PL162292B1 - Sposób wytwarzania bis-oksymu d,l-4, 8-diaza-3,6,6,9-tetrametyloundekano-2,10-dionu znakowanego technetem 99mTc - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania bis-oksymu d,l-4,8-diaza-3,6,6,9-tetrametyloundekano-2,10-dionu znakowanego technetem 99mTc w reakcji znakowanej soli nadtechnetanu z bis-oksymem d,l ,4-8- diaza-3,6,6,9-tetrametyloundekano-2,10-dionu wobec soli dwuwartościowej cyny, znamienny tym, że sól dwuwartościowej cyny stosuje się w postaci kompleksu z pirofosforanem metalu alkalicznego lub amonowym.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania bis-oksymu d,l-4,8-diaza-3,6,6,9-tetrametyloundckano-2,10-dionu znakowanego technetem ^99mTc, który znajduje zastosowanie w zestawach diagnostycznych do pomiaru in vivo mózgowego przepływu krwi oraz wykrywania składników krwi.

Kompleks bis-oksymu 4,8-diaz.a-3,6,6,9-tetrametyloundekano-2,10-dionu (znanego również jako heksametylo-prileno-aminoksym (HM-PAO)) z ^99m-technetem jest szeroko stosowany do pomiarów mózgowego przepływu krwi i . wykrywania składników krwi. Kompleks ten całkowicie spełnia wymagania dla idealnego radiofarmaceutyku, gdyż - związek ten jest obojętny i rozpuszczalny w lipidach, przechodzi więc barierę krew - mózg na zasadzie dyfuzji, - radiofarmaceutyk może być wydalony z krwi szybko i w proporcjonalnie dużych ilościach,

-stężenie radiofarmaceutyku wnikającego do tkanek nerwowych pozostaje niezmienne w ciągu dłuższego okresu, co umożliwia wykonanie stosunkowo długotrwałego badania radiograficznego z wykonaniem obrazów narządów (SPECT),

-własności pomiarowe znakującego radioizotopu 99^mTc idealnie nadają się do systemów polegających na wykonywaniu obrazów (kamera promieniowania gamma, SPECT),

-stosując generator 99^mTc - ⁹Mo i odpowiedni zestaw diagnostyczny, radiofarmaceutyk można wytwarzać stosunkowo tanio, w miejscu jego stosowania, w odpowiednim czasie,'w wymaganej ilości.

HM-PAO znakowany 99^mTc stosuje się w diagnostyce klinicznej, głównie do diagnozowania udaru mózgu, niedokrwienia przejściowego i mózgowego, blokady tętnicy szyjnej, zaburzeń krążenia mózgowego krwi, nowotworów mózgu, przerzutów do mózgu, zaburzeń w dopływie krwi po urazach mózgu, krwiaków podtwardówkowych, krwawień podpajęczynówkowych, demencji, padaczki, złośliwego stwardnienia rozsianego i choroby Altzheimera (The Lancet II, 1223, (1986), J. Nuci. Med, 27, 171 (1986), Nuci, Med. Commun. 7, 873, (1986)).

Kompleks HM-PAO znakowany technetem 99^mTc wytwarza się w reakcji d.l-stereoizomeru HM-PAO z solą nadtechnetanu (to jest z solą zawierającąjony TcO'4) wobec środka redukującego. Jako środek redukujący stosuje się winian cynawy lub dwuwodzian chlorku cynawego. Sól cynawą stosuje się w ilości 6,624 -0,01 części wagowych Sn²⁺ na 1 część wagową HM-PAO (publikacje europejskich zgłoszeń patentowych nr EP-179.608 i EP 194.843). Te znane sposoby mają jednak szereg wad. Dwuwartościowe sole cyny są podatne na samorzutne utlenianie i hydrolizę w środowisku alkalicznym, a zatem, reakcję HM-PAO z TcO-f powinno się prowadzić w zakresie pH 7,5 - 8,5 i później doprowadzić odczyn mieszaniny do pH 9-10, to jest do wartości pH umożliwiającej

162 292 powstawanie rozpuszczalnego w lipidach kompleksu ^99rnTc-HM-PAO, dodając do mieszaniny środek alkaliczny (taki jak wodorotlenek sodowy lub dwuwęglan sodowy). Biorąc pod uwagę fakt, że w tym zakresie pH hydroliza soli Sn²⁺jest raczej rozległa, sole Sn²⁺ powinny być użyte w dużym nadmiarze. Takie rozwiązanie jest jednak niekorzystne, gdyż nadmiar soli Sn2+ i tworzących się z nich soli Sn⁴+ w wyniku samorzutnego utleniania, zanieczyszczają radiofarmaceutyk. Wiadomo, że związki te są cytotoksyczne.

