【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロテアソーム阻害活性を示す新規な環状ヘキサペプチドに関する。さらに本発明は、その新規な環状ヘキサペプチドを有効成分とするプロテアソーム阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々な多数の酵素阻害物質が知られており、また種々な多数の生理活性物質が知られている。酵素に阻害活性を有する物質、すなわち酵素阻害剤をもって、抗炎症剤あるいは抗腫瘍剤を含めて幅広い疾病に有効な薬剤として応用するための多くの研究がなされている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
癌細胞の増殖や炎症が起きる際に、極めて重要な役割を果たす酵素にプロテアソームが挙げられる。この酵素の阻害物質を提供することによって、従来知られているまたは使用されている既知の抗炎症性化合物とは、異なる作用点を有し且つ新規な化学構造を有した抗炎症性を示す化合物の創製が期待され、そのための研究が行われている。また抗腫瘍性物質は、一般に強い毒性を有するものが多く、その抗腫瘍剤としての使用に当たって大きな制約となっている。そこで、毒性が低く且つ新規な化学構造を有する抗腫瘍性物質を発見または創製することが常に望まれており、そのための研究が行われている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の要望に応えることができる新規なプロテアソーム阻害活性物質を提供することを目的に、従来より有用な生理活性物質の開発と実用化の研究を促進してきた。その結果、放線菌の一種であるストレプトミセス属に属するストレプトミセス ｓｐ．ＭＫ６００−ＣＦ７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６６０９として寄託）が新しい構造骨格を有する生理活性物質を生産していることを見い出した。この新規生理活性物質を単離することに成功し、化学構造を決定し、それぞれを生理活性物質ＭＫ６００−Ａ，Ｂ，ＣおよびＤと命名した。更に、この新規生理活性物質がプロテアソーム阻害活性を有すことを見出した（特願２００１−９５５１１号、「新規生理活性物質ＭＫ６００−Ａ， Ｂ， ＣおよびＤとその製造方法」）。
【０００５】
前記のＭＫ６００−Ａ物質、ＭＫ６００−Ｂ物質、ＭＫ６００−Ｃ物質およびＭＫ６００−Ｄ物質はそれぞれ下記の式（Ａ）、式（Ｂ）、式（Ｃ）および式（Ｄ）で表される環状ヘキサペプチドである。
【０００６】
【０００７】
上記のＭＫ６００−Ａ， Ｂ， ＣおよびＤ物質の構造をつぶさに検討すると、共通部分としてフェニルアラニル−プロリン（Ｐｈｅ−Ｐｒｏ）の配列を含有する６個のアミノ酸からなる環状ヘキサペプチド構造を見出すことができる。そこで、本発明者らはＭＫ６００物質の活性増大を意図して研究を行い、Ｘ−フェニルアラニル−プロリン配列（但し、Ｘは第三のアミノ酸を表す）からなる保護されたトリペプチド誘導体を合成し、次にこれの２量体を作り、さらに保護されたトリペプチド２量体を環化し且つ脱保護して環状のヘキサペプチドを合成することに成功した。さらにそのプロテアソーム阻害活性を検討し本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、第１の本発明では、次式（Ｉ）
〔式中、Ｒは水素を表すか、または通常のα−アミノ酸側鎖、あるいは官能基を保護された通常のα−アミノ酸の側鎖、官能基を修飾されたα−アミノ酸側鎖を表す〕で表された環状ヘキサペプチドが提供される。ここで通常のα−アミノ酸とは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、クルタミンであり、また官能基を保護又は修飾された通常のα−アミノ酸としてはセリン、トレオニン、チロシン、アスバラギン酸、グルタミン酸、のエステル類、ヒスチジン、リジン、アルギニン等が挙げられる。
【０００９】
また、前記された通常のα−アミノ酸側鎖とは、既知のα−アミノ酸のα炭素に側鎖として結合しているアルキル基、あるいは官能基（水酸基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキサミド基、イミダゾール基、グアニジル基またはフェニル基など）を置換されているアルキル基を指す。
【００１０】
第１の本発明による式（Ｉ）の環状ヘキサペプチドの好ましい具体例には、次式（Ｉａ）
のシクロヘキサペプチド；あるいは次式（Ｉｂ）
のシクロヘキサペプチド；または式（Ｉｂ）のシクロヘキサペプチドのリジン部分（Ｌｙｓ）のアミノ基がベンジルオキシカルボニル基、ｐ−クロロベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、２−フリルメチル基、３−ピリジルメチル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシル基またはイソプロピル基で保護された誘導体；あるいは次式（Ｉｃ）
のシクロヘキサペプチド；あるいは式（Ｉｃ）のシクロヘキサペプチドのグルタミン酸部分（Ｇｌｕ）のカルボキシル基がベンジル基で保護された誘導体が包含される。
【００１１】
なお、上記の式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（Ｉｃ）のそれぞれのシクロヘキサペプチドは、各々の式の６番目のＰｒｏの後の部位で切断された直鎖状アミノ酸配列を有するものと見なした場合について、それらシクロヘキサペプチドのアミノ酸配列を後記の配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３にそれぞれ示される。
【００１２】
第１の本発明の環状ヘキサペプチドは、通常実施されるペプチド合成法を組み合わせて合成することができる。すなわちプロリンのベンジルエステルまたはトリクロロエチルエステルなどのエステルを、該エステル形成基とは異なる反応条件で脱保護可能なアミノ保護基でアミノ基を保護されたフェニルアラニン、たとえばＢｏｃ−フェニルアラニンと縮合してジペプチドエステルを生成し、その後、そのジペプチドエステルのフェニルアラニン部分（Ｐｈｅ）のアミノ基を脱保護により遊離させる。アミノ基がＢｏｃ（すなわち第３級ブトキシカルボニル基）で保護されている場合はＴＦＡまたは塩化水素−ジオキサン溶液、塩化水素−酢酸エチル溶液などの通常用いられる試薬をアミノ基からの脱保護に用いる。
【００１３】
次に、ここに得られた遊離アミノ基をもつジペプチドエステルに対して、官能基を保護された第三のアミノ酸（Ｘ）をアミド縮合して保護トリペプチドエステルを合成する。この段階で十分精製をしたのち保護トリペプチドエステルの量を２分し、一方の保護トリペプチドエステルのアミノ末端を脱保護し、もう一方の保護トリペプチドエステルのカルボン酸末端を脱保護する。この場合の脱保護には通常の方法が用いられる。すなわちアミノ末端を脱保護するには、前述のＴＦＡまたは塩化水素溶液を用いて脱保護でき、さらにカルボン酸末端を脱保護するにはベンジルエステルの場合では接触還元、接触水素移動還元、ケン化のいずれかの方法が用いられ、またトリクロロエチルエステルの場合では亜鉛−酢酸還元法が用いられる。
【００１４】
次に、ここで得られた二種類の直鎖状の保護トリペプチドの遊離アミノ基をもつものと遊離カルボキシル基をもつものとをアミド縮合することによって、繰り返えされたアミノ酸配列を含有する保護ヘキサペプチドを合成する。次に、この保護ヘキサペプチドからカルボキシル保護基を前述の方法で除去し、次いでアミノ基から脱保護することによって直鎖状のヘキサペプチドのＴＦＡ又は塩酸塩とする。
【００１５】
得られた直鎖状ヘキサペプチドの塩を大量のＤＭＦまたはＮ−メチルピロリドンに溶解し、その溶液に過剰の炭酸水素ナトリウムを加え氷水で冷却攪拌し、さらにペプチドの環化に良く用いられる縮合剤、例えばＤＰＰＡ（ジフェニル燐酸アジド）、ＰＦＰＤＰ（ペンタフロロジフェニルフォスフィネート）などを加えてから室温〜５℃の程度の低温で３〜７日間攪拌して環化反応させる。環化の反応液を必要ならば減圧下に濃縮し、水で希釈後に酢酸エチルなどの溶媒で環状ヘキサペプチド生成物を抽出する。抽出液中には縮合剤の残滓が含まれるので、濃縮後にメタノールで平衡化したセファデックスＬＨ２０のカラムを通すことにより、容易に低分子のこれらの残滓を除く事ができる。得られた環状ヘキサペプチドは、さらに必要ならばシリカゲル、ＯＤＳ−シリカゲルなどのクロマトグラフィーで精製することができる。
【００１６】
前記の第三のアミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスバラギン酸、アスパラギン、クルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニンをあげることができる。
【００１７】
前記の第三のアミノ酸が官能基を有したものであって、それが保護されていれば、通常の方法で脱保護してもよい。例えば、リジンのε−アミノ基がカルボベンジルオキシ基で保護されている場合には、接触還元または接触水素移動還元法で脱保護する。さらに、ここで新たに遊離した官能基は、通常行われている修飾をすることができる。例えばリジンのε−アミノ基は、アシル化、ウレタン化、アルキル化などの修飾を受けることができる。中でも、アルデヒド、ケトンとシアノ水素化ホウ素による還元的アルキル化は修飾に有効である。このようにして修飾された式（Ｉ）の環状ヘキサペプチドもシリカゲル、ＯＤＳ−シリカゲル、セファデックスＬＨ２０ などのクロマトグラフィーで精製することができる。
【００１８】
前記の式（１）で示される環状ヘキサペプチドのうちの代表的な化合物の中に存在する基Ｒの具体例を以下の表１に示す。また、表１には、その環状ヘキサペプチドの合成に第三のアミノ酸（Ｘ）として用いられたアミノ酸も併記する。表１で、Ｚはカルボベンジルオキシ基（すなわちベンジルオキシカルボニル基）の略号である。
【００１９】
【表１】
【００２０】
さらに、第１の本発明の環状ヘキサペプチドはプロテアソーム阻害活性を有するものである。
【００２１】
本発明による環状ヘキサペプチドのプロテアソーム阻害活性は下記の表２に示される。このプロテアソーム阻害活性は、以下のようにして測定した。即ち、マウス肝臓から調製したプロテアソームを含む画分を酵素として用い、またキモトリプシン様ペプチダーゼの蛍光基質（Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡ、ペプチド研究所製）を基質として用いた。これらの酵素と基質とを、ＡＴＰ（アデノシン−５’−３リン酸）とともに本発明の環状ヘキサペプチドの存在下または非存在下で３７℃にて３０分間反応させた。反応終了後、プロテアソームにより分解され遊離した物質の蛍光強度を測定して、本発明の環状ヘキサペプチドの存在下の反応の場合と非存在下の反応の場合との比較によって、蛍光強度が環状ヘキサペプチドにより抑制される程度を測定し、この測定によって本発明の環状ヘキサペプチドのプロテアソーム阻害活性のＩＣ５０値を判定した。
