PL163828B1 - Sposób wytwarzania utrwalonej tkanki naturalnej do Implantacji - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania utrwalonej tkanki naturalnej do implantacji polegający na utrwalaniu w aldehydzieglutarowym, znamiennytym, że materiał biologicznyprzeznaczony do implantacji, utrwalony aldehydem glutarowym poddaje się działaniu środowiska kwaśnego o pH poniżej 4,0.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania naturalnej tkanki do implantacji, a w szczególności protez naczyniowych elementów sztucznego serca oraz protez zastawek sercowych o zwiększonej odporności na mineralizację;.

Znane są z opisów patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr A 405 327 i 4 402 697 sposoby zahamowania mineralizacji tkanki naturalnej stosowanej do implantacji. Polegają one na tym, że zastawki świńskie serca poddane są działaniu aldehydu glutarowego, a następnie traktowane inhibitorem mineralizacji np. przez wodne roztwory detergentów jonowych, a w szczególności pochodnych siarczanu dodecylu.

Z opisu patentowego nr 4 770 665 znany jest sposób otrzymywania zwierzęcych tkanek do implantacji o zmniejszonej podatności na wapnienie. Przed wszczepieniem tkankę poddaje się specjalnej procedurze polegającej na inkubacji materiału w roztworach monomerów, ulegających polimeryzacji w tkance. W rezultacie uzyskuje się wypełnienie tkanki polimerami co zmniejsza szybkość wapnienia przeszczepionej tkanki.

Z opisu patentowego nr 4 729 139 znany jest sposób doboru polimeru stosowanego jak w opisie patentowym nr 4 770 665 taki, aby zewnętrzna powierzchnia tkanki była wolna od polimeru.

Sposoby te posiadają szereg wad, między innymi jest to w przypadku opisów nr 4 770 665 1 470 666 zmniejszenie elastyczności tkanki. W przypadku opisów nr 4 405 327 i 4 402 697 obserwuje się krótkotrwałość efektu hamowania mineralizacji tkanki po przeszczepieniu. Jak do tej pory brak potwierdzenia efektywności tych metod w badaniach klinicznych.

Znany jest sposób wytwarzania utrwalonej tkanki naturalnej do implantacji z polskiego opisu patentowego nr 136 323, gdzie stosuje się działanie wodnego roztworu rozpuszczalnej w wodzie soli siarczanu alkilowego. Roztwór siarczanu alkilowego jest buforem do uzyskania pH 7-7,5, a dodatek soli siarczanu dodecylu (SDS) powoduje wypłukiwanie fosfolipidów.

Obecnie biostatyczne protezy zastawkowe wytwarzane są z materiału biologicznego utrwalanego w roztworach aldehydu glutarowego o stężeniu 0,2-0,625% przez okres od 21 h do 4 tyg.

Metoda ta wprowadzona na początku lat siedemdziesiątych zwiększa wytrzymałość mechaniczną protezy, zmniejsza jej podatność na trawienie enzymatyczne, oraz zmniejsza jej immunogenność. Zastawki przygotowane z materiału utrwalonego tą metodą mają jednak tę wadę, iż ulegają po przeszczepieniu procesowi wapnienia. Odkładające się w płatkach przeszczepu sole wapnia powodują zmniejszenia ic.H elastyczności, przez co dochodzi do upośledzenia ich funkcji, oraz uszkodzeń mechanicznych prowadząc w efekcie do konieczności reoperacji i wymiany protezy. Proces ten jest szczególnie nasilony u młodych biorców. Doniesienia z ostatnich lat wykazują, iż wśród pacjentów w wieku do 15 lat, aż 88% wymaga wymiany protezy w okresie siedmiu lat po przeszczepieniu zastawki biostatycznej. Zastawka z wyboru dla tych pacjentów jest w obecnej chwili zastawką wykonaną z materiałów syntetycznych, która w przeciwieństwie do zastawek formowanych z materiałów biologicznych wymaga stosowania przewlekłej terapii przeciwzakrzepowej stanowiącej zagrożenie dla pacjenta.

Celem wynalazku jest usunięcie wskazanej wyżej niedogodności przez opracowanie sposobu utrwalania materiału biologicznego zastawki mającego zmniejszyć szybkość jego wapnienia po przeszczepieniu.

