Opis patentowy opublikowano: 89 09 30 147373 cz.* ;eiNh Urzedu Patentowego Int. Cl.4 C07H 15/234 Twórcy wynalazku: Halina Bojarska-Dahlig, Tadeusz Glabski, Swa Porebska-Kosik, Krzysztof Bieniek Uprawniony z patentu: Osrodek Badawozo-Rozwójowy Biotechnologii, Warszawa (Polska) SPOSÓB OTRZYMYWANIA 1-N-[L-/-/- f-mN0c£-HYDROKSYBUTYRYLOjKANAMYCYNY A I JEJ SOLI ADDYCYJNYCH 1-N-[L-/-/- jf-amino-^-hydroksybutyryloJ kanamycyna A, czyli amikacyjna, Jest acylowana w grupie aminowej przy C-1 pochodna kanamycyny Af bardzo wazna z punktu widzenia chemiote¬ rapii. Zarówno sama amikacyna jak i jej sole wykazuja silne dzialanie przeciwbakteryjne dzie¬ ki czemu znajduje zastosowanie w' lecznictwie. Obecnie powszechnie produkowany jest siarczan amikaoyny stosowany w postaoi roztworów do iniekoji dozylnyoh.Amikacyne otrzymuje sie przez selektywne acylowanie kanamycyny A dla wprowadzenia przy C-1 reszty kwasu L-/-/- Jf-amino-^C-hydroksymaslowego.W czasteczce kanamycyny A wystepuja cztery pierwszorzedowe grupy aminowe w pozycjach C-6#, C-1, C-3 oraz C-3". Opróoz nioh znajduje sie siedem grup hydroksylowych, z których jedna jest pierwszorzedowa, pozostale drugorzedowe. Obecnosc duzej liczby wspomnianych reaktywnych grup chemicznych w czasteczce wyjsciowego antybiotyku stwarza duze trudnosoi w przeprowadzaniu procesu selektywnego 1-N acylowania kanamyoyny A. Glówna idea opraoowan tego procesu, zmie- rzajaoyoh do pokonania wymienionych trudnosci jest wykorzystanie róznej reaktywnosci grup aminowyoh oraz stosowanie odpowiednich srodków aoylujaoych.Wedlug opisu patentowego polskiego nr 89 006 teohnologia otrzymywania amikaoyny polega na aoylowaniu kanamyoyny A w celu otrzymania 6'-N-benzyloksykarbonylokanamycyny A a nastep¬ nie wprowadzeniu w grupie aminowej przy C-1 reszty kwasu L-/-/-Jf-benzyloksykarbonyloamino- -*£-hydrokeymaslowego za pomoca jego aktywnego estru z N-hydroksysukcynoimidem (Anderson et. al,, J.Am.Chem.Soo. 86, 1839/1964) oraz usunieciu, w sposób typowy, np. przez wodorolize, ochrony grup aminowyoh. Praktyoznie metoda ta okazala sie malo przydatna ze wzgledu na nie¬ wielka selektywnosc reakcji, w wyniku czego tworzyly sie niepozadane produkty uboozne; wy¬ dajnosc amikaoyny nie przekraozala 10£* Proces wytwarzania amikacyny wedlug opisu patentowego polskiego nr 102 734 przebiega z wyzsza wydajnosoia jezeli zastosuje sie zablokowanie grup aminowych przez reakoje 6#-N-ben-2 147 373 zyloksykarbonylokanamycyny A z aldehydom, a otrzymany produkt o oharakterze zasady Sohiffa, podda sie selektywnemu dzialaniu nowego srodka acylujacego, to jest eetru N-hydroksy-5-nor- borneno-2,3^dikarboksyiraidowego kwasu L-/-/- 2f-benzyloksykarbonyloamino- -hydroksymaslowe¬ go. Niezaleznie od klopotliwosoi reakcji wytworzenia samego srodka acylujacego z bezwodnika kwasu 5-*iorbornenoendodikarboksylowego-2, 3 w trakoie procesu zachodzi konieoznosc parokrot¬ nego rozdzialu mieszanin reakcyjnych na kolumnach chromatograficznych. Proces zatem nie przebiega woale jednokierunkowo i równoczesnie jest bardzo kosztowny, co mozna wnosic z ilo¬ sci stosowanych reagentów.Obydwa wymienione wyzej patenty polskie przedstawiaja obecnie przestarzale rozwiazania technologicznef nieprzydatne w warunkach przemyslowych.Wsród aktualnych i opisanych sposobów otrzymywania amikacyny o znaczeniu przemyslowym nalezy wymienic dwa podstawowe kierunki. Pierwszy z nich opiera sie na znanym zjawisku two¬ rzenia przez antybiotyki aminoglikozydowe, w tym amikacyne A, kompleksów z metalami, miedzy innymi przedstawionymi w opisie patentowym brytyjskim nr 974 128 oraz przez Yamabe, Jap* J.Phannacol 17f 120 (1967). Wedlug tego schematu przeprowadzenie selektywnego acylowania kanamyoyny A wiaze sie z wykorzystaniem glównie kompleksów cynkowego lub miedziowego tego antybiotyku. Wspomniane kompleksy pozwalaja na uzyskanie 3,6#-di-N-benzyloksykarbonylokana- mycyny A, bedaoej podstawowym pólproduktem w dalszej syntezie, jak podano w opisie patento¬ wym St. ZJedn. Am. nr 4 230 847 °*az opisie patentowym belgijskim nr 879 925 i publikacji Teuchiya et al.f Tetrahedron Letters 1979t 4951- Jak wynika z oytowanyoh wyzej .opisów patentowyoh i publikacji wspomniany produkt posred¬ ni w homogennej mieszaninie tetrahydrofuranu z woda aoyluje sie glównie w pozycji 1-N za pomooa aktywnego estru kwasu L-/-/-!T-benzyloksykarbonyloamino--fi-hydroksymaslowego z N- hydroksysukcynoimidem, po czym nastepuje dosc skomplikowana operacja wyodrebniania pro¬ duktu.Bardziej korzystny jest opisany sposób postepowania polegajacy na dodatkowym zabezpie¬ czeniu grupy aminowej przy 0-3" w 3f6#-di-N-benzyloksykarbonylokanamycynie A przede wszyst¬ kim reszta trifluoroaoetylowa. Jednakze ta ostatnia metoda jest wieloetapowa i wymaga izo¬ lowania kilku produktów posrednich.Zasadnioza niedogodnosoia wspomnianyoh wyzej metod jest dlugotrwalosc poszczególnych reakoji. I tak, ozas reakcji wytwarzania samego podstawowego pólproduktu, otrzymanego po¬ przez kompleks cynkowy, wynosi od 9 do 24 godzin, po czym dopiero nastepuje wyodrebnienie 3,6'-di-N-benzyloksykarbonylokanamycyny A. Proces prowadzony jest w ukladzie jednofazowym, przy czym podkresla sie stale koniecznosc tworzenia w czasie reakoji roztworu