PL165525B1

PL165525B1 - Sposób wytwarzania aktywnego srodka roztoczobójczego PL PL PL PL

Info

Publication number: PL165525B1
Application number: PL90299558A
Authority: PL
Inventors: Tibor Nagy; Karoly Zalai; Denes Mathe; Bela Stefko; Gyula Csokas; Arpad Hadhazy; Istvan Gebhardt
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1989-06-27
Filing date: 1990-06-26
Publication date: 1995-01-31
Also published as: GR900100491A; BG60633B1; IE902303L; HUT58474A; AU636623B2; YU122690A; CZ318390A3; CA2063442A1; ZA904973B; IE902303A1; NZ234241A; IL94870A0; PL164215B1; AU5834790A; IL94870A; CZ279037B6; GR1000890B; TR24533A; FI916076A0; WO1991000013A1

Abstract

1. Sposób wytwarzania aktywnego srodka roztoczobójczego na drodze fermentacji aero- bowej lub czesciowo anaerobowej w srodowisku cieklej pozywki zawierajacej weglowodany i azot nieorganiczny jak równiez inne dodatki znane per se, znamienny tym, ze jako szczep mikroorganizmu stosuje sie mieszanke mikropopulacje zawierajaca szczep Bacillus zlozony w Narodowej Kolekcji Mikroorganizmów Rolniczych i Przemyslowych w Budapeszcie na Weg- rzech pod numerem identyfikacyjnym OC 1083 oraz szczep bakterii Pseudomonas zlozony w tej samej Kolekcji pod numerem identyfikacyjnym OC 1086. 2. Sposób wytwarzania aktywnego srodka roztoczobójczego na drodze fermentacji aero- bowej lub czesciowej anaerobowej w srodowisku cieklej pozywki zawierajacej weglowodan i azot nieorganiczny jak równiez inne dodatki znane per se, znamienny tym, ze jako szczep mikroorganizmu stosuje sie szczep Bacillus zdeponowany w Narodowej Kolekcji M ikroorga- nizmów Rolnicznych i Przemyslowych w Budapeszcie na Wegrzech pod numerem identyfika- cyjnym OC 1083. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania aktywnego środka roztoczobójczego na drodze fermentacji aerobowej lub częściowo anaerobowej w środowisku ciekłej pożywki zawierająeej-węglowodany i azot nieorganiczny jak również inne dodatki.

Aktywny środek roztoczobójczy zawiera jako składnik aktywny brzeczkę fermentacyjną w fermentacji jednego lub dwóch szczepów bakterii zdeponowanych w Narodowej Kolekcji Mikroorganizmów Rolniczych i Przemysłowych w Budapeszcie na Węgrzech (nazywanym poniżej skrótem NCAIM) pod numerami identyfikacyjnymi 001083 i 0^1086 w dniu 25. 05. 1989 albo z fermentacji ich mieszanej mikropopulacji, w razie potrzeby brzeczki fermentacyjnej pozbawionej komórek albo koncentratu brzeczki fermentacyjnej pozbawionej komórek lub nie pozbawionej komórek albo postaci zestalonej tej brzeczki fermentacyjnej pozbawionej komórek lub nie, w razie potrzeby w postaci sterylnej, ewentualnie w mieszaninie z dodatkami. Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania środka roztoczobójczego polegającego na tym, że poddaje się fermentacji aerobowej lub częściowo anaerobowej w środowisku ciekłej pożywki zawierającej węglowodany i azot nieorganiczny jak również inne dodatki znane per se, mieszaną mikropopulację zawierającą szczep Bacillus złożony w Narodowej Kolekcji Mikroorganizmów Rolniczych i Przemysłowych w Budapeszcie na Węgrzech pod numerem identyfikacyjnym OC 1083 oraz szczep bakterii Pseudomonas złożony w tej samej kolekcji pod numerem identyfikacyjnym OC 1086, lub pojedynczy szczep Bacillus zdeponowany w tej samej kolekcji pod numerem identyfikacyjnym OC 1083. Obydwa szczepy bakterii lub ich mieszana mikropopulacja znajdują zastosowanie w rolnictwie.

Z dwóch wyżej wymienionych szczepów, szczep Bacillus zdeponowany w NCAIM pod numerem identyfikacyjnym OC 1083 jest nowy, natomiast Pseudomonas zdeponowany pod numerem identyfikacyjnym OC 1086 jest znany. Mieszana mikropopulacja obydwu bakterii jest także nowa.

Kompozycja jest stosowana, np. do ochrony przeciw pasożytniczym roztoczom żyjącym na pszczołach Apis mellifera, a zwłaszcza przeciw roztoczom Varroa jacobsoni, tj. przeciw warrozie.

Wiadomo, że Varroa jacobsoni jest roztoczem żerującym na Apis mellifera, który zazwyczaj wsysa się w czerwie pszczół przez swoją żuchwę ssącą i skórę poczwarki, jednakże najczęściej powoduje ona hemolimfę rosnących pszczół. Jako wynik tej infekcji proporcjonalnie do różnych zniekształceń postaci rozwijających się powoduje, że pszczoły przestają się rozmnażać, roić, stają się wrażliwe na inne choroby i w końcu giną.

Rozprzestrzenianie się zakażenia na wszystkie najważniejsze obszary pszczelarskie powoduje straty. Po pierwszej infekcji, straty te występują w sposób falowy na początku trzeciego i czwartego

165 525 3 roku, a następnie każdego drugiego i trzeciego roku. Wymieranie kolonii pszczół jest spowodowane w większości przypadków zatruciem.

Znanych jest wiele metod zapobiegania warrozie, a mianowicie:

1) działanie lub odymianie uli pszczół różnymi olejami eterycznymi;

2) zastosowanie różnych syntetycznych aktywnych środków organicznych, np.

-synergistycznej kombinacji piretryny z piperonylobutanolanem (Chemical Abstracts, World

Patent Index (oznaczany poniżej WPI) Acc. nr 86-212705/33),

- kombinacji zawierającej tetradifon (the Pesticide Manual wydanie 8, the British Crop Protection Council, numer rejestracyjny (oznaczone poniżej: Reg. No.) 116^29-07 i dicofolu (Reg. No. 115-32-2) (WPI Acc. nr 86-037330/06);

- wosku pszczelego zawierającego środek pasożytobójczy, np. izoporpylo-4,4'-dibromobenzylan (WPI Acc. No. 85-290439/47);

- pochodnych 1 -pirydyloformamino-2-fenoksymetylo-2-imidazoliny (WPI Acc. nr 85-224091/37);

- pochodnych 2-anilinometylo-2-imidazoliny (WPI Acc. nr 85-21891/36);

- 2-dimetylofenylimino-3-metylotiazoliny (WPI Acc. nr 84-284115/46);

- kompozycji zawierających azoksybenzen (WPI Acc. nr 82-955263/45);

- acetonowego roztworu N-metylokarbaminian arylu (WPI Acc. nr 78-823961/46);

- pokarmu i wody do picia zawierającej syntetyczne piretroidy (WPI Acc. nr 87-130028/19).

