PL129783B1 - Method of isolation of novel enzyme of microbiological origin,coagulating milk casein - Google Patents

Description

Opis patentowy opublikowano: 1985 12 14 129 783 Int Cl? C12N 9/58 Twórcy wynalazku: Marla Kolaczkowska, Antoni Polanowskl Uprawniony z patentu: Uniwersytet Wroclawski im, Boleslawa Bieruta, Wroclaw /Polska/ SPOSÓB IZOLOWANIA NOWEGO ENZYMU POCHODZENIA MIKROBIOLOGICZNEGO O WLASNOSCIACH KOAGULUJACYCH KAZEINC MLEKA Wynalazek dotyczy sposobu izolowania nowego enzymu pochodzenia mikrobiologicznego o wlasciwosciach koagulujacych kazeine mleka z przeznaczeniem dla przemyslu mleczarskiego do produkcji serów dojrzewajacych.Zdolnosc do koagulacji mleka wykazuje wiele enzymów pochodzenia zwierzecego, roslinne¬ go i mikrobiologicznego. Stosowany od dawna preparat podpuszczki izolowany z zoladków cie¬ lat, jest obecnie coraz trudniej dostepny. Wzrost produkcji serów twardych, jak i ograni¬ czenie uboju cielat stwarza potrzebe poszukiwania substytutów zwierzecej renniny. Knight /Canad. J. Microbiol. 1966, 12, 420/ przebadal szereg grzybowych enzymów posiadajacych zdolnosc do scinania mleka, a wsród nich takich rodzajów grzybów jak: Penicillium chryzo- genum, Fusarium moniliforme i Byssochlarays fulva. Jednakze autor ten nie podal zadnych blizszych informacji dotyczacych enzymu z Fusarium moniliforme, ani tez skladu plynu hodowlanego.Natomiast grzyb Byssochlarays fulva produkowal enzym o najwyzszej aktywnosci koaguluja- cej mleko i stal sie przedmiotem dalszych badan. Równiez Endothia parasitica jest odpowied¬ nim grzybem produkujacym w duzej ilosci enzym, o wlasciwosciach koagulujacych kazeine /J. L. Sardinas Appl. Microbiol. 1968, 16.248/. W Japonii w skali przemyslowej stosuje sie preparat enzymu z plesni Mucor pusillus. Zastepujacy podpuszczke preparat "Fromazy" produ¬ kowany Jest we Francji z Mucor miehei. W USA firma Pfizer produkuje podobny enzym z Endo¬ thla parasitica* Dotychczas znane sposoby postepowania prowadzace do wytworzenia enzymów koagulujacych mleko sa przedstawione w opisach patentowych USA nr 2 936 265t nr 3 151 039» nr 3 275 453.W opisanych w nich sposobach postepowania enzymy koagulujace kazeine mleka otrzymywano2_ J29JZB3 2 grzybów -rodzaju Endothia-parasitica-lub Muoor pusillus Lindt, ^ proces ich produkcji po¬ lega na hodowli tych grzybów w srodowisku zawierajacym zródlo weglowodanów, azotu i nieorga¬ nicznych soli, w odpowiednim pH i temperaturze.Znany Jest Jedynie sposób hodowania grzyba z Fusariura moniliforme Sheldon /M, Kolaczkow¬ ska, A. Polanowski, 5t# Czaplinska; Hod. Rosl, Akl. Nas. 1980, 24, 1/. Natomiast nie Jest : znany sposób wyodrebnienia enzymu z plynów pohodowlanych Fuaarium moniliforme Sheldon.Wzrost grzyba Fusarium moniliforme prowadzono na plynnej pozywce mineralno-organicznej o skladzie g/l: maka sojowa - 2,0, Kf^FO^ - 1.0, MgSO^ x 7H20 - 0,5, glukoza - 10.0, CaCl2 x 6H20 - 0,05 o pH 5,0, która zakazano wodna zawiesina zarodników w ilosci 30 x 10 /l.Pozywke wytrzasano w temp, 30°C, przez 4 dni, a nastepnie wirowano przez 20 minut przy 3 tys. obrotów/minute. Otrzymany plyn chociaz koaguluje kazeine mleka, nie nadaje sie do wytwarzania seców, gdyz wykazuje niska aktywnosc /34 j/ml/.Celem wynalazku jest otrzymanie enzymu pochodzenia mikrobiologicznego nadajacego sie do produkcji