Jako następną wadę należy wymienić właściwość wiązania się soli Sn2+ ze znakowanym technetem, w wyniku czego znakowany technet pojawia się nie tylko w tkankach, które mają być badane ale również w innych tkankach organizmu, co prowadzi do fałszywych wyników diagnozy. Nadmiar soli Sn2+ przyspiesza przekształcanie się kompleksu ^mTc-HM-PAO rozpuszczalnego w lipidach w kompleks rozpuszczalny w wodzie. Tłumaczy się tym fakt, że stosunek rozpuszczalnej w lipidach frakcji kompleksów mTc-HM-PAO wytwarzanych znanymi sposobami jest najwyższy po minucie od dodania radioaktywnego nadtechnetanu, co oznacza, że w tym czasie preparat ma najkorzystniejszy skład jeśli chodzi o jego przydatność jako diagnostyku, a następnie, zawartość frakcji rozpuszczalnej w lipidach ciągle maleje. Biorąc pod uwagę, że nawet w najdogodniejszych warunkach upływa znacznie więcej czasu niż minuta od przygotowania znakowanego kompleksu do podania injekcji odczynnika diagnostycznego pacjentowi, należy stwierdzić, że znane metody nie dają możliwości stosowania odczynnika o optymalnym składzie.

Potrzebny był zatem sposób uniknięcia samorzutnego utleniania i hydrolizy soli Sn2+ i w rezultacie całkowitego przebiegu procesu tworzenia się kompleksu nawet w obecności bardzo małej stechiometrycznej ilości Sn2+.

Przeprowadzono rozległe badania stabilności soli Sn2+ i stwierdzono, że sole dwuwartościowej cyny tworzą stabilne kompleksy z pirofosforanami metali alkalicznych lub amonu. Tak skompleksowany jon Sn²⁺ nie utlenia się i nie hydrolizuje przy pH = 9-10. Nieoczekiwanie okazało się również, że kompleksy soli Sn²+ z pirofosforanem metalu alkalicznego lub amonowego mają zdolność selektywnego redukowania jonu nadtechnetanu. Tak więc, w obecności takich kompleksów pirofosforanów można osiągnąć całkowitą redukcję jonu nadtechnetanu oraz całkowite powstanie żądanego kompleksu mTc-HM-PAO, a co więcej, do reakcji potrzebna jest bardzo niewielka ilość soli Sn2+, co pozwala uniknąć niedogodności związanych z obecnością nadmiernych ilości soli Sn2+ .

Sposób wytwarzania d,l-bis-oksymu 4,8-diaza-3,6,6,9--etrametyloundekano-2,10-dionu znakowanego 99mTc w reakcji soli znakowanego nadtechnetanu z d,l-bis-oksymem 4,8-diaza-3,6,6,9tetrametyloundekano-2,10-dionu wobec soli Sn2+ według wynalazku, polega na tym, że sól Sn2+ stosuje się w postaci kompleksu z pirofosforanem metalu alkalicznego lub amonowym.

W celu wyeliminowania reakcji ubocznych, powyższą reakcję prowadzi się korzystnie w atmosferze gazu obojętnego (takiego jak azot).

Jako sole Sn2+ stosuje się np. sole kationu Sn²+ z jedno- lub wielowartościowymi kwasami karboksylowymi (takimi jak kwas octowy, winowy, cytrynowy i podobne) lub z kwasami nieorganicznymi. Szczególnie korzystny jest chlorek cynawy. Chlorek cynawy stosuje się korzystnie jako dwuwodzian, gdyż dwuwodzian jest substancją krystaliczną, łatwą do posługiwania się nią, oznaczeń i oczyszczania. Okazało się, że do przeprowadzenia reakcji wystarczająca jest ilość soli Sn²+ odpowiadająca 0.002-0.01 części wagowych Sn2+ na 1 część wagową d,l-bis-oksymu 4,8-diaza3,6,6,9-te trametylo-undeka-2,10-dionu.