【００２２】
【表２】
【００２３】
従って、第２の本発明においては、式（Ｉ）の環状ヘキサペプチドを有効成分とするプロテアソーム阻害剤が提供される。
【００２４】
【発明の実施の形態】
次に実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。なお、実施例中に示されたアミノ酸のＤ，Ｌは特記されているもの以外はＬ体である。
【００２５】
以下の実施例において、薄層クロマトグラフィーではプレートとしてメルク社製品（ＳＩＬＩＣＡＧＥＬ６０Ｆ−２５４）を用いてＲｆ値を測定した。展開溶媒として酢酸エチル−ｎ−ヘキサン（１：１）を用いた場合にはＲｆ１値として表示し、またクロロホルム−メタノール （１０：１）を用いた場合にはＲｆ２値として表示した。プレートとしてメルク社製品（ＲＰ−１８Ｆ−２５４）を用い且つ展開溶媒として４％酢酸カリウム＋０．８％クエン酸緩衝液−アセトニトリル（１：１）を用いた場合にはＲｆ３値として表示した。
【００２６】
【実施例１】
（ａ） Ｂｏｃ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン ベンジルエステルの合成
Ｂｏｃ−Ｄ−フェニルアラニン １．５ｇ（５．６６ｍｍｏｌ）、 Ｌ−プロリン ベンジルエステル、Ｔｏｓ １．５１ｇ（６．２５ｍｍｏｌ，１．１当量）、Ｂｏｐ試薬２．７６ｇ（１．１当量）、ＨＯＢｔ ０．８５ｇ （１．１当量）をナス型フラスコに入れ、ＤＭＦ１２ｍｌを加えてマグネチックスターラーで攪拌下に溶解した。得られた溶液を氷水で冷却し、トリエチルアミン２．３８ｍｌを加えた。３０分後に氷水浴を取り除き、室温で１夜攪拌してアミド縮合反応を行った。
得られた反応液に酢酸エチル２００ｍｌを加え、２００ｍｌ×２の１０％クエン酸水溶液、４％炭酸水素ナトリウム水溶液で順次に洗浄し、飽和食塩水で１回洗浄した。その後、硫酸ナトリウムで１時間乾燥した。ろ過、濃縮すると無色水飴状物質２．９３ｇを与えた（理論収量は２．５６ｇ）。これをクロロフォルムに溶かし、１００ｍｌのシリカゲルカラムにつけクロロフォルム−酢酸エチル（３：１）で展開、ＵＶでモニター、濃縮乾固すると、２．６６ｇの表題物質を得た。
【００２７】
（ｂ） Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン ベンジルエステル 塩酸塩の合成
上記Ｂｏｃ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン ベンジルエステルを５ｍｌ無水ＴＨＦに溶解し、その溶液に１５ｍｌの４Ｎ塩酸／ジオキサンを加えた。溶液を収容するフラスコの口にしぼんだ風船をつけて外気と遮断し、室温で１時間放置した（Ｂｏｃの脱離反応）。１時間後に濃縮する。さらに酢酸エチルを加えて濃縮を繰り返して乾固すると、表題物質を得た。
【００２８】
（ｃ） Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン ベンジルエステルの合成
４ｍｍｏｌのＢｏｃ−Ｄ−フェニルアラニンから上記の（ｂ）で合成したＤ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン ベンジルエステル塩酸塩（２工程で１００％と計算する）に対して１０９７ｍｇ（１．１当量）のＢｏｃ−Ｌ−ロイシン１水和物、１９４６ｍｇ（１．１当量）のＢｏｐ試薬、５９５ｍｇ（１．１当量）のＨＯＢｔを加えてＤＭＦ１２ｍｌ程度に溶解した。その溶液に１．６８ ｍｌ（３当量）のトリエチルアミンを加えて１夜攪拌してアミド縮合反応をする。その反応液を減圧下に濃縮乾固した。１５０ｍｌの酢酸エチルに溶かし、その溶液を実施例１（ａ）と同様に酸、アルカリで洗浄後、乾燥して濃縮乾固する。得られた乾燥固体をクロロフォルムに溶かし、１００ｍｌのシリカゲルカラムにつけクロロフォルム−酢酸エチル（３：１）で展開、ＵＶでモニター、濃縮乾固すると、２０１２ｍｇの表題物質（保護トリペプチド）を得た。
【００２９】
（ｄ） Ｂｏｃ−（Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−）２ ベンジルエステルの合成
（ｉ）実施例１（ｃ）で得られたＢｏｃ−Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン ベンジルエステル ６３０ｍｇを酢酸エチル１０ｍｌに溶かし、その溶液へパラジウム黒５０ｍｇを加えた。常温常圧下で一夜水素還元する（ベンジル基の脱離）。触媒を濾過して除き濃縮乾固してＢｏｃ−Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリンを得た。
（ｉｉ）同じく実施例１（ｃ）で得られた６３０ｍｇのＢｏｃ−Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン ベンジルエステルを１ｍｌの脱水ＴＨＦに溶解し、その溶液に３ｍｌの４Ｎ塩酸−ジオキサン溶液を加え常温一時間反応した（Ｂｏｃの脱離）。その後濃縮、シロップ状の残滓に酢酸エチルを加え濃縮乾固してＬ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン ベンジルエステル塩酸塩を得た。
【００３０】
（ｉｉｉ）上記の（ｉｉ）の生成物に上記（ｉ）で得たＢｏｃ−Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリンとＢｏｐ試薬の５９１ｍｇ（１．２当量）とＨＯＢｔの１６６ｍｇ（１．１当量）とＤＭＦの１０ｍｌを加え溶解し、これを氷水で冷却し、トリエチルアミン０．４６８ｍｌを加えた。３０分後に氷水浴を取り除き、室温で１夜攪拌してアミド縮合反応を行った。
生成された線状の保護ヘキサペプチドを含む反応液に酢酸エチル１００ｍｌを加え、１００ｍｌ×２の１０％クエン酸水溶液、４％炭酸水素ナトリウム水溶液、で洗浄し、さらに飽和食塩水で１回洗浄後、硫酸ナトリウムで１時間乾燥した。ろ過、濃縮すると無色水飴状物質１２００ｍｇを与えた。これをクロロフォルムに溶かし、１００ｍｌのシリカゲルカラムにつけクロロフォルム−酢酸エチル（３：１）で展開、ＵＶでモニター、濃縮乾固して９９０ｍｇの表題物質（保護ヘキサペプチド）を得た。
【００３１】
（ｅ） シクロ（−Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）２の合成
実施例１（ｄ）（ｉｉｉ）で得られたＢｏｃ−（Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−）２ ベンジルエステル ９００ｍｇを、酢酸エチル１５ｍｌに溶かし、その溶液にパラジウム黒８０ｍｇを加え常温常圧下に一夜水素還元する（ベンジル基の脱離）。触媒を濾過して除き濃縮乾固してＢｏｃ−（Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−）２−ＯＨを得た。
【００３２】
次に得られた固体に、トリフロロ酢酸１０ｍｌを加え常温一時間反応してＢｏｃを脱離させた。その後、濃縮、得られたシロップ状の残滓に酢酸エチルを加え濃縮乾固する。得られた（Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル）２−ＯＨにＤＭＦ９０ｍｌを加えて溶かし、炭酸水素ナトリウム１ｇ、を加え氷水で冷却、攪拌し、この溶液に０．３ｍｌのＤＰＰＡ（ジフェニル燐酸アジド）を加え５℃の低温実験室で９０時間攪拌した（環化反応）。
【００３３】
この環化反応液に酢酸エチル４００ｍｌを加え４００ｍｌ×２の１０％クエン酸水溶液、４％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄、さらに飽和食塩水で１回洗浄後、硫酸ナトリウムで１時間乾燥し、ろ過、濃縮すると淡黄色の油状物質を得る。
【００３４】
これを少量のメタノールに溶解し、メタノールで充填した５００ｍｌのセファデックスＬＨ２０カラムに注ぎ、メタノールで展開し、ＵＶ吸収をモニターして最初のピークを集める。溶媒を減圧で除き残滓を６０％アセトニトリルに溶解し、ＯＤＳシリカゲル ３７ｍｍＩＤ×３００ｍｍのカラムに吸着させて段階的にアセトニトリルの濃度を高めて展開する。溶出液をＵＶ吸収をモニターしてアセトニトリル９０％で主生成物を得た。濃縮乾固して１８０ｍｇの目的の表題物質（環状ヘキサペプチド）を無色固体として得た。
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝７１５（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ２＝０．５３
【００３５】
【実施例２】
（ａ） Ｂｏｃ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン ２，２，２−トリクロロエチルエステルの合成
Ｌ−プロリン ２，２，２−トリクロロエチルエステル塩酸塩２．６３７ｇ、Ｂｏｃ−Ｄ−フェニルアラニン ２．５９４ｇ、Ｂｏｐ試薬４．６９５ｇ、ＨＯＢｔ１．３８３ｇをＤＭＦ １６ｍｌに溶解し、その溶液を氷水で冷却攪拌してトリエチルアミン３．９１５ｍｌを加えて３０分攪拌、室温で一夜攪拌した（アミド縮合反応）。
反応液に酢酸エチル２００ｍｌを加え、２００ｍｌ×２の１０％クエン酸水溶液、４％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄、飽和食塩水で１回洗浄後、硫酸ナトリウムで１時間乾燥した。ろ過、濃縮すると無色固体として表題物質の４．５６５ｇを与えた。
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝４９３（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ１＝０．７４
【００３６】
（ｂ） Ｂｏｃ−（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル）−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン ２，２，２−トリクロロエチルエステルの合成
実施例２（ａ）で得られたＢｏｃ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン ２，２，２−トリクロロエチルエステル ２．６６７５ｇをＴＨＦ１０ｍｌに溶解し、その溶液に４Ｎ塩酸ジオキサン溶液２０ｍｌを加えて室温で一時間放置した後、減圧で塩酸、溶媒を溜去すると、Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン ２，２，２−トリクロロエチルエステル塩酸塩を得た。
これにＢｏｃ−（ε−ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジンの２．２６６ｇ、Ｂｏｐ試薬の２．６４７ｇ、ＨＯＢＴの８０９ｍｇを添加し、１５ｍｌのＤＭＦに溶解し、氷水で冷却攪拌してトリエチルアミン２．２７１ｍｌを加えて冷却下に３０分攪拌、室温で一夜攪拌した（アミド縮合反応）。
