Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych pochodnych polipeptydów uzytecznych do hamowania rozszczepiajacego dzialania enzymu, reniny, na angiotensynogen.Renina, enzym proteolityczny o ciezarze cza¬ steczkowym okolo 40 000, jest produkowana i wy¬ dzielana do krwi przez nerki. Znana jest jej aktywnosc in vivo w rozszczepianiu wystepujacej naturalnie, plazmatycznej glikoproteiny, angioten- syngenu. W przypadku angiotensyngenu ludzkiego renina rozszczepia wiazanie pomiedzy leucyna {10 ta) i walina <11 ta) reszta aminokwasowa na N-terminalnym koncu angiotensyngenu o wzorze 4.Krazacy, N-terminalny dekapeptyd, angiotensyna I, wytwarzany w wyniku omówionego wyzej, roz¬ szczepiajacego dzialania reniny, ulega dalszemu rozszczepiajacego dzialania tego enzymu do okta- peptydu, znanego jako angiotensyna II. Angioten¬ syna II jest znana jako silnie dzialajaca substan¬ cja podnoszaca cisnienie krwi, czyli substancja zdolna do wywolania znacznego wzrostu cisnienia krwi, i jak sie sadzi, do dzialania przez wywola¬ nie zwezenia naczyn krwionosnych i uwalnianie z gruczolu nadnerczego aldosteronu, hormonu utrzymujacego sód. Dlatego tez, uklad renina—an¬ giotensynogen wystepuje jako czynnik sprawczy w pewnych postaciach nadcisnienia.Srodkiem lagodzacym niekorzystne wplywy fun¬ kcjonowania ukladu renina—angiotensynogen jest 10 15 20 25 podawanie substancji wplywajacej hamujaco na rozszczepiajace dzialanie reniny na angiotensyno¬ gen. Znanych jest wiele takich substancji, a wsród nich przeciwciala, antyreniny, pepstatyna i wyste¬ pujace naturalnie zwiazki fosfolipidowe. Znane sa inhibitujace renine pochodne polipeptydowe o wzorze X-Y-Pro-Phe-His-A-B-Z-W, w którym X moze oznaczac atom wodoru lub grupe ochronna grupy aminowej, Y moze nie wystepowac, B ozna¬ cza lipofilowa reszte aminokwasu, Z oznacza resz¬ te aromatycznego aminokwasu, W moze oznaczac grupe hydroksylowa, a A moze oznaczac miedzy innymi grupe o wzorze 5, w którym kazdy R1 i Rf oznacza lipofilowy lub aromatyczny lancuch boczny, zgodnie z okresleniami podanymi w publi¬ kacji europejskiego zgloszenia patentowego nr 45 665 nie bierze sie w rachube przypadku, zeby albo A albo Z we wzorze moglo oznaczac statyne lub, zeby B w tym wzorze moglo oznaczac lizyne.Znane sa inhibitujace renine zwiazki polipepty¬ dowe zawierajace reszte nieterminalnej statyny lub pochodnej statyny. W tej grupie zwiazków sa takie, które zawieraja sekwencje fenyloalanina— histydyna—statyna. Jednak omawiana publikacja nie ujawnia przypadku umieszczenia lizyny bez¬ posrednio po sekwencji -Phe-His-Sta.Stwierdzono obecnie, ze pewne nowe zwiazki sa uzyteczne jako srodki inhibitujace renine. Te no¬ we zwiazki sa nowymi pochodnymi polipeptydów 147 021147 621 o wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru, ugrupowanie acylowe, chroniace grupe aminowa, o ciezarze czasteczkowym nizszym niz 500, proline, proline z chroniona grupa aminowa, kwas piro- glutaminowy lub kwas piroglutaminowy z chro¬ niona grupa aminowa, W oznacza fenyloalanine, W1 oznacza histydyne, przy czym atom azotu wia¬ zania peptydowego pomiedzy W i W1 jest ewen¬ tualnie podstawiony grupa alkilowa o 1—4 ato¬ mach wegla, R2 oznacza atom wodoru, grupe alki¬ lowa o 1—6 atomach wegla, grupe cykloalkilowa o 4—7 atomach wegla lub grupe cykloalkilo(alki- lenowa) o 5—10 atomach wegla, R3 oznacza grupe hydroksylowa lub aminowa, a R1 oznacza ugru¬ powanie (a) o wzorze -A-E-B, w którym A ozna¬ cza lizyne lub proline, albo dodatkowo, jezeli R3 we wzorze 1 oznacza grupe aminowa lub, jezeli atom azotu wiazania peptydowego pomiedzy W i W1 jest podstawiony grupa alkilowa o 1—4 ato¬ mach wegla, A oznacza izoleucyne, E oznacza fe¬ nyloalanine, B oznacza grupe OH, (b) o wzorze 2, w którym X oznacza wiazanie chemiczne lub ala¬ nine, izoleucyne lub lizyne, kazdy Z i Z1 oznacza atom wodoru, grupe alkilowa o 1—6 atomach we¬ gla, grupe cykloalkilowa o 4—7 atomach wegla, grupe cykloalkilo(alkilenowa) o 5—10 atomach we¬ gla lub grupe fenyloalkilowa o 7—9 atomach we¬ gla, nim oznaczaja zero lub liczby calkowite od 1 do 6, Q oznacza grupe —CHz—, —CH=CH—, —O—, —NH—, =CH(OH)— lub =C(0)—, Y ozna¬ cza grupe metylowa, fenylowa, grupe o wzorze —COOR*R7, grupe —NHa, grupe (benzyloksy)kar- bonyloaminowa, grupe o wzorze —CO—kwas glu¬ taminowy i(—OR82, —CO—kwas glutaminowy (—OR8)(—NR6R7} lub —CO—kwas glutaminowy (—NReR7)2, w których to wzorach kazdy R6 i R7 oznacza atom wodoru, grupe alkilowa o 1—4 ato¬ mach wegla, grupe fenyloalkilowa o 7—9 atomach wegla lub grupe cykloalkilo atomach wegla, (c) grupe 1,2,3,4-tetrahydrochino- lin-1-ylowa, (d) grupe 1,2,3,4-tetrahydroizochinolin- -2-ylowa, (e) grupe l,2,3,4-tetrahydro-3-aminokar- bonyloizochinolin-2-ylowa, (f) grupe 1,2,3,4-tetra- hydro-3-metoksykarbonyloizochinolin-2-ylowa, (g) grupe l,2,3,4,5,6,7,8-dekahydro-3-metoksykarbonylo- izochinolin-2-ylowa, (h) grupe 4-fenylometylopipe- rydyn~l-ylowa lub (i) grupe o wzorze -prolina-B, w którym B ma wyzej podane znaczenie. Zwiazki o wzorze 1 moga miec postac dopuszczalnych far¬ makologicznie soli.Nalezy zauwazyc, ze pewne zwiazki sa szczegól¬ nie korzystne, przy czym w kazdym przypadku, jezeli w opisie jest mowa o korzystnych zwiazkach o wzorze 1, to ich zalety sa oceniane z punktu widzenia ich skutecznosci przeciwnadcisnieniowej (IC50 w jjim reniny ludzkiej), a sa to takie zwiazki, w których we wzorze 1 R oznacza ugrupowanie acylowe chroniace grupe aminowa lub proline z chroniona grupa aminowa, R2 oznacza grupe izo- butylowa lub cykloheksylo(metylenowa), R3 ozna¬ cza grupe hydroksylowa, a R1 ma znaczenie po¬ dane wyzej w punkcie (a), (b) lub (i), z tym, ze jezeli R1 ma znaczenie podane w punkcie (a), to A oznacza lizyne, a jezeli R* ma znaczenie poda¬ ne w punkcie (b), to X oznacza lizyne.Sposób wytwarzania zwiazków o wzorze 1 we- 5 dlug wynalazku polega na tym, ze (A) acyluje sie zwiazek o wzorze 3 lub jego kwasowa sól addy¬ cyjna, w którym to wzorze 3 R1, R2, R* i W1 maja wyzej podane znaczenie, a dowolne grupy reak¬ tywne w R1 i R3, o ile sa obecne, sa chronione l0 odpowiednimi grupami ochronnymi, zwiazkiem o wzorze R-W-OX, w którym R i W maja wyzej podane znaczenie, -OX oznacza ugrupowanie kar¬ boksylowe aktywowane do acylowania, (B) usuwa sie grupy ochronne, o ile istnieja, ze wspomnia- 15 nych grup reaktywnych R* i R3 i (C) ewentualnie otrzymany zwiazek o wzorze 1 przeksztalca sie w farmakologicznie dopuszczalna sól addycyjna lub w sól zasadowa.