homogennego.Etap zabezpieozania grupy aminowej przy C-3" reszta trifluoroaoe tylowa jest równiez dlugo¬ trwaly i przebiega w ciagu okolo 12 godzin. Przy wyodrebnianiu 3,6'-di-N-benzyloksykarbo- nylo-3" -N-trifluoroaoetylokanamyoyny A zuzywa sie duze ilosci eteru etylowego, co jest rozwiazaniem nie do przyjecia z punktu widzenia technicznego. Czas reakoji produktu posred¬ niego z aktywnym estrem, prowadzacej do otrzymania odpowiedniej pochodnej amikacyny wynosi 10 godzin, a skrócenie czasu trwania procesu pociaga za soba spadek wydajnosci.Odmienny schemat syntezy amikacyny jest podany w opisie patentowym polskim nr 117 307.Opisana w nim metoda polega na sililowaniu kanamycyny A lub jej 6'-N-monopodstawionej po- ohodnej w celu otrzymania polisililokanamyoyny A, która poddaje sie czesoiowej hydrolizie, a nastepnie wprowadza w polozenie 1-N reszte kwasu L-/-/-^f-amino-J!-hydroksymaslowego z zabezpieczona grupa aminowa. Usuwajac, w znany sposób, ochrony grup aminowyoh otrzymuje sie amikacyne.Wedlug naszych doswiadczen powyzszy sposób postepowania daje zdecydowanie mniej czysty produkt konoowy, jak równiez mniejsza wydajnosc niz w przypadku otrzymania go sposobem we¬ dlug opisu patentowego belgijskiego nr 879 925* Dodatkowa niedogodnosoia omówionych sohema- tów jest koniecznosc stosowania jako substratu kanamycyny A w formie zasady. Kanamycyna A w procesie biosyntezy jest wyodrebniana jako siarczan lub disiarczan. Ze wzgledu na wlasoi- wosci zasady jedyna metoda jej izolowania jest metoda jonitowa, tym samym do procesu pro¬ dukcyjnego wchodzi dodatkowy etap izolaoji kanamyoyny A zasady z jej siarczanu lub disiar- czanu.147 373 3 Postepujac sposobem wedlug niniejszego wynalazku jako produkt wyjsciowy stosuje sie siarczan lub disiarczan kanarayoyny A, którego roztwór wodny alkalizuje sie zasada taka, jak wodorotlenki metali alkalicznyoh, korzystnie wodorotlenek sodowy lub potasowy, wodorotlenek amonu, poddajac zawarta w roztworze wodnym kanamyoyne A zasade, w temperaturze od 0 do 100°C, korzystnie 40° - 60°Cf reakcji z solami cynku, kadmu i magnezu, badz ich mieszanina¬ mi. Nastepnie, dla wytworzenia ukladu heterofazowego, do mieszaniny reakcyjnej wprowadza sie rozpuszczalnik organiczny nie mieszajacy sie z woda, taki jak ester, keton lub chlorow- coalkan, korzystnie octan etylu, octan amylu, metyloizobutyloketon, ohlorek metylenu lub chloroform, po czym dodaje sie N-benzyloksykarbonyloksysukoynoimid w postaci stalej badz w roztworze tego rozpuszczalnika. Proces prowadzi sie w temperaturze od 0 C do temperatury wrzenia, korzystnie 40 - 60 C.Dla przyspieszenia poczatkowego stadium reakcji, jako katalizatory przeniesienia fazo¬ wego stosuje sie rózne czwartorzedowe zwiazki amoniowe, np. ohlorek tetraetyloamoniowy, chlorek benzylodimetyloheksadeoyloamoniowy lub wodorotlenek tetrametyloamoniowy. Proces wy¬ tworzenia podstawowego pólproduktu przez kompleks z metalami prowadzi sie w ciagu 1-2 go¬ dzin. Po jego zakonczeniu rozdziela sie warstwy i z warstwy wodnej, usuwajac jony metalu, wyodrebnia sie pólprodukt 3,6'-di-N-benzyloksykarbonylokanamyoyne A w sposób typowy.Sposobem wedlug niniejszego wynalazku przejscie z otrzymanego jak wyzej pólproduktu lub jego kompleksu z metalem do chronionej amikacyny prowadzi sie poprzez sililowe pochodne 3,6#-di-K-benzyloksykarbonylokanamyoyny A. Po przeprowadzeniu procesu polisililowania doko¬ nuje sie selektywnego odblokowania grupy aminowej przy C-1 droga hydrolizy lub alkoholizy.Otrzymany w ten sposób produkt, glównie 3,6#-di-H-benzyloksykarbonylo-3t, -U-sililo-poli-O- -sililokanamyoyne A, poddaje sie kolejno reakoji z aktywnym estrem dla wprowadzenia do wol¬ nej grupy aminowej reszty kwasu L-/-/- Jf-benzyloksykarbonyloamino-X-hydroksymaslowego, a nastepnie z otrzymanej w ten sposób ohronionej amikacyny czyli l-N-jjj-/-/- ^f-benzyloksykar- bonyloamino-Jl-hydroksybutyryloJ-3,6'-di-N-benzyloksykarbonylo-3t, -N-sililo-poli-O-sililo- -kanamyoyny A usuwa wszystkie grupy zabezpieczajace. Ten ostatni etap prowadzi sie dwustop¬ niowo przez usuniecie pozostalych reszt sililowych i wodorolize, uzyskujac czysta amikacyne.W reakcji polisililowania 3,6'-di-N-benzyloksykarbonylokanamycyny A stosuje sie kla¬ syczne srodki sililujace, korzystnie trimetylosililujace, w tym heksanie ty lodisilazan, tri- metylosililoaoetamid, bis-/trimetylosililo/aoetamid, korzystnie z dodatkiem katalizatora si- lilowania, takiego jak trimetylochlorosilan lub siarozany amin. Do wprowadzenia grupy ami¬ nowej przy C-1 w 3,6*-di-N-Benzyloksykarbonylo-3M -N-sililo-poli-O-sililokanamycynie A resz¬ ty kwasu L-/-/-jf-benzyloksykarbonyloamino-oC-hydroksymaslowego szczególnie dogodne sa jego aktywne estry, takie jak N-hydroksysukcynoimidowy, N-hydroksyftalimidowy lub N-hydroksy-5- norbomeno-2,3-dikarboksyimidowy, korzystnie N-hydroksysukcynoimidowy.Stosujac odmiane sposobu wedlug niniejszego wynalazku, po reakcji kanamyoyny A z N-ben- zyloksykarbonyloksysukcynoimidem, w dalszych etapach syntezy amikacyny wykorzystuje sie bezposrednio kompleks 3f6'-dibenzyloksykarbonylokanamycyny A, poddajac go reakoji z aktyw¬ nym estrem dla wprowadzenia przy C-1 reszty kwasu L-/-/- ^-benzyloksykarbonyloamino-pc-hy- droksymaslowego i uzyskuje