Reakcję prowadzi się w zakresie pH 9-10, to jest w zakresie optymalnym dla powstawania rozpuszczalnego w lipidach kompleksu mTc-HM-PAO. Obecny w mieszaninie reakcyjnej pirofosforan metalu alkalicznego lub amonowy samorzutnie utrzymuje wartość pH w tym zakresie.

Pirofosforan sodowy, bądź w formie bezwodnej bądź jako wodzian, stosuje się szczególnie korzystnie do wytwarzania kompleksu Sn²+. Najbardziej korzystny okazał się dziesięciowodzian pirofosforanu sodowego, ponieważ związek ten jest stabilny, łatwo dostępny i wygodny w obchodzeniu się z nim.

Kompleks soli Sn2+ z pirofosforanem metalu alkalicznego lub amonowym można przygotowywać bezpośrednio w mieszaninie reakcyjnej stosowanej do wytwarzania kompleksu mTc-HMPAO w taki sposób, ze poszczególne składniki kompleksu redukującego, to jest, sól Sn²+ i

162 292 pirofosforan wprowadza się do mieszaniny reakcyjnej przed wprowadzeniem znakowanej soli nadtechnetanu. Kompleks pirofosforanu z solą Sn²⁺jest jednak wystarczająco stabilny aby można go było stosować w stanie uprzednio przygotowanym. Kompleks ten jest całkowicie obojętny w stosunku do d,l-HM-PAO. Możliwe jest zatem przygotowanie zestawu diagnostycznego, który można przechowywać przez dłuższy okres czasu bez zmian. Po dodaniu znakowanej soli nadtechnetanu przechodzi on bezpośrednio w odczynnik do badań radiologicznych zawierający kompleks ^mTc-d,l-HM-PAO.

Przeznaczony do znakowania technetem ^99mTc zestaw diagnostyczny mający zastosowanie do pomiarów in vivo mózgowego przepływu krwi i do oznaczania składników krwi zawiera d,l-bis-oksym 4,8-diaza-3,6,6,9--etrametyloundekano-2,10-dionu, sól Sn²⁺ w ilości 0,002-0,01 części wagowych Sn2+ na 1 część wagową d,l-bis-oksymu 4,8-diaza-3,6,6,9-tetrametyloundekano-2,10dionu oraz 5-150 części wagowych pirofosforanu metalu alkalicznego lub amonowego na 1 część wagową d,l-bis-oksymu 4,8-diaza-3,6,6,9-tetramietyloundekano-2,10-dionu.

Okazało się ponadto, że przez zmianę zawartości pirofosforanu można regulować optymalny czas inkubacji zestawu diagnostycznego o powyższym składzie, to jest, wpływać na zmianę zawartości rozpuszczalnego w lipidach kompleksu ^99mTc-d,l-HM-PAO powstającego po wprowadzeniu znakowanej soli nadtechnetanu w funkcji czasu. Jeśli zestaw diagnostyczny zawiera 5-10 części wagowych pirofosforanu metalu alkalicznego lub amonowego na 1 część wagową d,l-HM-PAO, to zawartość rozpuszczalnej w lipidach frakcji kompleksu ^^mTc-d,l-HM-PAO wynosi powyżej 90% i pozostaje niezmieniona przez przynajmniej 120 minut. Jeśli zestaw diagnostyczny zawiera 100-150 części wagowych pirofosforanu metalu alkalicznego lub amonowego na 1 część wagową d,l-HMPAO, to zawartość rozpuszczalnej w lipidach frakcji kompleksu ^mTc-d,l-HM-PAO osiąga maksymalną wartość 90% po około 30 minutach od wprowadzenia znakowanej soli nadtechnetanu i wartość ta pozostaje praktycznie niezmieniona przez około 90 minut. Tak więc, przez odpowiednią zmianę składu zestawu diagnostycznego można doprowadzić optymalny czas inkubacji do wartości najlepiej dostosowanej do rzeczywistych warunków w danym laboratorium. W aspekcie niezawodności badań diagnostycznych, fakt, że zawartość rozpuszczalnego w lipidach kompleksu ^Tc-dJ-HM-PAO pozostaje na poziomie około 90% przez dłuzszy okres czasu należy uznać za podstawową zaletę zestawu.