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalaz- 20 ku maja in vivo dzialanie przeciwnadcisnieniowe wobec ssaków, w tym ludzi. Co najmniej znaczna .czesc tej aktywnosci wynika z ich zdolnosci ha¬ mowania rozszczepiania angiotensynogenu przez renine. Bez zamiaru ograniczania sie nastepuja- 25 cym, teoretycznym mechanizmem, prawdopodobne jest, ze mechanizm hamowania aktywnosci reniny zwiazkami wytwarzajacymi sposobem wedlug wy¬ nalazku polega na ich selektywnym, w porówna¬ niu z angiotensynogenem, wiazaniu sie z renina. 30 Z powodu ich niskich ciezarów czasteczkowych, zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku wykazuja korzystne charakterystyki rozpuszczal¬ nosci w srodowisku wodnym, co czyni latwym podawanie doustne, i moga byc syntetyzowane na 35 skale techniczna po realistycznych kosztach. Zwiaz¬ ki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku sa równiez uzyteczne jako srodki moczopedne.Okreslenie „dopuszczalne farmakologicznie" sole oznacza takie sole, które sa nietoksyczne w stoso- 40 wanych dawkach. Poniewaz zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku moga zawierac za¬ równo grupy zasadowe jak i kwasowe, mozliwe sa tak kwasowe, jak i zasadowe sole addycyjne.Dopuszczalne farmakologicznie, kwasowe sole 45 obejmuja np. sole chlorowodorowe, bromowodoro- we, jodowodorowe, siarczanowe, wodorosiarczano- we, mesylanowe, fumaranowe, cytrynianowe, kwas¬ ne cytrynianowe, winianowe, wodorowinianowe, bursztynianowe, glukonianowe i cukronowe. Do- 50 puszczalne farmakologicznie, zasadowe sole addy¬ cyjne obejmuja np. sole sodowe, potasowe, wap¬ niowe i magnezowe. Do wytwarzania addycyjnych soli kwasowych i zasadowych stosuje sie znane metody. 35 Jak wspomniano grupa R na N-terminalnym koncu zwiazku o wzorze 1, która jest zwiazana z azotem a reszty W, wybrana jest z grupy obej¬ mujacej atom wodoru, ugrupowania acylowe chro¬ niace grupe aminowa o ciezarze czasteczkowym 60 mniejszym niz 500, proline, proline z chroniona grupa aminowa, kwas piroglutaminowy i kwas piroglutaminowy z chroniona grupa aminowa. Win¬ no byc zrozumiale, ze grupa chroniaca grupe ami¬ nowa proliny z chroniona grupa aminowa lub 65 kwasu piroglutaminowego z chroniona grupa ami-147 621 nowa jest równiez ugrupowaniem acylowym, chro¬ niacym grupe aminowa, o ciezarze czasteczkowym nizszym niz 500. Okreslenie „ugrupowania acylo- we chroniace grupe aminowa" dotyczy tych grup acylowych, które sa zdoilne do znacznego hamo¬ wania reakcji przy azocie a grupy W lub proliny lub kwasu piroglutaminowego in vivo, po podaniu doustnym. R ma ciezar czasteczkowy nizszy niz 500, w celu unikniecia nadmiernie niekorzystnego wplywu na rozpuszczalnosc zwiazku o wzorze 1.Przykladami odpowiednich, chroniacych grupe aminowa, ugrupowan acylowych sa dobrze znane fachowcom grupy, np. ugrupowanie Illrzed.-butylo- ksykarbonylowe, Illrzed.-butyloacetylowe, benzylo- ksykarbonylowe, Illrzed.-butyloureidowe, (tris-hy- droksyMIIIrzed.-butyloureidowe) i fenoksyacetylo- we.Uzywany w tekscie wzór -CO-kwas glutamino¬ wy cowych, które sa amidowane przy weglu b kwasu glutaminowego i grup C-koncowych, które sa es¬ tryfikowane przy weglu 8 kwasu glutaminowego.Jak wspomniano wczesniej, jedna korzystna gru¬ pa zwiazków o wzorze 1 sa te zwiazki, w których R3 oznacza grupe hydroksylowa, a Ra oznacza grupe izobutylowa lub cykloheksylowa(metyleno- wa), a korzystniej te druga, tak ze ugrupowanie o wzorze 6 staje sie -statyna- lub cyklostatyna-, R we wzorze 1 oznacza chroniace grupe aminowa ugrupowanie acylowe o ciezarze czasteczkowym mniejszym niz 500 lub proline z chroniona grupa aminowa, W1 oznacza histydyne polaczona z W wiazaniem peptydowym, a R1 oznacza grupe -Lys- -Z-B, -Pro-B lub grupe o wzorze 7. Umieszczenie reszty lizynowej (zamiast, na przyklad reszty leu- cynowej, izoleucynowej, walinowej lub alaninowej) tuz po ugrupowaniu —fenyloalanina—histydyna— (statyna lub cyklostatyna)— nieoczekiwanie powo¬ duje powazny wzrost czasu trwania aktywnosci hamowania reniny in vivo.Inna korzystna grupa zwiazków o wzorze 1 sa te zwiazki, w których R oznacza chroniace grupe aminowa ugrupowanie acylowe o ciezarze czastecz¬ kowym nizszym niz 500 lub proline z chroniona grupa aminowa, W1 oznacza histydyne polaczona z W wiazaniem peptydowym, R3 oznacza grupe hydroksylowa, R2 oznacza grupe izobutylowa lub cykloheksylo(metylenowa), korzystniej te druga, a R1 oznacza grupe o wzorze 2. Redukcja charakte¬ ru peptydowego tej czesci czasteczki, która sa¬ siaduje z C-terminalnym koncem, powoduje wzrost absorpcji tego zwiazku przez krew, po wprowa¬ dzeniu go droga doustna. Jezeli n i m we wzorze 2 oznaczaja zero, Z oznacza grupe izobutylowa, Q oznacza grupe —CH(OH)—, Z1 oznacza atom wo¬ doru, a Y oznacza grupe karboksylowa, to R1 sta¬ je sie grupa —X—statyna.Jako korzystny czynnik acylujacy stosuje sie zwiazek o wzorze R-W-OX, w którym R oznacza grupe Illrzed.-butoksykarbonylowa lub N-(IIIrzed.