ohroniona amikaoyne czyli l-N-[L-/-/-jf-benzyloksykarbonyloami- no-0C-hydroksybutyryloJ-3f6#-di-N-benzyloksykarbonylokanamycyne A, po czym usuwa ochrone grup aminowyoh przez wodorolize. Otrzymana w ten sposób amikaoyna jest identyczna jak w pierwszej wersji sposobu.Otrzymana w procesie wedlug niniejszego wynalazku amikaoyne w postaoi addycyjnej soli z kwasem weglowym przeprowadza sie w inne addycyjne sole z kwasami nieorganioznymi takimi jak kwas siarkowy, solny, fosforowy lub z kwasami organioznymi takimi jak kwas winowy, lak- tobionowy, glukolaktonowy, glukoheptonowy, L-asparaginowy w ilosci 1-4 gramorównowazników na 1 mol amikacyny.Opisane wyzej sposoby wedlug wynalazku wykazuja te wyzszosc, ze operuje sie jednym tyl¬ ko izolowanym produktem posrednim, to jest 3,6#-di-N-benzyloksykarbonylokanamycyna A lub jej kompleksem z metalem. Zastosowanie w reakoji kanamyoyny A z N-benzyloksykarbonyloksy- sukoynoimidem ukladu heterofazowego z dodatkowym udzialem katalizatora przeniesienia fazo-4 147 373 wego kilkakrotnie przyspiesza te reakcje. Warunki prowadzenia prooesu sa szczególnie dogod¬ ne dla stosowania kanamycyny A zasady in situ z siarczanem kanaraycyny z pomieciem izolacji jonitowej. Zastosowanie polisililowania jako metody przejsciowego blokowania grupy aminowej przy C-3" w 3,6'-di-N-benzyloksykarbonylokanamyoynie A pozwolilo na wyeliminowanie etapów dlugotrwalych. Uzycie wspomnianego produktu posredniego zamiast kanamyoyny A doprowadzilo do zwiekszenia wydajnosci amikacyny oraz poprawy czystosci produktu.Przyklad I. Otrzymywanie 3,6*-di-N-benzyloksykarbonylokanamycyny A. 1,2 g (0,0021 mola) siarczanu kanamycyny A rozpuszczono w 20 om' wody i alkalizowano stezonym roztworem KOH do wartosci pH = 9,5. Dodano 10 om' metanolu oraz 2,4 g (0,0090 mo¬ la) trihydratu octanu kadmu i mieszano 2 godziny na lazni wodnej w temperaturze 45 - 50 C.Nastepnie dodano 20 om' ohlorku metylenu, 0,3 g chlorku benzylodimetyloheksadecyloamonio- wego oraz wkraplano roztwór 1,2 g (0,0048 mola) N-benzyloksykarbonyloksysukcynoimidu w 10 cm' chlorku metylenu. Mieszanie i ogrzewanie na lazni wodnej kontynuowano przez 1 godzi¬ ne. Mieszanine reakcyjna schlodzono do temperatury pokojowej, oddzielono faze wodna i odpa¬ rowano pod próznia do sucha. Sucha pozostalosc rozpuszczono w 60 cm' roztworu dioksan-woda (1 : 1) i wprowadzono na chromatograficzna kolumne jonitowa (40 cm' jonitu Amberlit CG-50, forma H+, w roztworze dioksan-woda 1:1).Eluowano roztworem dioksan - 1 N roztwór NH.OH (1 : 1). Frakcje zawierajace 3,6^-di-N- benzyloksykarbonylokanamycyne A zatezano pod próznia, saczono wydzielony osad, przemywajac go nastepnie woda. Po suszeniu uzyskano 0,92 g (wydajnosc 77% w/w) 3f6'-di-N-benzyloksykar- bonylokanamycyny A.Analiza dla wzoru C^Ha^^IC* Obliozono: 54,2% C; 6,4% H; 7,4% N; Otrzymano: 53f6% C; 6,3% H; 7,0% N.Przyklad II. Otrzymywanie kompleksu 3,6'-di-N-benzyloksykarbonylokanamyoyny A z. cynkiem. 12,0 g (0,0206 mola) siarczanu kanamycyny A rozpuszczono w 200 cm' wody i alkalizowano stezonym roztworem NaOH do wartosci pH = 9,5. Dodano 80 om' metanolu oraz 20,0 g (0,0911 mo¬ la) dihydratu octanu cynku i mieszano 1 godzine na lazni wodnej w temperaturze 45° - 50°C.Nastepnie dodano 400 cm' octanu etylu, 1,0 g chlorku tetraetyloamoniowego oraz porcjami 12,0 g (0,0481 mola) N-benzyloksykarbonylokeysukcynoimidu. Mieszanie i ogrzewanie na lazni wodnej kontynuowano przez 45 min. Mieszanine reakoyjna ochlodzono do temperatury pokojowej, oddzielono faze wodna, skorygowano jej wartosc pH do 7,5, po czym odparowano ja pod zmniej¬ szonym cisnieniem do sucha. Pozostalosc rozdrobniono i mieszano przez 1 godzine z 200 cm' metanolu, po ozym chlodzono w temperaturze okolo 5°G.Wydzielony Osad odsaozono i wysuszono pod próznia, uzyskujao 10,4 g (wydajnosc 87% w/w) kompleksu 3,6'-di-N-benzyloksykarbonylokanamycyny A z cynkiem.Przyklad III. Otrzymywanie 1-N-[1-/-/-Jf-amino-^-hydroksybutyrylo]kanamyoy¬ ny A (amikacyny) z 3,6'-di-N-benzyloksykarbonylokanamycyny A.Do zawiesiny 10,0 g (0,0133 mola) 3f6'-di-N-benzyloksykarbonylokanamycyny A w 100 om' bezwodnego aoetonitrylu dodano 11,7 g (15f0 cm'; 0,073 mola) heksametylodisilazanu, 0,1 om' trimetylochlorosilanu i calosc ogrzewano do wrzenia przez 5 godzin. Roztwór poreak- oyjny odparowano pod zmniejszonym cisnieniem do uzyskania spienionej pozostalosoi, która nastepnie rozpuszczono w 75 cm' aoetonu. Po ochlodzeniu otrzymanego roztworu do temperatu¬ ry 5 C dodano 2,0 om' wody i mieszano w tej temperaturze przez 0,5 godziny.Nastepnie przy mieszaniu wkroplono roztwór 5f0 g (0,0143 mola) estru N-hydroksysukcyno- imidowego kwasu L-/-/- Jf-benzyloksykarbonyloamino-JI -hydroksymaslowego w 40 om' acetonu i calosc mieszano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Do pozostalego roztworu dodano 50 cm^ wody i doprowadzono pH mieszaniny do wartosci 2 za pomoca kwasu solnego, po czym mieszano w tyoh warunkach jeszcze przez 0,5 godziny. Otrzymana mieszanine odparowano pod zmniejszonym cisnieniem do uzyskania suchej pozostalosoi, która z kolei rozpuszczono w 250 cm^ mieszaniny dioksan - woda (1 : 1). Do otrzymanego roztworu dodano 3,0 g mrówozanu amonu, 2,5 g katalizatora 5% Pd/C i mieszano w