Kompozycje zawierające syntetyczne aktywne składniki organiczne stosuje się przez opylanie (atomizację) lub odymianie uli. Te, komercjalne kompozycje (jednakże nie mogą być autoryzowane w wielu krajach) stanowią je, np. Mitac EC (200 g/l) i Mitac WP (250-500 g/kg) zawierające jako składnik aktywny amitraze; oraz Ectodex EC (50 h/l) (The Pesticide Manual wyd. 8,1987; The British Grop. Protection Council, numer wejściowy 330). Ich zastosowanie jest możliwe tylko w odpowiedniej temperaturze zewnętrznej (powyżej 10°C).

Według tych samych supozycji w przypadku obróbki prowadzonej w nieodpowiednim czasie lub za często, szkodliwe produkty uboczne mogą być akumulowane w nektarze, który może być szkodliwy zarówno dla spożywających go pszczół jak i miodu;

3) zastosowanie środków wabiących jak i odstraszających (atraktantów i repelentów) WPI Acc. nr 87-129545/19 i WPI Acc. nr 84-018266/04,

4) innych metod ochrony, np.

- ochrona mechaniczna (WPI Acc. nr 84-302720/49) i

- sterylizacja roztoczy promieniami X (WPI Acc. nr,86-048673/08).

Podczas badań prowadzonych w celu ochrony pszczół przed roztoczami, nieoczekiwanie stwierdzono, że brzeczka fermentacyjna jednego z dwóch szczepów bakteryjnych zdeponowanych w NCAIM pod nr nr identyfikacyjnymi 001083 i 001086 lub brzeczka fermentacyjna ich mieszanej mikropopulacji oraz omówione wyżej brzeczki fermentacyjne pozbawione wolnych komórek albo koncentrat tych brzeczek pozbawionych lub nie pozbawionych komórek albo zestalona postać omówionych wyżej brzeczek fermentacyjnych lub tych brzeczek fermentacyjnych pozbawionych komórek (brzeczka fermentacyjna w postaci suchego proszku) są bardzo skutecznym środkiem przeciw warrozie.

Skutek ten jest bardzo dobry jeżeli kompozycje roztoczobójcze (patrz przykłady IV-XII) wytwarzane sposobem według wynalazku stosuje się przed nadejściem zimy. Ponadto, ich toksyczność wynosi około jednej dziesiątej w odniesieniu do komercjalnego środka zawierającego amitrase, a dodatkowo w przypadku wprowadzania go w postaci pokarmu lub wody skuteczność działania obserwowano w 100%. Fakt ten ma szczególne znaczenie, ponieważ karmienie lub pojenie można prowadzić w znacznie prostszy sposób. W tego typu podawaniu zwykłe życie rodzin pszczelich nie wymaga zakłóceń powodowanych odymianiem lub usuwaniem z uli. Oprócz tego, jak przedstawia przykład XXXVIII, skutku 100% nie można by osiągnąć działaniem amitrazy za pomocą rozpylania.

165 525

Rozwiązanie według wynalazku jest równocześnie nieoczekiwane ponieważ dotychczas stwierdzono, że nie uzyskano skutecznej ochrony przeciw roztoczom stosując brzeczkę fermentacyjną lub jakąkolwiek jej postać.

Ważną cechą nowego środka wytwarzanego sposobem według wynalazku jest to, że należałoby zastosować do osiągnięcia tych samych wyników znacznie więcej tradycyjnych środków roztoczobójczych.

Środek roztoczobójczy wytwarzany sposobem według wynalazku jako składnik aktywny może zawierać brzeczkę fermentacyjną lub brzeczkę fermentacyjną pozbawioną komórek albo koncentrat brzeczki fermentacyjnej lub brzeczki fermentacyjnej pozbawionej komórek albo zestaloną postać brzeczki fermentacyjnej lub brzeczki fermentacyjnej pozbawionej komórek, a która to brzeczka pochodzi z fermentacji z jednego lub dwóch szczepów bakteryjnych złożonych w Narodowej Kolekcji Mikroorganizmów Rolniczych i Przemysłowych, w Budapeszcie na Węgrzech pod numerami identyfikacyjnymi 001083 i 001086 albo ich mieszanej mikropopulacji, w razie potrzeby, w stanie sterylnym ewentualnie razem z produktami metabolizmu występującymi podczas fermentacji oraz z niewykorzystanymi pożywkami, jak również z jednym lub więcej stałym i/lub ciekłym nośnikiem korzystnie cukrem lub przemiałem naturalnych minerałów albo z obojętnym rozpuszczalnikiem takim jak woda, i w razie potrzeby substancją powierzchniowo czynną, korzystnie anionowo lub niejonowo emulgowaną lub dyspergowaną.

Sposób ochrony przeciw roztoczom, zwłaszcza roztoczom Varroa jacobsoni polega na tym, ze Apis mullifera lub ule albo ramki, w razie potrzeby, pokarm lub wodę Apis mullifera zadaje się środkiem wytwarzanym sposobem według wynalazku zawierającym jako składnik aktywny brzeczkę fermentacyjną jednego lub dwóch szczepów bakteryjnych zdeponowanych w NCAIM pod identyfikacyjnym nr OC 1083 i nr OC 1086 lub ich mieszanej mikropopulacji ewentualnie ich brzeczkę fermentacyjną pozbawioną komórek albo koncentrat takiej brzeczki fermentacyjnej pozbawionej lub nie pozbawionej komórek albo zestaloną postać ich brzeczki fermentacyjnej lub brzeczki fermentacyjnej pozbawionej komórek.

Bakterie otrzymuje się przez pobranie próbki z powierzchniowej warstwy (od głębokości 2 do 5 cm) ziemi. Co najmniej 3 próbki bierze się do każdej kolekcji sterylnymi przyrządami i przenosi do szczelnych na powietrze butli.

Szczepy wyizolowuje się z kilku gramów ziemi z zastosowaniem metody płytkowej w taki sposób, że próbkę ziemi zawieszono w blisko 100-krotnej objętości roztworu fizjologicznego odpowiedniej solanki, po czym z zawiesiny wytworzono serię rozcieńczeń z zastosowaniem solanki fizjologicznej podczas stałego mieszania. Podwielokrotność np. każdorazowo 1 ml przenoszonego pipetą do sterylnej płytki Petriego, dodano około 10-krotną objętość ciekłej pożywki (pożywka agarowa) w temperaturze 40-45°C dokładnie mieszano i pozostawiono do zestalenia.

Pożywka może mieć np. następujący skład:

a)

Ekstrakt mięsny 3,0g

Pepton 10,0 g

Agar 20,0 g

Woda destylowana 1000,0 ml pH = 2

Sterylizacja w temperaturze 120°C w czasie 20 minut; albo

b)

Ekstrakt mięsny 3,0g

Pepton 5,0g

Agar 15,0g

Woda destylowana 11)00,0 rm pH = 7,0

Sterylizacja w temperaturze 120°C w czasie 20 minut.

