nieoczekiwanie okazało się, że do otrzymywania enzymów celulolitycznych można zastosować jako źródło węgla dla wyodrębnionego szczepu Trichoderma reesei, surowiec celulozowy jak w sposobie według wynalazku, uzyskując przy tanich kosztach wytwarzania, wysokie aktywności enzymatyczne w cieczy.

Istota wynalazku polega na tym, że prowadzi się hodowlę przy użyciu wyselekcjowanego szczepu Trichoderma reesei Tch. r. 12 lub jego kolejnych mutantów, korzystnie metodą dolewową, przez 192 - 360 godzin, stosując jako źródło węgla w podłożu produkcyjnym 1,5 - 4% wagowych celulozy pochodzącej z surowca roślinnego pozbawionego pentozanów przez przeprowadzenie ich w lotne pochodne, korzystnie furfural, oraz ewentualnie częściowo zdelignifikowanego.

W sposobie według wynalazku począwszy od 40 do 60 godziny hodowli, podłoże uzupełnia się nowymi składnikami pokarmowymi zawierającymi surowiec celulozowy, sole mineralne, pepton i mikroelementy. Świeże podłoże dodaje się z częstotliwością od 3 do 8 godzin.

Sposób według wynalazku polega również na tym, że surowiec roślinny stanowią odpady z roślin jednorocznych lub wieloletnich pozbawione pentozanów, korzystnie odpady po produkcji furfuralu. Ewentualną częściową delignifikację tego surowca prowadzi się metodą parowa4

168 032 nia, korzystnie w temperaturze 110 - 120°C, z dodatkiem katalizatorów, korzystnie ługu sodowego lub siarczanów sodu lub siarczynów sodu.

Szczep grzybowy Trichoderma reesei Tch. r. 12 został otrzymany w Instytucie Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w wyniku mutagenezy szczepu dzikiego Trichoderma reesei Tch. r./4. Zastosowano metodę wielostopniowej mutagenezy, w której wykorzystano działanie na zarodniki grzybowe, kolejno promieni UV, N-metyl-N-nitro-N-nitrozoguanidyny /MNNG/, promieni UV oraz promieni UV i MNNG łącznie. Mutant Trichoderma reesei Tch. r. 12 wytwarza enzymy celulolityczne w warunkach hodowli wgłębnej w podłożu ciekłym, zawierającym mikrokrystaliczną celulozę lub surowce celulozowe, jako źródło węgla w podłożu. W warunkach laboratoryjnych uzyskuje się po 3 - 4 dniowej inkubacji filtrat o aktywności enzymów 2,5 FPU/ml. Kompleks enzymów celulolitycznych charakteryzuje się wysoką aktywnością endo-1,4-betaglukanazy celobiohydrolazy i ksylanazy.

Mutant Trichoderma reesei Tch. r. 12 jest organizmem mezofilnym tlenowym. Optymalną temperaturą dla wzrostu szczepu i biosyntezy enzymów jest temperatura około 30 -32°C, optymalnym pH podłoża 5,5 - 6,0.

Mutant Trichoderma reesei Tch. r. 12 wytwarza na podłożu brzeczkowo-agarowym i ziemniaczano-glukozowo-agarowym delikatną białą grzybnię, która w 5 - 7 dniu hodowli pokrywa się masą konidiów barwy żółto-zielonej. Konidia mają kształt szeroko-owalny lub kulisty. Powstają na typowych dla rodzaju Trichoderma fialidach. Wielkość konidiów jest zróżnicowana i waha się w granicach: 2,1 - 4,2 x 2 - 3,7 pm.

Mutant Trichoderma reesei Tch. r. 12 wytwarza na podłożu brzeczkowo-agarowym, ziemniaczano-glukozowo-agarowym oraz na podłożu ciekłym wg Mandels, z surowcami celulozowymi żółty barwnik. Jego obecność w podłożu ciekłym jest związana z produkcją enzymów celulolitycznych. Intensywność barwy nie jest skorelowana z aktywnością enzymów celulolitycznych.

Szczep Trichoderma reesei Tch. r. 12 znajduje się w kolekcji Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego.