atmosferze wodoru w temperaturze pokojowej147 373 5 przez 4 godziny. Po oddzieleniu katalizatora otrzymany przesaoz zatezano pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 80 om' i naniesiono na kolumne z jonitem Amberlit CG-50(NH^+) Po przemyoiu kolumny woda dokonano elucji za pomooa 0,5 N roztworu NH^OH, zbierajac frakcje po 20 om' i kontrolujac je chromatograficznie. Frakcje zawierajace produkt polaczono i od¬ parowano lacznie do uzyskania szklistej pozostalosci. Po wymieszaniu jej z 100 cm5 etanolu bezwodnego otrzymano osad, który odsaczono i wysuszono pod próznia otrzymujac 5,4 g (wydaj¬ nosc 54% w/w) weglanu amikacyny.Analiza dla wzoru: C22H43N5°13 * H2C°3; Obliczono: 42,6% C; 7t0% H; 10,6% N; Otrzymano: 42,1% C; 7,1% H; 10,4% N.W widmie HPLC produktu praktycznie brak zanieczyszczen.Przyklad IV, Otrzymywanie 1-N-[L-/-/- jf-benzyloksykarbonyloamino-«C-hydroksy- butyrylo -3,6'-di-N-benzyloksykarbonylokanamyoyny A z kompleksu 3,6'-di-N-benzyloksykarbo- nylokanamyoyny A z cynkiem.Do roztworu 1,8 g kompleksu 3,6#-di-N-benzyloksykarbonylokanamyoyny A z cynkiem w 40 om' mieszaniny dioksan-woda (1 : 1) dodano w ciagu 10 minut 0,9 g (0,0026 mola) estru N-hydroksysukcynoimidowego kwasu L-/-/- ]J"-benzyloksykarbonyloamino-*6-hydroksymaslowego i calosc mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Mieszanine poreakoyjna rozcien¬ czono za pomooa 20 cm' wody i zatezono pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 30 cm' wody. Wydzielony osad odsaczono i wysuszono pod próznia otrzymujac 0,75 S (wydaj¬ nosc 42% w/w) 1-N- L-/-/« )f-benzyloksykarbonyloamino-j6-hydroksybutyrylo -3f6*-di-N-benzy- loksykarbonylokanamycyny A, Przyklad V, Otrzymywanie 1-N-^L-/-/-V-stmlno-j6-hydroksybutyrylo3kaiiamycy¬ ny A (amikacyny) z l-N-Qj-/-/- jf-benzyloksykarbonyloamino-^-hydroksybutyrylol^je^-di-N- -benzyloksykarbonylokanamycyny A.Do mieszaniny 0,75 S (0,0008 mola) 1-N-£L-/-/- ^-benzyloksykarbonyloamino-Jt-hydroksy- butyrylo]-3,6'-di-N-benzyloksykarbonylokanamycyny A w 20 cm' mieszaniny dioksan-woda (1:1) dodano 0,2 cm' kwasu octowego i calosc mieszano w temperaturze 50°C do rozpuszczenia osa¬ du. Po ochlodzeniu otrzymanego roztworu do temperatury pokojowej dodano 0,25 g katalizato¬ ra 5% Pd/C i calosc mieszano w atmosferze wodoru przez 4 godziny. Nastepnie odsaozono ka¬ talizator i przemyto go 10 om' wody, dolaczajac roztwór z przemycia do przesaczu. Uzyskany roztwór zageszozono pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 10 om' i naniesiono na kolumne z jonitem Amberlit CG-50 (NH^+). W wyniku elucji roztworem 0,5 N NH.OH wyizolowano 0,4 g (wydajnosc 53% w/w) weglanu amikacyny o wlasciwosoiaoh jak w przykladzie III, Przyklad VT. Otrzymywanie 1-N-[L-/-/- ]f-amino- <£-hydroksybutyrylo]kanamycyny A (amikacyny) z kompleksu 3,6#-di-N-benzyloksykarbonylokanamyoyny A z cynkiem Do zawiesiny 1,0 g kompleksu 3,6'-di-H-benzyloksykarbonylokanamycyny A z cynkiem w 15 om' bezwodnego aoetonitrylu dodano 2,0 cm' heksametylodisilazanu, 0,01 cm' trimetylochlo- rosilanu i calosc mieszajac ogrzewano do wrzenia przez 5 godzin. Odsaczono osad, a przesacz odparowano pod zmniejszonym cisnieniem do sucha. Pozostalosc rozpuszczono w 10 cm' acetonu, a do uzyskanego roztworu dodano 0,25 om' wody i oalosc mieszano przez 1 godzine. Nastepnie dodano 0,5 S (0,0014 mola) estru N-hydroksysukcynoimidowego kwasu L-/-/- ]f-benzyloksykarbo- nyloamino-jS-hydroksymaslowego i mieszano jeszcze przez 3 godziny. Do zawiesiny poreakcyj¬ nej dodano 10 om' wody, doprowadzono pH kwasem solnym do wartosci 2,5 i mieszano w tych wa- runkaoh przez 0,5 godziny. Nastepnie oalosc zageszczono pod zmniejszonym cisnieniem do mo¬ mentu uzyskania substancji oleistej, która z kolei rozpuszczono w 10 cm' wody. Do otrzyma¬ nego roztworu dodano 0,2 g katalizatora 2% Pd/C i mieszano w atmosferze wodoru przez 2 go¬ dziny. Po oddzieleniu katalizatora otrzymany przesaoz wprowadzono na kolumne z jonitem Am¬ berlit CG-50 (NH^"1"). W wyniku eluoji 0,5 N roztworem NH.OH wyizolowano 0,35 S (wydajnosc 35% w/w) weglanu amikacyny o wlasciwosoiaoh jak w przykladzie III, Przyklad VII, Otrzymywanie soli addycyjnej amikacyjny z kwasem siarkowym (1 t 2; disiarczanu amikacyny).Do roztworu 32,4 g (0,005 mola) weglanu amikacyny w 250 om' wody wkroplono mieszajac 10,0 cm' (0,01 mola) 1 H roztworu NgSO^. Calosc mieszano jeszoze przez okolo 0,5 godziny do6 147 373 momentu ustania wydzielania pecherzyków C02, po czym saczono, usuwajac sladowe ilosoi za¬ nieczyszczen mechanicznych. Przesacz poddano suszeniu rozpylowemu, otrzymujao 39|0 g soli addycyjnej amikacyny z kwasem siarkowym (1:2; disiarozanu amikacyny) o mocy biologioznej 686 g/mg.Przyklad VIII, Otrzymywanie soli addycyjnej amikacyny z kwasem winowym (1:1; monowinianu amlkaoyny).Do roztworu 10,0 g (0,017 mola) amikacyny w 100 cm* wody dodano mieszajao 2,55 g (0,017 mola) kwasu winowego. Calosc mieszano jeszcze przez 1 godzine, po czym saczono usu¬ wajac sladowe ilosci zanieczyszczen mechanicznych, Przesaoz poddano liofilizacji, otrzymu¬ jac 12,5 g soli addyoyjnej amikacyny z kwasem winowym (1:1; monowinianu amikacyny) o mocy biologioznej 695 g/mg. PLThe patent description was published: 89 09 30 147 373 part *; eiNh