- -butoksykarbonylo)proline, a W i X maja wyzej podane znaczenie.Korzystnie acyluje sie sposobem wedlug wyna¬ lazku zwiazek o wzorze 3, w którym Rf, R3 i W1 maja wyzej podane znaczenie, a R1 oznacza grupe o wzorze 2, w którym Z oznacza grupe izobutylo¬ wa, Q oznacza grupe -CH(OH), Z* oznacza atom 5 wodoru, kazdy n i m oznacza 0, a X i Y maja wyzej podane znaczenie, albo zwiazek o wzorze 3, w którym R», R3 i W* maja wyzej podane zna¬ czenie, a Rl oznacza grupe o wzorze 2, w któryta Z1 oznacza atom wodoru, Q oznacza grupe —CH*—, 10 Y oznacza grupe o wzorze -COOR« lub -CONRW, -CO-kwas glutaminowy minowy (-OR«) (-NR«R* lub -CO-kwas glutamino¬ wy (-NRW), w których to wzorach R« i R* maja wyzej podane znaczenie, Z oznacza grupe alkilo- 15 wa o 1—6 atomach wegla, suma n i m wynosi od 0 do 3, a X ma wyzej podane znaczenie, albo zwiazek o wzorze 3, w którym R«, R3 i W1 maja wyzej podane znaczenie, R* oznacza grupe o wzo^ rze 2, w którym Z1 oznacza grupe benzylowa lub s0 IIrzed.-butylowa, a Q, Z, Y, X, m i n maja wyzej podane znaczenie.Sposób wytwarzania zwiazków o wzorze 1 we¬ dlug wynalazku obejmuje, jak wspomniano, jako podstawowy etap acylowania niechronionej grupy as a-aminowej reszty aminokwasu, aminokwasem za¬ wierajacym aktywowana dla celów acylowania grupe karboksylowa i odpowiednia grupe ochron¬ na przylaczona do jego wlasnego azotu a, przy czym otrzymuje sie wiazanie peptydowe pomiedzy 30 dwiema resztami aminokwasowymi, a nastepnie polega na usunieciu wspomnianej grupy ochron¬ nej. Ta synteza podjednostki obejmujaca sprzega¬ nie — odblokowywanie dokonywana kilkakrotnie prowadzi do narastania polipeptydu poczawszy od 35 C-terminalnego konca struktury syntetyzowanej czasteczki az do N-terminalnego konca. Wykorzy¬ stywane w syntezie prowadzonej sposobem wedlug wynalazku a aminokwasy sa dostepne w handlu jako wolne kwasy, sole lub estry itp. w obu po- 40 staciach a-amino chronionej i a-amino niechro¬ nionej. Statyna jest dostepna w handlu jako N- -(Illrzed.-butyloksykarbonylo)-statyna. Ponadto sta- tyne mozna wytwarzac w postaci kwasu lub estru w obu postaciach, y-amino chronionej i y-amino 45 niechronionej sposobami zaczerpnietymi z literatu¬ ry (patrz np. opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 397 786 i D. H. Rich i in., Jour. Org. Chem., 43, str. 3624 i nastepne (1978)). W razie potrzeby odpowiedni analog N-niechronionego aminokwasu, 50 w postaci kwasu, soli lub estru itp., takiego jak kwas 4-aminomaslowy, 4-aminowalerianowy lub 4- -amino-4-IIrzed.-butylomaslowy stosuje sie jako reagent w pierwszym etapie sprzegania. Odpo¬ wiednie pochodne statyny mozna wytwarzac zna- 55 nymi metodami syntezy. Na przyklad, zwiazek o wzorze 8, czyli aminostatyne otrzymuje sie w postaci zwiazku z obiema grupami aminowymi chronionymi przez podanie estru statyny z chro¬ niona grupa aminowa reakcji z chlorkiem sulfo- 60 nylu, przy czym otrzymuje sie ester sulfonianu, który poddaje sie reakcji z azydkiem sodu i otrzy¬ muje sie ester kwasu 4-izobutylo-l-propenokarbo- ksylowego z chroniona grupa aminowa i ester kwasu 4-izobutylo-3-azydomaslowego z chroniona w grupa aminowa, poddaje sie zwiazek z grupa alke-i 147 621 8 nylokarboksylowa reakcji z pierwszorzedowa ami¬ na i/lub uwodornia sie zwiazek azydowy, a na¬ stepnie redukuje sie otrzymany zwiazek przejscio¬ wy wodorkiem metalu alkalicznego, w obecnosci acylowych, które sa zdolne do znacznego hamo- padkach, pochodna 4-izobutylo-3-IIr(Zed.-aminowa kwasu maslowego, uwodornia te 4-izobutylo-3-II- rzed.-aminowa pochodna kwasu maslowego, a na¬ stepnie otrzymany zwiazek poddaje sie reakcji z halogenkiem alkilowym, w warunkach zasado¬ wych. Zwiazki o wzorze 9 z chroniona grupa ami¬ nowa, w którym to wzorze skrót Ochr. oznacza grupe ochronna, okreslane w tekscie jako N-chro- nione zwiazki cyklostatynowe, wytwarza sie przez uwodornienie kwasu 4-amino-4-fenylometylo-4-hy- droksymaslowego z chroniona grupa aminowa, któ¬ ry z kolei otrzymuje sie w sposób podany przez D. H. Richa i in., Jour. Med. Chem., 23(1), str. 27—33 (1980.Zredukowane wiazanie peptydowe, czyli -CO-za- stapione, -CHa- w zwiazku wytwarzanym sposo¬ bem wedlug wynalazku o wzorze 1, w którym R1 oznacza grupe o wzorze 2, w którym n oznacza co najmniej liczbe 1, a Q oznacza grupe -NH-, mozna wytworzyc przez redukcje aldehydu o wzo¬ rze i0, w którym skrót Ochr. oznacza grupe ochronna grupy aminowej, w obecnosci estru ami¬ nokwasu o wzorze 11, w którym R6 ma inne zna¬ czenie niz atom wodoru.Aktywnosc zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku jako inhibitorów zdolnosci re¬ niny do rozszczepiania angiotensynogenu mozna okreslic badajac (1) ich zdolnosc do hamowania rozszczepiajacego dzialania reniny na angiotensy- nogen in vitro i (2) ich zdolnosc do przeciwdzia¬ lania egzogennej, wywolanej renina, reakcji pre- sprowej in vivo. Inhibitowanie rozszczepiajacej an- giotensynogen aktywnosci reniny badano in vitro.Plazme krwi otrzymana od zdrowego personelu laboratoryjnego polaczono i przechowywano w sta¬ nie zamrozonym do czasu uzycia. Przed uzyciem plazme odmrozono i odwirowano i przezroczysta ciecz zmieszano z inhibitorami proteazy i buforo¬ wano do pH 7,4. Dodano rózne ilosci inhibitorów reniny do róznych porcji supernatantu plazmy i otrzymane mieszaniny (310 X) inkubowano 3 go¬ dziny w temperaturze 37°C razem z mieszaninami kontrolnymi, które nie zawieraly inhibitora reniny.Po inkubacji mieszaniny zamrozono w lodowatej wodzie i kazda z nich badano na zawartosc an- giotensyny I, stosujac przeciwcialo angiotensyny I.Wytwarzanie angiotensyny I w obecnosci inhibi¬ tora reniny porównano z wytwarzaniem jej pod nieobecnosc inhibitora reniny i wyliczano procent inhibitowania. Uzywajac dane otrzymane z dwu¬ krotnego inkubowania, przy kazdym z kilku róz¬ nych stezen inhibitowania, obliczono dla róznych inhibitorów stezenie inhibitora w inkubowanej mieszaninie, potrzebne do uzyskania 50e/o hamo¬ wania aktywnosci reniny w rozszczepianiu angio¬ tensynogenu, czyli IC50 inhibitora.Angiotensyne I w zamrozonych mieszaninach po inkubacji oznaczano próba radioimmunologiczna, stosujac skladniki zestawu prób radioimmunolo- gicznych dla reniny wytwarzanych przez Becton Dickinson C. (Orangeburg, N. Y.). Próby te wyko¬ nano w oparciu o sposób opisany przez Habera i in., J. Clin. Endocrinal., 29, str. 1349—1355 (1969).Stosujac opisany sposób postepowania okreslono wspólczynnik inhibitowania reniny dla zwiazków otrzymanych w przykladach I—V i VII—XX.W kazdym przypadku doswiadczalna wartosc IC50 byla nizsza od 5 mikromoli/litr. Antagonizowanie egzogennej, wywolanej renina, reakcji presorowej in vivo.Meskie osobniki szczurów Spraaue-Dawley (230 do 300 g wagi ciala) uspiono pentabarbitalem sodu 65 mg/kg wagi ciala, dootrzewnowo), po czym w zyle udowej kazdego zwierzecia umieszczono szyj¬ ne katetery zylne. Po zakonczeniu zabiegu zwie¬ rzeta ulozono na brzuchu i w sposób ciagly ozna¬ czano temperature mierzona w odbytnicy. Srednie cisnienie krwi tetniczej (MAP) rejestrowano szyj¬ nym kateterem zylnym, stosujac przetwornik cis¬ nienia Statham P23 ID i fizjograf. Po okresie sta¬ bilizacji otrzymano kontrolne reakcje presorowe reniny (dP) 26,6—39,9X102 Pa po podaniu reniny (30 do 80 mWkg wagi ciala dozylnie). Po powro¬ cie MAP do poziomu wyjsciowego podano inhibi¬ tor reniny (10 mgi/kg wagi ciala, dozylnie), a na¬ stepnie renine (taka sama dawke jak w próbach kontrolnych) w 5, 15 i 30 minucie po podaniu inhi¬ bitora reniny i mierzono odpowiednie reakcje pre¬ sorowe reniny (dP). Procent antagonizowania wy¬ liczano z wzoru - (dP kontrolne — dP doswiadczalne) w którym dP kontrolne i doswiadczalne sa zmia¬ nami presorowymi MAP, odpowiednio przed i po podaniu inhibitora reniny. Korzystnie w kazdym badaniu uzywano 3 zwierzat, a do obliczenia bra¬ no srednie wyniki.Stosujac opisane postepowanie mozna oznaczyc dla zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wy¬ nalazku procent antagonizowania reakcji presoro¬ wej wywolanej renina.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wyna¬ lazku mozna podawac jako srodki przeciw nad¬ cisnieniu droga doustna lub droga pozajelitowa, z tym, ze ten pierwszy sposób jest korzystniejszy z punktu widzenia wygody i latwosci stosowania dla pacjenta. Zwykle, omawiane zwiazki przeciw- nadcisnieniowe podaje sie doustnie w dziennych dawkach zawartych w zakresie od okolo 0,1 mg do okolo 10 mg na kilogram wagi ciala. Odstep¬ stwa od podanego zakresu zaleza od stanu leczone¬ go pacjenta i konkretnego zwiazku stosowanego w kuracji. Leczenie rozpoczyna sie zazwyczaj mala dawka dzienna, która lekarz podwyzsza jedynie w razie potrzeby. Nalezy zauwazyc, ze omawiane zwiazki moga byc podawane w polaczeniu z do¬ puszczalnymi farmakologicznie nosnikami, dowol¬ nym z podanych wyzej sposobów, przy czym moz¬ na je podawac zarówno w dawkach pojedynczych jak i wielokrotnych.Nowe zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku mozna podawac doustnie w postaci sze- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6014t 621 9 10 rokiej gamy róznych form dawkowania, czyli moz¬ na je preparowac z róznymi, dopuszczalnymi far¬ maceutycznie, obojetnymi nosnikami w postaci ta¬ bletek, kapsulek, pigulek romboidalnych, kolaczy- ków, cukierków, pudrów, sprajów, zawiesin wod¬ nych, eliksirów, syropów i podobnych preparatów.Nosnikami takimi sa stale rozczynniki i wypelnia¬ cze, jalowe srodowiska wodne i rózne, nietoksycz¬ ne rozpuszczalniki organiczne itp. Ponadto doustne preparaty farmaceutyczne moga byc odpowiednio dosladzane i/lub nawaniane przy uzyciu róznych srodków tego typu, stosowanych zwykle do podob¬ nych celów. Na ogól, zwiazki wytwarzane sposo¬ bem wedlug wynalazku stanowia w skladzie ta¬ kich preparatów doustnych udzialy zawarte w zakresie od okolo 0,5*/d do okolo 90°/< wagowych calosci kompozycji, w ilosciach odpowiednich do uzyskania potrzebnej jednostki dawkowania.Tabletki do podawania doustnego zawieraja róz¬ ne rozczynniki, takie jak cytrynian sodu, weglan wapnia i fosforan wapnia, które mozna stosowac razem z róznymi substancjami rozkruszajacymi, takimi jak skrobia, korzystnie ziemniaczana lub skrobia tapiokowa, kwas alginowy i pewne kom¬ pleksowe krzemiany, razem ze srodkami wiazacy¬ mi, takimi jak poliwinylopirolidon, cukroza, zela¬ tyna i akacja. Ponadto, do tabletkowania sa czesto bardzo uzyteczne srodki sklejajace, takie jak stea¬ rynian magnezu, siarczan laurylowo sodowy i talk.Kompozycje stale podobnego typu moga byc równiez stosowane jako wypelnienia miekkich i twardych kapsulek zelatynowych. Korzystnymi substancjami uzywanymi w takich kompozycjach moga byc równiez laktoza lub cukier mleczny, jak równiez glikole polietylenowe o duzym cieza¬ rze czasteczkowym. Jezeli potrzebne sa do poda¬ wania doustnego zawiesiny wodne i/lub eliksiry, to zawarta w nich substancja czynna moze byc laczona z róznymi srodkami slodzacymi lub zapa¬ chowymi, barwiacymi lub z barwnikami i, o ile jest to potrzebne, ze srodkami emulgujacymi i/lub suspendujacymi, jak równiez z takimi rozcienczal¬ nikami, jak woda, etanol, glikol propylenowy, gli¬ ceryna i rózne, podobnie jak ich kombinacje. Nastepujace przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. [N^IIIrzed.-butyloksykarbonylo)- -Phe]-His-Sta-Lys-Phe.A. Ester benzylowy [N- bonylo)-N-e-benzyloksykarbónylo-lizyno]fenyloala- ndny.N-Hydroksybenzotriazol (162 mg, 1,2 mmola), N- -metylomorfoline (101,2 mg, 1 mmol), p-tolueno- sulfonian estru benzylowego L-fenyloalaniny (428 mg, 1 mmol), N-a-(IIIrzed.