D,1-HM-PAO, stosowany jako składnik w zestawie diagnostycznym oraz jako substancja wyjściowa w sposobie według wynalazku, wytwarza się według przepisu podanego w publikacji zgłoszenia patentowego europejskiego, EP nr 179 608, przez redukcję bis-oksymu 4,8-diaza-3,3,9trimetylo-dodeka-8-eno-2,10-dionu borowodorkiem sodowym. Substancję wyjściową wytwarza się w trzyetapowej syntezie z 3-chloro-3-metylo-2-niirozobutanu. Według publikacji zgłoszenia patentowego europejskiego nr EP 194 843, d,l-HM-PAO wytwarza się w reakcji monooksymu

2,3-butanodionu z 2,2^<^iii^(^tt^yl^-l,3-propanodiaminą wobec kwasu octowego, utrzymując reagenty w stanie wrzenia, w benzenie. W obydwu metodach uzyskuje się HM-PAO jako mieszaninę diastereoizomerów d,l i mezo. Spośród tych diastereoizomerów, forma mezo nie przechodzi do mózgu, a więc, nie może być stosowana w praktyce diagnozowania mózgu, metodami radiologicznymi.

izomerem mającym zastosowanie do celów diagnostycznych jest forma d,l-HM-PAO. Na ogół, w znanych sposobach uzyskuje się formę mezo jako główny produkt, natomiast żądaną formę d,l izoluje się wykonując długą procedurę oczyszczania z bardzo niską wydajnością, około 6%.

Okazało się, że formę d,l-HM-PAO można otrzymać z wydajnością znacznie przewyższającą wydajności deklarowane w znanych metodach jeśli oksym 3-chloro-2-butanonu podda się reakcji z 2,2-dimetylo-l,3-propylenodiammą, powstałą mieszaninę zawierającą formy d,l i mezo HM-PAO wielokrotnie się krystalizuje w celu selektywnego usunięcia formy mezo nie mającej zastosowania do celów diagnostycznych, roztwory macierzyste po krystalizacjach odparowuje się uzyskując formę d,l i jeśli to potrzebne, uzyskany izomer d,l oczyszcza się dalej przez krystalizację.

Oksym 3-chloro-2-butanonu poddaje się reakcji z 2,2-dimetyko-l,3-propylenodiaminą, na ogół w temperaturze -15°C do -25°C. Korzystnie, reagenty stosuje się w ilościach stechiometrycznych. Otrzymaną mieszaninę izomerów korzystnie rekrystalizuje się z octanu etylowego i/lub acetonitrylu. Rekrystalizację prowadzi się korzystnie w temperaturze pokojowej. Przy rekrystali162 292 zacji, forma mezo wytrąca się w postaci osadu a forma d,l pozostaje rozpuszczona w roztworze macierzystym. Izomer d,l otrzymany przez odparowanie roztworu macierzystego zawiera około 10% zanieczyszczenia formą mezo już po pierwszej rekrystalizacji. Po dodatkowych czterech lub pięciu rekrystalizacjach zawartość formy mezo można obniżyć poniżej 1%.

Wynalazek jest zilustrowany przykładami, przy czym przykład I dotyczy wytwarzania d,l-HM-PAO.

Przykład I. Wytwarzanie bis-oksymu d,l-4,8-diaza-3,6,6,9-tetrametyloundekano-2,10dionu (d,l-HM-PAO).

Etap a/ Wytwarzanie oksymu 3-chloro-2-butanonu. Ilość 151,8 g (2,2 mola) chlorowodorku hydroksyloaminy rozpuszcza się w 200 ml wody i do roztworu dodaje się kroplami, mieszając, podczas chłodzenia, zimny roztwór 88 g (2,2 mola) wodorotlenku sodu w 200 ml wody. Następnie, do mieszaniny, również podczas mieszania i chłodzenia dodaje się kroplami 213,10 g (2,0 mole)

3-chloro-2-butanonu. Mieszaninę reakcyjną miesza się, chłodząc, przez 4 godziny, pozostawia do ogrzania do temperatury pokojowej i miesza w temperaturze pokojowej przez 8 godzin. Wytrąconą małą ilość osadu przesącza się, oddziela się fazę organiczną przesączu a fazę wodną poddaje się ekstrakcji eterem. Roztwory organiczne łączy się, suszy nad siarczanem sodowym, przesącza i odparowuje się przesącz. Otrzymuje się 170 g (70% wydajności) surowego oksymu 3-chloro-2butanonu. Substancję czystą analitycznie, wrzącą w temperaturze 145°C przy 533,29 Pa można otrzymać przez destylację.