【００３７】
反応液に酢酸エチル２００ｍｌを加え、２００ｍｌ×２の１０％クエン酸水溶液、４％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄、飽和食塩水で１回洗浄後、硫酸ナトリウムで１時間乾燥した。ろ過、濃縮すると、無色固体としてＢｏｃ−（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル）−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン ２，２，２−トリクロロエチルエステルの３．３７２ｇを得た。
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝７５５（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ１＝０．３２
【００３８】
（ｃ） Ｂｏｃ−（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル）−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル）−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン ２，２，２−トリクロロエチルエステルの合成
（ｉ）実施例２（ｂ）で得られた物質３．３４ｇを二等分した。一方をＴＨＦ３ｍｌに溶解し、４Ｎ塩酸−ジオキサン溶液１２ｍｌを加えて室温一時間放置してＢｏｃを脱離した。その後、減圧で塩酸、溶媒を溜去し、ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン ２，２，２−トリクロロエチルエステル塩酸塩を得た。
（ｉｉ）もう一方を、１５ｍｌの９０％酢酸に溶解し、攪拌下に亜鉛末２ｇを三回に分け加え、一夜攪拌した（２，２，２−トリクロロエチル基の脱離反応）。過剰の亜鉛を含む不溶物を濾別し濾液を減圧下に濃縮した。残滓を１００ｍｌ酢酸エチルに溶解し、水１００ｍｌで二回洗浄し飽和食塩水で洗浄し、さらに硫酸ナトリウムで乾燥後に減圧下に濃縮乾固してＢｏｃ−（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル）−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリンを得た。
【００３９】
（ｉｉｉ）これら両者、すなわち上記の（ｉ）の生成物と（ｉｉ）の生成物を併せＢｏｐ試薬１０７７ｍｇ、ＨＯＢｔ３３０ｍｇを加えて１０ｍｌＤＭＦに溶解し、氷冷攪拌下にトリエチルアミン０．３３ｍｌを加えた。一時間後室温に戻し一夜攪拌した（アミド縮合反応）。 反応液に酢酸エチル２００ｍｌを加え、２００ｍｌ×２の１０％クエン酸水溶液、４％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄、飽和食塩水で１回洗浄後、硫酸ナトリウムで１時間乾燥した。ろ過、濃縮すると無色固体２．５８６ｇを得た。これを１０ｍｌのメタノールに溶解しメタノールで充填したセファデックスＬＨ２０、１Ｌのカラムに注ぎメタノールで展開した。溶出液を紫外部吸収をモニターして分画した。前半はＨＰＬＣ分析で単一であったので濃縮乾固して１．１７８ｇの固体を得た。後半は不純物を含み１．０３６ｇであった。これをクロロフォルムに溶解して２００ｍｌのシリカゲルカラムに吸着、クロロフォルム：メタノール（４０：１）で展開し、８３７ｍｇの目的物を得た。合計収率：２．００５ｇ。
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝１１７５（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ１＝０．１０
【００４０】
（ｄ） シクロ（−ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例２（ｃ）で得られた生成物の物質１．５５ｇを１１ｍｌの９０％酢酸に溶解して、その溶液に攪拌下に亜鉛末１ｇを三回に分け加え、一夜攪拌下に反応した。過剰の亜鉛を含む不溶物を濾別し濾液を減圧濃縮した。残滓を１００ｍｌ酢酸エチルに溶解し水１００ｍｌで洗浄し減圧濃縮乾固した。残滓にメタノールを加え溶解しメタノールで充填したセファデックスＬＨ２０、２００ｍｌのカラムに注ぎ、メタノールで展開した。ＵＶでモニターして最初のピークを集めて減圧濃縮乾固し１．３４３ｇを得た。
このうち１．３０３ｇにトリフルオロ酢酸１４ｍｌを加えて一時間攪拌した。減圧下トリフルオロ酢酸を溜去し残滓にトルエン３ｍｌを加えて減圧濃縮を二回行って遊離したアミノ基およびカルボキシル基を有したヘキサペプチドのトリフルオロ酢酸塩を得た。これを１００ｍｌＤＭＦに溶解し、炭酸水素ナトリウム７６０ｍｇを加えて氷水で冷却下に攪拌してジフェニル燐酸アジド０．６ｍｌを加えた。５℃の低温実験室で６４時間攪拌した。
【００４１】
反応液を６００ｍｌの酢酸エチルで希釈し、４００ｍｌの４％炭酸水素ナトリウム水溶液で二回、１０％クエン酸水溶液、飽和食塩水溶液で洗浄後硫酸ナトリウムで一時間乾燥、ろ過、濃縮すると、淡黄色の油状物質を得る。これを少量のメタノールに溶解し、メタノールで充填した５００ｍｌのセファデックスＬＨ２０カラムに注ぎ、メタノールで展開し、ＵＶ吸収をモニターして最初のピークを集める。溶媒を減圧で除き１．０３６ｍｇの無色固体として得た。これを少量のクロロフォルムに溶解し、クロロフォルムで充填したシリカゲル２００ｍｌのカラムに注ぎクロロフォルム：メタノール（４０：１）ついで（２０：１）で展開した。ＵＶ吸収をモニターして分画を集め濃縮乾固して８８５ｍｇの無色固体を得た。６０％アセトニトリルに溶解しＯＤＳシリカゲルクロマトグラフィーでさらに精製をすると、７２８ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝１０１３（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ２＝０．４４
【００４２】
（ｅ） シクロ（−リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例２（ｄ）の生成物３８０ｍｇを５ｍｌのメタノールに溶解して、その溶液に少量の水で湿したパラジウム黒４８ｍｇを加えて攪拌し、これに５％蟻酸アンモニウムのメタノール溶液６ｍｌを加えた攪拌を続ける。７時間後ＨＰＬＣで原料物質の消失を認めたので濾過、減圧濃縮して残滓を２ｍｌのメタノールに溶解しメタノールで充填したセファデックスＬＨ２０のカラムに注ぎメタノールで展開し３１２ｍｇの表題物質の蟻酸塩を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝７４５（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．５７
【００４３】
【実施例３】
（ａ） Ｂｏｃ−（δ−ベンジル）グルタミル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリン ２，２，２−トリクロロエチルエステルの合成
実施例２（ｂ）と同様にして、Ｂｏｃ−ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンの代わりに用いられるＢｏｃ−グルタミン酸δ−ベンジルエステル６１４ｍｇと、８０７ｍｇのＢｏｃ−Ｄ−フェニルアラニル−プロリン−Ｌ−プロリン ２，２，２−トリクロロエチルエステルから製造したＤ−フェニルアラニル−プロリンＬ−プロリン ２，２，２−トリクロロエチルエステル塩酸塩とを用いて、アミド縮合した。反応液を実施例２（ｂ）と同様に処理し８７２ｍｇの表題物質を得た。
【００４４】
（ｂ） Ｂｏｃ−（δ−ベンジル）グルタミル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−（δ−ベンジル）グルタミル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリン ２，２，２−トリクロロエチルエステルの合成
実施例３（ａ）で得られたＢｏｃ−（δ−ベンジル）グルタミル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリン ２，２，２−トリクロロエチルエステル７７６ｍｇを二等分した。実施例
２（ｃ）と同様に一方を酢酸−亜鉛末で処理して且つもう一方を塩酸−ジオキサンで処理した後にＢｏｐ試薬とＨＯＢｔでアミド縮合した。実施例２（ｃ）と同様に後処理をして表題物質の６０５．４ｍｇを得た。
【００４５】
（ｃ） シクロ−（−（δ−ベンジル）グルタミル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）２の合成
実施例３（ｂ）で得られたＢｏｃ−（δ−ベンジル）グルタミル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−（δ−ベンジル）グルタミル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリン ２，２，２−トリクロロエチルエステル５８０ｍｇを実施例２（ｄ）と同様に酢酸−亜鉛末で処理し且つＴＦＡ処理して遊離のへキサペプチドを得た。さらに、希釈ＤＭＦ溶液中でＤＰＰＡ−炭酸水素ナトリウムで環化し反応を行った。反応液から抽出、セファデックスＬＨ２０クロマトグラフィー、ＯＤＳ−シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、表題物質３０２ｍｇを得た。
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝９２７（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ２＝０．４２
なお、上記（ｃ）の生成物を実施例２（ｅ）と同様にパラジウム黒の存在下にベンジル基の脱離のため水素還元すると、シクロ−（−グルタミル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル）２が合成できた。
【００４６】
【実施例４】
シクロ（−ε−ベンジルリジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−ε−ベンジルリジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例２（ｅ）で得られたシクロ（−リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）４０ｍｇをメタノール２ｍｌに溶解し、その溶液にベンズアルデヒド５０μｌ、シアノトリヒドロ硼酸ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）１３ｍｇを加えて室温６時間攪拌した。