of the Patent Office Int. Cl.4 C07H 15/234 Inventors: Halina Bojarska-Dahlig, Tadeusz Glabski, Swa Porebska-Kosik, Krzysztof Bieniek Authorized by the patent: Research and Development Center Biotechnologii, Warsaw (Poland) METHOD OF OBTAINING 1-N- [L - / - / - f-mN0c £ -HYDROXYBUTYRYLOjKANAMYCYIN AND ITS ADDITIONAL SALTS 1-N- [L - / - / - jf-amino - ^ - hydroxybutyryl, canamycin A that is, amicated. It is acylated in the amino group at C-1 of the kanamycin derivative Af very important from the point of view of chemotherapy. Both amikacin itself and its salts exhibit a strong antibacterial effect, which makes them useful in medicine. Currently, amikaoyin sulfate is widely produced, used in the form of intravenous injection solutions. Amikacin is obtained by selective acylation of kanamycin A to introduce an L - / - / - Jf-amino- ^ C-hydroxybutyric acid residue at C-1. Kanamycin A molecules are present. four primary amine groups at positions C-6 #, C-1, C-3 and C-3 ". Empty there are seven hydroxyl groups, one of which is primary, the other secondary. Presence of a large number of the mentioned reactive chemical groups in the molecule. The main idea of this process, aimed at overcoming the above-mentioned difficulties, is the use of different reactivity of amino groups and the use of appropriate aoyl compounds. According to Polish patent description no. 89 006, amikaoyna is the aoylation of kanamyoyna A in order to obtain 6'-N-gasoline loxycarbonylcanamycin A followed by the introduction in the C-1 amino group of a L - N - Jf-benzyloxycarbonylamino- - * β-hydroxybutyric acid residue with its active ester with N-hydroxysuccinimide (Anderson et. al ,, J.Am.Chem.Soo. 86, 1839/1964) and removing, in a conventional manner, e.g. by hydrogenolysis, the protection of the amino groups. In practice, this method turned out to be of little use due to the low selectivity of the reaction, which resulted in the formation of undesirable by-products; The efficiency of amikaoyin did not exceed 10 £ * The process of producing amikacin according to Polish patent no. 102 734 is more efficient if the blocking of amino groups is applied by reacting 6 # -N-ben-2 147 373 vinyoxycarbonylcanamycin A with aldehyde, and the obtained product is With a Sohiff base, it will be subject to the selective action of a new acylating agent, i.e. the N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboxyirid eether of L - / - 2-b-benzyloxycarbonylamino-hydroxybutyric acid. Regardless of the troublesome reaction of preparing the acylating agent itself from 5- * iorborneneendodicarboxylic acid anhydride, it is necessary during the process to separate the reaction mixtures several times over the chromatographic columns. Therefore, the process is not one-way and is very costly, which can be deduced from the amount of reagents used. Both of the above-mentioned Polish patents presently outdated technological solutionsf not useful in industrial conditions. Among the current and described methods of obtaining amikacin of industrial importance, two should be mentioned basic directions. The first is based on the known phenomenon of the formation of metal complexes by aminoglycoside antibiotics, including amikacin A, including those described in British Patent No. 974,128 and by Yamabe, Jap.J.Phannacol 17f 120 (1967). According to this scheme, selective acylation of kanamyoyin A is mainly associated with the use of zinc or copper complexes of this antibiotic. Said complexes make it possible to obtain the 3,6% -di-N-benzyloxycarbonylcaramycin A, which is the basic intermediate in the further synthesis, as described in US Pat. Of Am. No. 4,230,847 ° and Belgian Patent No. 879,925 and Teuchiya et al., Tetrahedron Letters 1979t 4951 - As is apparent from the above-referenced patents and publications, said intermediate product in a homogeneous mixture of tetrahydrofuran with water aliases mainly in of the 1-N position with the help of an active L - / - / -! T-benzyloxycarbonylamino-β-hydroxybutyric acid ester with N-hydroxysuccinimide, followed by a rather complicated operation of isolating the product. The described procedure is more advantageous. Combining the amino group at 0-3 "in the 3f6-di-N-benzyloxycarbonylcanamycin And, above all, the trifluoroaoethyl residue. However, the latter method is multi-step and requires the isolation of several intermediates. The reason for the inefficiency of the above-mentioned methods is the long duration of the Thus, the reaction time for the production of the basic intermediate, obtained via the zinc complex itself, is from 9 days. about 24 hours, and then only 3,6'-di-N-benzyloxycarbonylkanamycin A is isolated. The process is carried out in a single-phase system, and the necessity of creating a homogeneous solution during the reaction is constantly emphasized. The stage of protecting the amino group at C-3 " the rest of the posterior trifluoroacein is also long lasting and takes about 12 hours to complete. In the isolation of 3,6'-di-N-benzyloxycarbonyl-3 "-N-trifluoroaethylcanamyoyin A, large amounts of diethyl ether are used, which is technically unacceptable. The reaction time of the intermediate product