165 525 5

Płytki Petnego odwracano do góry dnem, a następnie przeprowadzano inkubowame w temperaturze 25-30°C w czasie kilku (2-6) dni.

Podczas inkubacji na pożywce pojawiały się kolonie. Z nich do dalszego postępowania pobierano płytki Petriego zawierające 10 do 20 kolonii. Kolonie te poddawano dalszemu propagowaniu znaną metodą. W ten sposób, otrzymywano kolonie zawierające odpowiednio homogeniczną mikropopulację o tym samym charakterze mikrobiologicznym albo mieszaną mikropopulację ewentualnie rozwiniętą spontanicznie.

Spontanicznie rozwiniętą mieszaną lub czystą mikropopulację utrzymywano na skosie

pożywki o np. następującym składzie:
Ekstrakt mięsny	l,0g
Ekstrakt drożdży	2,0^
Pepton	5,0g
Chlorek sodu	5,0g
Agar	15,0g
Woda destylowana	1000,0 ml

pH = 7,4

Sterylizacja w temperaturze 121°C w czasie 15 minut.

Świeżo inokulowane probówki inkubowano w temperaturze 32°C w czasie 48 h, a następnie przechowywano w temperaturze 4°C w lodówce.

Komórki z powierzchni tak przechowywanego skoku pożywki zawieszano w soli fizjologicznej i korzystnie inokulowano do roztworu pożywki zawierającej następujące składniki (komponenty):

Pepton 7,7g

Triton 7,8g

Ekstrakt drożdży 7,7g

Chlorek sodu 5,6g

Glukoza 1,0 g

Woda destylowana 1100,0 ml pH = 7,5

Sterylizacja w temperaturze 120°C w czasie 20 minut.

Następnie poddawano fermentacji, korzystnie w kulturze wstrząsanej w temperaturze 30-35°C w czasie 2-3 dni, ewentualnie przez stojącą kultywację (w częściowo anaerobowy sposób).

W razie potrzeby, brzeczkę fermentacyjną pozbawiono komórek, korzystnie za pomocą filtracji membranowej. Przeprowadzano badanie biologicznego, zwłaszcza roztoczobójczego działania brzeczki fermentacyjnej lub brzeczki fermentacyjnej pozbawionej komórek.

Działanie biologiczne, ewentualnie mieszanej mikropopulacji oddzielano od jej składników szczepu.

W innym przypadku mieszaną mikropopulację powtórnie propagowano na pożywce dla różnych celów diagnostycznych.

Składniki (komponenty) pożywki odpowiednie do stosowania dla różnych celów diagnostycznych są np. następujące:

a)

Pepton 20,0 g

Chlorek sodu 5,0 g

Agar 15,0 g

Woda destylowana 1000,0 ml

Defibrynowana krew 20-50 ml

Pożywkę sterylizowano w temperaturze 120°C bez regulowania wartości pH w czasie 20 minut. Przed wylaniem ochłodzono ją do 48°C, a następnie w warunkach sterylnych dodawano 2-5% objętościowych defibrynowanej krwi.

165 525

b)

Ekstrakt mięsa

Pepton

Agar

Woda destylowana Sterylna defibrynowana krew

0,3« l,0g

2,0g

100003 ml 10,0 ml

Do pożywki uprzednio roztopionej wlewano krew i chłodzono do temperatury 48°C. Następnie mieszaninę umieszczono na łaźni wodnej w temperaturze 80°C na 5 minut. Po 5 minutach pożywkę wprowadzano do sterylnych płytek Petriego.

c)

Ekstrakt mięsa

Pepton

Dekstroza

Wodorofosforan disodowy

Siarczyn żelaza (II) (siarczyn żelazawy) Siarczyn bizmutu Zieleń brylantynowa Agar

Woda destylowana pH = 7,7

5,0 g

10,0g

5,0 g 4,0 g 0,3g

8,0 g 0,025 g

20,0 g

WOO.Oml

Roztwór zawierający wszystkie składniki ogrzewano podczas intensywnego mieszania az piana osiadła na szyjce kolby, po czym pozostawiono do ochłodzenia podczas intensywnego mieszania i wlewano do płytek Petriego.

d)

Pepton proteazy Ekstrakt drożdży Laktoza Sacharoza Chlorek sodu Czerwień fenolowa Zieleń brylantynowa Agar

Woda destylowana pH = 6,9

10,0g

3,0g

10,0g 10,0g

5,0g

0,08 g

0,0125 g 12,0g

1000,01!

Pożywkę sterylizowano w temperaturze 020°C w czasie 05 minut, po czym wlewano do sterylnych płytek Petriego.

W tym sposobie otrzymano brzeczkę fermentacyjną lub jej różne postacie (przykłady III-XI), które stosowano bezpośrednio w postaci jednej z ich kompozycji (przykłady XII-XXXVII) do leczenia Apis mellifera zakażonych Varroa jacobsoni.

W sposobie według wynalazku, składnik aktywny, z włączeniem również brzeczki fermentacyjnej zawierającej komórki lub jej kondensat albo brzeczkę fermentacyjną pozbawioną komórek lub jej kondensat albo jej stałe postacie ewentualnie wysterylizowane przez naświetlanie formuje się znanymi metodami w kompozycje w postaci proszków do opylania lub zwilżalnych, takich jak koncentraty zawiesin, aerozole, koncentraty rozpuszczalne w wodzie albo inne kompozycje użyteczne do zastosowania np. w pokarmie lub wodzie do picia. Preparat z tych kompozycji wytwarza się znanym sposobem: (Pesticide formulations, wydanej przez Vode van Valkenburg, Marcel Dekker Inc., New York ł973).

W kompozycjach tych składnik aktywny miesza się ze stałym i/lub ciekłymi nośnikami, rozpuszczalnikami, regulatorami napięcia i ewentualnie z innymi materiałami pomocniczymi (dodatkami) w tym celu by składnik aktywny był bardziej użyteczny do zastosowania (patrz. np.

165 525 7 brytyjski opis patentowy nr 1 552 277). Wymaga się aby te substancje pomocnicze (dodatki) nie były toksyczne wobec pszczół, a pośrednio wobec ludzi.

Jako stałe nośniki lub podłoża stosuje się substancje organiczne lub nieorganiczne inaczej mówiąc o charakterze naturalnym lub sztucznym. Naturalne stałe nośniki lub podłoża otrzymuje się z rozmaitych minerałów, takich jak ziemia okrzemkowa, bentonit, różnych gatunków perlitu, kaolitu, dolomitu itp. przez rozdrabnianie.

Sztucznymi stałymi nośnikami lub podłożami są np. kwasy krzemowe o dużej powierzchni (aerosil); zele krzemionkowe wytworzone różnymi metodami; dokładnie rozdrobniony węglan wapnia otrzymany przez zobojętnianie mleka wapiennego lub zobojętniony wodzian glinowy albo jego pochodne poddane obróbce cieplnej otrzymane przez rozdrabnianie. Są to również nośniki pochodzenia sztucznego. Jako naturalne stałe nośniki organiczne stosuje się np. mąkę, cukier, śruty z odpadów niektórych roślin, takie jak mączka drzewna itp.