serów dojrzewajacych, a wiec preparatu wysokoaktywnego i dajacego wlasciwa konsy¬ stencje skrzepów kazeiny mleka nadajacych sie do ich dalszej obróbki.Istota wynalazku polega na wykorzystaniu plynów pohodowlanych z Fusarium moniliforme Sheldon i wyodrebnieniu z nich wytworzonego aktywnego enzymu. Sposobem wedlug wynalazku plyn pohodowlany kontaktuje sie z kationitem zwlaszcza takim jak CM-Sephadex C 50 lub C 25, Cm celluloza, SP-Sephadex C 50 lub 25, a nastepnie zaadsorbowany enzym eluuje sie buforem octanowym 0,05 - 1,0 Mo pH 4,4 - 4,6 zawierajacym 0,2 - 0,4 M NaCl, korzystnie 0,1 M bu¬ forem octanowym o pH 4,4 zawierajacym 0,3 M NaCl.Enzym uzyskany z hodowli grzyba Fusarium moniliforme charakteryzuje sie nastepujacymi wlasciwosciami fizyko-chemicznymi: ciezar czasteczkowy jego wynosi 38.000, punkt izoelek- tryczny 4.9, zbudowany Jest z 321 aminokwasów i nalezy do typu aspartylowych proteinaz.Izolowanie enzymu koagulujacego kazeine mleka wedlug wynalazku, zostanie blizej objasnione w przykladach wykonania.Przyklad 1. 151 odwirowanego plynu po 4-dniowej hodowli grzyba Fusarium moni¬ liforme Sheldon doprowadzono do pH 4,4. Do plynu dodawano CM-Sephadex C 50 zrównowazony 0,1 M buforem octanowym o pH 4,4 w ilosci 2 g/l. Adsorpcje przeprowadzono w zlewce w tempe¬ raturze pokojowej, przy ciaglym mieszaniu przez 1,5 godziny. Nastepnie plyn po przesaczeniu na lejku Buchnera, przez pojedyncza warstwe fliseliny, przy uzyciu pompy wodnej, odrzucano.Nlezaadsorbowane bialka, pozbawione aktywnosci koagulujacej, wymywano z CM-Sephadex 0,1 M bu¬ forem octanowym o pH 4,4 az do zaniku reakcji na bialko. Obecnosc bialka kontrolowano przez odczyty na spektrofotometrze przy 280 nm. Zaadsorbowany na kationicie enzym eluowano przez wzrost sily Jonowej.W tym celu zastopowano 0,1 M bufor octanowy o pH 4,4 z 0,4 M NaCl. Frakcje o ekstyncji przy 280 nm powyzej 0,2 laczono i oznaczono aktywnosc koagulujaca wg You, Taniura /Bioch.Bioph. Acta. 1969, 171, 138/. W tak przedstawionym postepowaniu uzyskano preparat o wyso¬ kiej aktywnosci koagulujacej okolo 2000 j/ml, nadajacy sie do produkcji serów dojrzewaja¬ cych. CM - Sephadex stosowany do adsorpcji enzymu po regeneracji polegajacej na przemyciu 0,1 M NaOH, 1 M NaCl i zawieszaniu w buforze, nadaje sie do wielokrotnego uzycia. Z 15 1 plynu pohodowlanego otrzymuje sie taka ilosc, która wystarcza do skoagulowania okolo 50 1 mleka. Z takiej porcji mleka mozna wyprodukowac 2-3 serów twardych o wadze okolo 2 kg kazdy.Przykl ad II. Powtórzona jest procedura przykladu I. Róznica polega na zastoT sowaniu innego kationitu, a mianowicie SP-Sephadex C 50. Zaadsorbowany enzym eluuje sie 0,05 M buforem octanowym o pH 4,6 zawierajacym 0,2 M NaCl.121.183 3 PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób izolowania nowego enzymu pochodzenia mikrobiologicznego o wlasnosciach koagulu- Jacych kazeine mleka, nadajacego sie do produkcji serów dojrzewajacych, znamienny tym, ze-plyny pohodowlane z Fusarium moniliforme Sheldon kontaktuje sie z kationitem zwlaszcza takim Jak CM-Sephadex C 50 lub C 25, Cm celluloza, SP-Sephadex C 50 lub C 25, a nastepnie zaadsorbowany enzym eluuje sie buforem octanowym 0,05 - 0,1 M o pH 4,4 - 4,6, zawierajacym 0,2 - 0,4 M NaCl, korzystnie 0,1 M buforem octanowym o pH 4,4 zawieraja¬ cym 0,3 M NaCl, PL