Sposób według wynalazku pozwala na wykorzystanie do produkcji enzymów celulolitycznych tanich odpadowych surowców celulozowych, przy jednoczesnym uzyskaniu wysokich aktywności enzymatycznych w cieczy - powyżej 3 FPU/ml. Aktywności te są wyższe lub porównywalne z aktywnościami otrzymywanymi przy stosowaniu idealnie czystej mikrokrystalicznej celulozy. Ponadto wykorzystanie odpadów po produkcji furfuralu daje oszczędności kosztów obróbki wstępnej, w stosunku do dotychczas używanych surowców celulozowych.

Sposób według wynalazku ilustrują bliżej przykłady wykonania nie ograniczając jego zakresu.

Przykład I. Hodowlę szczepu Trichoderma reesei Tch. r. 12 prowadzono w podłożu produkcyjnym, zawierającym jako źródło węgla odpady po produkcji furfuralu ze słomy rzepakowej/ o składzie około 50% celulozy i 30% ligniny w suchej masie/. Użyte podłoże produkcyjne zawierało w 1 litrze wody wodociągowej: odpady po produkcji furfuralu ze słomy rzepakowej - 30,0g, siarczan amonowy - 3,0g, fosforan potasowy jednozasadowy - 2,0g, siarczan magnezowy uwodniony - 0,5g, chlorek wapniowy - 0,4g, mocznik - 0,3g, pepton Aminobak 1,6g, Tween 80 - 3,0g, mikroelementy /siarczan manganowy uwodniony - 0,8 mg, siarczan cynkowy uwodniony - 1,7 mg, chlorek kobaltowy uwodniony - 1,0 mg, siarczan żelazawy uwodniony - 2,5 mg/. Wartość pH podłoża była zawarta w granicach 5,8 - 6,0.

Do szczepienia podłoża produkcyjnego użyto inokulum otrzymane w wyniku około dwu-dobowej hodowli szczepu Tch. r. 12 na podłożu inokularnym na wytrząsarce w kolbach Erlenmayera. Stosowano 5% inokulum /ciecz pohodowlana z grzybnią/. Inokulum wykazywało aktywność enzymów celulolitycznych 0,2 - 0,3 FPU/ml. Ponadto w 1 litrze inokulum znajdowało się około 6g suchej masy grzybni o zawartości białka surowego około 30%.

Materiałem szczepiennym do hodowli inokulum były zarodniki Tch. r. 12 dodawane w ilości 10⁸ zarodników na 1 litr podłoża. Podłoże inokularne zawierało w 1 litrze wody destylowanej: mikrokrystaliczną celulozę /Cellulosepulver MN 300/ - 10,0g, siarczan amonowy - 4,8g, fosforan potasowy jednozasadowy - 15,0g, siarczan magnezowy uwodniony - 0,5g, chlorek wapniowy - 0,4g, mocznik - 0,3g, pepton Aminobak - 1,6g, Tween 80 - 2,0g i mikroelementy

168 032 /siarczan manganowy uwodniony - 0,8 mg, siarczan cynkowy uwodniony - 1,7 mg, chlorek kobaltowy uwodniony - 1,0 mg, siarczan żelazawy uwodniony - 2,5 mg/. Wartość pH podłoża była zawarta w granicach 5,8 - 6,0.