Analiza: Dla wzoru: CiHeNOCl

Wyliczono: C 39,52%, H 6,63% N 11,52% Cl 29,16%

Otrzymano: C 39,10% , H 6,95% N 11,23% C 1 28,75%

Ilość 20 g (0,2 mola) 2,2-dimetylo-1,3-propylenodiaminy rozpuszcza się w 200 ml bezwodnego alkoholu, dodaje się 20 g drobno sproszkowanego węglanu sodowego, miesaninę oziębia się do temperatury -20°Ci dodaje się kroplami roztwór 48,4 g (0,4 mola) oksymu 3-chloro-2-butanonu w 200 ml bezwodnego alkoholu. Mieszaninę miesza się przez 2 godziny podczas chłodzenia, pozostawia się do ogrzania do temperatury pokojowej i następnie utrzymuje się w stanie łagodnego wrzenia w czasie 12 godzin. Mieszaninę przesącza się, odparowuje się alkohol, olejową pozostałość rozpuszcza się w acetonitrylu i pozostawia się mieszaninę do krystalizacji. Otrzymuje się 22 g (40% wydajności) żądanego produktu w postaci mieszaniny (1:1) izomerów d, 1 i mezo. Temperatura topnienia: 122°-124°C.

Etap c/ rozdzielanie form d, 1 i mezo HM-PAO.

Ilość 22 g surowego produktu otrzymanego w etapie b/ rekrystalizuje się siedem do dziewięciu razy z acetonitrylu. Czysty izomer mezo (7,5 g) uzyskuje się w postaci drobnych bezbarwnych igieł o temperaturze topnienia 150-151°C

Analiza: Dla wzoru: C13H28N4O2 Wyliczono: C 57,32% , H 10,36% N 20,56%

Otrzymano: C 56,98% , H 10,48% N 20,26%

Roztwory macierzyste z etapu rekrystalizacji łączy się i odparowuje. Pozostałość rozpuszcza się w dużej ilości acetonitrylu i pozostawia się do krystalizacji w temperaturze pokojowej. Wytrącone kryształy, zawierające głównie izomer mezo, przesącza się i odparowuje się roztwór macierzysty. Pozostałość rekrystalizuje się pięć lub sześć razy z octanu etylowego. Czysty izomer d,l otrzymuje się w postaci dużych, bezbarwnych płytek o temperaturze topnienia 129-130°C. Wydajność: 5g.

Widmo IR: (w paletce KBr): charakterystyczne maksima przy 3300, 2400, 1460 1 1670 cm’\

Widmo NMR (DMSO-d6, 250 MHz): charakterystyczne sygnały przy 1,07 (6H,d, CHMe), 0,78 (6H, s, CMe₂), 1,50 (2H, b, NH), 1,65 (6H, s, CNMe) 2,12 (4H, m, CH₂N), 3,14 (2H, q, OH) i 10,24 (2H, s, OH) ppm.

Rf = 0,4 (płytka z żelem krzemionkowym G, rozpuszczalnik: metanol, wizualizacja parami jodu).

Analiza: Dla wzoru: C13H28N4O2 Wyliczono: C 57,32%, H 10,36% N 20,56%

Otrzymano: C 57,15%, H 10,58% N 20,42%

162 292

Zmiany zawartości izomeru mezo po kolejnych etapach rekrystalizacji są przedstawione w tabeli 1.

Tabela 1

Kolejny etap rekrystalizacji	Rozpuszczalnik użyty do rekrystalizacji	Ogólna ilość substancji (g)	Zawartość izomeru mezo HM-PAO (%)
0 (wartość wyjściowa)	-	22,0	50
1	acetonitryl	10,0	12,0
2	octan etylowy	9,2	8,2
3	octan etylowy	8,5	6.0
4	octan etylowy	7,1	3,1
5	octan etylowy	6,2	1,3
6	octan etylowy	5,0	0,4