Odpowiednimi ciekłymi nośnikami i rozpuszczalnikami są woda i różne rozpuszczalniki organiczne oraz ich mieszaniny; alkanole i alkanole poliwodorowe oraz ich estry utworzone z różnymi kwasami, np. kwasami tłuszczowymi, aromatycznymi, hydroksylowymi lub aminowymi, takie jak octan etylu, octan butylu, octan amylu, benzoesan metylu, ftalan dioktylu itp., chociaż w tym samym celu mogą być użyte inne polarne związki organiczne, takie jak amidy kwasowe, np. dimetyloformamid, laktony, np. gamma-butyrolakton i laktamy, np. N-metylopirolidon.

Substancje obniżające napięcie (środki powierzchniowo czynne) stosowane w wielu kompozycjach mają tu zastosowanie w szerokim zakresie. Środki emulgujące, dyspergujące i zwilżające są ogólnie znane przy wytwarzaniu pestycydów należących do tego typu dodatków.

Substancje obniżające napięcie mogą mieć charakter niejonowy i jonowy.

Jako niejonowe substancje obniżające napięcie stosuje się np. estry tlenku etylenowego z alkoholami; estry tlenku etylenowego z kwasami tłuszczowymi lub kwasem oleinowym; etery tlenku alkilenu z aralkilofenolami; polimery blokowe tlenku etylenu z tlenkiem propylenu; ich estry i etery, jak również pochodne tlenku etylenu z kwasami tłuszczowymi lub kwasem oleinowym i bezwodnikami heksitolu, taki jak etery nonylofenylopoliglikolu, estry oleinianu polioksyetylenu lub monooleinian sorbitanu polioksyetylenowego itp.

Jonowe substancje obniżające napięcie mają charakter anionowy, kationowy i amfoteryczny.

Anionowe substancje obniżające napięcie są np. kwasami karboksylowymi lub sulfonowymi; siarczanami i sulfonianami alkoholi; estrami fosforowymi eterów polioksyetylenowych i estrami oraz solami utworzonymi z metalami ziem alkalicznych lub z kationami organicznymi, takimi jak mydło potasowe, wapń, sód, amon lub dodecylobenzenosulfonianem diizopropyloamonu; diizooktylosulfobursztynianem sodu, albo solami kwasu poliakrylowego z wyżej wymienionymi kationami.

Kationowe substancje obniżające napięcie są np. wodorohalogenkami wyższych alkiloamin lub ich sulfonianami; chlorkiem sterylodimetyloamonowym; lub wyższymi etanoloaminami lub ich solami i ewentualnie solami utworzonymi także z anionowymi substancjami obniżającymi napięcie.

Amfoteryczne substancje obniżające napięcie są np. betainami, lecytynami i N-metyloalkilolaurimidem sodu itp.

Użytecznymi dodatkami, np. adhezantami są naturalne lub syntetyczne polimery, takie jak np. skrobia, dekstryna, mono- i disacharydy, karboksymetyloceluloza, hydroksyetyloceluloza, poliwinylopirolidon, kwas poliakrylowy, żywica ksantynowa, alginiany itp.

Użytecznymi środkami przeciw pienieniu są np. blokowy polimeryzat polioksyetylenowopolipropylenowy, wyższe alkanole lub szczególne oleje silikonowe.

Ponadto, mogą być stosowane inne dodatki, np. substancje wabiące, takie jak miód, mono- i disacharydy, oraz perfumy, takie jak octan izoamylu itp.

Dodatki (materiały pomocnicze) obejmują również stabilizatory zapewniające mikrobiologiczną stabilność kompozycji. Użytecznymi stabilizatorami są np. kwas benzoesowy, benzoesan sodu, estry kwasu 4-hydroksybenzoesowego itp.

Składnik aktywny może być formułowany do zastosowania w postać ciekłą, stałą lub aerozolową.

165 525

W celu wytwarzania ciekłych kompozycji, składnik aktywny rozpuszcza się lub zawiesza w odpowiednim rozpuszczalniku (korzystnie w wodzie) równocześnie z wyżej wymienionymi dodatkami albo przez dodanie jednego dodatku po drugim.

Ciekłe kompozycje mogą być zarówno układem homogenicznym jak i dyspersyjnym. Można je wytwarzać przez rozdrabnianie (mielenie) stałego składnika aktywnego w odpowiednich rozmiarów cząstki, po czym homogenizowania w środowisku dyspersyjnym ewentualnie zawierającym również żądane środki powierzchniowo czynne, przez zastosowanie mieszania o niskich obrotach, a następnie rozdrabniania np. w młynie kulowym. Do otrzymanej zawiesiny, w razie potrzeby, dodaje się środek przeciw pienieniu, materiały zwiększające lepkość podczas mieszania przy niskich obrotach.

Pyły do opylania (kompozycje pyliste) wytwarza się w ten sposób, że składnik aktywny rozdrabnia się w odpowiednim urządzeniu, a następnie homogenizuje razem z nośnikiem i środkiem powierzchniowo czynnym. Powyższy proces można zmodyfikować w taki sposób, że składnik aktywny, nośnik i środek (środki) powierzchniowo czynne najpierw homogenizuje się, po czym rozdrabnia i na zakończenie homogenizuje. Do rozdrabniania stosuje się młyn młotkowy, prętowy, strumieniowo powietrzny. Proszki do opylania (kompozycje pyliste) można również wytwarzać w taki sposób, że nośnik i substancje powierzchniowo czynne dysperguje się lub rozpuszcza odpowiednio w dyspersji lub roztworze zawierającym składnik aktywny, po czym otrzymaną ciecz przeprowadza się w postać stałą znanymi metodami, takimi jak suszenie rozpyłowe lub liofilizacja. W razie potrzeby otrzymaną kompozycję pylistą rozdrabnia sią, a następnie homogenizuje.

Celowe jest zastosowanie takich ilości (dawek) ciekłej kompozycji (np. brzeczek fermentacyjnych), które nie przeszkadzają swobodnym ruchom Apis mellifera przy zwilżeniu.

W przypadku, np. brzeczki fermentacyjnej pozbawionej komórek wytworzonej według przykładu VIIIa, dawka ta wynosi 5-500 ml/m² ramki pszczelej. Dawka ta, jednakże może być mniejsza lub większa niż ta wartość ponieważ brzeczki fermentacyjne i ich różne postacie są nietoksyczne wobec Apis mellifera. Częstotliwość i dawki stosowane w sposobie według wynalazku zależą od stopnia zakażenia.

Ze względu na niedogodność ciekłych kompozycji z większą korzyścią stosuje się różne postacie proszkowe kompozycji. Dawka tych ostatnich mieści się zazwyczaj w zakresie 0,01-10 g składnika aktywnego/m ² ramki.