Proces biosyntezy enzymów celulolitycznych odbywał się w fermentorze, przy wypełnieniu fermentora podłożem produkcyjnym w około 60%. Hodowlę grzyba prowadzono w temperaturze 30°C. W czasie wzrostu szczepu Tch. r. 12, w ciągu pierwszych 3 dni wprowadzano powietrze w ilości 1 litr/litr podłoża x min., a w następnych 5 dniach - 0,5 - 0,71/1 podłoża x min. Obroty mieszadła zmieniano w zależności od stanu hodowli, w granicach 300 - 350 obr/min. W czasie całej hodowli stężenie tlenu w podłożu było wyższe niż 40%. Poczynając od 60 godziny hodowli, podłoże hodowlane uzupełniano nowymi składnikami pokarmowymi. Co 4 godziny dodawano do 1 litra podłoża wyjściowego 15 ml świeżego podłoża, zawierającego następujące składniki rozpuszczone lub zawieszone w wodzie wodociągowej: odpady po produkcji furfurolu ze słomy rzepakowej - 1,3g, siarczan amonowy - 0,45g, fosforan potasowy jednozasadowy 0,25g, siarczan magnezowy uwodniony - 0,02g, chlorek wapniowy - 0,02g, mocznik - 0,0015g, pepton Aminobak - 0,07g, Tween 80 - 0,1g i mikroelementy /siarczan manganowy uwodniony - 0,03mg, siarczan cynkowy uwodniony - 0,06 mg, chlorek kobaltowy uwodniony - 0,033 mg, siarczan żelazawy uwodniony - 0,07 mg/. W czasie biosyntezy enzymów celulolitycznych pH podłoża regulowano na poziomie 5,4 - 5,5 poprzez wprowadzanie 5% amoniaku lub 2% kwasu siarkowego. Po ośmiodniowej hodowli szczepu Tch. r. 12 ciecz oddzielono od biomasy przez sączenie na sączku Schotta. Następnie oddzieloną ciecz klarowano w dwóch etapach stosując ziemię okrzemkową. W I etapie klarowania użyto ziemi okrzemkowej Super Cell + Standard Cell, a w II etapie - Filter Cell.

Aktywność enzymatyczna w otrzymanym filtracie wynosiła 3,5 FPU/ml.

Przykładu. Hodowlę mutanta Trichoderma reesei Tch. r. 12/9 prowadzono w podłożu produkcyjnym zawierającym jako źródło węgla odpady po produkcji furfurolu z drewna iglastego /o składzie 40% celulozy i 45% ligniny w suchej masie/. Do hodowli użyto podłoże produkcyjne zawierające w 1 litrze wody wodociągowej: odpady po produkcji furfurolu z drewna iglastego - 40,0g, siarczan amonowy - 3,0g, fosforan potasowy jednozasadowy - 2,0g, siarczan magnezowy uwodniony - 0,5g, chlorek wapniowy - 0,4g, mocznik - 0,3g, pepton Aminobak 1,6g, Tween 80 - 3,0g, mikroelementy /siarczan manganowy uwodniony - 0,8 mg, siarczan cynkowy uwodniony - 1,7 mg, chlorek kobaltowy uwodniony - 1,0 mg, siarczan żelazawy uwodniony - 2,5 mg/. Wartość pH podłoża była zawarta w granicach 5,8 - 6,0.

Do szczepienia produkcyjnego użyto inokulum mutanta Tch. r. 12/9, w ilości 10%, przygotowane według sposobu podanego w przykładzie I.

Proces biosyntezy enzymów celulolitycznych i obróbkę cieczy przeprowadzono analogicznie jak w przykładzie I. Wystąpiły jedynie różnice w zawartości surowca celulozowego w świeżym podłożu, dodawanym do podłoża w czasie hodowli mutanta Tch. r. 12/9, począwszy od 60 godziny hodowli. 15 ml świeżej pożywki zawierało 1,6g odpadów po produkcji furfurolu z drewna iglastego /zamiast stosowanych w przykładzie I -1,3g odpadów po produkcji furfurolu ze słomy rzepakowej/.

Uzyskano aktywność filtratu w granicach 3,6 - 3,8 FPU/ml.

Przykład III. Hodowlę mutanta szczepu Trichoderma reesei Tch. r. 12/9 prowadzono w podłożu produkcyjnym stosując jako źródło węgla lignocelulozę pofurfuralową z drewna iglastego /zawierającą 65% celulozy i 20% ligniny/, otrzymaną w wyniku częściowej delignifikacji odpadów po produkcji furfurolu z drewna iglastego, działając ługiem sodowym dodawanym w ilości 2% w stosunku do wagi surowca. Proces prowadzono w temperaturze 110°C przez 50 minut. Do hodowli użyto podłoże produkcyjne zawierające w 1 litrze wody wodociągowej: lignocelulozę pofurfuralową z drewna iglastego - 25g, siarczan amonowy - 3,0g, fosforan potasowy jednozasadowy - 2,0g, siarczan magnezowy uwodniony - 0,5g, chlorek wapniowy 0,4g, mocznik - 0,3g, pepton Aminobak, - 1,6g, Tween 80 - 3,0g, mikroelementy /siarczan manganowy uwodniony - 0,8 mg, siarczan,cynkowy uwodniony - 1,7 mg, chlorek kobaltowy uwodniony - 1,0 mg, siarczan żelazawy uwodniony - 2,5 mg/. Wartość pH podłoża była zawarta w granicach 5,8 - 6,0.