反応液をメタノールで充填したセファデックスＬＨ２０、５００ｍｌカラムに注ぎメタノールで展開し、最初に溶出する紫外部吸収を示す分画を集めた。溶媒を減圧で溜去し、残滓を５０％アセトニトリルに溶解しＯＤＳシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、２８ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝９２５（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．３８
【００４７】
【実施例５】
シクロ（−ε−（ｐ−クロロベンジル）リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−ε−（ｐ−クロロベンジル）−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例４のベンズアルデヒドに代えて、ｐ−クロロベンズアルデヒド５０ｍｇを加えて実施例４と同様に反応を行った。精製をして２９ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝９８５（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．３７
【００４８】
【実施例６】
シクロ（−ε−（ｐ−メトキシベンジル）リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−ε−（ｐ−メトキシベンジル）−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例４のベンズアルデヒドに代えて、ｐ−メトキシベンズアルデヒド５０ｍｇを加えて実施例４と同様に反応を行った。精製をして２７ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝９９３（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．２４
【００４９】
【実施例７】
シクロ（−ε−（２−フリルメチル）リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−ε−（２−フリルメチル）リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例４のベンズアルデヒドに代えて、フルフラール５０μＬを加えて実施例４と同様に反応を行った。精製をして２５ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝９０５（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．２５
【００５０】
【実施例８】
シクロ（−ε−（３−ピリジルメチル）リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリルε−（３−ピリジルメチル）−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例４のベンズアルデヒドに代えて、３−ピリジンカルボアルデヒド５０μＬを加えて実施例４と同様に反応を行った。精製をして２５ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝９２７（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．４２
【００５１】
【実施例９】
シクロ（−ε−シクロヘキシルメチルリジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリルε−シクロヘキシルメチルリジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成実施例４のベンズアルデヒドに代えて、シクロヘキサンカルボアルデヒド５０μＬを加えて実施例４と同様に反応を行った。精製をして２８ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝９３７（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．２３
【００５２】
【実施例１０】
シクロ（−ε−シクロヘキシルリジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリルε−シクロヘキシルリジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例４のベンズアルデヒドに代えて、シクロヘキサンノン５０μＬを加えて実施例４と同様に反応を行った。精製をして２８ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝９０９（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．３５
【００５３】
【実施例１１】
シクロ（−ε−イソプロピルリジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−ε−イソプロピル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例４のベンズアルデヒドに代えて、アセトン５０μＬを加えて実施例４と同様に反応を行った。精製をして２８ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ： ｍ／ｚ＝８２９（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．５５
【００５４】
【配列表】
【００５５】
【００５６】
[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel cyclic hexapeptide having a proteasome inhibitory activity. Furthermore, the present invention relates to a proteasome inhibitor comprising the novel cyclic hexapeptide as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Many various enzyme inhibitors are known, and various many biologically active substances are known. Many studies have been made to apply a substance having an inhibitory activity to an enzyme, that is, an enzyme inhibitor, as an effective drug for a wide range of diseases including an anti-inflammatory agent or an antitumor agent.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Proteasome is an enzyme that plays a very important role in the proliferation and inflammation of cancer cells. By providing an inhibitor of this enzyme, a compound exhibiting a different action point from the conventionally known or used known anti-inflammatory compounds and exhibiting an anti-inflammatory property having a novel chemical structure Is expected and research is being conducted for that purpose. In addition, many antitumor substances generally have strong toxicity, which greatly restricts their use as antitumor agents. Therefore, it has always been desired to discover or create an antitumor substance having a low toxicity and a novel chemical structure, and research for that purpose has been conducted.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have conventionally promoted research on development and practical application of useful physiologically active substances for the purpose of providing a novel proteasome inhibitory active substance that can meet the above demand. As a result, Streptomyces {sp. MK600-CF7 strain (deposited as FERM @ P-16609) was found to produce a bioactive substance having a new structural skeleton. This new physiologically active substance was successfully isolated, the chemical structure was determined, and these were named as physiologically active substances MK600-A, B, C and D, respectively. Further, they have found that this novel physiologically active substance has proteasome inhibitory activity (Japanese Patent Application No. 2001-95511, "New physiologically active substances MK600-A, ΔB, ΔC and D and a method for producing the same").