Kompozycja w postaci do spożywania lub pojenia (woda do picia) przedstawia bardzo korzystną postać zapewniającą długotrwałe i jednorodne podawanie i staje się dostępna w ulach w przeciwieństwie do rozpryskiwania i opylania. W tym przypadku czas trwania karmienia i pojenia (picie wody) może być określone i zależny od stopnia w lub ewentualniej rozległości całej infekcji.

Przedmiot wynalazku ilustrują szczegółowo poniższe przykłady, które nie ograniczają jego zakresu.

Przykład I. Izolowanie szczepów.

Mikroorganizmy wyizolowano z ziemi leśnej (las akacjowy z okolicy Tolina, wrzesień 1986) metodą płytkową. Próbkę ziemi w ilości 1 g zawieszono w 99 ml roztworu fizjologicznego chlorku sodu (solanka) i wytwarzano serię rozcieńczeń przez dodanie 3 ml każdej zawiesiny do 27 ml solanki fizjologicznej w każdym etapie rozcieńczania. Z każdej kolby pobierano pipetą 1 ml rozcieńczenia i wprowadzano do pustej, sterylnej płytki Petriego o średnicy 4 cm i do każdej dodawano 9 ml roztopionej, do temperatury 40-45°C, ciekłej pożywki zawierającej actidion w ilości 0,02 mg/ml.

Przez eliptyczne poruszanie płytki Petriego zawiesinę dokładnie mieszano z agarem i pozostawiono do zestalenia. Następnie płytki Petriego odwracano do góry dnem i inkubowano 72 h w temperaturze 28°C.

Do dalszych badań stosowano te płytki Petriego, w których ilość rosnących kolonii mieściła się w zakresie 10-20. Kolonie te kilkakrotnie propagowano znaną metodą z otrzymywaniem dziesięciu morfologicznie jednorodnych kolonii różniących się od innych. Dziesięć tych kolonii ujednorodniano, natomiast na jednej spontanicznie rozwijano mikropopulację. Działanie roztoczobójcze brzeczek fermentacyjnych lub brzeczek fermentacyjnych pozbawionych komórek i w ten sposób

165 525

Przykład XXIII.

Składnik aktywny według przykładu XI 80,0%

Sacharoza 20,C>%

Kompozycję otrzymano w sposób opisany w przykładzie XXI. Kompozycja stosowana do picia (picia wody).

Przykład XXIV.

Składnik aktywny według przykładu VHIb 98,0%

Sacharoza 1,95%

Octan amylu 0,025%

Octan etylu 0,025%

Kompozycję wytwarzano w sposób opisany w przykładzie XXI.

Kompozycje w proszku.

Pyły (kompozycje do opylania).

Przykład XXV.

Składnik aktywny według przykładu IV 98,0%

Żel krzemionkowy o dużej powierzchni 88)9%

Sacharoza 2,0%

Kompozycję wytworzono przez mieszanie, a następnie rozdrabnianie do wielkości cząstek poniżej 20 rum.

Przykład XXVI.

Składnik aktywny według przykładu V 98,0%

Żel krzemionkowy o dużej powierzchni 8,0%

Sacharoza 2,0%

Kompozycję wytwarzano w sposób opisany w przykładzie XXV. Przykład XXVII.

Składnik aktywny według przykładu IX 98,0%

Talk 50^0%

Sacharoza 1,0%

Kompozycję wytwarzano w sposób opisany w przykładzie XXV o wielkości cząstek poniżej 20 jum.

Przykład XXVIII.

Składnik aktywny według przykładu VI 50,0%

Żel krzemionkowy o dużej powierzchni 11,0%

Talk 33^^ę%

Sacharoza 5,0%

Kompozycję wytworzono w sposób opisany w przykładzie XXV. Przykład XXIX.

Składnik aktywny według przykładu XII 50,0%

Żel krzemionkowy o dużej powierzchni Talk 30,0%

Sacharoza 5,0%

Kompozycję wytworzono w sposób opisany w przykładzie XXV. Przykład XXX.

Składnik aktywny według przykładu XII 50,0%

Żel krzemionkowy o dużej powierzchni W,0%

165 525

Monooleinian sorbitanu polioksyetylenowego 10% emulsja oleju metylosilikonowego Octan izoamylu

Kompozycję otrzymano w sposób opisany w przykładzie XIII. Przykład XVII.

Składnik aktywny odpowiednio według przykładu IIIa i b 88,7%

0,15%

0,05%

Monooleinian sorbitanu polioksyetylenowego 0,1%

10% emulsja oleju metylosilikonowego 01%

Żywica ksantynowa 011%

Kompozycję otrzymano w sposób opisany w przykładzie XIII. Przykład XVIII.

Składnik aktywny według przykładu IV 30,00%

Monooleinian sorbitanu polioksyetylenowego l ,00%

Sacharoza 11030%

10%o emulsja oleju metylosilikonowego 0,,0%

Woda 50,0%

Octan izoamylu 0,,%

Kompozycję otrzymano w sposób opisany w przykładzie XIII. Przykład XIX.

Składnik aktywny według przykładu V 30,()%

Monooleinian sorbitanu polioksyetylenowego 1,0%

Sacharoza 11,0%

10% emulsja oleju metylosilikonowego 0,,5%

Woda 50,0%

Octan izoamylu 0,5%

Kompozycję otrzymano w sposób opisany w przykładzie XIII. Przykład XX.

Składnik aktywny według przykładu XI 93,0%

Sacharoza 6,4%

Ester fosforowy eteru polioksyetylenowego alkoholu tłuszczowego 0,0%%

Monooleinian sorbitanu polioksyetylenowego 0,0%%

Lecytyna 0,0%%%

Octan izoamylu 0,0%%

Kompozycję otrzymano w sposób opisany w przykładzie XIII. Kompozycje stosowane do karmienia.

Przykład XXI.

Składnik aktywny według przykładu VIIIb 79,95%

Sacharoza 20,0%

Octan amylu 0,025%

Octan etylu 0,025%

Kompozycję otrzymano przez mieszanie składników.

Przykład XXII.

Składnik aktywny według przykładu MIIb 50,0%

Nektar mieszany 50,0%

Kompozycję otrzymano w sposób opisany w przykładzie XXI.

165 525 wyizolowanych czystych lub mieszanych mikropopulacji wytwarzanych odpowiednio w przykładach Ilia, VIIIa lub b badano zgodnie z przykładami XXXVIII-XL.

Przykład II. Wyizolowanie subkultur spontanicznie rozwiniętych mieszanych mikropopulacji.