	Przykład II. Zestawy diagnostyczne. Przygotowuje się testy diagnostyczne o następujących składach:
A.	d.l-HM-PAO	0,30 mg
	Dwuwodzian chlorku cynawego	0,0038 mg
	Dziesięciowodzian pirofosforanu sodowego (pH 9,0-9,8)	2,52 mg
B.	d,l-HM-PAO	0,30 mg
	Dwuwodzian chlorku cynawego	0,0076 mg
	Dziesięciowodzian pirofosforanu sodowego (pH 9,0-9,8)	2,52 mg
C.	d,l-HM-PAO	0,30 mg
	Dwuwodzian chlorku cynawego	0,0019 mg
	Dziesięciowodzian pirofosforanu sodowego (pH 9,0-9,8)	2,52 mg
D.	d,l-HM-PAO	0,30 mg
	Dwuwodzian chlorku cynawego	0,0038 mg
	Dziesięciowodzian pirofosforanu sodowego	42,52 mg
	Przykład III. Wytwarzanie kompleksów ^mTc-d,l-HM-PAO.
	Ilość d.l-HM-PAO podaną w punktach A., B., C., D. przykładu II rozpuszcza się w bezwod-

nym etanolu wysyconym gazowym azotem i do tego roztworu dodaje się w atmosferze azotu wodny roztwór odpowiedniej ilości dwuwodzianu chlorku cynawego i dziesięciowodzianu pirofosforanu sodowego wysyconego azotem. Do powstałej mieszaniny dodaje się eluat ^99mnadtechmetanu (aktywność: 370-1110 MBq/5.0 ml) otrzymany z generatora ⁹⁹Mo-^99mTc. Czystość radiochemiczną uzyskanych produtków w funkcji czasu oznacza się metodą radiochromatografii (płytka „Gelman ITLC/SG‘‘ o wymiarach 2.5 cm X 20 cm, rozpuszczalnik: keton metylowo-etylowy; płytka „Gelman ITLC/SG“ o wymiarach 2.5cmX20cm, rozpuszczalnik: 0.9% (wagowo-objętościowo) wodny roztwór chlorku sodowego; bibuła Whatman nr 1 o wymiarach 2.5 cm X 30 cm, rozpuszczalnik: mieszanina acetonitrylu i wody (1:1, objętościowo).

W tabeli 2 podana jest procentowa zawartość rozpuszczalnej w lipidach frakcji ^99mTc-d,lHM-PAO w otrzymanych produktach w funkcji czasu inkubacji.

Tabela 2

Czas inkubacji (w minutach) A	Rozpuszczalna w lipidach frakcja 99mTc-d,l-HM-PAO (w %)
B	C	D
1	91 62	93 91	83 23	33 47
5	94.05	91 77	91 53	53 37
15	94 77	85 19	89 78	74.12
30	94 47	85 30	89 46	91 50
60	93 19	81 22	89 36	90 26
120	92 99	78 79	80.73	88 57

162 292

Przykład IV. Próby kwalifikacyjne i kontrolne.

Odczynnik diagnostyczny zawierający kompleks ^mTc-d,l-HM-PAO, wytworzony według przykładu III z zestawu diagnostycznego o składzie podanym w przykładzie IIA, poddaje się następującym testom kwalifikacyjnym i kontrolnym.

A. Analiza HPLC. Analizę HPLC prowadzi się na kolumnie BIO-RAD RF-318 z dwiema pompami BIO-RAD 1330, stosując chromatografię gradientową. Pomiary radioaktywności wykonuje się w detektorze scyntylacyjnym NaJ połączonym z licznikiem. Sygnały na liczniku są drukowane i przedstawiane graficznie na rejestratorze Χ-Υ. Na starcie chromatografii podaje się 0,02 molowy roztwór buforowy NaHaPO4 zawierający 2% metanolu jako środek eluujący. Po upływie pół minuty od wstrzyknięcia 20μ\ próbki, do systemu dodaje się acetonitryl według programu gradientu liniowego w taki sposób, że w czasie 5 minut ilość acetonitrylu wzrasta do 75% (objętościowo). Eluowanie kontynuuje się przez 4,5 minuty mieszaniną zawierającą 75% acetonitrylu (objętościowo), następnie, w czasie 1,5 minuty zawartość acetonitrylu zwiększa się do 100%. Ten poziom utrzymuje się przez 9,5 minuty a następnie środek eluujący zmienia się na bufor startowy w czasie minuty. Szybkość przepływu środka eluującego ustawia się na 1 ml/min.