with the active ester, 10 hours to obtain the appropriate amikacin derivative, and the shortening of the duration of the process entails a decrease in efficiency. A different scheme for the synthesis of amikacin is given in Polish patent description No. 117 307. The method described therein consists in silylating kanamycin A or its 6'-N - monosubstituted derivative in order to obtain polysilyl kanamoyin A, which is subjected to bum hydrolysis and then introduces to the 1-N position of the L - / - / -? f-amino-J 1 -hydroxybutyric acid residue with a protected amino group. known way, the protection of amino groups is obtained amikacyne.According to our experience, the above procedure gives a definitely less pure horse product, as well as a lower yield than in the case of In order to obtain it by the method according to Belgian patent specification No. 879,925 *, an additional disadvantage of the discussed compounds is the need to use kanamycin A as a base as a substrate. Kanamycin A is isolated in the process of biosynthesis as sulphate or disulphate. Due to the nature of the base, the only method of its isolation is the ion-exchange method, thus the production process includes an additional step of isolating kanamyoyin A of the base from its sulphate or disulphate.147 373 3 In the process according to the present invention, the starting product is used canaryna A sulphate or bisulphate, the aqueous solution of which is alkalized with a base such as alkali metal hydroxides, preferably sodium or potassium hydroxide, ammonium hydroxide, subjecting the kanamyne A contained in the aqueous solution to a rule at a temperature of 0 to 100 ° C, preferably 40 ° - 60 ° C for reaction with zinc, cadmium and magnesium salts or mixtures thereof. Then, an organic solvent immiscible with water, such as an ester, ketone or halogen alkane, preferably ethyl acetate, amyl acetate, methyl isobutyl ketone, methylene chloride or chloroform, is introduced into the reaction mixture to form the heterophasic system, followed by the addition of N- benzyloxycarbonyloxysucinoimide in solid form or in a solution of this solvent. The process is carried out at a temperature of 0 ° C to reflux temperature, preferably 40-60 ° C. Various quaternary ammonium compounds are used as phase transfer catalysts as phase transfer catalysts, for example, tetraethyl ammonium chloride, benzyldimethyl hexadeoyl ammonium chloride or tetramethyl ammonium hydroxide, to accelerate the initial stage of the reaction. The process for the formation of the basic intermediate by the metal complex is carried out within 1-2 hours. After its completion, the layers and the aqueous layer are separated, removing the metal ions, the 3,6'-di-N-benzyloxycarbonylokanamyoyne intermediate is isolated in a typical manner. According to the present invention, the transition from the above-obtained intermediate or its complex with metal to the protected amikacin is carried out via the silyl derivatives of 3,6% -di-K-benzyloxycarbonylcarbonylcarbonyl A. After the polysilylation process has been carried out, the amino group is selectively deprotected at C-1 by hydrolysis or alcoholysis. The product obtained in this way, mainly 3.6% - di-H-benzyloxycarbonyl-3-t, -U-silyl-poly-O-silyl kanamyoyne A, is reacted sequentially with an active ester to introduce the acid residue L - N - Jf-benzyloxycarbonylamino-X- to the free amino group hydroxybutyryl, and then from the thus obtained protected amikacin, i.e. 1N-jj - / - / - ^ f-benzyloxycarbonylamino-J1-hydroxybutyryl J-3,6'-di-N-benzyloxycarbonyl-3t, -N-silyl-poly -O-silyl-kanamyoyny A removes all protecting groups. The latter step is carried out in two steps by removing the residual silyl residues and hydrogenolysis to obtain pure amikacin. In the polysilylation reaction of 3,6'-di-N-benzyloxycarbonylcarbonylcarbonylcanamycin A classic silylating agents, preferably trimethylsilylating agents, including hexanes and ice-sylating agents, are used. , trimethylsilylethamide, bis- (trimethylsilyl) aoethamide, preferably with the addition of a silylation catalyst such as trimethylchlorosilane or amine sulfosates. For the introduction of the amino group at C-1 in 3,6 * -di-N-benzyloxycarbonyl-3M -N-silyl-poly-O-silylcanamycin A, the residual acid L - / - / - jf-benzyloxycarbonylamino-oC- active esters such as N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide or N-hydroxy-5-norbomeno-2,3-dicarboximide, preferably N-hydroxysuccinimide, are particularly suitable. Using a variation of the method according to the present invention, after the reaction of kanamyoyin A with N -benzyloxycarbonyloxysuccinimide, in the further stages of the synthesis of amikacin, the 3f6'-dibenzyloxycarbonylcarbonylcanamycin A complex is used directly, reacting it with an active ester to introduce L - (-) - 4-benzyloxycarbonyl acid residue at C-1 droxybutyrate and obtains protected amikaoyne, i.e. lN- [L - / - / - jf-benzyloxycarbonylamino-OC-hydroxybutyryl J-3f6 # -di-N-benzyloxycarbonylcarbonyl A, and then removes the protection of the amino groups by hydrogenolysis. The amikaoyne obtained in this way is identical to the first version of the process. The