-butyloksykarbonylo-N- -c-benzyloksykarbonylo-L-lizyne (465 mg, 1,2 mmo¬ la) i meto-p-toluenosulfonian l-cykloheksylo-3-(2- morfolinoetylo)-karbondwuimidu (635 mg, 80% czy¬ stosci, 1,2 mmola) rozpuszczono kolejno w chlorku metylenu (50 ml), w temperaturze 0°C, a otrzy¬ many roztwór mieszano 19 godzin w temperaturze 20°C. Mieszanine reakcyjna przemyto nastepnie kolejno 75 ml 5fi*h wodnego roztworu HC1, 75 ml nasyconego, wodnego roztworu NaHCOa i 75 ml solanki i wysuszono bezwodnym MgS04. Po od¬ saczeniu i odparowaniu otrzymano w postaci pia¬ ny 669 mg surowego produktu [1H NMH, CDCU, 5 1,5 fi, 9 Hs (BOC)]. Surowy produkt stosowano bez dalszego oczyszczania w nastepnym etapie.B. Chlorowodorek estru benzylowego (N-e-ben- zyloiksykarbonylThe present invention relates to a method of producing novel polypeptide derivatives useful for inhibiting the cleavage action of the enzyme renin on angiotensinogen. Renin, a proteolytic enzyme with a molecular weight of about 40,000, is produced and excreted into the blood by the kidneys. It is known to be active in vivo to cleave a naturally occurring plasma glycoprotein, angiotensin-syngene. In the case of human angiotensinigen, renin cleaves the bond between leucin (10 ta) and valine <11 ta) an amino acid residue at the N-terminal end of the angiotensinogen of formula 4. Trauma, the N-terminal decapeptide, angiotensin I, produced by the above-mentioned cleavage The action of renin is further degraded by this enzyme to an octa-peptide known as angiotensin II. Angiotensin II is known to be a potent blood pressure-elevating substance, i.e. a substance capable of causing a significant increase in blood pressure, and is believed to act by constricting blood vessels and releasing aldosterone, a sodium-retaining hormone from the adrenal gland. . Therefore, the renin-angiotensinogen system is a causative factor in some forms of hypertension. A number of known agents are known to alleviate the adverse effects of the renin-angiotensinogen system by administering a substance that inhibits the cleavage action of renin on angiotensin genes. such substances, including antibodies, antirenins, pepstatin and naturally occurring phospholipid compounds. Renin-inhibiting polypeptide derivatives of the formula XY-Pro-Phe-His-ABZW are known, in which X may be a hydrogen atom or an amino protecting group, Y may not be present, B means a lipophilic amino acid residue, Z means an aromatic residue. of the amino acid, W may be a hydroxyl group, and A may be, inter alia, a group of formula 5, in which R1 and Rf each represent a lipophilic or aromatic side chain, as defined in European Patent Application Publication No. 45,665 is not included in In the case that either A or Z in the formula could be statin or that B in this formula could be lysine. Renin inhibiting polypeptide compounds containing residues of a non-terminal statin or statin derivative are known. In this group of compounds there are compounds that contain the sequences phenylalanine-histidine-statin. However, the present publication does not disclose the case of placing lysine immediately after the sequence -Phe-His-Sta. It has now been found that some new compounds are useful as renin inhibitors. These new compounds are new derivatives of the polypeptides 147 021147 621 of the formula I, in which R is hydrogen, an acyl moiety that protects an amino group, a molecular weight lower than 500, proline, proline with a protected amino group, pyroglutamic acid or pyroglutamic acid with a protected amino group, W is phenylalanine, W1 is histidine, whereby the nitrogen of the peptide bond between W and W1 is optionally substituted with an alkyl group of 1-4 carbon atoms, R2 is hydrogen, an alkyl group of 1-6 carbon atoms, a cycloalkyl group of 4-7 carbon atoms or a cycloalkyl (alkylene) group of 5-10 carbon atoms, R3 is hydroxy or amino, and R1 is (a) of the formula -AEB, where A is lysine or proline, or in addition, if R3 in formula I is an amino group, or if the nitrogen of the peptide bond between W and W1 is substituted with an alkyl group of 1-4 carbon atoms, A is isoleucine and E is phena yloalanine, B is the OH group, (b) of formula II, where X is a chemical bond or ala-nine, isoleucine or lysine, Z and Z1 each represent a hydrogen atom, an alkyl group with 1-6 carbon atoms, a cycloalkyl group with 4-7 carbon atoms, cycloalkyl (alkylene) group with 5-10 carbon atoms or phenylalkyl group with 7-9 carbon atoms, when they represent zero or integers from 1 to 6, Q is the group "CHz", —CH = CH—, —O—, —NH—, = CH (OH) - or = C (O) -, Y represents a methyl, phenyl group, a group of the formula —COOR * R7, a group —NHa, a group (benzyloxy) carbonylamino group of the formula —CO — glutamic acid and (—OR82, —CO — glutamic acid (—OR8) (- NR6R7} or —CO — glutamic acid (—NReR7) 2, in which In the formulas, R6 and R7 each represent a hydrogen atom, an alkyl group of 1-4 carbon atoms, a phenylalkyl group of 7-9 carbon atoms or a cycloalkyl group of carbon atoms, (c) 1,2,3,4-tetrahydroquinoline 1-yl, (d) 1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin-2-yl group, (e) 1,2,3,4-tetrahydro-3-aminocarbone ylisoquinolin-2-yl, (f) 1,2,3,4-tetrahydro-3-methoxycarbonylisoquinolin-2-yl, (g) 1,2,3,4,5,6,7,8- group decahydro-3-methoxycarbonyl-isoquinolin-2-yl, (h) 4-phenylmethylpiperidin-1-yl or (i) a -proline-B group, wherein B is as defined above. The compounds of formula I may take the form of pharmacologically acceptable salts. It should be noted that certain compounds are particularly preferred, in each case where the preferred compounds of formula I are mentioned in the description, their advantages are assessed from the