Ze spontanicznie rozwiniętej mieszanej mikropopulacji (czyste subkultury) wyizolowano dwa szczepy przez powtórne propagowanie na stałej pożywce z zastosowaniem różnych metod diagnostycznych (agar czekoladowy, agar krwi, agar zieleni brylantowej, agar siarczynu bizmutu itp.) i przez starzenie kultur. Obydwa szczepy zdeponowano w NCAIM pod identyfikacyjnymi numerami 001083 i 001086. Jeden z tych szczepów jest nowym Bacillus, zaś drugi jest znany i należy do rodzaju Pseudomonas i wykazuje niżej podane właściwości bakteriologiczne.

a) Szczep Pseudomonas zdeponowany pod numerem identyfikacyjnym 001086 tworzy błyszczące kolonie o średnicy 0,5-1 mm na prostej pożywce agarowej, wykazuje słaby wzrost w temperaturze 37°C i lepszy w 30°C.

b) Szczep Bacillus zdeponowany pod numerem identyfikacyjnym 001083 tworzy matowe szarawe kolonie o średnicy 1-2 mm na prostej pożywce agarowej.

a) Gram: dodatni,

b) sporulacja: owolnan

c) Not: dodatai,

d) wzrost anaerobowy: dodatat,

e) wzrost na agarze siarczanu bizmutu: + /-,

f) wzrost na agarze eozyna-błękit metylenowy: + /-,

g) wzrost w obecności 7% chlorku sodu: dodatαLi,

h) katalaza: dodatni,

i) NO 3—NO 2: ujemny,

j) test Voges-Proskauer: ^εππηγ,

k) indol: ujemny,

l) ureaza (Kristensen): ^€πίπυ,

m) arginina-dihydrolaza: ujemmy.

n) lizyna-dekarboksylaza:

o) omityna-dekarboksylaza: ujerj^^^n

p) hydroliza eskuliny: dodatni,

q) hydroliza skrobii: ujemm

r) hydroliza kazeiny: ujemm

s) hydroliza lecytyny: ujemm

t) hydroliza żelatyny: dodatnia,

u) cytrynian amonu: ujemm

u) wytwarzanie kwasu w środowisku utleniania Hungh-Leifson'a odzywka fermentacyjna: udeniame,

v) wytwarzanie gazu pepton-glukoza z wodą: ujπmne,

x) wytwarzanie kwasu (BSS) glukoza:

fruktoza:

laktoza:

maltoza:

mannitol:

ramnoza:

sacharoza:

ksyloza:

arabinoza:

adonitol:

z) ONPC.

dodatnie, dodatnie, ^ειη^ ujemny dodatme, ^οιώππ, dodatnie, ^ειη^ ^οιήππ, dodatnie.

165 525

Talk 35,0%

Sacharoza 5,0%

Kompozycję wytworzono w sposób opisany w przykładzie XXV. Proszki zwilzalne (kompozycje WP).

Przykład XXXI.

Składnik aktywny według przykładu IV 95,0%

Żel krzemionkowy o dużej powierzchni 4,0%

N-metylotaurimid sodu L0%

Kompozycję wytworzono przez homogenizowanie składników, a otrzymanej mieszaniny do wielkości cząstek poniżej 40 pm.

Przykład XXXII.

Składnik aktywny według przykładu V 95,0%

Żel krzemionkowy o dużej powierzchni 4,0%

N-metylotaurimid sodu 1,0%

Kompozycję wytworzono w sposób opisany w przykładzie XXXI. Przykład XXXIII.

Składnik aktywny według przykładu V Kaolin

Proszek z odpadów siarczynowych

Siarczyn sodu alkoholu tłuszczowego Ce-9 na nośniku z żelu krzemionkowego o dużej powierzchni

Kompozycję wytworzono w sposób opisany w przykładzie XXXI. Przykład XXXIV.

Składnik aktywny według przykładu VII Kaolin

Proszek z odpadów siarczynowych Siarczyn sodu alkoholu tłuszczowego na żelu krzemionkowym o dużej powierzchni

Kompozycję wytworzono w sposób opisany w przykładzie XXXI. Przykład XXXV.

następnie rozdrabnianie

95,0%

4,0%

0,5%

95,0%

4,0%

0,5%

Składnik aktywny według przykładu IX 98,0%

Sacharoza 0,5%

Żel krzemionkowy o dużej powierzchni 1 /0%

Monooleinian sorbitanu polioksyetylenowego 0,5%

Kompozycję wytworzono w sposób opisany w przykładzie XXXI. Przykład XXXVI.

Składnik aktywny według przykładu XII 99,5%

Monooleinian sorbitanu polioksyetylenowego 0,5%

Kompozycję wytworzono w sposób opisany w przykładzie XXXI. Kompozycja aerozolowa.

Przykład XXXVII.

Składnik aktywny według przykładu XI #>,0%

Sacharoza 3,C>%

Eter nonylofenolopoliglikolowy (ED-00) 0,1%

Lecytyna 1,0%

Octan izoamylu 0,1%

Octan butylu 0,1%

Nośnik gazowy 55,7%

165 525

Kompozycję wytworzono w taki sposób, że sacharozę, środek powierzchniowo czynny i substancje wabiące rozpuszcza się w składniku aktywnym podczas mieszania, po czym otrzymaną ciecz wprowadza się do butli aerozolowych. Butle zamyka się zaworem, napełnia gazem nośnikowym i na zakończenie butelki zaopatruje się w dysze.

Skuteczność biologiczna.

Przykład XXXVIII. Trzy rodziny pszczele w dobrej kondycji na dziewięciu ramkach zakaża się w całej rozciągłości następnie zadaje trzykrotnie co trzy dni brzeczką fermentacyjną wytworzoną w przykładzie VHIa. Każdorazowo rozpyla się 60 ml brzeczki fermentacyjnej pozbawionej komórek otrzymanej jak opisano w przykładzie VIHa za pomocą urządzenia rozpylającego dyszą powietrzną na powierzchnie plastrów miodu i na tych powierzchniach pszczoły roją się. Ponadto, każdą rodzinę pszczelą wystawia się na działanie dymiącego się pasła zawierającego 30 mg emitrase jako składnika aktywnego (preparatu ARTIVER do celów weterynaryjnych) na trzeci dzień po ostatniej obróbce.

Dla kontroli zastosowano trzy dalsze rodziny pszczele, które poddawano tylko działaniu ANTIVARU (30 mg amitrase) w czasie działania brzeczki fermentacyjnej otrzymanej w przykładzie VIIla. Następnie obliczano i rejestrowano liczbę martwych roztoczy i pszczół wewnątrz ula. Ponadto obserwowano ogólną kondycję i zachowanie rodzin i królowej.

Warunki testu.

Ule pszczele wyposażono w półki do zbierania roztoczy.

Półki były wykonane z aluminium i zaopatrzone w wystające obrzeża o wysokości 5 mm umieszczone na płytce - podłodze ula pszczelego. W razie konieczności półkę usuwano lub wymieniano przez odpowiedniego kształtu otwór wykonany w płytce - podłodze bez konieczności otwierania samego ula. Określania liczyb pszczół, larw i czerwi nieżywych wewnątrz ula pszczelego.

Liczbę pszczół, larw i czerwi nieżywych wewnątrz ula obliczano każdego dnia za pomocą sidła, tj. pudełka wykonanego z aluminium, które to pudełko było otwarte u góry i mzszym boku i wyposażone w wysuwaną półkę na dnie. U góry otwór był pokryty drutem stanowiącym otwory 8 mm dla zabezpieczenia pszczół od nieżywych roztoczy z ula pszczelego.

Zachowanie rodzin pszczelich.