amikaoyne obtained in the process of the present invention in the form of carbonic acid addition salt is converted into other addition salts with inorganic acids such as sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid or with organic acids such as tartaric, lactobionic, glucolactonic, glucoheptonic, L-aspartic acids in the amount of 1-4 gramequivalents per 1 mole of amikacin. The methods described above according to the invention show the superiority of handling only one isolated intermediate product, i.e. 3.6 # -di-N-benzyloxycarbonylcanamycin A or its metal complex. The use of a heterophasic system in the reaction of kanamyoyin A with N-benzyloxycarbonyloxy sukoinimide with additional participation of a phase transfer catalyst accelerates these reactions several times. The processing conditions are particularly convenient for the application of kanamycin A base in situ with canaraicin sulfate with ion exchange isolation. The use of polysilylation as a method of transient blocking of the amino group at C-3 "in 3,6'-di-N-benzyloxycarbonylokanamyoyn A made it possible to eliminate long-lasting stages. Using the mentioned intermediate product instead of kanamyoyin A led to an increase in the yield of amikacin and the purity of the product. Example I Preparation of 3,6 * -di-N-benzyloxycarbonylcanamycin A. 1.2 g (0.0021 mol) of kanamycin A sulfate was dissolved in 20 µm of water and basified with a concentrated KOH solution to pH = 9.5. 10 µm was added. methanol and 2.4 g (0.0090 mol) of cadmium acetate trihydrate and stirred for 2 hours in a water bath at a temperature of 45 - 50 C. Then 20 μm of methylene chloride, 0.3 g of benzyldimethyl hexadecyl ammonium chloride were added, and the solution was added dropwise 1.2 g (0.0048 mole) of N-benzyloxycarbonyloxysuccinimide in 10 cm3 of methylene chloride. Stirring and heating in a water bath were continued for 1 hour. The reaction mixture was cooled to room temperature, then separated. The aqueous phase was poured and evaporated to dryness under a vacuum. The dry residue was dissolved in a 60 cm 'dioxane-water solution (1: 1) and applied to a chromatographic ion exchange column (40 cm' Amberlite CG-50 ion exchanger, H + form, in a 1: 1 dioxane-water solution). Elution with a dioxane-1 solution. N NH.OH solution (1: 1). Fractions containing 3,66 -di-N-benzyloxycarbonyloxycarbonylcanamycin A were concentrated under vacuum, the separated precipitate was filtered off, washing it then with water. After drying, 0.92 g (77% w / w yield) of 3f6'-di-N-benzyloxycarbonylcanamycin A was obtained. Analysis for the formula C ^ H ^ ^ IC * Obliozone: 54.2% C; 6.4% H; 7.4% N; Found: 53F6% C; 6.3% H; 7.0% N. Example II. Preparation of 3,6'-di-N-benzyloxycarbonylcanamyoyny A complex with zinc. 12.0 g (0.0206 mol) of kanamycin A sulfate was dissolved in 200 cm 3 of water and basified with a concentrated NaOH solution to a pH value of 9.5. 80 ml of methanol and 20.0 g (0.0911 mol) of zinc acetate dihydrate were added and stirred for 1 hour in a water bath at 45 ° - 50 ° C. Then 400 cm3 of ethyl acetate, 1.0 g of chloride were added. tetraethylammonium chloride and 12.0 g (0.0481 mol) of N-benzyloxycarbonyl kysuccinimide in portions. Stirring and heating in the water bath was continued for 45 min. The reaction mixture was cooled to room temperature, the aqueous phase was separated, the pH was adjusted to 7.5 and then evaporated to dryness under reduced pressure. The residue was ground and mixed for 1 hour with 200 cm of methanol, then cooled at a temperature of about 5 ° G. The separated sediment was desalted and dried under vacuum, yielding 10.4 g (87% w / w yield) of the 3.6'-complex. di-N-benzyloxycarbonylcanamycin A with zinc. Example III. Preparation of 1-N- [1 - / - Jf-amino-1-hydroxybutyryl] kanamyoyl A (amikacin) from 3,6'-di-N-benzyloxycarbonylcanamycin A. For a suspension of 10.0 g (0.0133 mole) of 3f6'-di-N-benzyloxycarbonylcanamycin A in 100 µm of anhydrous acetonitrile were added 11.7 g (15 µm "; 0.073 mole) of hexamethyldisilazane, 0.1 µm trimethylchlorosilane and the entire mixture was refluxed for 5 hours. The reaction solution was evaporated under reduced pressure to obtain a foamed residue which was then dissolved in 75 cm 3 of aoethone. After the resulting solution had cooled to 5 ° C, 2.0 ml of water was added and stirred at this temperature for 0.5 hours. A solution of 5 g (0.0143 mol) of L-N-hydroxysuccinimide N-hydroxysuccinimide ester was then added dropwise with stirring. (-) - N-benzyloxycarbonylamino-N-hydroxybutyric acid in 40 µm acetone and the mixture is stirred for 3 hours at room temperature. 