[0005]
The MK600-A substance, MK600-B substance, MK600-C substance and MK600-D substance are cyclic hexamers represented by the following formulas (A), (B), (C) and (D), respectively. Is a peptide.
[0006]
A close examination of the structure of the above MK600-A, ΔB, ΔC and D substances reveals a cyclic hexapeptide structure consisting of 6 amino acids containing the sequence of phenylalanyl-proline (Phe-Pro) as a common part. Can be. Therefore, the present inventors conducted a study aiming at increasing the activity of the MK600 substance, and synthesized a protected tripeptide derivative consisting of an X-phenylalanyl-proline sequence (where X represents a third amino acid). The dimer was then produced, and the protected tripeptide dimer was cyclized and deprotected to successfully synthesize a cyclic hexapeptide. Furthermore, the present inventors completed the present invention by examining its proteasome inhibitory activity.
[0008]
That is, in the first invention, the following formula (I)
[0009]
The above-mentioned ordinary α-amino acid side chain is an alkyl group or a functional group (hydroxyl group, amino group, carboxyl group, carboxamide group, imidazole) bonded to the α-carbon of a known α-amino acid as a side chain. Group, guanidyl group or phenyl group).
[0010]
Preferred specific examples of the first cyclic hexapeptide of the formula (I) according to the present invention include the following formula (Ia)
[0011]
The cyclohexapeptide of each of the above formulas (Ia), (Ib) and (Ic) has a linear amino acid sequence cleaved at the site after the sixth Pro in each formula. The amino acid sequences of these cyclohexapeptides are shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3 in the sequence listing below.
[0012]
The cyclic hexapeptide of the first invention can be synthesized by a combination of commonly practiced peptide synthesis methods. That is, an ester such as benzyl ester or trichloroethyl ester of proline is condensed with a phenylalanine whose amino group is protected with an amino protecting group that can be deprotected under reaction conditions different from the ester forming group, for example, Boc-phenylalanine to form a dipeptide ester. And the amino group of the phenylalanine moiety (Phe) of the dipeptide ester is liberated by deprotection. When the amino group is protected with Boc (that is, a tertiary butoxycarbonyl group), a commonly used reagent such as TFA or a hydrogen chloride-dioxane solution or a hydrogen chloride-ethyl acetate solution is used for deprotection from the amino group.
[0013]
Next, the resulting dipeptide ester having a free amino group is subjected to amide condensation with a third amino acid (X) having a protected functional group to synthesize a protected tripeptide ester. After sufficient purification at this stage, the amount of the protected tripeptide ester is divided into 2 minutes, the amino terminal of one protected tripeptide ester is deprotected, and the carboxylic acid terminal of the other protected tripeptide ester is deprotected. In this case, a usual method is used for deprotection. That is, the amino terminal can be deprotected by using the above-mentioned TFA or hydrogen chloride solution, and the carboxylic acid terminal can be deprotected by catalytic reduction, catalytic hydrogen transfer reduction or saponification in the case of benzyl ester. Either method is used, and in the case of trichloroethyl ester, a zinc-acetic acid reduction method is used.
[0014]
Next, the two types of linearly protected tripeptides obtained here contain a repeated amino acid sequence by amide condensation of those having a free amino group and those having a free carboxyl group. Synthesize the protected hexapeptide. Next, the carboxyl protecting group is removed from the protected hexapeptide by the method described above, and then deprotected from the amino group to obtain a linear hexapeptide TFA or hydrochloride.
[0015]
The obtained salt of the linear hexapeptide is dissolved in a large amount of DMF or N-methylpyrrolidone, excess sodium bicarbonate is added to the solution, the mixture is cooled and stirred with ice water, and a condensing agent often used for peptide cyclization. For example, DPPA (diphenylphosphoric azide), PFPDP (pentafluorodiphenyl phosphinate) and the like are added, and the mixture is stirred at a low temperature of room temperature to 5 ° C. for 3 to 7 days to carry out a cyclization reaction. The reaction solution for cyclization is concentrated under reduced pressure if necessary, and after dilution with water, the cyclic hexapeptide product is extracted with a solvent such as ethyl acetate. Since the extract contains residues of the condensing agent, it can be easily removed by passing through a column of Sephadex LH20 equilibrated with methanol after concentration. The obtained cyclic hexapeptide can be further purified by chromatography on silica gel, ODS-silica gel or the like, if necessary.
[0016]
Examples of the third amino acid include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, methionine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, aspartic acid, asparagine, curtamine, glutamic acid, histidine, lysine, and arginine. .
[0017]
If the third amino acid has a functional group and is protected, it may be deprotected by a usual method. For example, when the ε-amino group of lysine is protected with a carbobenzyloxy group, deprotection is performed by catalytic reduction or catalytic hydrogen transfer reduction. Furthermore, the functional group newly released here can be modified in a usual manner. For example, the ε-amino group of lysine can be modified by acylation, urethanation, alkylation and the like. Among them, reductive alkylation with aldehydes and ketones and cyanoborohydride is effective for modification. The thus-modified cyclic hexapeptide of the formula (I) can also be purified by chromatography on silica gel, ODS-silica gel, Sephadex LH20 or the like.
[0018]
Specific examples of the group R present in a representative compound of the cyclic hexapeptide represented by the above formula (1) are shown in Table 1 below. Table 1 also shows the amino acids used as the third amino acid (X) in the synthesis of the cyclic hexapeptide. In Table 1, Z is an abbreviation for carbobenzyloxy group (that is, benzyloxycarbonyl group).
[0019]
[Table 1]
Furthermore, the cyclic hexapeptide of the first invention has a proteasome inhibitory activity.