Oznaczenia HPLC prowadzi się po 5,35,65,95,125,155 i 185 minutach oraz po 24 godzinach od znakowania zestawu diagnostycznego technetem ^99mTc. Czas retencji jonu ^99mTcO4^_ wynosił 2,3 minuty a czas retencji kompleksu ^mTc-d,l-HM-PAO wynosił 8,4 minuty.

Udział procentowy, tych dwu pików w frakcji czasu jest przedstawiony w tabeli 3.

Tabela 3

Czas od znakowania (minuty)	M^lTtOi	Kompleks 99TTc-d. 1-HM-PAO (%)
5	1	99
35	1	99
65	1	99
95	2	98
125	4	96
155	6	94
185	8	92
24 godziny	54	46

B. Oznaczanie leukocytów. Zawiesinę leukocytów uzyskaną przez sedymentację z próbki krwi antykoagulowanej z 30 ml mieszaniny roztworu cytrynianu sodowego i dekstranu przemywa się dwukrotnie płynem fizjologicznym zawierającym 3,0 ml buforu fosforanowego. Następnie, do tej zawiesiny leukocytów dodaje się podczas mieszania 0,25 ml roztworu odczynnika sporządzonego z zestawu diagnostycznego o składzie podanym w przykładzie 2A i dokonuje się pomiarów radioaktywności związanej z leukocytami w funkcji czasu. Inkubację prowadzi się w temperaturze pokojowej. Otrzymano następujące wyniki: 2 minuty - 62%, 5 minut - 81%, 10 minut - 90%.

C. Oznaczanie biodystrybucji. Oznaczenia odczynnika diagnostycznego w organizmie wykonuje się na szczurach rasy CFY/Wistar obydwu płci, o wadze 110-120 g.

Do żyły udowej szczurów w normalnym stanie nawodnienia, pozbawionych pożywienia pizez 24 godziny i uśpionych nembutalem wstrzykuje się 0,2 ml radiofarmaceutyku (14,8-44,4 MBq). Po 2,30 lub 60 minutach dokonuje się dekapitacji, usuwa się organy zwierząt i poddaje się je hydrolizie w 20% (wagowo) wodnym roztworze wodorotlenku potasowego w łaźni parowej. Z hydrolizatów organów pobiera się próbki i w próbkach tych oznacza się radioaktywność. Radioaktywność tę wyraża się w procentach w stosunku do aktywności wstrzykniętej. Wyniki są przedstawione w tabeli 4.

162 292

Tabela 4

Organ	2 nfrniity />SD/’	30 minut />SD/	60 minut />SD/
Krew	9,69	9,11	8,55
	/3,46/	/3,15/	/4,16/
Mózg	2,18	1,79	1,92
	/0,23/	/0,51/	/0 36/
Mięśnie	17,17	14,96	11,08
	/3.62/	/4,18//	/1,28/
Serce	0,74	0,46	0.40
	/0,15/	/0,08/	/0,12/
Płuca	2,27	2,12	1,90
	/0,06/	/0,25/	/0,63/
Wątroba	16,22	14,31	11,80
	/4,81/	/2,33/	/1,41/
Nerki	2,66	3,13	3,60
	/1,16/	/0,16/	/0,31/
Sledz.iona	0,49	0,45	0,39
	/0,35/	/0,21/	/0,09/
Żołądek	1,23	1,87	1,49
	/0,61/	/0,64/	/0,72?/
Jelita	5,07	1,48	2,90
	/2,06//	/^1,41/	/3,46/

'/ odchylenie średnie kwadratowe,/.

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania bis-oksymu d, 1-4,8-diaza-3,6,6,9-tetrametyIoundekano-2,10-dionu znakowanego technetem 99^mTc w reakcji znakowanej soli nadtechnetanu z bis-oksymem d,1,4-8diaza-3,6,6,9-tetrametyloundekano-2,10-dionu wobec soli dwuwartościowej cyny, znamienny tym, że sól dwuwartościowej cyny stosuje się w postaci kompleksu z pirofosforanem metalu alkalicznego lub amonowym.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sól dwuwartościowej cyny stosuje się w postaci kompleksu z pirofosforanem sodowym.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w atmosferze gazu obojętnego.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w zakresie odczynu pH 9-10.