50 ml of water was added to the remaining solution, and the mixture was adjusted to pH 2 with hydrochloric acid, followed by stirring under these conditions for an additional 0.5 hour. The resulting mixture was evaporated under reduced pressure until a dry residue was obtained, which was in turn dissolved in 250 cm 3 of a dioxane-water mixture (1: 1). To the obtained solution were added 3.0 g of ammonium formosate, 2.5 g of 5% Pd / C catalyst, and stirred under a hydrogen atmosphere at room temperature for 4 hours. After separating off the catalyst, the obtained filtrate was concentrated under reduced pressure to a volume of about 80 μm and applied to the column with Amberlite CG-50 (NH4 +). After washing the column with water, elution was carried out with 0.5 N NH4OH solution, collecting fractions of 20 ohms' and controlling them chromatographically. The product fractions were combined and evaporated altogether to a glassy residue. After mixing it with 100 cm 5 of anhydrous ethanol, a precipitate was obtained, which was filtered off and dried under vacuum, obtaining 5.4 g (yield 54% w / w) of amikacin carbonate. Analysis for the formula: C22H43N5 ° 13 * H2C ° 3; Calculated: 42.6% C; 7t0% H; 10.6% N; Found: 42.1% C; 7.1% H; 10.4% NW of the HPLC spectrum of the product virtually no impurities. Example IV, Preparation of 1-N- [L - / - / - jf-benzyloxycarbonylamino- "C-hydroxybutyryl -3,6'-di-N-benzyloxycarbonylcarbonylamino A from 3,6'-di-N-benzyloxycarbonyl kanamyoyny A complex with zinc. To a solution of 1.8 g of a 3.6 #-di-N-benzyloxycarbonyl kanamyoyne A complex with zinc in 40 ohm dioxane-water mixture (1: 1) 0.9 g (0.0026 mol) of L - N -] J "-benzyloxycarbonylamino- * 6-hydroxybutyric acid N-hydroxysuccinimide ester was added over 10 minutes and the mixture was stirred at room temperature for 4 hours. It was treated with 20 cm of water and concentrated under reduced pressure to a volume of about 30 cm of water. The separated precipitate was filtered off and dried in a vacuum, giving 0.75 S (yield 42% w / w) 1-N-L - / - (") F-benzyloxycarbonylamino-j6-hydroxybutyryl -3f6 * -di-N-benzyloxycarbonylcarbonylcanamycin A, Example V, Preparation of 1-N- ^ L - / - / - V-100 milli-j6-hydroxybutyryl-3-alkyamycin A (amikacins ) from lN-Qj - / - / - jf-benzyloxycarbonylamino - ^ - hydroxybutyrylol ^ - di-N-benzyloxycarbonylcarbonylcanamycin A. To a mixture of 0.75 S (0.0008 mol) 1-N- £ L - / - / - 1-Benzyloxycarbonylamino-Jt-hydroxybutyryl] -3,6'-di-N-benzyloxycarbonylcarbonylcanamycin A in a 20 cm 'dioxane-water mixture (1: 1) was added 0.2 ml of acetic acid and the mixture was stirred at 50 ° C until the precipitate dissolves. After the resulting solution was cooled to room temperature, 0.25 g of 5% Pd / C catalyst was added, and the mixture was stirred under a hydrogen atmosphere for 4 hours. The catalyst was then desalted and washed with 10 ohms of water, adding the washing solution to the filtrate. The resulting solution was concentrated under reduced pressure to a volume of about 10 µm and applied to an Amberlite CG-50 (NH 4 +) ion exchanger column. As a result of elution with 0.5 N NH.OH solution 0.4 g (yield 53% w / w) of amikacin carbonate was isolated with the properties as in Example III, Example VT. Preparation of 1-N- [L - / - / -] f-amino- <E-hydroxybutyryl] kanamycin A (amikacin) from the 3.6 # -di-N-benzyloxycarbonyl kanamycin A complex with zinc For the suspension of 1.0 g of complex 3 , 6'-di-H-benzyloxycarbonylcanamycin A with zinc in 15 µm of anhydrous aoetonitrile were added 2.0 cm "of hexamethyldisilazane, 0.01 cm" of trimethylchlorosilane and the entire mixture was heated to reflux for 5 hours with stirring. The precipitate was filtered off, and the filtrate was evaporated to dryness under reduced pressure. The residue was dissolved in 10 cm 3 of acetone, and 0.25 µm of water was added to the resulting solution, and the residue was stirred for 1 hour. Then 0.5 S (0.0014 mol) of L- / -] [beta] -benzyloxycarbonylamino-[beta] -hydroxybutyric acid N-hydroxysuccinimide ester was added and stirred for another 3 hours. 10 ml of water was added to the reaction suspension, the pH was adjusted to 2.5 with hydrochloric acid and stirred under these conditions for 0.5 hours. The oil was then concentrated under reduced pressure until an oily substance was obtained, which was in turn dissolved in 10 cm. Of water. 0.2 g of 2% Pd / C catalyst was added to the resulting solution and stirred under a hydrogen atmosphere for 2 hours. After the catalyst was separated off, the filtrate obtained was loaded onto a column of Amberlite CG-50 (NH4 "1"). As a result of elution with 0.5 N NH.OH solution, 0.35 S (35% w / w yield) of amikacin carbonate was isolated with the properties as in example III, Example VII, Preparation of amicative addition salt with sulfuric acid (1 t 2; amikacin disulfate To a solution of 32.4 g (0.005 mol) of amikacin carbonate in 250 ml of water was added dropwise with stirring 10.0 cm (0.01 mol) of a 1 H solution of NgSO4. The whole was stirred for about 0.5 hours until the release of CO 2 bubbles had ceased, then filtered, removing any traces of mechanical contamination. The slurry was subjected to spray drying to obtain 39 µg of amikacin addition salt with sulfuric acid (1: 2; amikacin disulfate) with a biological strength of 686 g / mg. To a solution of 10.0 g (0.017 mol) of amikacin in 100 cm 3 of water was added 2.55 g (0.017 mol) of tartaric acid by stirring. The whole was stirred for another hour, then filtered, removing traces of mechanical impurities. The transfer was freeze-dried, obtaining 12.5 g of amikacin additive salt with tartaric acid (1: 1; amikacin monotartrate) with a biological strength of 695 g / mg. . PL