Według wynalazku materiał biologiczny poddany uprzednio działaniu aldehydu glutarowego poddawany jest działaniu środowiska kwaśnego o pH poniżej 4,0. Jako środowisko kwaśne stosuje się wodne roztwory kwasów organicznych i/lub nieorganicznych lub roztworów buforowych.

163 828

Jako materiał biologiczny stosuje się zastawki sercowe, osierdzie, żyły, tętnice, jak również inne tkanki ludzkie i zwierzęce.

Tak przygotowany materiał biologiczny po odpłukaniu kwasu przechowuje się w warunkach, jałowych do momentu zabiegu, lub bezpośrednio przeszczepia się pacjentowi.

Sposobem według wynalazku otrzymuje się zmniejszenie szybkości mineralizacji przeszczepionej zastawki o ok. 50%, co powinno zwiększyć trwałość zastawki około dwukrotnie, oraz umożliwić użycie tych zastawek w przypadku młodych pacjentów.

Przykład wykonania przybliża sposób wytwarzania utrwalonej tkanki naturalnej.

W badaniach posłużono się zwierzęcym modelem doświadczalnym przeszczepiając badany materiał podskórnie szczurom. Do doświadczeń użyto aortalne zastawki świńskie uzyskane w rzeźni, oraz komercyjny preparat zastawki uformowanej z osierdzia bydlęcego stabilizowanego aldehydem glutarowym. W eksperymentach oceniano stopień zwapnień w dwóch grupach przeszczepów.

-Grupa kontrolna (k)-materiał stabilizowany w aldehydzie glutarowym.

-Grupa badana (HCl)-materiał stabilizowany w aldehydzie glutarowym dodatkowo poddany działaniu kwasu solnego.

Zwapnienia oceniano po 4 tyg., 8 tyg., 12 tyg. i 24 tyg. Zastawki pobierano z ujść tętniczych od świń z uboju. Bezpośrednio po pobraniu przemywano materiał kilkakrotnie w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) o temp. ok. 10*C, a następnie utrwalano w 0,625% roztworze aldehydu glutarowego w PBS o e ok. 15° C prze z 2 4 godziny.

Po tym czasie przekładano materiał do 0,2% roztworu aldehydu glutarowego w PBS na okres minimum czterech tygodni. W roztworze tym przechowywano przeszczep do momentu zabiegu. Przebadano również nanoioey ereparet ztstawki osierdziewej finey Poltanan, utrwananej aldehydem gPutarowym tak jak świńskie zastawki tętnicze.

Przygotowany matafiał modyfikowano poddając go inkubacji w 0 6 N Cl. W tym cel u tuż przed przeszczepieniem materiału płukano go najpierw przez alk. 15 oz. . e hufc^wnym roztworze solo fizjologicznej (PBS), a następnie przez 1,5 godziny w 0,6 N roztworze HCl w soli fizjologicznej o temp. 15’C. Po inkubacjo w kwasie materiał płukano trzykrotnie w PBS i przeszczepiano. Przed rfzeszczepian0am materiał płukano w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) a następnie pfzesrczepisno pod skórę brzucha rasy WAG w wieku tyg. o wadze 45-50 g. Zabieg przeprowadzano w narkozi e nembutalojej (5 0 mg/k. e. k^ydy szczur miał równocześnie przuzsszcrSoo ffrsmint wg wynalazku (materea grupy badanej) oraz fragment zastawki n0etrαktowαneW (materiał grupy kontrolnej).

Stopień zwapnienia oceniano po okrasia od 4 tyg. do 3 miesięcy od pfzeszczep0ania.

W celu pobrania wszczepów szczury usypiano etaram. Pfzapfowsdzozo ocenę histologiczną oraz biochemiczzą przeszczepionego materiału.

Ocena histologiczna: wszczepy do badania histologicznego utrwalono w 10% formalinie w pH 7,4 przez 24 godziny, następnie zatapiano w parafinie. Otrzymane skrawki barwiono metodą von Kossa w celu uwidocznienia złogów wapniowych.