point of view of view their antihypertensive efficacy (IC50 in human renin), and these are compounds in which in the formula 1 R is an acyl group protecting an amino group or a proline group with a protected amino group, R2 is an isobutyl or cyclohexyl (methylene) group, R3 is hydroxy and R1 is as defined in (a), (b) or (i) above, except that if R1 is as defined in (a) then A is lysine, and if R * has the meaning given in (b), then X is lysine. The method of preparing the compounds of formula I according to the invention consists in acylating a compound of formula III or its acid addition salt. wherein R1, R2, R * and W1 are as defined above, and dd The lower reactive groups in R 1 and R 3, if present, are protected with suitable protecting groups by a compound of the formula RW-OX, wherein R and W are as defined above, -OX is a carboxyl group activated for acylation. (B) the protecting groups are removed, provided that the aforementioned reactive groups R * and R3, and (C) the compound of formula I obtained, if any, are converted into a pharmacologically acceptable addition salt or into a basic salt. - May 20, in vivo, antihypertensive effect on mammals, including humans. At least a significant portion of this activity is due to their ability to inhibit the cleavage of angiotensinogen by renin. Without wishing to be limited by the following theoretical mechanism, it is likely that the mechanism of inhibition of renin activity by the producing compounds of the present invention resides in their selective binding to renin as compared to angiotensinogen. Due to their low molecular weights, the compounds according to the invention show favorable aqueous solubility characteristics which makes oral administration easy, and can be synthesized on a technical scale at realistic costs. The compounds of the invention are also useful as diuretics. The term "pharmacologically acceptable" salts means those salts which are non-toxic at the dosages employed. Since the compounds of the invention may contain both basic and acidic groups. Both acid and base addition salts are possible. Pharmacologically acceptable acid salts include, for example, hydrochloric, hydrobromic, hydroiodic, sulfate, bisulfate, mesylate, fumarate, citrate, citrate, tartrate, and bitartrate salts. , succinate, gluconate and sucrose. Pharmacologically acceptable base addition salts include, for example, sodium, potassium, calcium, and magnesium salts. Known methods are used for the preparation of acid and base addition salts. The N-terminal end of the compound of formula I, which is bonded to the nitrogen and the residues W, is selected from the group consisting of hydrogen, acyl groups protecting an amino group with a molecular weight of less than 500, proline, proline with a protected amino group, pyroglutamic acid and pyroglutamic acid with a protected amino group. It should be understood that the protecting amino group of proline with a protected amino group or pyroglutamic acid with a protected amino group is also an acyl group which protects the amino group with a molecular weight lower than 500. The term " amino-protecting acyl moieties "refers to those acyl groups capable of significantly inhibiting the reaction at the nitrogen of the W group, or proline or pyroglutamic acid in vivo after oral administration. R has a molecular weight lower than 500 to avoid An unduly adverse effect on the solubility of a compound of formula 1 Examples of suitable amino-protecting acyl groups are those groups well known to those skilled in the art, e.g., Tert-butyl-xycarbonyl, Tert-butylacetyl, benzyl-xycarbonyl, Tert-butylureido, ( tris-hydroxyMIII-butylureido) and phenoxyacetyl. The formula used in the text is -CO-glutamic acid, which are amidated to carbon or glutamic acid and the C-terminal groups which are esterified on the carbon 8 of glutamic acid. As mentioned earlier, one preferred group of compounds of formula I are those in which R3 is hydroxyl and Ra is isobutyl. or cyclohexyl (methylene), and more preferably the latter, such that the moiety of formula 6 becomes -statin- or cyclostatin-, R in formula 1 is an amine-protecting acyl moiety with a molecular weight of less than 500 or a proline with a protected amino group , W1 is histidine linked to a W peptide bond and R1 is the group -Lys- -ZB, -Pro-B or a group of formula 7. Placement of a lysine residue (instead of, for example, a leucine, isoleucine, valine or alanine residue) right next to after the moiety -phenylalanine-histidine- (statin or cyclostatin), unexpectedly causes a dramatic increase in the duration of the activity of renin inhibition in vivo. Another preferred group of compounds of formula I are those in which R oz. has an amino-protecting acyl group with a molecular weight of less than 500 or a proline with a protected amino group, W1 is histidine with a peptide bond, R3 is a hydroxyl group, R2 is an isobutyl or cyclohexyl (methylene) group, more preferably the latter, and R1 represents the group of formula 2. Reduction of the peptide character of that part of the molecule adjacent to the C-terminal end results in an increase in blood absorption of this compound when introduced by the oral route. When n and m represent zero in formula II, Z is isobutyl, Q is —CH (OH) -, Z1 is hydrogen and Y is carboxyl, then R1 is —X — statin. the acylating agent is a compound of the formula RW-OX, wherein R is tertiary-butoxycarbonyl or N- (tertiary-butoxycarbonyl) proline, and W and X are as defined above. Preferably acylated according to the invention is of formula III, in which Rf, R3 and W1 are as defined above, and R1 is the group of formula II, in which Z is isobutyl, Q is -CH (OH), Z * is hydrogen, each and n and n is 0, and X and Y are as defined above, or the compound of formula III, in which R1, R3 and W * are as defined above, and R1 is a group of formula II, in which Z1 is hydrogen, Q represents a -CH * - group, Y represents a group of the formula -COOR "or -CONRW, -CO-glutamic minic acid (-OR") (-NR "R * or -CO-glutamic acid (-NRW) , in which it is wz R 'and R * are as defined above, Z is an alkyl group of 1-6 carbon atoms, the sum of n and m ranges from 0 to 3 and X is as defined above, or a compound of formula 3 wherein R' , R3 and W1 have the meaning given above, R * represents the group of formula 2, in which Z1 is a benzyl or so-butyl group, and Q, Z, Y, X, min have the meaning given above. of formula I according to the invention comprises, as mentioned, as the primary step of acylation of the unprotected as -amino group of an amino acid residue with an amino acid containing a carboxyl group activated for acylation and a corresponding protecting group attached to its own nitrogen, where a peptide bond is obtained between two amino acid residues, followed by the removal of said protecting group. This subunit synthesis involving splicing-deblocking performed several times leads to an accumulation of the polypeptide from the C-terminal end of the synthesized molecule structure to the N-terminal end. The amino acids used in the synthesis according to the invention are commercially available as free acids, salts or esters and the like in both the protected a-amino and unprotected a-amino forms. The statin is commercially available as N- (Tert.-butyloxycarbonyl) -statin. In addition, the statins can be prepared as the acid or ester in both the γ-protected and γ-amino forms in unprotected literary methods (see, for example, U.S. Patent No. 4,397,786 and DH Rich et al. in., Jour. Org. Chem., 43, p. 3624 et seq. (1978)). If desired, a suitable analog of an N-unprotected amino acid, acid, salt or ester etc. such as 4-aminobutyric acid, 4-aminovaleric acid or 4-amino-4-tert-butylbutyric acid is used as a reactant in the first step. coupling. The corresponding statin derivatives can be prepared by known synthetic methods. For example, the compound of formula VIII, i.e., aminostatin, is obtained as a compound with both amino groups protected by the administration of a statin ester with a protected amino group by reaction with sulfonyl chloride to give a sulfonate ester which is reacted with sodium azide to give a protected amino 4-isobutyl-1-propenecarboxylic acid ester and an amino-protected 4-isobutyl-3-azidobutyric acid ester, a compound with the alkyne group is processed. reaction with a primary amine and / or hydrogenation of the azide compound, and then the resulting transition compound is reduced with an alkali metal hydride, in the presence of acyls, which are capable of significant inhibition, the 4-isobutyl-3-IIr derivative (The amino acid of butyric acid hydrogenates this 4-isobutyl-3-tertiary amino derivative of butyric acid, and then the compound obtained is reacted with an alkyl halide under basic conditions. with 9 with a protected amino group, in which formula the abbreviation Ochr. denotes a protecting group, referred to in the text as N-protected cyclostatin compounds, prepared by hydrogenation of 4-amino-4-phenylmethyl-4-hydroxybutyric acid with a protected amino group, which in turn is obtained as described in DH Richa et al., Jour. Med. Chem., 23 (1), pp. 27-33 (1980. A reduced peptide bond, or -CO-substituted, -CHa, in a compound according to the invention of formula I, wherein R 1 is a group of formula I) 2, in which n is at least 1 and Q is -NH-, can be prepared by reduction of an aldehyde of formula I0, in which the abbreviation Ochr is an amino protecting group, in the presence of an amino acid ester of formula 11 in which R6 has a different meaning than the hydrogen atom. The activity of the compounds according to the invention as inhibitors of the ability of Renin to cleave angiotensinogen can be determined by examining (1) their ability to inhibit the cleavage effect of renin on angiotensinogen in vitro and (2) ) their ability to counteract exogenous, induced renin, prepress reaction in vivo. Inhibition of angiotensinogen-cleaving activity of renin was tested in vitro. Blood plasma obtained from healthy laboratory personnel was pooled and stored frozen until use. Before use, the plasma was thawed and centrifuged, and the clear liquid was mixed with protease inhibitors and buffered to a pH of 7.4. Different amounts of renin inhibitors were added to different aliquots of the plasma supernatant and the resulting mixtures (310 X) were incubated for 3 hours at 37 ° C along with the control mixtures that did not contain the renin inhibitor. After incubation, the mixtures were frozen in ice-cold water and each of them tested. The production of angiotensin I in the presence of a renin inhibitor was compared with that in the absence of a renin inhibitor and the percentage of inhibition was calculated. Using the data obtained by incubating twice, for each of several different inhibition concentrations, the inhibitor concentration in the incubated mixture was calculated for the different inhibitors to obtain 50% inhibition of the activity of renin in cleavage of angiotensinogen, ie the IC50 of the inhibitor. Angiotensin I in the frozen mixtures after incubation was assayed for radioimmunoassay using the components of the renin radioimmunoassay kit manufactured by Becton Dickinson C. (Orangeburg, NY). These tests were made following the method described by Haber et al., J. Clin. Endocrinal., 29, pp. 1349-1355 (1969). Using the procedure described, the