[0021]
The proteasome inhibitory activity of the cyclic hexapeptide according to the present invention is shown in Table 2 below. This proteasome inhibitory activity was measured as follows. That is, a fraction containing proteasome prepared from mouse liver was used as an enzyme, and a fluorescent substrate of chymotrypsin-like peptidase (Suc-LLVY-MCA, manufactured by Peptide Institute) was used as a substrate. These enzymes and substrates were reacted with ATP (adenosine-5'-3 phosphate) for 30 minutes at 37 ° C in the presence or absence of the cyclic hexapeptide of the present invention. After the completion of the reaction, the fluorescence intensity of the substance decomposed and released by the proteasome is measured, and the fluorescence intensity is compared with the reaction in the presence and absence of the cyclic hexapeptide of the present invention. The degree of inhibition by the peptide was measured, and this measurement was used to determine the IC of the proteasome inhibitory activity of the cyclic hexapeptide of the present invention.50The value was determined.
[0022]
[Table 2]
[0023]
Accordingly, a second aspect of the present invention provides a proteasome inhibitor comprising a cyclic hexapeptide of the formula (I) as an active ingredient.
[0024]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Next, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following Examples. In addition, D and L of the amino acids shown in the examples are L-forms except those specially described.
[0025]
In the following examples, Rf values were measured by thin-layer chromatography using Merck's product (SILICAGEL60F-254) as a plate. When ethyl acetate-n-hexane (1: 1) was used as a developing solvent, it was indicated as an Rf1 value, and when chloroform-methanol (10: 1) was used, it was indicated as an Rf2 value. When a product of Merck (RP-18F-254) was used as a plate and 4% potassium acetate + 0.8% citrate buffer-acetonitrile (1: 1) was used as a developing solvent, the Rf3 value was displayed.
[0026]
Embodiment 1
(A) Synthesis of {Boc-D-phenylalanyl-L-proline} benzyl ester
Boc-D-phenylalanine 1.5 g (5.66 mmol), L-proline benzyl ester, Tos 1.51 g (6.25 mmol, 1.1 eq), Bop reagent 2.76 g (1.1 eq), HOBt 0. 85 g (1.1 equivalent) was placed in an eggplant-shaped flask, to which 12 ml of DMF was added and dissolved by stirring with a magnetic stirrer. The obtained solution was cooled with ice water, and 2.38 ml of triethylamine was added. After 30 minutes, the ice-water bath was removed, and the mixture was stirred at room temperature overnight to perform an amide condensation reaction.
Ethyl acetate (200 ml) was added to the obtained reaction solution, and the mixture was washed successively with 200 ml × 2 10% aqueous citric acid solution and 4% aqueous sodium hydrogen carbonate solution, and washed once with saturated saline. Then, it dried with sodium sulfate for 1 hour. Filtration and concentration gave 2.93 g of a colorless syrupy substance (theoretical yield 2.56 g). This was dissolved in chloroform, applied to a 100 ml silica gel column, developed with chloroform-ethyl acetate (3: 1), monitored by UV, and concentrated to dryness to obtain 2.66 g of the title substance.
[0027]
(B) Synthesis of {D-phenylalanyl-L-proline} benzyl ester} hydrochloride
The above Boc-D-phenylalanyl-L-proline benzyl ester was dissolved in 5 ml of anhydrous THF, and 15 ml of 4N hydrochloric acid / dioxane was added to the solution. A closed balloon was attached to the mouth of the flask containing the solution to shield it from the outside air, and the flask was allowed to stand at room temperature for 1 hour (Boc elimination reaction). Concentrate after 1 hour. Ethyl acetate was further added, and the mixture was repeatedly concentrated to dryness to obtain the title substance.
[0028]
(C) Synthesis of {Boc-L-leucyl-D-phenylalanyl-L-proline} benzyl ester
1097 mg (1.1 equivalents) of D-phenylalanyl-L-proline benzyl ester hydrochloride (calculated as 100% in two steps) synthesized from 4 mmol of Boc-D-phenylalanine in (b) above. Boc-L-leucine monohydrate, 1946 mg (1.1 equivalents) of Bop reagent, and 595 mg (1.1 equivalents) of HOBt were added and dissolved in about 12 ml of DMF. 1.68 ml (3 equivalents) of triethylamine is added to the solution, and the mixture is stirred overnight to perform an amide condensation reaction. The reaction was concentrated to dryness under reduced pressure. It is dissolved in 150 ml of ethyl acetate, and the solution is washed with an acid and an alkali in the same manner as in Example 1 (a), dried and concentrated to dryness. The obtained dried solid was dissolved in chloroform, applied to a 100 ml silica gel column, developed with chloroform-ethyl acetate (3: 1), monitored by UV, and concentrated to dryness to obtain 2012 mg of the title substance (protected tripeptide).
[0029]
(D) Boc- (L-leucyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-)2Synthesis of benzyl ester
(I) 630 mg of Boc-L-leucyl-D-phenylalanyl-L-proline {benzyl ester} obtained in Example 1 (c) was dissolved in 10 ml of ethyl acetate, and 50 mg of palladium black was added to the solution. Hydrogen reduction at room temperature and pressure overnight (elimination of benzyl group). The catalyst was removed by filtration and concentrated to dryness to obtain Boc-L-leucyl-D-phenylalanyl-L-proline.
(Ii) 630 mg of Boc-L-leucyl-D-phenylalanyl-L-proline dibenzyl ester obtained in Example 1 (c) was dissolved in 1 ml of dehydrated THF, and 3 ml of 4N hydrochloric acid was added to the solution. A dioxane solution was added and reacted at room temperature for 1 hour (Boc desorption). After concentration, ethyl acetate was added to the syrupy residue and concentrated to dryness to obtain L-leucyl-D-phenylalanyl-L-proline benzyl ester hydrochloride.
[0030]
(Iii) 591 mg (1.2 equivalents) of Boc-L-leucyl-D-phenylalanyl-L-proline obtained in (i) above and Bop reagent and 166 mg of HOBt ( 1.1 eq.) And 10 ml of DMF were added and dissolved, the mixture was cooled with ice water, and 0.468 ml of triethylamine was added. After 30 minutes, the ice-water bath was removed, and the mixture was stirred at room temperature overnight to perform an amide condensation reaction.
100 ml of ethyl acetate is added to the reaction solution containing the generated linear protected hexapeptide, and the mixture is washed with 100 ml × 2 of a 10% aqueous citric acid solution and a 4% aqueous sodium hydrogen carbonate solution, and further washed once with a saturated saline solution. , And dried over sodium sulfate for 1 hour. Filtration and concentration gave 1200 mg of a colorless syrupy substance. This was dissolved in chloroform, applied to a 100 ml silica gel column, developed with chloroform-ethyl acetate (3: 1), monitored by UV, and concentrated to dryness to obtain 990 mg of the title substance (protected hexapeptide).
[0031]
(E) Cyclo (-L-leucyl-D-phenylalanyl-prolyl-)2Synthesis of
Boc- (L-leucyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-) obtained in Example 1 (d) (iii)2900 mg of {benzyl ester} is dissolved in 15 ml of ethyl acetate, and 80 mg of palladium black is added to the solution, and the mixture is hydrogen-reduced at room temperature and normal pressure overnight (elimination of benzyl group). The catalyst was removed by filtration and concentrated to dryness. Boc- (L-leucyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-)2-OH was obtained.
[0032]
Next, 10 ml of trifluoroacetic acid was added to the obtained solid and reacted at room temperature for 1 hour to desorb Boc. Then, ethyl acetate is added to the syrupy residue obtained by concentration, and the mixture is concentrated to dryness. Obtained (L-leucyl-D-phenylalanyl-L-prolyl)2-OH was dissolved in 90 ml of DMF, 1 g of sodium hydrogen carbonate was added, the mixture was cooled and stirred with ice water, 0.3 ml of DPPA (diphenylphosphate azide) was added to the solution, and the mixture was stirred in a low-temperature laboratory at 5 ° C for 90 hours ( Cyclization reaction).
[0033]
400 ml of ethyl acetate was added to the cyclization reaction solution, and the mixture was washed with 400 ml × 2 of a 10% aqueous citric acid solution, a 4% aqueous sodium hydrogen carbonate solution, and once with a saturated saline solution, dried over sodium sulfate for 1 hour, filtered and filtered. Concentrate to give a pale yellow oil.