168 032

Do szczepienia podłoża produkcyjnego użyto inokulum otrzymane w wyniku 40 godzinnej hodowli mutanta Tch. r. 12/9 w fermentorze, na podłożu inokularnym. Stosowano 10% inokulum, które wykazywało aktywność enzymów 0,5 - 0,6 FPU/ml. Ponadto w 1 litrze inokulum znajdowało się około 8g suchej masy grzybni o zawartości białka surowego około 25%.

Materiałem szczepiennym do hodowli inokulum były zarodniki mutanta Tch. r. 12/9 dodawane w ilości 10⁸ zarodników na 1 litr podłoża. Podłoże inokularne zawierało w 1 litrze wody destylowanej: lignocelulozę pofurfuralową z drewna iglastego -16,0g, siarczan amonowy - 4,8g, fosforan potasowy jednozasadowy - 15,0g, siarczan magnezowy uwodniony - 0,5g, chlorek wapniowy - 0,4g, mocznik - 0,3g, pepten Aminobak - 1,6g, Tween 80 - 2,0g i mikroelementy /siarczan manganowy uwodniony - 0,8 mg, siarczan cynkowy uwodniony - 1,7 mg, chlorek kobaltowy uwodniony - 1,0 mg, siarczan żelazawy uwodniony - 2,5 mg/. Wartość pH podłoża była zawarta w granicach 5,8 - 6,0.

Proces biosyntezy enzymów celulolitycznych prowadzono w fermentorze według metody opisanej w przykładzie I, z taką różnicą, że uzupełnianie podłoża hodowlanego nowymi składnikami pokarmowymi rozpoczęto od 40 godziny hodowli, dodając po 15 ml świeżego podłoża z częstotliwością od 3 do 8 godzin, w zależności od szybkości wykorzystywaniacelulozy przez grzyb, aby stężenie surowca celulozowego nie mogło przekroczyć 1,5% /w przeliczeniu na czystą celulozę/. Ponadto, w porównaniu z przykładem I, wystąpiły różnice w zawartości surowca celulozowego w świeżym podłożu. 15 ml świeżej pożywki zawierało 1,0g lignocelulozy pofurfuralowej z drewna iglastego, zamiast stosowanych w przykładzie I 1,3g odpadów po produkcji furfuralu ze słomy rzepakowej.

Uzyskano aktywność enzymatyczną cieczy w zakresie 4,5 - 5,0 FPU/ml.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,50 zł

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania enzymów celulolitycznych metodą hodowli wgłębnej grzyba strzępkowego Trichoderma reesei w pożywce płynnej zawierającej nierozpuszczalny materiał celulozowy oraz składniki mineralne, przy równoczesnym mieszaniu i napowietrzaniu, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się przy użyciu wyselekcjonowanego szczepu Trichoderma reesei Tch. r. 12 lub jego kolejnych mutantów, korzystnie metodą dolewową, przez 192 - 360 godzin, stosując jako źródło węgla w podłożu produkcyjnym 1,5 - 4% wagowych celulozy pochodzącej z surowca roślinnego pozbawionego pentozanów poprzez przeprowadzenie ich w lotne pochodne, korzystnie furfural, oraz ewentualnie częściowo zdelignifikowanego.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że począwszy od 40 do 60 godziny hodowli, podłoże uzupełnia się nowymi składnikami pokarmowymi zawierającymi surowiec celulozowy, sole mineralne, pepton i mikroelementy, z częstotliwością od 3 do 8 godzin.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że surowiec roślinny stanowią odpady z roślin jednorocznych lub wieloletnich pozbawione pentozanów, korzystnie odpady po produkcji furfuralu.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że częściową delignifikację surowca roślinnego pozbawionego pentozanów, prowadzi się metodą parowania, korzystnie w temperaturze 110 -120°C, z dodatkiem katalizatorów, korzystnie ługu sodowego lub siarczanów sodu lub siarczynów sodu.