renin inhibition factor was determined for the compounds obtained in Examples I-V and VII-XX. In each case the experimental IC50 value was less than 5 micromol / liter. Antagonization of exogenous induced renin pressure reaction in vivo. Male Spraaue-Dawley rats (230 to 300 g body weight) were anesthetized with sodium pentabarbital 65 mg / kg body weight, intraperitoneally) and the jugular catheters were placed in the femoral vein of each animal. venous. At the end of the procedure, the animals were placed on the stomach and the rectal temperature was continuously measured. Mean arterial blood pressure (MAP) was recorded with a jugular venous catheter using a Statham P23 ID pressure transducer and a physiograph. After a period of stabilization, control renin pressure reactions (dP) of 26.6 to 39.9 × 10 2 Pa were obtained after administration of renin (30 to 80 mW kg body weight intravenously). After the MAP returned to baseline, the renin inhibitor (10 mg / kg body weight, i.v.) was administered and renine (same dose as in the controls) was administered at 5, 15 and 30 minutes after administration of the inhibitor. renin and the corresponding precursor reactions of renin (dP) were measured. The percentage of antagonization was calculated from the formula - (dP control - experimental dP) in which control and experimental dP are MAP pressure changes before and after administration of the renin inhibitor, respectively. Preferably, 3 animals were used in each test, and the mean results were used for the calculation. Using the procedure described, the percentage of antagonizing the renin-induced pressor response can be determined for the compounds produced according to the invention. The compounds produced by the method according to the invention can be administered as agents. against hypertension by the oral or parenteral route, with the former being more advantageous from the point of view of convenience and ease of use for the patient. Typically, these antihypertensive compounds are administered orally in daily doses ranging from about 0.1 mg to about 10 mg per kilogram of body weight. Variations from the range given depend on the condition of the patient being treated and the particular compound employed in the treatment. Treatment is usually started with a small daily dose which the doctor will only increase if necessary. It should be noted that the compounds in question may be administered in conjunction with a pharmacologically acceptable carrier by any of the above methods, and may be administered in both single and multiple doses. The new compounds of the invention may be administered orally. in the form of a wide range of different dosage forms, i.e. they can be formulated with various pharmaceutically acceptable inert carriers in the form of tablets, capsules, rhomboidal pills , earrings, candies, powders, sprays, aqueous suspensions, elixirs, syrups and similar preparations. Such carriers are solid excipients and fillers, sterile water environments and various non-toxic organic solvents, etc. In addition, oral pharmaceutical preparations they can be suitably sweetened and / or flavored with various agents of this type, usually used for similar purposes. In general, the compounds of the present invention comprise fractions in the composition of such oral preparations ranging from about 0.5% per day to about 90% per weight of the total composition, in amounts appropriate to the dosage unit required. for oral administration, they contain various excipients, such as sodium citrate, calcium carbonate and calcium phosphate, which can be used together with various disintegrating agents such as starch, preferably potato or tapioca starch, alginic acid and certain complex silicates, together with binding agents such as polyvinylpyrrolidone, sucrose, gelatin and acacia. In addition, tackifiers such as magnesium stearate, sodium lauryl sulfate and talc are often very useful for tabletting. Steels of a similar type can also be used as fillings for soft and hard gelatine capsules. The preferred substances used in such compositions may also be lactose or milk sugar, as well as polyethylene glycols with a high molecular weight. If aqueous suspensions and / or elixirs are required for oral administration, the active substance contained therein may be combined with various sweetening or flavoring agents, coloring agents or dyes and, if necessary, with emulsifying agents and / or or suspending agents, as well as with such diluents as water, ethanol, propylene glycol, glycerine, and others, as well as combinations thereof. The following examples illustrate the process according to the invention. Example 1 [N, tert.-butyloxycarbonyl) -Phe] -His-Sta-Lys-Phe.A. Benzyl [N-bonyl) -Ne-benzyloxycarbonyl-lysine] phenylalandine ester. N-Hydroxybenzotriazole (162 mg, 1.2 mmol), N-methylmorpholine (101.2 mg, 1 mmol), p-toluenesulfonate L-phenylalanine benzyl ester (428 mg, 1 mmol), Na- (tertiary-butyloxycarbonyl-N-c-benzyloxycarbonyl-L-lysine (465 mg, 1.2 mmol) and 1- p-toluenesulfonate cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbondimide (635 mg, 80% pure, 1.2 mmol) was successively dissolved in methylene chloride (50 ml) at 0 ° C and the resulting solution was stirred for 19 hours. at 20 ° C. The reaction mixture was then washed successively with 75 ml of 5% aqueous HCl, 75 ml of saturated aqueous NaHCOa solution and 75 ml of brine and dried with anhydrous MgSO4. After filtration and evaporation, 669 mg of foam was obtained. crude product [1H NMH, CDClU, δ 1.5 µl, 9 Hs (BOC)]. The crude product was used without further purification in the next step. B. Benzyl ester hydrochloride (N-benzylixycarbonyl