[0034]
This is dissolved in a small amount of methanol, poured into a 500 ml Sephadex LH20 column filled with methanol, developed with methanol, and monitored for UV absorption to collect the first peak. The solvent is removed under reduced pressure, the residue is dissolved in 60% acetonitrile, and adsorbed on a column of ODS silica gel @ 37 mm ID × 300 mm to develop the acetonitrile concentration stepwise. The eluate was monitored for UV absorption to give the main product with 90% acetonitrile. After concentrating to dryness, 180 mg of the desired title substance (cyclic hexapeptide) was obtained as a colorless solid.
FAB-MS: Δm / z = 715 (M + H)+
Rf2 = 0.53
[0035]
Embodiment 2
(A) Synthesis of {Boc-D-phenylalanyl-L-proline} 2,2,2-trichloroethyl ester
2.637 g of L-proline 2,2,2-trichloroethyl ester hydrochloride, 2.594 g of Boc-D-phenylalanine, 4.695 g of Bop reagent, and 1.383 g of HOBt were dissolved in 16 ml of DMF, and the solution was cooled and stirred with ice water. Then, 3.915 ml of triethylamine was added, and the mixture was stirred for 30 minutes and stirred at room temperature overnight (amide condensation reaction).
Ethyl acetate (200 ml) was added to the reaction solution, and the mixture was washed with 200 ml × 2 10% aqueous citric acid solution and 4% aqueous sodium hydrogen carbonate solution, washed once with saturated saline, and then dried over sodium sulfate for 1 hour. Filtration and concentration gave 4.565 g of the title material as a colorless solid.
FAB-MS: Δm / z = 493 (M + H)+
Rf1 = 0.74
[0036]
(B) Synthesis of {Boc- (ε-benzyloxycarbonyl-L-lysyl) -D-phenylalanyl-L-proline} 2,2,2-trichloroethyl ester
2.6675 g of Boc-D-phenylalanyl-L-proline {2,2,2-trichloroethyl ester} obtained in Example 2 (a) was dissolved in 10 ml of THF, and 20 ml of a 4N hydrochloric acid-dioxane solution was added to the solution. After leaving at room temperature for 1 hour, hydrochloric acid and the solvent were distilled off under reduced pressure to obtain D-phenylalanyl-L-proline @ 2,2,2-trichloroethyl ester hydrochloride.
To this, 2.266 g of Boc- (ε-benzyloxycarbonyl) -L-lysine, 2.647 g of Bop reagent and 809 mg of HOBT were added, dissolved in 15 ml of DMF, cooled with ice water and stirred, and cooled with triethylamine. After adding 271 ml, the mixture was stirred under cooling for 30 minutes and stirred at room temperature overnight (amide condensation reaction).
[0037]
Ethyl acetate (200 ml) was added to the reaction solution, and the mixture was washed with 200 ml × 2 10% aqueous citric acid solution and 4% aqueous sodium hydrogen carbonate solution, washed once with saturated saline, and then dried over sodium sulfate for 1 hour. After filtration and concentration, 3.372 g of Boc- (ε-benzyloxycarbonyl-L-lysyl) -D-phenylalanyl-L-proline 2,2,2-trichloroethyl ester was obtained as a colorless solid.
FAB-MS: Δm / z = 755 (M + H)+
Rf1 = 0.32
[0038]
(C) {Boc- (ε-benzyloxycarbonyl-L-lysyl) -D-phenylalanyl-L-prolyl- (ε-benzyloxycarbonyl-L-lysyl) -D-phenylalanyl-L-proline} 2 Synthesis of 2,2-trichloroethyl ester
(I) 3.34 g of the substance obtained in Example 2 (b) was bisected. One was dissolved in 3 ml of THF, 12 ml of a 4N hydrochloric acid-dioxane solution was added, and the mixture was left at room temperature for 1 hour to remove Boc. Thereafter, hydrochloric acid and the solvent were distilled off under reduced pressure to obtain ε-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-D-phenylalanyl-L-proline−2,2,2-trichloroethyl ester hydrochloride.
(Ii) The other was dissolved in 15 ml of 90% acetic acid, 2 g of zinc dust was added in three portions with stirring, and the mixture was stirred overnight (elimination reaction of 2,2,2-trichloroethyl group). The insoluble matter containing excess zinc was filtered off, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in 100 ml of ethyl acetate, washed twice with 100 ml of water, washed with saturated saline, further dried over sodium sulfate, and then concentrated to dryness under reduced pressure to obtain Boc- (ε-benzyloxycarbonyl-L-lysyl). -D-Phenylalanyl-L-proline was obtained.
[0039]
(Iii) Both of these, that is, the product of (i) and the product of (ii) were combined, 1077 mg of Bop reagent and 330 mg of HOBt were added, dissolved in 10 ml of DMF, and 0.33 ml of triethylamine was added under ice-cooling and stirring. One hour later, the mixture was returned to room temperature and stirred overnight (amide condensation reaction). (4) 200 ml of ethyl acetate was added to the reaction solution, and the mixture was washed with 200 ml × 2 of a 10% aqueous citric acid solution and a 4% aqueous sodium hydrogen carbonate solution, washed once with a saturated saline solution, and then dried over sodium sulfate for 1 hour. After filtration and concentration, 2.586 g of a colorless solid was obtained. This was dissolved in 10 ml of methanol, poured into a 1 L column of Sephadex LH20 filled with methanol, and developed with methanol. The eluate was fractionated by monitoring ultraviolet absorption. The first half was single by HPLC analysis and was concentrated to dryness to obtain 1.178 g of a solid. The latter half weighed 1.036 g including impurities. This was dissolved in chloroform, adsorbed on a 200 ml silica gel column, and developed with chloroform: methanol (40: 1) to obtain 837 mg of the desired product. Total yield: 2.005 g.
FAB-MS: Δm / z = 1175 (M + H)+
Rf1 = 0.10
[0040]
(D) Synthesis of cyclo (-ε-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-D-phenylalanyl-prolyl-ε-benzyloxycarbonyl-L-lysyl-D-phenylalanyl-prolyl-)
1.55 g of the product substance obtained in Example 2 (c) was dissolved in 11 ml of 90% acetic acid, and 1 g of zinc dust was added to the solution with stirring three times, and the mixture was reacted overnight with stirring. . The insoluble matter containing excess zinc was filtered off, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in 100 ml of ethyl acetate, washed with 100 ml of water, and concentrated to dryness under reduced pressure. Methanol was added to the residue, dissolved, poured into a 200 ml column of Sephadex LH20 filled with methanol, and developed with methanol. The first peak was collected by monitoring with UV and concentrated under reduced pressure to dryness to obtain 1.343 g.
14 ml of trifluoroacetic acid was added to 1.303 g of the mixture and stirred for 1 hour. The trifluoroacetic acid was distilled off under reduced pressure, 3 ml of toluene was added to the residue, and the mixture was concentrated under reduced pressure twice to obtain a trifluoroacetic acid salt of a hexapeptide having a released amino group and a carboxyl group. This was dissolved in 100 ml of DMF, 760 mg of sodium hydrogen carbonate was added, and the mixture was stirred while cooling with ice water, and 0.6 ml of diphenylphosphoric azide was added. Stirred in a cold laboratory at 5 ° C. for 64 hours.
[0041]
The reaction solution was diluted with 600 ml of ethyl acetate, washed twice with 400 ml of a 4% aqueous sodium bicarbonate solution, with a 10% aqueous citric acid solution and a saturated saline solution, dried over sodium sulfate for 1 hour, filtered, and concentrated to give a pale yellow solution. An oil is obtained. This is dissolved in a small amount of methanol, poured into a 500 ml Sephadex LH20 column filled with methanol, developed with methanol, and monitored for UV absorption to collect the first peak. The solvent was removed under reduced pressure to obtain 1.036 mg of a colorless solid. This was dissolved in a small amount of chloroform, poured into a 200 ml column of silica gel packed with chloroform, and developed with chloroform: methanol (40: 1) and then (20: 1). The fractions were collected by monitoring UV absorption and concentrated to dryness to obtain 885 mg of a colorless solid. Dissolution in 60% acetonitrile and further purification by ODS silica gel chromatography gave 728 mg of the title material.