Badanie mikroskopowe wykazało obecność zwapnień w obu grupach pfreszczapów tj. kontrolnej (K) oraz badanej (mαtefoαł poddazy az0a3an0u HCl). RozmWelrcrszws zwapnień w obu rodzajach pfrsszcrspu było podobne. Złogi występowały początkowo w części komorowej («-ζ^οcularis), a następnie w warstwie włUkz.ilrew (fibrna) oła^a, w dalszym stadium złogi w postaci dużych ognisk występowały za całym pfrskfoWu zastawki z wyjątkiem wąskiej warstwy podwsierdrOoteJ. Obraz mikfolaopwy wskazywał iż w większości pi^^f^^ratów w grupis badanej (HH1) złogi wapnia występowały fzadziej 0 były mniejsze noż w grupie kontrolnej. Wstępną ocanę hiltolog0crną potwierdziły badania biochemiczne.

Ocana bόchsmoczze: wlrcrspl pozbawiano rocrao łącrzrkankowew, płukano krótko w wodna destylowanej, a potem suszono w temp. 100°C do momentu uzyskania stałej wago. Odparowane próbko ważono, s następnie umieszczano w 0,4 ml 6N HCl i hyaiPόzotano pirar 6 godzin w 130°C. Hydrolizat odparowywano, a następnie rozpuszczano w wodna dsltl)otαnsw. Stężania Cs⁺⁺ w próbkach oznaczano metodą miareczkową. Wskaźnikiem poziomu zwapniania była ilość ptiol Cs zawarta w 1 mg suchej mesy prrasrczapu.

Zaobserwowano progresję poziomu zwapnień w grupia kontrolnej (K) jak 0 w badanej (HCl) (tabl. 1).

163 828 średnie wartości zwapnienia przeszczepów traktowanych HCl przed implantacją były Jednak istotnie statystycznie niższe od wartości zwapnień przeszczepów grupy kontrolnej. Stosując nieparametryczny test Wilcoxona wykazano występowanie różnic istotnych statystycznie na poziomie 0,01 pomiędzy grupą badaną (HCl) a kontrolną (K), we wszystkich badanych przedziałach czasowych z wyjątkiem 12 tygodnia gdzie różnice wystąpiły na poziomie 0,05. Podobny wynik uzyskano w przypadku zastawki uformowanej z osierdzia bydlęcego (tabl. 2). Różnice istotne statystycznie na poziomie 0,01).

Sposobem według wynalazku uzyskano wyniki pozwalające sądzić iż: poddanie materiału zastawek konserwowanych aldehydem glutarowrm działaniu 0,6 N HCl zmniejsza w sposób istotny szybkość ich wapnienia w zwierzęcym modelu przeszczepów podskórnych.

Wpływ inkubacji w środowisku kwaśnym na szybkość wapnienia obserwuje się również w przypadku protezy perykardialnej konserwowanej w aldehydzie glutarowym.

Tablica 1

Wyniki w mmol wapnia/g suchej masy przeszczepu

Tkanka płatków świńskiej zastawki	4 tyg.	8 tyg.	12 tyg.	24 tyg.
	1,77	2,47	3,41	4,95
Obróbka według patentu	-0,38	-0,31	-0,43	-0,46
(0,6 N HCl)	n = 15	n=10	n = 7	n=10
Kontrola	3,79	4,29	4.91	7,77
	-0,57	-0,49	-0,31	-0,37
	n=15	n=10	n=7	n=10

Tablica 2

Wyniki w mmol wapnia/g suchej masy przeszczepu

Tkanka płatków zastawki perykardialnej	4 tygodnie po przeszczepieniu
Obróbka według patentu	1,42 - 0,14
(0,6 N HCl)	n=12
Kontrola	3,01 - 0,34 n=12

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania utrwalonej tkanki naturalnej do implantacji polegający na utrwalaniu w aldehydzie glutarowym, znamienny tym, że materiał biologiczny przeznaczony do implantacji, utrwalony aldehydem glutarowym poddaje się działaniu środowiska kwaśnego o pH poniżej 4,0.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako kwaśne środowisko stosuje się roztwory kwasów organicznych lub nieorganicznych lub roztwory buforowe.

   * * *