Zachowanie, tj. brzęczenie i mruczenie rodzin pszczelich, umiejscowienie i ruch na powierzchni ramek oraz zachowanie poszczególnych pszczół obserwowano przez indywidualną inspekcję w czasie otwierania uli pszczelich i życia na ramkach.

Kondycja zdrowotna i zachowania królowych pszczół.

Kondycja zdrowotna i zachowania królowych oceniano indywidualną inspekcją. Obserwacja taka była przedłużona również do monitowania zachowania pszczół tworzących „dwór królowej, ruchy królowej, brzmienie jej skrzydeł (np. krawędzie odgryzione przez insekty) oraz jej drogę wykonywaną do miejsc odpowiednich do składnia jaj dla wyciągnięcia odpowiednich wniosków dotyczących aktywności królowej.

Ocenianie zajętych pasków na plastrze miodu.

Określenie „zajęty pasek plastra miodu oznacza, że powierzchnia wyznaczona między dwoma przeiegającymi sekcjami plastra miodu w co najmniej 70-80% po przeciwnej powierzchni plastra miodu była pokryta pszczołami.

Prowadzenie badania.

Przy każdej obróbce 60 ml nierozcieńczonej brzeczki fermentacyjnej pozbawionej komórek wytworzonej jak opisano w przykładzie VIlla i utrzymanej w temperaturze pokojowej rozpryskiwano za pomocą ręcznego przyrządu z dyszą powietrzną na powierzchnię dziewięciu ram utrzymujących trzy rodziny pszczele (tj. na powierzchnię 27216 cm² na rodzinę). Pszczoły pokrywały podczas opryskiwania powierzchnię plastra miodu całkowicie. Pasek dymiący zawierający jako środek aktywny armitrase (ANTIVAR) stosowano do kontroli w postaci „V i umieszczano na półce aluminiowej, po czym wkładano do wnętrza ula pszczelego. Otwór wyjściowy był zamknięty przez 1 h.

Parametry testu.

a) Liczbę nieżywych mszyc rejestrowano po 24, 48 i 72 godzinach po obróbce.

b) Liczbę nieżywych pszczół obliczano i rejestrowano co trzy dni, przed rozpoczęciem obróbki łącznie.

c) Zachowanie rodzin i królowej jak również liczbę zajętych miejsc na plastrze miodu oceniano w czasie obróbki, gdy ule pszczele były otwarte.

165 525

Wyniki.

Liczba nieżywych mszyc Varroa jacobsoni w każdej rodzinie po przeprowadzeniu obróbki każdego 3-go dnia, trzykrotnie z zastosowaniem brzeczki fermentacyjnej wytworzonej jak opisano w przykładzie VHIa, a następnie działanie amitrase.

Tabela 1

Obróbka	Czas upływający po obróbce (h)	Liczba martwych pszczół w rodzinie nr
1	2	3
1	4	74	43	31
	48	0	12	10
	72	1	1	0
	Razem	80	07	41
2	24	47	07	34
	48	6	1	3
	72	0	1	1
	Razem	03	04	38
3	24	62	77	47
	48	12	8	7
	72	2	0	1
	Razem.	76	86	00
	Podsumowanie	208	197	134
4	24	220	134	84
amitrase	48	24	4	11
(30 mg)	72	0	1	0
	Razem:	248	138	100

Liczba nieżywych roztoczy „Varroa jacobsoni na rodzinę pszczelą po obróbce trzeciego dnia, 4-krotne zastosowanie 30 mg amitrase na obróbkę (kontrola).

Tabela 2

Obróbka	Czas po obróbce (h)	Liczba nieżywych mszyc w rodzinie pszczelej nr
1 2	3
1	24		164	241	1180
	48		3	12	3
	72		0	1	0
		Razem:	167	2Ó4	193·
2	24		68	87	37
	48		0	3	,
	72		0	1	0
		Razem:	68	81	38
3	24		21	30	24
	48		0	2	1
	72		0	0	2
		Razem.	21	37	27
4	24		07	00	32
	48		4	0	4
	72		1	0	1
		Razem.	62	00	37

Nieżywe pszczoły.

Liczba martwych pszczół znalezionych na półkach korespondowała ze zwykłym stopniem śmiertelności. Zgodnie z tym obróbki nie powodowały znacznego zwiększenia liczby nieżywych pszczół.

Zachowanie rodzin pszczelich i królowej, liczba zajętych miejsc.

Nie zauważono żadnej patologicznej zmiany w ogólnej kondycji rodzin pszczelich oraz królowej na skutek działania tych samych wrażeń dotyczących ogólnych warunków życia rodzin.

165 525

Przykład XXXIX. Badania toksylogiczne na pszczołach.

Wartość doustna LD50 dla Apis mellifera brzeczki fermentacyjnej wytworzonej według przykładu VIlla.

Materiał testowy.

Stężenie w szeregu rozcieńczeń wytworzonych z brzeczki fermentacyjnej pozbawionej komórek z przykładu VIIla z roztworem opisanym poniżej daje pierwsze stężenie 1% i końcowe stężenie 0,25% w seriach (w przeliczeniu na brzeczkę fermentacyjną).

Roztwór zawierał następujące składniki:

- cukier granulowany 20,0%

- aceton 5,0 ml

- woda destylowana do 100,0 ml.

Dawkę 0,2 ml każdego roztworu serii podano grupom zawierającym każdorazowo 10 pszczół.

Dawkowanie.

W 0,2 ml roztworu podawano 500,0, 1000,0 i 2000,0 mikrogramów na 10 pszczół.

Badanie zwierzęta.

Pszczoły stosowane do testowania pobierano ostrożnie odszczepiając je z ramek używanych do hodowli. Pszczoły pobierano z trzech rodzin będących w dobrej kondycji fizycznej w okresie intensywnego rojenia. Testowane pszczoły według różnych rodzin umieszczano w oddzielnych plastykowych pudełkach wyposażonych w perforowaną pokrywę.

Do celów badawczych 6 grup obejmujących 10 pszczół umieszczano w zależności od każdej rodziny w 2 grupach.

Metoda badania.

Badane zwierzęta z ramek stosowane do hodowania przenoszono natychmiast do laboratorium, gdzie były narkotyzowane gazowym dwutlenkiem węgla.

Grupy obejmujące każdorazowo 10 pszczół umieszczano w cylindrach o wysokości 10 cm i średnicy 5 cm wykonanych z drutu o wielkości otworów 4 mm galwanizowanych cynkiem i zamykanych na jednym końcu aluminiową folią, a na drugim końcu zatyczką korkową osłonięto aluminiową folią.

W środku zatyczki korkowej był otwór o średnicy 1 cm i głębokości 0,4 mm i pojemności 0,5 ml zrobiony do miejsca doprowadzającego pokarm. Otwór zamykano cienkimi drucikami rozmieszczonymi w odległości 3-4 mm.

Jedną godzinę po narkotyzowaniu pszczół, gazowym dwutlenkiem węgla, 6 kontrolnym grupom, za pomocą szklanej strzykawki wprowadzono pokarm stanowiący 0,2 ml roztwór zawierający określoną dawkę brzeczki fermentacyjnej pozbawionej komórek wytworzonej w sposób opisany w przykładzie VIlla.