FAB-MS: Δm / z = 1013 (M + H)+
Rf2 = 0.44
[0042]
(E) Synthesis of cyclo (-lysyl-D-phenylalanyl-prolyl-lysyl-D-phenylalanyl-prolyl-)
380 mg of the product of Example 2 (d) was dissolved in 5 ml of methanol, 48 mg of palladium black moistened with a small amount of water was added to the solution, and the mixture was stirred, and 6 ml of a 5% ammonium formate methanol solution was added. Continue stirring. After 7 hours, the disappearance of the starting material was confirmed by HPLC, and the mixture was filtered and concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in 2 ml of methanol, poured into a Sephadex LH20 column filled with methanol, developed with methanol, and developed with 312 mg of the formate of the title substance. Obtained.
FAB-MS: Δm / z = 745 (M + H)+
Rf3 = 0.57
[0043]
Embodiment 3
(A) Synthesis of {Boc- (δ-benzyl) glutamyl-D-phenylalanyl-proline} 2,2,2-trichloroethyl ester
In the same manner as in Example 2 (b), 614 mg of Boc-glutamic acid δ-benzyl ester used in place of Boc-ε-benzyloxycarbonyl-L-lysine and 807 mg of Boc-D-phenylalanyl-proline-L Amide condensation was carried out using D-phenylalanyl-proline L-proline {2,2,2-trichloroethyl ester hydrochloride prepared from -proline} 2,2,2-trichloroethyl ester. The reaction solution was treated in the same manner as in Example 2 (b) to obtain 872 mg of the title substance.
[0044]
(B) Synthesis of {Boc- (δ-benzyl) glutamyl-D-phenylalanyl-prolyl- (δ-benzyl) glutamyl-D-phenylalanyl-proline} 2,2,2-trichloroethyl ester
776 mg of Boc- (δ-benzyl) glutamyl-D-phenylalanyl-proline 2,2,2-trichloroethyl ester obtained in Example 3 (a) were bisected. Example
Similarly to 2 (c), one was treated with acetic acid-zinc powder and the other was treated with hydrochloric acid-dioxane, followed by amide condensation with a Bop reagent and HOBt. Post-treatment was carried out in the same manner as in Example 2 (c) to obtain 605.4 mg of the title substance.
[0045]
(C) {Cyclo-(-(δ-benzyl) glutamyl-D-phenylalanyl-prolyl-)2Synthesis of
Boc- (δ-benzyl) glutamyl-D-phenylalanyl-prolyl- (δ-benzyl) glutamyl-D-phenylalanyl-proline {2,2,2-trichloroethyl ester obtained in Example 3 (b) 580 mg of the compound was treated with zinc acetate-zinc powder and treated with TFA in the same manner as in Example 2 (d) to obtain a free hexapeptide. Further, the reaction was cyclized with DPPA-sodium bicarbonate in a diluted DMF solution to carry out a reaction. The reaction mixture was extracted and purified by Sephadex LH20 chromatography and ODS-silica gel chromatography to obtain 302 mg of the title substance.
FAB-MS: Δm / z = 927 (M + H)+
Rf2 = 0.42
The product of the above (c) was subjected to hydrogen reduction in the presence of palladium black for elimination of a benzyl group in the same manner as in Example 2 (e) to give cyclo-(-glutamyl-D-phenylalanyl-prolyl).2Could be synthesized.
[0046]
Embodiment 4
Synthesis of cyclo (-ε-benzylidyl-D-phenylalanyl-prolyl-ε-benzyllidyl-D-phenylalanyl-prolyl-)
40 mg of cyclo (-lysyl-D-phenylalanyl-prolyl-lysyl-D-phenylalanyl-prolyl-) obtained in Example 2 (e) was dissolved in 2 ml of methanol, and 50 µl of benzaldehyde and cyanotriene were added to the solution. 13 mg of sodium hydroborate (NaBH3CN) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 6 hours.
The reaction solution was poured into a 500 ml column of Sephadex LH20 filled with methanol, developed with methanol, and the fraction eluted first and exhibiting ultraviolet absorption was collected. The solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was dissolved in 50% acetonitrile and purified by ODS silica gel chromatography to obtain 28 mg of the title substance.
FAB-MS: Δm / z = 925 (M + H)+
Rf3 = 0.38
[0047]
Embodiment 5
Synthesis of cyclo (-ε- (p-chlorobenzyl) lysyl-D-phenylalanyl-prolyl-ε- (p-chlorobenzyl) -D-phenylalanyl-prolyl-)
The reaction was carried out in the same manner as in Example 4 except that 50 mg of p-chlorobenzaldehyde was added instead of the benzaldehyde of Example 4. Purification gave 29 mg of the title material.
FAB-MS: Δm / z = 985 (M + H)+
Rf3 = 0.37
[0048]
Embodiment 6
Synthesis of cyclo (-ε- (p-methoxybenzyl) lysyl-D-phenylalanyl-prolyl-ε- (p-methoxybenzyl) -D-phenylalanyl-prolyl-)
The reaction was carried out in the same manner as in Example 4 except that 50 mg of p-methoxybenzaldehyde was added instead of the benzaldehyde of Example 4. Purification gave 27 mg of the title material.
FAB-MS: Δm / z = 993 (M + H)+
Rf3 = 0.24
[0049]
Embodiment 7
Synthesis of cyclo (-ε- (2-furylmethyl) lysyl-D-phenylalanyl-prolyl-ε- (2-furylmethyl) lysyl-D-phenylalanyl-prolyl-)
The reaction was carried out in the same manner as in Example 4 except that 50 μL of furfural was added instead of the benzaldehyde of Example 4. Purification gave 25 mg of the title material.
FAB-MS: Δm / z = 905 (M + H)+
Rf3 = 0.25
[0050]
Embodiment 8
Synthesis of cyclo (-ε- (3-pyridylmethyl) lysyl-D-phenylalanyl-prolyl ε- (3-pyridylmethyl) -D-phenylalanyl-prolyl-)
The reaction was carried out in the same manner as in Example 4 except that 50 μL of 3-pyridinecarbaldehyde was added in place of the benzaldehyde of Example 4. Purification gave 25 mg of the title material.
FAB-MS: Δm / z = 927 (M + H)+
Rf3 = 0.42
[0051]
Embodiment 9
Synthesis of cyclo (-ε-cyclohexylmethyl lysyl-D-phenylalanyl-prolyl ε-cyclohexylmethyl lysyl-D-phenylalanyl-prolyl-) In place of benzaldehyde of Example 4, 50 μL of cyclohexanecarbaldehyde was added The reaction was carried out as in Example 4. Purification gave 28 mg of the title material.
FAB-MS: Δm / z = 937 (M + H)+
Rf3 = 0.23
[0052]
Embodiment 10
Synthesis of cyclo (-ε-cyclohexyl ridyl-D-phenylalanyl-prolyl ε-cyclohexyl lysyl-D-phenylalanyl-prolyl-)
The reaction was carried out in the same manner as in Example 4 except that 50 μL of cyclohexanenone was added instead of the benzaldehyde of Example 4. Purification gave 28 mg of the title material.
FAB-MS: Δm / z = 909 (M + H)+
Rf3 = 0.35
[0053]
Embodiment 11
Synthesis of cyclo (-ε-isopropylridyl-D-phenylalanyl-prolyl-ε-isopropyl-D-phenylalanyl-prolyl-)
The reaction was carried out in the same manner as in Example 4 except that 50 μL of acetone was added instead of the benzaldehyde of Example 4. Purification gave 28 mg of the title material.
FAB-MS: Δm / z = 829 (M + H)+
Rf3 = 0.55
[0054]
[Sequence list]
[0055]
[0056]