Każdej z 6 kontrolnych grup podawano 0,2 ml roztworu cukru. Po 4 h, po pierwszym karmieniu, pszczoły konsumowały pierwszą porcję. Następnie co trzy godziny podawano syrop cukrowy w dowolnej ilości.

Ponadto, w czasie 1 h stosowano głodówkę dla stopniowej konsumpcji badanego pożywienia zapewniającego znane niezbędne składniki pszczołom, mianowicie to, że były one karmione przez dostarczenie pożywienia.

Podczas okresu obserwacji, laboratoria były przyciemnione i tylko podczas okresów karmienia personel używał światła przyćmionego. Ponadto, pomieszczenie było pozostawione w spokoju z wyjątkiem prowadzenia tego eksperymentu. W czasie testu utrzymywano stałą temperaturę 23-24°C i wilgotność 55-70°C, przy czym obydwa parametry sprawdzano i rejestrowano co trzy godziny.

Ocena.

Śmiertelność obserwowano w 4,24 i 48 h po podaniu syropu cukrowego zawierającego badaną substancję. Ponieważ występowanie przypadków śmiertelnych jest zjawiskiem naturalnym u pszczół wynikającym z ich naturalnego środowiska (główną tego przyczyną jest to, że kąsają inne na śmierć w podnieceniu spowodowanym gwałtownymi zmianami otoczenia), stopień śmiertelności oznacza, że różne poziomy dawkowania były korygowane z uwzględnieniem przeciętnego

165 525 stopnia śmiertelności grup kontrolnych. Wartości skorygowane były brane pod uwagę dla dalszych ocen. Otrzymane wyniki podsumowano w tabeli 3.

Tabela 3

Śmiertelność Apis mellifera podczas określania doustnej wartości LD50 dla brzeczki fermentacyjnej pozbawionej komórek wytworzonej jak opisano w przykładzie VtIIa

	Liczba nieżywych
Dawka ilość leku dodanego	Stężenie brzeczki	Liczba seryjna grup	pszczół w grupie	Przeciętna liczba
do 0.2 ml syropu cukrowego	fermentacyjnej	obejmujących w każdej				nieżywych pszczół	Śmiertelność
i podanego grupie 10 pszczół	w syropie cukrowym	10 pszczół	4h	24 h	48 h	z 10 pszczół w czasie	skorygowana
kazdorazowo	% wag /obj					48 h	%
(mikrogramy/10 pszczół)			po pierwszym karmieniu
		1	0	0	0
		2	0	0	0
500,0	0.25	3	0	1	2	0,67	0.00
		5	0	0	1
		6	0	0	0
			0	0	0
1000,0	0,50	3	0	0	2	0,83	1,79
		4	0	0	0
		5	0	0	1
		6	0	0	1
		1	0	1	2
		2	0	0	0
2000,0	1,00	3	2	0	2	1,00	3,57
		4	0	0	0
		5	0	1	1
		6	0	1	I
		2	0	0	0
Kontrola	0,00	3	0	0	0	0,67
		4	0	0	2
		5	0	1	1
		6	0	0	0

Z powyższych danych należy stwierdzić, że wartość doustna LD 50 wynosi powyżej 200,0 mikrogramów/pszczołę, tj. powyżej 2 g/kg ciężaru ciała pszczoły. Dla porównania wartość LD 50 dla amitrase wynosi 12 mikrogramów/pszczołę.

Przykład XL. Badania działania roztoczobójczego brzeczki fermentacyjnej otrzymanej według przykładu Illb wobec Apis mellifera zakażonych Varroa jacobsoni.

Materiał testowy.

Roztwór 2,5% brzeczki fermentacyjnej wytworzonej jak opisano w przykładzie Illb z zastosowaniem syropu cukrowego o stężeniu 50%.

Badane zwierzęta.

Pszczoły stosowane do badań pobierano ostrożnie z ramek stosowanych do hodowli, a należących do rodzin o dobrej kondycji w czasie intensywnego rojenia. Badane pszczoły umieszczano w plastykowych pudełkach wyposażonych w perforowaną pokrywę.

Metoda badania.

Zwierzęta pobrane z ramek stosowanych do hodowli przenoszono bezpośrednio do laboratorium gdzie były narkotyzowane dwutlenkiem węgla. Narkotyzowane pszczoły badano pod soczewką powiększającą i osobniki zakażone roztoczami umieszczono w cylindrze o wysokości 10 cm i średnicy 8 cm wykonanym z drutu, który tworzył otwory 4 mm, a który był pokryty na jednym końcu folią aluminiową. Na dnie cylindra był umieszczony pusty plaster miodu o długości 3-5 cm. Do otworów dla karmienia wprowadzono 5-10 ml roztworu zawierającego brzeczkę fermentacyjną wytworzoną sposobem opisanym w przykładzie Illb za pomocą skrzykawki szklanej i pozostawiano pszczołom dowolność.

165 525

Podczas okresu obserwacyjnego, laboratorium było całkowicie zaciemnione, a pomieszczenia nie używano do żadnych innych celów. W czasie badań utrzymywano stałą temperaturę 23-24°C i wilgotność 55-70%.

Ocena.

Nieżywe roztocza pozostające na pszczołach obliczano 12 h po podaniu syropu cukrowego zawierającego badany materiał, po narkotyzowaniu pszczół gazowym dwutlenkiem węgla. Stwierdzono, że wszystkie roztocza obecne na pszczołach były nieżywe i spadły na dno klatki.

Tak więc, przez spożywanie syropu cukrowego zawierającego brzeczkę fermentacyjną wytworzoną w sposób opisany w przykładzie IIIb skuteczność jej działania w czasie 12 h osiągnęła wartość 100%.

165 525

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,100 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania aktywnego środka roztoczobójczego na drodze fermentacji aerobowej lub częściowo anaerobowej w środowisku ciekłej pożywki zawierającej węglowodany i azot nieorganiczny jak również inne dodatki znane per se, znamienny tym, że jako szczep mikroorganizmu stosuje się mieszankę mikropopulację zawierającą szczep Bacillus złożony w Narodowej Kolekcji Mikroorganizmów Rolniczych i Przemysłowych w Budapeszcie na Węgrzech pod numerem identyfikacyjnym OC 1083 oraz szczep bakterii Pseudomonas złożony w tej samej Kolekcji pod numerem identyfikacyjnym OC 1086.
2. Sposób wytwarzania aktywnego środka roztoczobójczego na drodze fermentacji aerobowej lub częściowej anaerobowej w środowisku ciekłej pożywki zawierającej węglowodan i azot nieorganiczny jak również inne dodatki znane per se, znamienny tym, że jako szczep mikroorganizmu stosuje się szczep Bacillus zdeponowany w Narodowej Kolekcji Mikroorganizmów Rolnicznych i Przemysłowych w Budapeszcie na Węgrzech pod numerem identyfikacyjnym OC 1083.